CN100467473C - 用冰城链霉菌制备化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的是一种用冰城链霉菌制备的新化合物-α型米尔贝霉素及其制备方法。它是从冰城链霉菌中分离的三种新化合物,其制备方法包括种子培养和液体发酵,发酵液经过滤后,用甲醇提取,EtOAc萃取,浓缩后硅胶柱层析,RP-18柱层析可得化合物。本发明的新化合物具有强的杀螨活性,同样可用以控制其他会危害植物的昆虫。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种化合物,具体地说是一种α系列米尔贝霉素。本发明还涉及这种化合物的制备方法。
背景技术
目前,国内外应用广泛的大环内酯类农用抗生素阿维菌素属双糖类化合物,国内年产量的50%用于出口。阿维菌素含avermectin Bla≥80%和avermectinBlb≤20%,对植食性螨类有特效,由美国Merck公司开发并生产,具有触杀和胃毒作用,有很弱的内吸性。能防治桔缘螨、普通红叶螨、榆全爪螨和棉红蜘蛛等害螨,主要用于防治棉花、柑桔、坚果、蔬菜、土豆、观赏植物等作物上的害螨,对天敌安全,对能动期的害螨都有活性,但其对胚胎未发育的初产卵无毒杀作用,只对胚胎已发育的后期卵有较强杀卵活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种对螨虫和其他损害植物的昆虫具有很高的抑制活性的用冰城链霉菌制备的新化合物-α型米尔贝霉素。
本发明的另一个目的是提供冰城链霉菌制备的新化合物-α型米尔贝霉素的制备方法。
本发明的化合物的结构式为:
其具体组合结构可以为:
本发明的产品是采用这样的方法来制备的:
(1)发酵菌株:发酵菌种的分类命名为冰城链霉菌(Streptomyces bingchengsis sp.nov),于2006年06月12日保藏于“中国生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”,其保藏登记号为:CGMCC NO.1734。并在NCBI登陆16S rDNA序列,序列号为DQ449953。
(2)斜面培养:将0.4%的蔗糖,0.2%的酵母粉,0.5%的麦芽提取物,0.1%的脱脂奶粉,溶于水中,用1M NaOH调pH至7.0,加2.0%的琼脂,再调pH至7.2后121℃灭菌30min,28℃培养7-8天,用1ml无菌水将斜面的冰城链霉菌孢子洗下并制成孢子悬浮液。
(3)种子培养:培养基(蔗糖1%;蛋白冻0.4%;K2HPO4 0.05%。用250ml的三角瓶每瓶分装25ml,将1ml孢子悬浮液加入25ml种子培养基中,置于摇床上28℃,250rpm培养42h然后将培养基(蔗糖8%;大豆饼粉1%;酵母粉0.2%;牛肉膏0.1%;CaCO3 0.3%;K2HPO4 03%,MgSO4·7H2O 0.1%,FeSO4·7H2O 0.005%;调节pH至7.2)每100ml分装于1L三角瓶,121℃灭菌30min,接种8ml含孢子悬浮液的种子培养基,至于摇床28℃,250rpm培养8天。
(4)发酵液处理:50L发酵液经200目筛网过滤,并且用水清洗发酵液,发酵液和清洗用的水全都弃掉,用30L甲醇浸提过滤后得到的滤渣,通过减压蒸馏的方法最后将甲醇溶液浓缩到大约2L,再将浓缩液用相同体积的EtOAc浸提3次,将得到的EtOAc相,减压蒸馏会产生25g油状物质。将所得油状物上硅胶柱(粒径200~300目)进行层析,分别用石油醚:丙酮(95:5—50:50)洗脱,蒸馏得到不含A3和A4的粗制品10g。将粗制品分别用石油醚:丙酮(9:1-3:1)两种洗脱液进行洗脱,得到了五个组分,将组分四上RP-C18硅胶柱进行层析,用甲醇:水=70:30-85:15二种洗脱液进行洗脱,会得到化合物1(20mg)和化合物2(11mg)。将组分三上RP—C18硅胶柱进行层析,用甲醇:水(70:30—95:5)洗脱得到化合物3(22mg)。本发明的化合物具有强的杀螨活性,能杀灭,例如寄生在果树、蔬菜和花上的四爪螨属、全爪螨属和锈螨属的成螨和卵。它们对于寄生于动物身上的硬蜱科、皮刺螨科和疥螨科也有活性。它们还能杀灭:外寄生物,如寄生于动物和鸟,尤其是家畜和家禽身上的狂蝇属、绿蝇属、皮蝇属、胃蝇属,虱和蚤;家庭昆虫,如蟑螂和家蝇;以及农业和园艺地里的各种有害昆虫,如蚜虫和鳞翅目幼虫。它们也能有效杀灭土壤中的蝼属。它们也能有效杀灭以下种类的昆虫:鞘翅目,同翅目,异翅目,双翅目,缨翅目,直翅目,虱目,蚤目,食毛目,缨尾目,等翅目,膜翅目等。
本发明的化合物同样可用以控制其他会损害植物的昆虫,尤其通过吃植物而使之损害的昆虫。这些化合物可用以保护观赏植物和生产性植物,尤其棉花(如杀灭烟芽夜蛾),以及蔬菜作物(如杀灭马铃薯甲虫和桃蚜)和水稻作物(如杀灭二化螟和稻虱)。
本发明的新化合物不但具有很好的杀死成虫的效果,对虫卵药效也很高,因此,更具开发潜力。
附图说明
图1米尔贝α23的inv4gplrndqf谱图;
图2米尔贝α23的cosygpqf谱图;
图3米尔贝α23的inv4gplrndqf谱图;
图4米尔贝α23的invietgp谱图;
图5米尔贝α23的ms谱图;
图6米尔贝α23的zgdc谱图;
图7米尔贝α24的noesyph谱图;
图8米尔贝α24的invietgp谱图;
图9米尔贝α24的cosygpqf谱图;
图10米尔贝α24的zgdc谱图;
图11米尔贝α24的zgdc谱图米尔贝α24的zg30谱图;
图12米尔贝α24的ms谱图;
图13米尔贝α24的inv4gplrndqf谱图;
图14米尔贝α25的noesyph谱图;
图15米尔贝α25的inv4gplrndqf谱图;
图16米尔贝α25的invietgp谱图;
图17米尔贝α25的zgdc谱图;
图18米尔贝α25的zg30谱图。
具体实施方式
下面结合实施例,对本发明作详细说明。
实施例1:化合物制备
1.发酵
(1)发酵菌株:发酵菌种的分类命名为冰城链霉菌(Streptomyces bingchengsis sp.nov),于2006年06月12日保藏于“中国生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”,其保藏登记号为:CGMCC NO.1734。并在NCBI登陆16S rDNA序列,序列号为DQ449953
(2)斜面培养:将0.4%的蔗糖,0.2%的酵母粉,0.5%的麦芽提取物,0.1%和脱脂奶粉,溶于水中,用1mol NaOH调pH至7.0,加2.0%的琼脂,再调pH至7.2后121℃灭菌30min,28℃培养7-8天,用1ml无菌水将斜面的冰城链霉菌孢子洗下并制成孢子悬浮液。
(3)种子培养:培养基(蔗糖1%;蛋白冻0.4%;K2HPO4 0.05%。用250ml的三角瓶每瓶分装25ml,将1ml孢子悬浮液加入25ml种子培养基中,置于摇床上28℃,250rpm培养42h然后将培养基(蔗糖8%;大豆饼粉1%;酵母粉0.2%;牛肉膏0.1%;CaCO3 0.3%;K2HPO4 03%,MgSO4·7H2O 0.1%,FeSO4·7H2O 0.005%;调节pH至7.2)每100ml分装于1L三角瓶,121℃灭菌30min,接种8ml含孢子悬浮液的种子培养基,至于摇床28℃,250rpm培养8天。
(4)发酵液处理:50L发酵液经200目筛网过滤,并且用水清洗发酵液,发酵液和清洗用的水全都弃掉,用30升甲醇浸提过滤后得到的滤渣,通过减压蒸馏的方法最后将甲醇溶液浓缩到大约2升,再将浓缩液用相同体积的EtOAc浸提3次,将得到的EtOAc相,减压蒸馏会产生25g油状物质。将所得油状物上硅胶柱(粒径200~300目)进行层析,分别用石油醚:丙酮(95:5—50:50)洗脱,蒸馏得到不含A3和A4的粗制品10g。将粗制品分别用石油醚:丙酮(9:1-3:1)两种洗脱液进行洗脱,得到了五个组分,将组分四上RP-C18硅胶柱进行层析,用甲醇:水=70:30-85:15二种洗脱液进行洗脱,会得到化合物1(20mg)和化合物2(11mg)。将组分三上RP—C18硅胶柱进行层析,用甲醇:水(70:30—95:5)洗脱得到化合物3 22mg。
2 结构鉴定
米尔贝α23(1)分子式:C41H55NO12;
物态:白色粉末;
元素分析:C 65.34% H 7.30% 0 25.50%
[α]20 D-12°(c 0.65,CHCl3);V(MeOH)λmaxnm(log ε):246(3.32);R(KBr),vmax cm-1:3425(OH),2926,1716,1649,592,1458,1415,1377,1261,1034,802,756,665;1H NMR(CDCl3,400MHz)and13C-NMR(CDCl3,100MHz)数据参看表1;ESIMS m/z 771[M+NH4]+;HRESIMS m/z 771.2303[(M+NH4)+,calcd for C41H59N2O12,771.2273]。
米尔贝α24(2)分子式:C43H59NO12;
物态:白色粉末;
元素分析:C 66.07% H 7.55% O 24.58%
[α]20 D-12°(c 0.65,CHCl3);UV(MeOH)λmaxnm(log ε):246(3.32);IR(KBr),vmaxcm-1:3425(OH),2926,1716,1649,1592,1458,1415,1377,1261,1034,802,756,665;1H NMR(CDCl3,400MHz)and13C-NMR(CDCl3,100MHz)数据参看表1;ESIMS m/z 799[M+NH4]+;HRESIMS m/z 799.2303[(M+NH4)+,calcd for C43H63N2O12,799.2273]。
米尔贝α25(3)分子式:C37H54O10;
物态:白色粉末;
元素分析:C 71.84% H 8.74% O 19.42%
[α]20 D-12°(c 0.65,CHCl3);UV(MeOH)λmaxnm(logε):246(3.32);IR(KBr),vmaxcm-1:3425(OH),2926,1716,1649,1592,1458,1415,1377,1261,1034,802,756,665;1H NMR(CDCl3,400MHz)and13C-NMR(CDCl3,100MHz)数据参看表1;ESIMS m/z 657[M-H]+;HRESIMS m/z 657.2303[(M-H)+,calcd for C37H53O10,657.2273]。
表1:米尔贝α23(1),α24(2),α25(3)1H-和13C NMR的数据(括号中为耦合常数)
3.抗虫活性测定方法
(1)抗成虫螨类的活性
将供试化合物的0.1%甲醇溶液用含有0.01%去污剂的水稀释10倍以制成100μg/ml的溶液。再配制成不同浓度的试验用液,分别为100μg/ml,50μg/ml,30μg/ml,10μg/ml。
实验将对有机磷类杀虫剂敏感的二斑叶螨感染菜豆植株主叶片,一天以后,将感染二斑叶螨的叶片浸入到配置好的试验溶液1-2s。在25℃让植株生长三天,用显微镜观察计算螨类死亡率。
(2)抗螨类虫卵的活性
将供验化合物溶液分别配成100μg/ml,50μg/ml,30μg/ml,10μg/ml,用雌性二斑叶螨感染菜豆主叶片。观察叶片上大概有40颗卵后再将成虫移开。将感染二斑叶螨的叶片浸入到配置好的试验溶液1-2s。在25℃让植株生长十天,计算未长成成虫的比率,即其死亡率。
(3)抗线虫活性
将供试化合物的0.1%甲醇溶液用含有0.01%去污剂的水稀释10倍以制成100μg/ml的溶液。再配制成不同浓度的试验用液,分别为100μg/ml,50μg/ml,30μg/ml,10μg/ml。
将配好的溶液加入1ml含有活线虫的水悬液中,混合后25℃,放置15小时,线虫不再活动,用立体显微镜观察。线虫不活动的比率,即其死亡率。
4.活性测定结果
三种新的化合物米尔贝α23,α24和α25,具有强大的杀灭螨虫和线虫的活性,见表2、3。实验证明,这些新化合物比以往所知的米尔贝菌素活性更强。一般来说,α型米尔贝霉素比β型活性强。但是,更高活性的半成品仍在不断的研究中。
表2.米尔贝新化合物杀灭二斑叶螨成虫和虫卵的活性
表3.米尔贝新化合物杀灭线虫的活性
*米尔贝A3andA4混合(30:70)
Claims (1)
1、一种用冰城链霉菌制备化合物的方法,其特征是:
(1)发酵菌株:发酵菌种为冰城链霉菌;
(2)斜面培养:将0.4%的蔗糖,0.2%的酵母粉,0.5%的麦芽提取物,0.1%的脱脂奶粉,溶于水中,用1M NaOH调pH至7.0,加2.0%的琼脂,再调pH至7.2后121℃灭菌30min,28℃培养7-8天,用1ml无菌水将斜面的冰城链霉菌孢子洗下并制成孢子悬浮液;
(3)种子培养:培养基组成为蔗糖1%、蛋白冻0.4%、K2HPO4 0.05%,用250ml的三角瓶每瓶分装25ml,将1ml孢子悬浮液加入25ml种子培养基中,置于摇床上28℃,250rpm培养42h;然后将重量比组成为蔗糖8%、大豆饼粉 1%、酵母粉 0.2%、牛肉膏 0.1%、CaCO3 0.3%、K2HPO4 0.3%,MgSO4·7H2O 0.1%和FeSO4·7H2O 0.005%的培养基,调节pH至7.2,每100ml分装于1L三角瓶,121℃灭菌30min,接种8ml含孢子悬浮液的种子培养基,至于摇床28℃,250rpm培养8天;
(4)发酵液处理:50L发酵液经200目筛网过滤,并且用水清洗发酵液,发酵液和清洗用的水全都弃掉,用30L甲醇浸提过滤后得到的滤渣,通过减压蒸馏的方法最后将甲醇溶液浓缩到2L,再将浓缩液用相同体积的EtOAc浸提3次,将得到的EtOAc相,减压蒸馏会产生25g油状物质;将所得油状物上硅胶柱进行层析,分别用石油醚:丙酮的95:5—50:50的混合物洗脱,蒸馏得到不含米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4的粗制品10g;将粗制品分别用石油醚:丙酮的9:1-3:1的混合物洗脱液进行洗脱,得到了五个组分,将组分四上RP-C18硅胶柱进行层析,用甲醇:水=70:30-85:15洗脱液进行洗脱,会得到20mg化合物1和11mg化合物2;将组分三上RP—C18硅胶柱进行层析,用甲醇:水的70:30—95:5的混合物洗脱得到22mg化合物3;所述的化合物1、化合物2、化合物3的结构式:
化合物1
化合物2
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