CN100516231C - 双黄连制剂在抑制病毒诱导Hela细胞凋亡中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及双黄连制剂在抑制病毒诱导Hela细胞凋亡中的应用以及Hela细胞培养液，Hela细胞培养液是添加体积百分浓度0.25%的胰蛋白酶，体积百分浓度0.02%EDTA组成的消化液。Hela细胞凋亡的检测方法，其中按下列步骤操作：A.制备细胞；B.制备流感病毒；C.测试药物毒性限量；D.测病毒EID50；E.双黄连抑制病毒诱导细胞凋亡；试验分组；F.试验步骤：G.流式细胞仪测试。双黄连制剂抗流感病毒，一方面直接作用病毒颗粒，破坏病毒包膜，阻断病毒复制，作用靶点为病毒。另一方面双黄连制剂抑制流感病毒诱导细胞凋亡，抵抗炎症消除疾病。从分子生物学水平上揭示了双黄连有新的抗流感病毒作用部位即新靶点。
Description
技术领域
本发明涉及双黄连制剂在抑制病毒诱导Hela细胞凋亡中的应用以及Hela细胞培养液，Hela细胞凋亡的检测方法。
背景技术
Hela细胞凋亡的检测方法对于筛选治疗病毒性疾病的药物有帮助。双黄连制剂抑制病毒诱导Hela细胞凋亡中的应用尚未见报道。
流行性感冒简称流感。流感病毒是流感的病原体，流感病毒极易产生变异，形成新的病毒株，因人群对新毒株无免疫力，故常引起流行，对人类危害很大，因此，抗流感病毒药物研究倍受关注。20世纪60年代以来，抗流感病毒药物陆续出现，常用的有①离子通道剂，作用靶点为流感病毒基质蛋白-2，如金刚烷胺等；②神经胺酸酶抑制剂，作用靶点为流感病毒的神经胺酸酶如神经胺酸酶抑制剂。③其它药作用靶点为流感病毒的核酸，如病毒唑。上述药物虽有可观的疗效，但毒性大，而且易产生耐药性。近年来人们为了寻找理想的抗流感药物正着力于研发中草药，并已发现有不少中草药可以抗流感病毒。常见的有：野菊花、大青叶、板兰根、金银花和黄岑等。它们的作用靶点为流感病毒及其组成成分。
由于分子生物学飞速发展，多学科渗透推动了病毒学的发展，目前研究已证明流感病毒可在体内和体外诱导宿主细胞凋亡，产生炎症改变，这是流感病毒引起疾病的重要机制。
细胞坏死和细胞凋亡是细胞死亡两种完全不同的方式，二者具有本质不同。后者为细胞在基因控制下，主动的程序化死亡。凋亡细胞形态学改变是判断细胞凋亡的重要指标。凋亡细胞经染色，在光镜下观察，其特征为核固缩，核断裂，形呈新月形，花瓣状，黑洞状，八字形等改变。依此可计算出凋亡率(AI)和抑制率(IR)。凝胶电泳中，核酸片段形成梯带状。细胞凋亡技术的应用促进了抗病毒药物机理研究，开创了一新的研究途径，增加了寻找药物抗病毒作用新靶点手段。现已有实验研究报道某些抗流感病毒药物如鱼金及穿琥宁等，可抑制流感病毒诱导宿主细胞凋亡。这是药物抗流感病毒作用的新靶点。
双黄连常被用于防治流感，并且已获得了令人可喜的效果。传统的研究采用动物及细胞水平的方法进行抑毒试验证明双黄连抗流感病毒作用的靶点是病毒粒子。病毒包膜和病毒的吸附。然而，双黄连是否能影响流感病毒宿主细胞，可否找到与上不同的作用靶点在国内国外至今没有见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供双黄连制剂在抑制病毒诱导Hela细胞凋亡中的应用以及Hela细胞培养液，Hela细胞凋亡的检测方法。
本发明的技术方案为：
双黄连制剂在抑制病毒诱导Hela细胞凋亡中的应用。
Hela细胞培养液，其中：Hela细胞培养液是添加体积百分浓度0.25％的胰蛋白酶，体积百分浓度0.02％EDTA组成的消化液。
Hela细胞凋亡的检测方法，其中按下列步骤操作：
A、制备细胞
B、制备流感病毒
C、测试药物毒性限量：
D、测病毒EID50
E、双黄连抑制病毒诱导细胞凋亡：
试验分组：
F、试验步骤：
G、流式细胞仪测试
本发明的主要实验仪器如下：
CO2培养箱(SL-SHELDON，USA)；
超低温冰箱(SANYO，JAPAN)；
低温冰箱(-20℃，中国上海)；
II级生物安全操作柜(哈尔滨仪器厂制)；
净化工作台(江苏净化设备厂)；
电子天秤(EK-120，JAPAN)；
倒置显微镜(日本欧olympus-ckx41)；
流式细胞仪(FACS Calibur，BD公司USA)；
台式高速(TGL-16G，上海安享)；
电热恒温箱(上海跃进医疗仪器厂)；
50ml细胞培养瓶、24孔、96孔组织培养板(Costor公司、USA)；
移液器(Glison公司，USA)(八头、单头)各一把。
本发明的主要实验材料和试剂如下：
甲1型流感病毒：感病毒株(A/南昌/692/97(H1N1)由南昌大学医学院微生物教研室分离获得、经世界卫生组织和美国疾病控制中心鉴定。甲1型流感病毒是经经世界卫生组织和美国疾病控制中心鉴定的标准病毒，也可以通过其他科研机构购买。
HeLa细胞中的宫颈癌(Hela)传代细胞(购自武汉大学生命科学院物种保藏中心)。
HeLa细胞还可以由河北医科大学第四医院科研中心或山东省医学科学院药物研究所提供。
HeLa细胞来源广泛，是最常见的应用于药物研究的细胞。
鸡胚(购自南昌市种蛋厂)。
DMEM基础培养基(Gibco公司，USA)。
牛血清白蛋白及胰蛋白酶(Sigma公司，USA)。
胎牛血清(海克隆公司，USA)。
Annexin V及PI(美国BD公司)。
双黄连注射液(含金银花、黄芩、连翘)黑龙江多得药业有限公司，批号2005081312。
本发明涉及的双黄连制剂是一种市场上可以购买到的常规的药品，主要是双黄连注射液，双黄连注射液拼音名：Shuanghuanglian Zhusheye其标准编号：WS3-B-2104-96，配方为：金银花250g、黄芩250g、连翘500g，制法以上三味，黄芩酌予碎断，加水煎煮二次，每次1小时，分次滤过，合并滤液，滤液用盐酸(2mol/L)调pH而得。或者双黄连制剂按中国药典记载的方法获得。
实验数据效果：
(1)双黄连制剂对Hela细胞毒性范围与无毒界限(见表1)
表1 双黄连细胞毒性试验结果
注：+-++++表示产生细胞病变的程度
表1结果表示，不同浓度的双黄连组中，以1∶64为无毒界限。
(2)双黄连制剂抑制流感病毒诱导Hela细胞凋亡结果，采用Anuexinl及PI双染法用流式细胞仪测试，详细结果见表2及图1。
表2 流式细胞仪测试结果(X±S，n＝3)
※与病毒感染组比较P＜0.01
(3)采用金银花、黄芩、连翘(1∶64～1∶256浓度)测试结果与上述相同。
(4)结论
本发明采用Hela细胞为靶细胞，以双染法在流式细胞仪上测试了双黄连对流感病毒甲型诱导细胞凋亡的影响。结果病毒感染组与试验组比较，细胞凋亡率有非常显著的差异(P＜0.01)，试验组与其它组比较无显著差异，证明双黄连可抑制流感病毒诱导Hela细胞凋亡。双黄连抗流感病毒不仅是单纯抑制流感病毒，还作用流感病毒宿主细胞即靶细胞凋亡，首次发现双黄连抗流感病毒的新靶点。
本发明的优点和效果：
双黄连制剂抗流感病毒，一方面直接作用病毒颗粒，破坏病毒包膜，阻断病毒复制，作用靶点为病毒。另一方面双黄连制剂抑制流感病毒诱导细胞凋亡，抵抗炎症消除疾病。从分子生物学水平上揭示了双黄连有新的抗流感病毒作用部位即新靶点。增加了中草药抗病毒理论知识点，对完善知识结构，促进学科发展具有重要的作用。
证明了双黄连制剂抗流感病毒作用有新靶点，多一个靶点，则多一个作用，比只有一个靶点作用强。这是双黄连在临床疗效好应用多的原因之一。
具体实施方式
实施例1、
双黄连制剂在抑制病毒诱导Hela细胞凋亡中的应用。
实施例2、
Hela细胞培养液，其中：Hela细胞培养液是添加体积百分浓度0.25％的胰蛋白酶，体积百分浓度0.02％EDTA组成的消化液。
Hela细胞培养液还可以是其他种类的，但采用本实施例的Hela细胞培养液，可以较好的保持Hela细胞活性，并配合其他步骤获得有效的Hela细胞凋亡的检测方法。
实施例3、
Hela细胞凋亡的检测方法，其中按下列步骤操作：
A、制备细胞
①取带有生长液的长成单层的Hela细胞一瓶，以磷酸缓冲盐液洗涤三次；
其中的HeLa细胞来源广泛，是最常见的应用于药物研究的细胞；
HeLa细胞可以由河北医科大学第四医院科研中心或山东省医学科学院药物研究所、武汉大学生命科学院物种保藏中心提供；
②再添加体积百分浓度0.25％的胰蛋白酶，体积百分浓度0.02％EDTA组成的消化液37℃培育5～10分钟，轻轻摇动至细胞脱落；
③再添加体积百分浓度10％胎牛血清的DMEM培养基的生长液制成细胞悬液；
④将Hela细胞分装于细胞培养瓶中，24孔板和96孔细胞培养板中，供用；
B、制备流感病毒
①取-70℃冻存甲1型流感病毒行加稀释液作10倍系列稀释得到稀释的病毒液；稀释液为添加体积百分浓度4％白蛋白的DMEM培养基；
②稀释的病毒液接种Hela细胞，在培养箱中37℃、体积混合比例为5∶95的CO2和空气的混合气体条件下孵育3-5天；无菌收集，-70℃存放备用；
C、测试药物毒性限量：
①取24孔细胞培养板长成单层的Hela细胞；
②弃添加体积百分浓度10％胎牛血清的DMEM培养基的生长液，以磷酸缓冲盐液洗三次；
③取双黄连注射液加稀释液作2倍系列稀释得到双黄连注射液稀释样品，稀释液为添加体积百分浓度4％白蛋白的DMEM培养基，双黄连注射液稀释样品平行的放置在3个孔中；
④在培养箱中37℃、体积混合比例为5∶95的CO2和空气的混合气体条件下孵育3-5天；
⑤每日观察细胞病变；
D、测病毒EID50
①取10日龄鸡胚，消毒打孔；
②将甲1型流感病毒液加稀释液作10倍系列稀释接种鸡胚尿囊腔，每腔接种0.2ml，每稀释度接种4只胚，37℃孵育；稀释液为添加体积百分浓度4％白蛋白的DMEM培养基；
③3天后收集各胚尿囊腔液测红细胞凝集滴度，记录EID50；
E、双黄连抑制病毒诱导细胞凋亡：
试验分组：
①细胞对照组：Hela细胞加体积百分浓度4％白蛋白的DMEM培养基作为维持液；
②药物对照组：药物加Hela细胞加体积百分浓度4％白蛋白的DMEM培养基作为维持液；
③病毒对照组：Hela细胞加病毒加体积百分浓度4％白蛋白的DMEM培养基作为维持液；
④试验组：Hela细胞加病毒加药物加体积百分浓度4％白蛋白的DMEM培养基作为维持液；
F、试验步骤：
①取形成单层的Hela细胞4瓶，弃上清，以磷酸缓冲盐液洗3次；
②同时加入流感病毒100EID50，加体积百分浓度4％白蛋白的DMEM培养基的维持液稀释的药液，稀释度为1∶128，在培养箱中37℃、体积混合比例为5∶95的CO2和空气的混合气体的条件下孵育；
③设病毒对照，药液对照和细胞对照组；
④每天观察细胞，待细胞产生病变时，分别收集各组细胞进行测试；
G、流式细胞仪测试
①取各组试验细胞，分别以磷酸缓冲盐液洗3次；过滤使细胞分散；
②将细胞浓度调至1×106/ml；
③取100μl细胞悬液置专用试管中，加5μl Annexin V及10μlPI，立即加100μl缓冲工作液混匀；
④置4℃冰箱30分钟；
⑤加400μl工作液；
⑥检测Hela细胞凋亡数据；计算10000个细胞，每标本测试3次。
实施例3、Hela细胞培养液：
添加体积百分浓度0.25％的胰蛋白酶，体积百分浓度0.02％EDTA组成的消化液。
Claims (2)
1、双黄连制剂在抑制甲1型流感病毒诱导Hel a细胞凋亡中的应用。
2、Hela细胞凋亡的检测方法，其特征在于按下列步骤操作：
A、制备细胞
①取带有生长液的长成单层的Hela细胞一瓶，以磷酸缓冲盐液洗涤三次；
②再添加体积百分浓度0.25％的胰蛋白酶，体积百分浓度0.02％EDTA组成的消化液37℃培育5～10分钟，轻轻摇动至细胞脱落；
③再添加体积百分浓度10％胎牛血清的DMEM培养基的生长液制成细胞悬液；
④将Hela细胞分装于细胞培养瓶中，24孔板和96孔细胞培养板中，供用；
B、制备流感病毒
①取-70℃冻存甲1型流感病毒行加稀释液作10倍系列稀释得到稀释的病毒液；稀释液为添加体积百分浓度4％白蛋白的DMEM培养基；
②稀释的病毒液接种Hela细胞，在培养箱中37℃、体积混合比例为5∶95的CO2和空气的混合气体条件下孵育3-5天；无菌收集，-70℃存放备用；
C、测试药物毒性限量：
①取24孔细胞培养板长成单层的Hela细胞；
②弃添加体积百分浓度10％胎牛血清的DMEM培养基的生长液，以磷酸缓冲盐液洗三次；
③取双黄连注射液加稀释液作2倍系列稀释得到双黄连注射液稀释样品，稀释液为添加体积百分浓度4％白蛋白的DMEM培养基，双黄连注射液稀释样品平行的放置在3个孔中；
④在培养箱中37℃、体积混合比例为5∶95的CO2和空气的混合气体条件下孵育3-5天；
⑤每日观察细胞病变；
D、测病毒EID50
①取10日龄鸡胚，消毒打孔；
②将甲1型流感病毒液加稀释液作10倍系列稀释接种鸡胚尿囊腔，每腔接种0.2ml，每稀释度接种4只胚，37℃孵育；稀释液为添加体积百分浓度4％白蛋白的DMEM培养基；
③3天后收集各胚尿囊腔液测红细胞凝集滴度，记录EID50；
E、双黄连抑制病毒诱导细胞凋亡：
试验分组：
①细胞对照组：Hela细胞加体积百分浓度4％白蛋白的DMEM培养基作为维持液；
②药物对照组：药物加Hela细胞加体积百分浓度4％白蛋白的DMEM培养基作为维持液；
③病毒对照组：Hela细胞加病毒加体积百分浓度4％白蛋白的DMEM培养基作为维持液；
④试验组：Hela细胞加病毒加药物加体积百分浓度4％白蛋白的DMEM培养基作为维持液；
F、试验步骤：
①取形成单层的Hela细胞4瓶，弃上清，以磷酸缓冲盐液洗3次；
②同时加入流感病毒100EID50，加体积百分浓度4％白蛋白的DMEM培养基的维持液稀释的药液，稀释度为1∶128，在培养箱中37℃、体积混合比例为5∶95的CO2和空气的混合气体的条件下孵育；
③设病毒对照，药液对照和细胞对照组；
④每天观察细胞，待细胞产生病变时，分别收集各组细胞进行测试；
G、流式细胞仪测试
①取各组试验细胞，分别以磷酸缓冲盐液洗3次；过滤使细胞分散；
②将细胞浓度调至1×106/ml；
③取100μl细胞悬液置专用试管中，加5μlAnnexin V及10μlPI，立即加100μl缓冲工作液混匀；
④置4℃冰箱30分钟；
⑤加400μl工作液；
⑥检测Hela细胞凋亡数据；计算10000个细胞，每标本测试3次。
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| 流感病毒诱导肿瘤细胞凋亡及其机制的研究. 李虹等.四川大学学报（医学版），第34卷第3期. 2003 |
| 流感病毒诱导肿瘤细胞凋亡及其机制的研究. 李虹等.四川大学学报（医学版），第34卷第3期. 2003 * |
| 穿琥宁抑制流感病毒诱导狗肾传代细胞凋亡. 孙坚，王农荣，陈世件，李平，田丽华.中国医院药学杂志，第23卷第7期. 2003 |
| 穿琥宁抑制流感病毒诱导狗肾传代细胞凋亡. 孙坚，王农荣，陈世件，李平，田丽华.中国医院药学杂志，第23卷第7期. 2003 * |
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