CN100509965C - 一种从杏仁皮中提取和纯化黑色素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从杏仁皮中提取和纯化黑色素的方法，该方法以杏仁皮为原料，采用碱性水溶液提取，酸水解杂质，反复有机溶剂洗涤和反复碱溶解后酸化使之沉淀进行纯化，冻结—解冻后去离子水反复洗涤除去Cl-，最后真空干燥得到杏仁皮黑色素成品。本发明制备的黑色素，氧化程度低，纯度高，和多数黑色素性质相同或相近，溶于碱性水溶液，不溶于水和常见的有机溶剂，pH小于3时完全沉淀，多酚定性反应为阳性，遇强氧化剂褪色，其元素含量为：C：59.9%～60.9%、H：4.87%～5.61%、N：2.05%～2.78%，在紫外—可见光区没有吸收峰，红外光谱中在3400cm-1附近和1650cm-1～1620cm-1各有一强的吸收带，电子自旋共振波谱为典型的单线一次微商波谱，无超精细结构，其特征参数g为2.0030～2.0040。
Description
技术领域
本发明涉及植物黑色素生产技术领域，具体地说是一种从植物材料中提取和纯化黑色素的方法。该黑色素可用于食品和化妆品工业、医药以及生物电子等领域。
背景技术
黑色素(Melanin)是一类普遍存在于生物界结构复杂多样的酚类或吲哚类生物大分子色素的总称[Butler MJ，Day AW.Fungal melanins：A review.Canadian Journal of Microbiology，1998，44(12)：1115-1136.]，它为生物体提供结构性强度或保护生物免受紫外线、电离辐射、重金属污染、低温和高温等环境胁迫的伤害[霍夫里特M，斯泰因比希尔A主编，郭圣荣主译，生物高分子黑色素，第一卷，木质素、腐殖质和煤.北京：化学工业出版社，2004：251-273.]。它不仅是一类光保护剂、抗辐射剂、螯合剂、生物抗氧化剂[Hung Y-C，Sava VM，Makan SY，et al..Antioxidant activityof melanins derived from tea：comparison between different oxidativestates.Food Chemistry，2002，78：223-240.]和免疫促进剂[Sava，VM，Galkin BN，Hong M-Y，et al..A novel melanin-l ike pigment derivedfrom black tea leaves with immuno-stimulating activity.Food ResearchInternational，2001，34(4)：337-343.]，而且还是一类生物半导体材料和光电传递材料[Guerra，Elidia M.Electrochromic and conductivityproperties：A comparative study between melanin-like/V205·nH20 andpolyaniline/V205·nH20hybrid materials.Journal of Non-CrystallineSolids，2000，273：193-197.]。近年来的研究还发现黑色素具有抗蛇毒[Hung，Y-C，Sava V，Hong M-Y，et al..Inhibitory effects onphosphol ipase A2 and antivenin activity of melanin extracted fromThea sinensis Linn..Life Sciences，2004，74(16)：2037-2047.]、抗癌[El-Obeid A，Al-Harbi S，Al-Jomah N，et al..Herbal melanin modulatestumor necrosis factor alpha(TNF-α)，interleukin 6(IL-6)andvascular endothelial growth factor(VEGF)production.Phytomedicine，2006，13(5)：324-333。]、抑制艾滋病毒复制[Kerestes JJR，Kerestes J，Venger，LA.Biologically active fraction of vegetable melanin，process for its production and its use.USA，6576268，2003.]、治疗帕金森症[Berliner，David L，Erwin，et al.Methods of treatingParkinson’s disease using melanin.USA，5210 076，1993。]等作用。因此，在医药、化妆品、食品、电子等方面有着广泛的应用前景。目前可以通过酪氨酸或其衍生物的氧化化学合成黑色素[Pawelek JM，Orlow SJ.Soluble melanin[P].USA，N5618519，1997.]，可以从动植物材料中提取[Kerestes JJR，Kerestes J，Venger，LA.Biologically activefraction of vegetable melanin，process for its production and its use.USA，6576268，2003；Golounin AV.The method of melanin preparation[P].Russian，N2083214，1997。]，也可以利用微生物合成黑色素[Oloke JK，Cl ick BR.A new，pigment-producing，strain of Bacillus thuringiensis.PCT WO 97/41235，1997；Robisheva ZN，Vinarov，Yu A，et al..The methodof microbiological preparation of melanin.Russian，N2186105，2000。]。目前茶叶黑色素已可以工厂化生产，近年来还从桂花种子、七叶树等一些植物材料中提取出了黑色素。与动物、微生物以及合成黑色素相比，植物黑色素安全性较高，应用范围更广，但植物材料中黑色素的含量一般很低，只有0.2％～0.3％，少数材料可达6％～8％[Kerestes JJR，Kerestes J，Venger，LA.Biologically active fraction of vegetable melanin，process forits production and its use.USA，6576268，2003.]，因此生产中仍缺乏黑色素含量高具有开发利用价值的原料。
杏仁在各国广泛应用于面包、糖果、饮料等的生产中，其种皮是杏仁深加工过程中产生的下脚料，据笔者初步测定，其种皮约占杏仁重量的5％。根据申请人的研究发现，杏仁皮中含有黑色素，以杏仁皮为原料提取黑色素可以变废为宝，提高杏仁深加工企业的经济效益。
根据申请人所作的资料检索，目前还没有发现从中提取黑色素的相关研究报告。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种从杏仁深加工过程中产生的下脚料——杏仁皮中提取和纯化黑色素的方法。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
一种从杏仁皮中提取和纯化黑色素的方法，其特征在于，该方法以杏仁皮为原料，采用碱性水溶液提取，盐酸水解杂质，有机溶剂反复洗涤和反复碱溶解后酸化使之沉淀进行纯化，冻结，解冻后去离子水反复洗涤除去Cl-，最后真空干燥得到杏仁皮黑色素成品。
该方法依次包括以下步骤：
碱溶液浸提步骤：取碱性水溶液与杏仁皮的体积/重量比为(10～20)：1，提取温度为35℃～75℃，在氮气保护下提取两次，每次提取12小时，合并提取液；
离心分离步骤：将所得提取液经双层纱布粗滤，离心分离，相对离心力15000g～20000g，离心时间15分钟～20分钟，得到离心上清液；
取离心上清液，加入稀盐酸使溶液pH值为pH1～pH2，静置2小时～24小时，使黑色素完全沉淀；沉淀后的溶液再经离心分离得黑色素粗提物，相对离心力3000g～5000g，离心时间10分钟～20分钟，；
水解步骤：将得到的黑色素粗提物用6mol/L～7mol/L盐酸水解，水解时间2小时～6小时，温度98℃～100℃；经离心分离后收集黑色素，相对离心力3000g～5000g，离心时间10分钟～20分钟；
洗涤步骤：将得到的黑色素依次用乙醇、乙酸乙酯和丙酮洗涤，每种溶剂洗涤3次，每次溶剂用量为黑色素体积的20倍～50倍；
溶解步骤：洗涤后的黑色素用碱溶液在氮气保护下超声辅助溶解，碱溶液用量为黑色素质量的50倍～100倍；溶解后的黑色素溶液经离心除去未溶解部分，其相对离心力为15000g～20000g，离心时间15分钟～20分钟；
酸化步骤：将离心后的黑色素溶液酸化使之沉淀，并反复沉淀至酸化后离心上清液无色，每次沉淀以碱溶液调节至pH9～11，离心，上清液稀盐酸调节pH1～pH2，静置1小时～2小时，离心，得黑色素沉淀物；
冻结、解冻步骤：将黑色素沉淀物放入冰箱中冻结，冻结后的黑色素在室温下融化解冻，离心收集黑色素颗粒；
洗涤除去Cl-步骤：以去离子水反复洗涤黑色素颗粒，除去其中Cl-，直至Cl-定性检测为阴性为止；
干燥步骤：采用真空干燥法进行干燥，干燥温度5℃～35℃，即得黑色素成品。
本发明的方法制备的黑色素，氧化程度低，纯度高，和多数黑色素性质相同或相近，溶于碱性水溶液，不溶于水和常见的有机溶剂，pH小于3时完全沉淀，多酚定性反应为阳性，遇强氧化剂褪色，其元素含量为：C：59.9％～60.9％、H：4.87％～5.61％、N：2.05％～2.78％，在紫外—可见光区没有吸收峰，红外光谱中在3400cm-1附近和1650cm-1～1620cm-1各有一强的吸收带，电子自旋共振波谱为典型的单线一次微商波谱，无超精细结构，其特征参数g为2.0030～2.0040。
附图说明
图1是本发明的黑色素制备路线图。
以下结合附图和发明人给出的实施例对本发明作进一步详细说明。
具体实施方式
参见附图，图1是本发明的黑色素制备路线图，本发明将杏仁深加工过程中产生的下脚料——杏仁皮充分利用，变废为宝，从中提取黑色素，具体的步骤是：
1.碱溶液浸提黑色素，碱溶液与杏仁皮比例为(10～20)：1(v/w)，提取温度为35～75℃，氮气保护，提取两次，每次提取12小时；
2.上一步骤所得提取液经双层纱布粗滤后，离心分离，相对离心力15000g～20000g，离心时间15分钟～20分钟；
3.离心上清液加入稀盐酸使溶液pH1～2，静置2小时～24小时，使黑色素完全沉淀；
4.离心分离得黑色素粗提物，相对离心力3000g～5000g，离心时间10分钟～20分钟；
5.黑色素粗提物用6mol/L～7mol/L盐酸水解，水解时间2小时～6小时，温度98～100℃；
6.离心收集水解后得黑色素，相对离心力3000g～5000g，离心时间10分钟～20分钟；
7.黑色素依次用乙醇、乙酸乙酯和丙酮洗涤，每种溶剂洗涤3次，每次溶剂用量为黑色素的20倍～50倍(v/v)；
8.黑色素用碱溶液在氮气保护下超声辅助溶解，碱溶液用量为黑色素的50倍～100倍(v/v)；
9.离心除去未溶解部分，相对离心力15000g～20000g，离心时间15分钟～20分钟；
10.黑色素溶液酸化使之沉淀，并反复沉淀至酸化后离心上清液无色，每次沉淀包括碱溶液调节pH9～11，离心，上清液稀盐酸调节pH1～2，静置1小时～2小时，离心；
11.黑色素沉淀放入冰箱中冻结；
12.冻结后的黑色素在室温下融化；
13.离心收集黑色素颗粒，反复去离子水洗涤至Cl-定性检测为阴性；
14.真空干燥，干燥温度5℃～35℃，即得黑色素成品。
上述方法中的碱溶液为0.1mol/L～2.0mol/L NaOH或KOH。
以下是发明人给出的实施例，需要说明的是，这些实施例仅仅用于理解本发明，并不是对本发明的限定。
实施例1：以山杏种皮为原料提取黑色素的工艺
称取5.0g山杏种皮，放入150ml锥形瓶中，加入75ml0.5mol/L NaOH水溶液，用玻璃棒搅拌使山杏种皮充分浸没在溶液中并排除溶液中的气体，通入氮气10分钟后瓶口用充有氮气的气球密封。三角瓶放入60℃水浴中反应12小时后取出，自来水冷却后用双层纱布粗虑，滤液15000g离心15分钟，上清液加入100ml去离子水混匀，以2mol/L盐酸调节pH至1～2，置4℃冰箱保存，虑渣再加入75ml 0.5mol/L NaOH水溶液，氮气保护下继续提取12小时，然后冷却、粗虑、虑渣用100ml去离子水冲洗压虑，合并滤液并离心，上清液以2mol/L盐酸调节pH至1～2，室温沉淀2小时后将两次的提取物混合，5000g离心10分钟，所得沉淀为山杏种皮黑色素粗提物。
将离心管中的黑色素粗提物用50ml的6mol/L～7mol/L HCl溶液100℃水解2小时～6小时，冷却后5000g离心10分钟，黑色素颗粒再依次用乙醇、乙酸乙酯、丙酮反复洗涤，具体做法是：将黑色素与约50ml的溶剂混合振荡30分钟，然后离心分离，每种溶剂重复洗涤3次。固体颗粒用0.5mol/L NaOH水溶液在氮气保护下超声辅助溶解30分钟，15000g离心15分钟。上清液用2mol/L HCl溶液调至pH1～2，使之沉淀，5000g离心15分钟，如此反复溶解和沉淀数次，直至上清液无色。得到的黑色素凝胶状沉淀放入-5℃的冰箱中1小时，使之冻结，然后室温下解冻，得到的颗粒状山杏种皮黑色素用蒸馏水洗涤沉淀至离心上清液Cl-定性检测为阴性。最后真空干燥至恒重。得山杏种皮黑色素237mg，得率为4.73％。在该工艺条件下提取得到的山杏种皮黑色素总多酚含量较高，约为262GAE mg/g，不溶于水和常见的有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚等，也不溶于植物油，在1mol/L NaOH溶液中完全溶解，pH小于3时完全沉淀，易被KMnO4、NaCl0、H2O2、K2Cr2O7等强氧化剂漂白，多酚定性反应为阳性，如加入FeCl3后发生沉淀，遇FeSO4/K3Fe(CN)6产生蓝色。其元素含量为：C 59.94％、H 5.50％、N 2.18％。紫外光谱是一条随波长增大而吸光度减小的曲线，在紫外区和可见光短波区很宽的波长范围内有较强的吸收，在整个扫描范围内没有明显的吸收峰，将吸光度取对数对波长回归作图可得到一条斜率为负值的直线，其斜率为-0.0039。红外光谱在3400cm-1附近存在强而宽的共振吸收带，是由OH和NH2的伸缩振动产生的，在1650cm-1～1620cm-1有一强的吸收带，是由芳香C＝C、酰胺I中的C＝O和(或)COO-的振动引起的。电子自旋共振波谱为典型的单线一次微商波谱，无超精细结构，其特征参数g为2.0032。
Claims (3)
1.一种从杏仁皮中提取和纯化黑色素的方法，其特征在于，具体包括下列步骤：
碱溶液浸提步骤：取碱性水溶液与杏仁皮的体积/重量比为(10～20)：1，提取温度为35～75℃，在氮气保护下提取两次，每次提取12小时，合并提取液；
离心分离步骤：将所得提取液经双层纱布粗滤，离心分离，相对离心力15000g～20000g，离心时间15分钟～20分钟，得到离心上清液；
取离心上清液，加入稀盐酸使溶液pH值为pH1～pH2，静置2小时～24小时，使黑色素完全沉淀；沉淀后的溶液再经离心分离得黑色素粗提物，相对离心力3000g～5000g，离心时间10分钟～20分钟，；
水解步骤：将得到的黑色素粗提物用6mol/L～7mol/L盐酸水解，水解时间2小时～6小时，温度98～100℃；经离心分离后收集黑色素，相对离心力3000g～5000g，离心时间10分钟～20分钟；
洗涤步骤：将得到的黑色素依次用乙醇、乙酸乙酯和丙酮洗涤，每种溶剂洗涤3次，每次溶剂用量为黑色素体积的20倍～50倍；
溶解步骤：洗涤后的黑色素用碱溶液在氮气保护下超声辅助溶解，碱溶液用量为黑色素体积的50倍～100倍；溶解后的黑色素溶液经离心除去未溶解部分，其相对离心力为15000g～20000g，离心时间15分钟～20分钟；
酸化步骤：将离心后的黑色素溶液酸化使之沉淀，并反复沉淀至酸化后离心上清液无色，每次沉淀以碱溶液调节至pH9～pH11，离心，上清液稀盐酸调节pH1～pH2，静置1小时～2小时，离心，得黑色素沉淀物；
冻结、解冻步骤：将黑色素沉淀物放入冰箱中冻结，冻结后的黑色素在室温下融化解冻，离心收集黑色素颗粒；
洗涤除去Cl-步骤：以去离子水反复洗涤黑色素颗粒，除去其中Cl-，直至Cl-定性检测为阴性为止；
干燥步骤：采用真空干燥法进行干燥，干燥温度5℃～35℃，即得黑色素成品。
2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的碱性水溶液为0.1mol/L～2.0mol/L NaOH或KOH。
3、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Cl-定性检测为去离子水洗涤至离心上清液与Ag+反应为阴性。
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