CN103217522A - 一种采用消化法消化提取细胞流式检测组织内细胞凋亡率的方法 - Google Patents
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Abstract
一种采用消化法消化提取细胞流式检测组织内细胞凋亡率的方法，将收集的组织在无菌条件下分离，置于胰蛋白酶中消化后离心，弃去上清液，于室温下用Ⅱ型胶原酶静止消化后离心，弃去上清液，并加入PBS溶液，将细胞吹打分散后加入离心管，离心并吸出上清液，随后再加入PBS溶液吹打细胞，得到消化的目的细胞；将消化的目的细胞制成每100μl单细胞悬液细胞密度1×106个细胞的溶液，使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，通过Annexin V抗体与磷脂丝氨酸的特异性结合来检测细胞凋亡。本发明消化法提取细胞流式检测组织内细胞凋亡率，为目前凋亡相关的实验研究提供了一种准确、定量及可靠的检测方法。采用此检测方法。检测结果与课题设计高度符合，结果精准可靠。
Description
技术领域
本发明属于基础医学，涉及细胞凋亡检测方法，具体涉及一种采用消化法消化提取细胞流式检测组织内细胞凋亡率的方法。
背景技术
细胞的凋亡(Apoptosis)[Kerr JF,Wyllie AH,Currie AR.Apoptosis:a basicbiological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics.Br JCancer,1972,26:239–257.]，又称程序性细胞死亡(Programmed cell death,PCD)，广泛发生于机体各种器官。细胞的凋亡对组织、器官的衰老、退变及更新具有重要的作用。目前研究发现，细胞凋亡与人类老年痴呆症[AndersonAJ,Su JH,Cotman CW.DNA damage and apoptosis in Alzheimer’s disease:colocalization with c-Jun immunore activity,relationship to brain area,and effectof postmortem delay.J Neurosci,1996,16:1710–1719.]，[Smale G,Nichols NR,Brady DR,Finch CE,Horton WE Jr.Evidence for apoptotic cell death inAlzheimer’s disease.Exp Neurol,1995,133:225–230.]、老年性白内障[Charakidas A,Kalogeraki A,Tsilimbaris M,Koukoulomatis P,Brouzas D,Delides G.Lens epithelial apoptosis and cell proliferation in human age-relatedcortical cataract.Eur J Ophthal-mol,2005,15:213–220]、骨关节炎[Heraud F,Heraud A,Harmand MF.Apoptosis in normal and osteoarthritic human articularcartilage.Ann Rheum Dis,2005,59:959–965.]及椎间盘退变[Wang HQ,Yu XD,Liu ZH,Cheng X,Samartzis D,Jia LT,Wu SX,Huang J,Chen J,Luo ZJ:Deregulated miR-155promotes Fas-mediated apoptosis in human intervertebraldisc degeneration by targeting FADD and caspase-3.The Journal of pathology,2011,225(2):232-242.]等疾病密切相关。然而对于组织，尤其是人椎间盘髓核这类细胞少，而细胞外基质丰富的结缔组织，目前常用的检测凋亡方法为Tunel染色法，这种方法灵敏度低，准确性差，且最终凋亡细胞比例需在显微视野下计数统计，可靠性低，数据受人为影响较大。
流式细胞仪(Flow cytometer,FCM)，是将流体喷射技术、激光技术、空气技术、γ射线能谱术及电子计算机等技术与显微荧光光度计密切结合的一种非常先进的检测仪器。可检测细胞散射光和标记荧光强度，从而快速分析颗粒的物理或化学性质，同时对细胞进行分类收集，可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个细胞特征参数，进行定性或定量分析，具有速度快、精度高、准确性好等特点。
细胞凋亡发生后，细胞膜，细胞核及细胞微结构出现一系列特定的生物学变化。可以采用常见的试剂Annexin V与Propidium Iodide(PI)在流式细胞仪的检测下分析组织细胞的凋亡比率。
Annexin V是一种分子量为35-36kD的Ca依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合，是一种检测细胞凋亡的试剂，在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V作为一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。
PI，碘化丙啶，分子式为C27H34I2N4，分子量668.40，可用作核酸(DNA,RNA)的荧光染料。PI不能通过正常的细胞膜，故细胞在处于坏死或晚期凋亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色，可以用来分辨坏死细胞和正常细胞。
采用FITC标记的Annexin V与PI对目的细胞进行双染，随后经流式细胞仪分析，便可得到正常细胞、坏死细胞、早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞的比例，结果精准。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够提高组织内细胞凋亡率检测精准性的采用消化法消化提取细胞流式检测组织内细胞凋亡率的方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
1）目的组织的酶消化法收集细胞
将收集的组织在无菌条件下分离，剪成碎块，于室温下置于胰蛋白酶中消化后离心，弃去上清液，于室温下用Ⅱ型胶原酶静止消化后离心，弃去上清液，并加入PBS溶液，将细胞吹打分散后加入离心管，离心并吸出上清液，随后再加入PBS溶液吹打细胞，得到消化的目的细胞；
2）Annexin V与PI双染与FCM检测
将消化的目的细胞制成每100μl单细胞悬液细胞密度1×106个细胞的溶液，使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，通过Annexin V抗体与磷脂丝氨酸的特异性结合来检测细胞凋亡。
所述步骤1）将收集的组织在无菌条件下分离，剪成1×1mm3碎块，于室温下以质量浓度为0.25%的胰蛋白酶消化40min，随后以1000r/min离心5min，弃去上清液，于室温下用质量浓度为0.025%的Ⅱ型胶原酶静止消化4h，以1000r/min离心5min后弃去上清液，并加入PBS溶液，将细胞吹打分散，将悬浮液加入离心管以1000r/min离心5min，吸出上清液，随后再加入PBS溶液吹打细胞，得到消化的目的细胞。
本发明消化法提取细胞流式检测组织内细胞凋亡率，为目前凋亡相关的实验研究提供了一种准确、定量及可靠的检测方法。发明人已在研究：miR-155在椎间盘退变机制中的作用研究，FasL在椎间盘免疫赦免中的作用机制研究中，采用此检测方法。检测结果与课题设计高度符合，结果精准可靠。
具体实施方式
1）目的组织的酶消化法收集细胞
将收集的组织在无菌条件下仔细分离，剪成1×1mm3碎块，于室温下以浓度为0.25%的胰蛋白酶消化40min，随后低速离心(1000r/min)5min，弃去上清液，于室温下用0.025%的Ⅱ型胶原酶静止消化4h，低速离心(1000r/min)5min后弃去上清液，并加入PBS溶液，将细胞吹打分散。将悬浮液加入离心管，1000r/min离心5分钟，吸出上清液，随后再加入PBS溶液吹打细胞，便得到消化的目的细胞。
2）Annexin V与PI双染与FCM检测
将已制备单细胞悬液(100μl单细胞悬液细胞密度约1×106个细胞)，使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，通过Annexin V抗体与磷脂丝氨酸（PS）的特异性结合来检测细胞凋亡的情况。
发明人分离培养不同状态下椎间盘髓核细胞，并进行体外培养。将培养的细胞进行流式细胞分析，可见不同退变程度下椎间盘髓核细胞有着不同的凋亡比例，检测结果较其他方法精确可靠，不同退变程度下椎间盘髓核细胞凋亡率的比较，反映出退变程度与髓核细胞凋亡比例的关系，退变程度越高，其细胞凋亡比例越高。
Claims (2)
1.一种采用消化法消化提取细胞流式检测组织内细胞凋亡率的方法，其特征在于：
1）目的组织的酶消化法收集细胞
将收集的组织在无菌条件下分离，剪成碎块，于室温下置于胰蛋白酶中消化后离心，弃去上清液，于室温下用Ⅱ型胶原酶静止消化后离心，弃去上清液，并加入PBS溶液，将细胞吹打分散后加入离心管，离心并吸出上清液，随后再加入PBS溶液吹打细胞，得到消化的目的细胞；
2）Annexin V与PI双染与FCM检测
将消化的目的细胞制成每100μl单细胞悬液细胞密度1×106个细胞的溶液，使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，通过Annexin V抗体与磷脂丝氨酸的特异性结合来检测细胞凋亡。
2.根据权利要求1所述的采用消化法消化提取细胞流式检测组织内细胞凋亡率的方法，其特征在于：所述步骤1）将收集的组织在无菌条件下分离，剪成1×1mm3碎块，于室温下以质量浓度为0.25%的胰蛋白酶消化40min，随后以1000r/min离心5min，弃去上清液，于室温下用质量浓度为0.025%的Ⅱ型胶原酶静止消化4h，以1000r/min离心5min后弃去上清液，并加入PBS溶液，将细胞吹打分散，将悬浮液加入离心管以1000r/min离心5min，吸出上清液，随后再加入PBS溶液吹打细胞，得到消化的目的细胞。
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