CN100462717C - 细胞外电位测定装置及其制造方法 - Google Patents

Abstract

细胞外电位测定装置具有拥有第一表面和第一表面相反一侧的第二表面的膜片，和在膜片的第二表面上设置的电极。在膜片上形成具有在第一表面上开口的开口部的凹部，和从凹部贯通至膜片的第二表面的通孔。通孔从比凹部的最深处更靠近凹部的开口部的位置贯通至膜片的第二表面。膜片的第二表面上，电极被设置在通孔的开口部周围。在该装置中，由于即使被验体细胞没有到达凹部内最深处，被验体细胞的细胞膜也可以与通孔确实地无间隙贴紧，所以，可遮断通孔内的培养液和膜片上面一侧的培养液，并且可以通过检测电极，有效地检测细胞活动时产生的电气化学变化。

Description

细胞外电位测定装置及其制造方法

技术领域

本明涉及一种为了测定细胞外电位或在细胞的活动中产生的物理化学变化而使用的细胞外电位测定装置及其制造方法，例如，用于通过化学物质检测细胞产生的反应的药品的鉴别。

背景技术

目前，开发新的药品时，以细胞的电气活动为指标，通过膜片钳定法(patch-clamp)，使用荧光色素或发光指示剂的方法进行候补药品的鉴别。

在该膜片钳定法中，使用微小电极测头(micropipette)，以电气方法记录通过附着在微型吸管前端部分上的、称为细胞膜的碎片的微小部分上的单一通道蛋白质分子的离子的输送。这种方法为可以实时研究一个蛋白质分子的功能的少数方法中的一种(例如《MolecularBiology of the Cell Third Edition》，Garland Publishing Inc.，New York，1994，Bruce Alberts，日语版《细胞分子生物学》第三版，181～182页，1995年，教育社)。

此外，通过根据特定的离子浓度的变化发光的荧光色素或发光指示剂，通过监视细胞内的离子移动，可以测定细胞的电气活动。

但是，由于膜片钳定法在制造和操作微型吸管时需要特殊的技术，并在测定一个试料中需要很多时间，所以在对于高速鉴别大量药品的候补化合物不适合。另外，使用荧光色素的方法，虽然可以高速鉴别大量的药品候补化合物，但需要染色细胞的工序，并且在测定时，由于色素的影响，背景也会变色，并且在之后的同时脱色，因此S/N比不好。

WO 02/055653号公报说明了通过具有细胞保持装置的基板及设在保持装置上的电极，测定细胞外电位的目前的装置。使用该装置，可以得到与由膜片钳定法得到的数据相同的高品质的数据，而且还可以使用荧光色素，高速简单地测定大量的试剂。

现使用附图，详细说明这种目前的细胞外电位测定装置的动作。

图45为目前的细胞外电位测定装置49的截面图。在凹坑40内加入培养液48A，并通过设在基板42上的细胞保持部分捕捉保持被验体细胞47。细胞保持部分由在基板42上形成的凹部41和通过开口部44A连通凹部41的通孔44构成。在通孔44中配置作为传感器的一部分的测定电极45，测定电极45经过线路输出在通孔44内的培养液48B的电位。

在测定时，被验体细胞47被从通孔44通过吸引泵贴紧保持在凹部41的开口部41A上。由此，通过被验体细胞47的活动产生的电气信号49A不会漏入凹坑40内的培养液48A中，并被安装在通孔44的测定电极45检测出来。

在目前的细胞外电位测定装置49中，通孔44在凹部41的最深处形成。所以，即使在被验体细胞47被保持在凹部41中的情况下，当细胞膜贴紧凹部41的中间部分时，通孔44内的培养液48B与凹坑40的培养液48A电气上导通，也不能进行精度高的测定。

另外，不可能研究被验体细胞47是否保持在凹部41中，还以覆盖通孔44的方式细胞膜贴紧着。

保持被验体细胞47的凹部41的直径为10～30μm，在通孔44的基板42上开口的开口部44B的直径为1～5μm，且在基板42的两面分别形成2种直径的开口41A、44B。为了正确形成该形状，需要二种掩膜(mask)。在用第一掩膜进行光刻的脱水腐蚀而形成凹部41后，进行用第二掩膜的脱水腐蚀，进而形成通孔44。

在用第一掩膜进行脱水腐蚀后，并在使用第一掩膜进行脱水腐蚀时，二个掩膜的对准产生偏差。另外，由于使用两个掩膜分别进行脱水腐蚀，因此，目前的装置49制造费事并导致成本升高。

此外，在目前的装置49中，由于将被验体细胞47保持在凹部41内，需要从凹坑40对培养液48A加压或对通孔44的培养液48B减压中的至少一种。与此同时，与测定有45接触。通过使该上下的压力差成为适当的值，培养液48B在通孔44的开口44B处。形成新月形形状而稳定。

图45所示的直线的开口44B的形状，能够形成培养液48B的新月形形状的适当的压力差值为狭小的范围。换言之，当压力差稍微与优选值不一致时，新月形形状被破坏，从而不能使培养液48B的容量为一定。

发明内容

细胞外电位测定装置具备拥有第一表面和第一表面相对一侧的第二表面的膜片和设在膜化的第二表面上的电极。在膜片上形成具有在第一表面上开口的开口部的凹部和从凹部贯通至膜片的第二表面贯通的通孔。通孔从靠近凹部最深处的凹部开口部的位置贯通至膜片的第二表面。电极设在膜片的第二表面上的通孔的开口部周围。

在该装置中，即使被验体细胞不会到达凹部内最深处，被验体细胞的细胞膜2也可以更可靠地无间隙地与通孔贴紧，因此，可隔开通孔内的培养液和膜片上面的培养液，并可以通过检测电极有效地检测细胞活动时产生的电气化学变化。

附图说明

图1为本发明的实施方式1的细胞外电位测定装置的立体图；

图2为实施方式1的细胞外电位测定装置的平面图；

图3为实施方式1的细胞外电位测定装置的截面图；

图4为实施方式1的细胞外电位测定装置的主要部分放大图；

图5为实施方式1的细胞外电位测定装置的主要部分放大图；

图6为用于对实施方式1的细胞外电位测定装置的动作进行说明的主要部分放大的截面图。

图7为实施方式1的细胞外电位测定装置的主要部分放大的截面图；

图8为实施方式1的细胞外电位测定装置的主要部分放大的截面图；

图9A为实施方式1的细胞外电位测定装置的主要部分放大的截面图；

图9B为实施方式1的细胞外电位测定装置的主要部分放大的截面图；

图10为实施方式1的细胞外电位测定装置的截面图；

图11为实施方式1的细胞外电位测定装置的主要部分放大图；

图12为用于对实施方式1的细胞外电位测定装置的制造方法进行表示的截面图；

图13为用于对实施方式1的细胞外电位测定装置的制造方法进行表示的截面图；

图14为用于对实施方式1的细胞外电位测定装置的制造方法进行表示的截面图；

图15为用于对实施方式1的细胞外电位测定装置的制造方法进行表示的截面图；

图16A为用于对实施方式1的细胞外电位测定装置的制造方法进行表示的截面图；

图16B为用于对实施方式1的细胞外电位测定装置的制造方法进行表示的截面图；

图16C为用于对实施方式1的细胞外电位测定装置的制造方法进行表示的截面图；

图16D为用于对实施方式1的细胞外电位测定装置的制造方法进行表示的截面图；

图17为用于对实施方式1的细胞外电位测定装置的制造方法进行表示的截面图；

图18为用于对实施方式1的细胞外电位测定装置的制造方法进行表示的截面图；

图19为用于对实施方式1的细胞外电位测定装置的制造方法进行表示的截面图；

图20为实施方式1的另外一种细胞外电位测定装置的截面图；

图21为实施方式1的另外一种细胞外电位测定装置的截面图；

图22为图21所示的细胞外电位测定装置的立体图；

图23为图21所示的细胞外电位测定装置的立体图；

图24为实施方式1的另外一种细胞外电位测定装置的截面图；

图25为本发明的实施方式2的细胞外电位测定装置的立体图；

图26为本发明的实施方式2的细胞外电位测定装置的截面图；

图27为本发明的实施方式2的细胞外电位测定装置的主要部分放大图；

图28A为用于对实施方式2的细胞外电位测定装置的动作进行说明的主要部分放大截面图；

图28B为用于对实施方式2的细胞外电位测定装置的动作进行说明的主要部分放大截面图；

图29为用于对实施方式2的细胞外电位测定装置的制造方法进行标示的截面图；

图30为用于对实施方式2的细胞外电位测定装置的制造方法进行标示的截面图；

图31为用于对实施方式2的细胞外电位测定装置的制造方法进行标示的截面图；

图32为用于对实施方式2的细胞外电位测定装置的制造方法进行标示的截面图；

图33A为用于对实施方式2的细胞外电位测定装置的制造方法进行标示的截面图；

图33B为用于对实施方式2的细胞外电位测定装置的制造方法进行标示的截面图；

图34为用于对实施方式2的细胞外电位测定装置的制造方法进行标示的截面图；

图35为本发明的实施方式2的另外一种细胞外电位测定装置的截面图；

图36为图35所示的细胞外电位测定装置的主要部分的放大截面图；

图37A为用于对图35所示的细胞外电位测定装置的制造方法进行说明的截面图；

图37B为用于对图35所示的细胞外电位测定装置的制造方法进行说明的截面图；

图38为用于对图35所示的细胞外电位测定装置的制造方法进行说明的截面图；

图39为用于对图35所示的细胞外电位测定装置的制造方法进行说明的截面图；

图40为用于对图35所示的细胞外电位测定装置的制造方法进行说明的截面图；

图41为实施方式2的另外一种细胞外电位测定装置的立体图；

图42为图41所示的细胞外电位测定装置的立体图；

图43为实施方式2的另外一种细胞外电位测定装置的截面图；

图44为实施方式2的另外一种细胞外电位测定装置的截面图；

图45为目前的细胞外电位测定装置的截面图；

具体实施方式

(实施方式1)

图1为本发明的实施方式1的细胞外电位测定装置51的立体图。图2为装置51的平面图。图3为图2的线3—3上的装置51的截面图。图5为装置51的主要部分的放大图。图12～图21为用于对装置51的制造工序进行说明的截面图。图22、图23为实施方式1的另外一种细胞外电位测定装置的立体图。

在图1～图3中，在硅基板1上形成凹部1A，以基板1的一部分形成膜片2，膜片2由基板1的凸部1C支承。膜片2的材质为与基板1相同的硅，且厚度约为25μm。凹部3以半球形的曲面形成，在基板1的表面上开口的开口部3A的直径约为20μm。在贯通膜片2的长度方向上，截面形状均匀的通孔4与凹部3连通。如图3所示，通孔4设置在距开口部3A比凹部3的最深处3B近的位置，并相对于膜片2的厚度方向2A倾斜约45°。通孔4的截面为直径约为5μm圆形或长轴约为5μm的椭圆形。

如图5所示，在表面2B上接近通孔4的开口部形成有数个检测电极5a、5b。

以下，说明细胞外电位测定装置51的动作。图6～图9A为用于对说明装置51的动作进行说明的主要部分放大的截面图。

首先，说明检测培养液的物理化学变化的顺序。图6、图7为膜片2上的凹部3、通孔4、检测电极5a、5b的放大截面图。如图7所示，当用电解质培养液6充满膜片2的上面2C上时，凹部3和通孔4依次被培养液6充满。当将膜片2的上面2A的上方空间6加压或将膜片2的下表面2B的下方空间减压时，培养液6从通孔4向外飞出。这时，如果使加压或减压的压力为适当的值，则在通孔4的前端，从开口部培养液6形成新月形形状而稳定。

由此，培养液6与检测电极5a及5b稳定地接触。如图5所示，检测电极5a和5b被相互电气绝缘。可是，通过形成来自通孔4的新月形形状，培养液6与检测电极5a、5b接触，并通过作为电解质的培养液6，电极5a、5b被电气连接。

检测电极5a、5b间的电阻值与培养液6的离子浓度有关。所以，通过检测电极5a、5b之间的电阻值的变化，可以检测培养液6的离子浓度的变化。此外，如果培养液6的新月形形状不完全，则检测电极5a、5b不会很好连接，它们间的电阻值增大。所以，如果测定该电阻值，可以知道在通孔4中，培养液6是否形成适当的新月形形状。

其次，说明测定被验体细胞的细胞外电位或细胞产生的物理化学变化的顺序。

如图8所示，如果将被验体细胞8与培养液6一起投入，并加压膜片2的表面2C上方的空间或减压膜片2的表面2B的下方空间，则被验体细胞8被与培养液6一起拉入凹部3内。此外，如图9A所示，被验体细胞8被拉入通孔4，且被验体细胞8的细胞膜被以塞住在通孔4的凹部3上开口的开口部4A的方式吸着。通孔4的开口部4A形成在距开口部3A比距凹部3的最深处3B近的位置上。因此，如图9A所示，在被验体细胞8比凹部3的开口部3A的直径大一些的情况下，在靠近最深处3B处，形成间隙3C，而且被验体细胞8有一些变形。可是，即使在这种情况下，被验体细8可以塞住通孔4的开口部4A。总之，被验体细胞8可以更可靠地保持在凹部3内。由于凹部3被以曲面构成，所以可有效地保持被验体细胞8。

在被验体细胞8保持在凹部3内后，边测定检测电极5a、5b之间的电阻值边适当调整膜片2的上下压力，以便培养液6在通孔4的开口4B处形成适当的新月形形状。

在被验体细胞8被以塞住通孔4的开口部4A的方式保持在凹部3后，对被验体的细胞8进行刺激。作为这种刺激，除了化学药品、毒物等的化学刺激外，还有机械的位移、光、电、电磁等的物理刺激。在被验体细胞8对这些刺激活泼地反应的情况下，被验体细胞8通过具有细胞膜的离子通道，放出或吸收各种离子。在被验体细胞8与培养液6接触的地方产生这种反应，并在通孔4内的培养液6和被验体细胞8之间进行离子交换。结果，通孔4内的培养液6的离子浓度变化，并如上所述地使用检测电极5a、5b之间的电阻值检测离子浓度的变化。

另外，虽然如上所述形成二个检测电极5a、5b的电极，但即使是一个检测电极也可以测定。如图4所示，在膜片2的凹部1A的表面2B上，接近通孔4的开口形成以金为主体的检测电极5，代替图5所示的电极5a、5b。如图9B所示，通过测定与充满膜片的上表面2C的上方的培养液6同电位的参照电极5c和检测电极5之间的电压，可以测定通孔4内的离子浓度，并测定被验体细胞8的细胞外电位或细胞8产生的物理和化学变化。

另外，不仅可以用电阻值，还可以测定电流值、电荷量、电位等的别的物理量，进而来测定离子浓度的变化。

图10为实施方式1的另外一种细胞外电位测定装置52的截面图。在图3所示的装置51中，通孔4在距凹部3的最深处3B比开口3A远的位置而形成，并相对于膜片2的厚度方向2A倾斜45°的角度。在实施方式1中，在图10所示的装置52中，将以离凹部3至膜片2的下表面2B设置通孔10a、10b。如图11所示，在通孔10a、10b中，分别设置以金为主体的检测电极11a、11b。在装置52中，由于通孔10a、10b是分开而形成的，因此可以容易地形成检测电极11a、11b。

如果用培养液6充满膜片2的上表面2C的上方，则凹部3、通孔10a、10b也被培养液6充满，并通过膜片2的上下压力差，在通孔10a、10b的前端，使培养液6形成新月形形状，并分别与检测电极11a、11b接触。通过测定检测电极11a，11b之间的电阻值，知道在通孔10a、10b的前端形成适当的新月形形状，也可知道通孔10a、10b内的离子浓度的变化。

在被验体细胞8与培养液6一起投入后，通过测定检测电极11a、11b之间的电阻值可以判断被验体细胞8是否被以细胞膜覆盖通孔10a、10b的方式保持。例如，在细胞膜只塞住通孔10a，而未塞住通孔10b的情况下，检测电极11a和与膜片2的上部的培养液6接触的参照电极5c之间的电阻值高变，检测电极11b和参照电极5c之间的电阻值降低。在这种情况下，通过测定参照电极和检测电极11a之间的电阻值，可以测定后述的被验体细胞8的活动。相反，在被验体细胞8塞住通孔10b，而不塞住通孔10a的情况下，通过测定参照电极5c和检测电极11b之间的电阻值，可以测定被验体细胞8的活动。这样，如果被验体细胞8的细胞膜覆盖通孔10a、10b中的任意一个，就可以测定细胞8的活动。因此，能够提高测定活动的概率，并增加装置的可靠性。

而且，如果被验体细胞8的细胞膜以覆盖通孔10a、10b的方式被保持状态下，被验体细胞8被施以来自外部的刺激，则因为被验体细胞8活动，且通孔10a、10b内的离子浓度变化，所以可以测定被验体细胞8的细胞外电位或细胞8产生的物理化学变化。

此外，在图3、图10所示的装置51、52中，通孔4、10a、10b被形成在距凹部3的最深处3B比开口3A远的位置上，但如图21所示，也可容易地在最深处3B形成通孔14。在这种情况下，需要根据被验体细胞8适当地调整凹部3的直径和形状，以便被验体细胞8容易到达最深处3B。

在实施方式1中，通孔4、10a、10b的截面为图形或椭圆形，但也可以是矩形或U字形。

图22、图23为将通孔15、17形成矩形、U字形的细胞外电位测定装置的立体图。如图22所示，在通孔15为矩形的情况下，凹部16的形状保持为没有棱角的圆柱形状。如图23所示，在通孔17为U字形的情况下，凹部18的形状大致为半球形。

在被验体细胞8的固定形状为细长的情况(例如来自耳萝卜螺(radix auricularia japonica)的神经节细胞)，优选半圆筒形的凹部16。

半球形的凹部18中，U字形截面的通孔17，在被验体细胞8容易变形的情况下有效。被验体细胞8在容易变形的情况下有可能穿过圆形截面的通孔4。换言之，不那么减小充满U字形通孔17内的培养液6的容量，可以减少在通孔17的凹部18上开口的开口部17A的最小宽度部分。因此，可防止被验体细胞8进入通孔17中而被破坏。另外，通孔17的截面为数个U字形、数个矩形，也可以是它们的组合等形状。

另外，凹部3、16、18、通孔4、15、17的直径由被验体细胞8的大小、形状、性质决定。通过使凹部3、16、18的直径为10～100μm，通孔4、15、17的直径为1～10μm，可以测定直径为5～10μm的被验体细胞8。

其次，说明实施方式1的细胞外电位测定装置51的制造方法。图12～图21为用于对实施方式1的细胞外电位测定装置51的制造方法进行说明的截面图。

如图12所示，在由硅构成的基板1的下表面1B上形成抗蚀剂掩膜12后，如图13所示，通过从下表面1B腐蚀预定的深度而形成凹部1A，形成膜片2的下表面2B。膜片2由基板1的凸部1C支承。然后，除去抗蚀剂掩膜12。

其次，如图14所示，在膜片2的上表面2C上形成抗蚀剂掩膜13。抗蚀剂掩膜13的腐蚀孔13A的形状与所希望的通孔4的截面形状大致相同。

然后，如图15所示，只通过促进腐蚀的气体，从上表面2C将膜片2腐蚀。对应硅基板1可使用SF₆，CF₄、XeF₂等作为促进腐蚀的气体。这些气体不但促进基板1的深度方向(即与掩膜13垂直的方向)还促进基板1的横向(即与掩膜13平行的方向)的腐蚀。由此，如图15所示，被腐蚀的部分成为以掩膜13的开口13A为中心的半球形形成凹部3。

其次，如16A所示，相对于腐蚀气体的离子行进方向61倾斜45°进行脱水腐蚀基板1。作为腐蚀气体交互地使用促进腐蚀的气体和抑制的气体。作为促进腐蚀的气体可以使用XeF₂、CF₄、SF₆等。作为抑制腐蚀的气体可以使用CHF₂、C₄F₈等。如图16C所示，由于通过抑制腐蚀的气体腐蚀基板1，在被腐蚀的壁面上形成作为CF₂的聚合物的保护膜31，因此，脱水腐蚀只从腐蚀孔13A向着方向61进行，并在方向61上形成通孔4。

以下详细说明腐蚀中只从腐蚀孔13A向着方向61的进行。

首先，如图16B所示，使用促进腐蚀的气体，少许腐蚀基板1。在这个工序中，将使用外部线圈的感应结合法产生的等离子体中的高频加在基板1上。由此，由于通过在基板1上产生的负的偏压，作为腐蚀气体的等离子体中的正离子的SF₅ ⁺或CF₃ ⁺向着基板1冲击，所以基板1在方向61上优选被脱水腐蚀。可是，由于在等离子体中的正离子的进行方向上存在着一些与方向61不平行的成分，所以在膜片2通过该腐蚀上形成直径比腐蚀孔13A稍大的孔3D。

然后，如图16C所示，使用抑制腐蚀的气体，在基板1的被腐蚀部分上形成保护膜31。在这个工序中，不将高频加在基板1上。由此，由于在基板1不产生偏压，所以作为保护膜31的材料的CF₃ ⁺不会受到偏向，并向基板1的被腐蚀部分的壁面上均匀地形成保护膜31。

其次，如图16D那样，通过促进腐蚀的气体再少许腐蚀基板1。在这个工序中，再次将高频加在基板1上。由此，在基板1上加上偏压，并增加与方向61平行运动的腐蚀气体的离子。该离子的能量很高，可通过与方向61平行运动的离子腐蚀在被腐蚀部分的底面上形成的保护膜31。可是，由于在不与方向61平行的方向上运动的离子的能量低，所以不容易除去在壁面上形成的保护膜31。这样，通过反复交互地进行促进腐蚀的气体产生的腐蚀和使用抑制腐蚀的气体产生腐蚀的工序，可使腐蚀只从腐蚀孔13A向方向61进行，可以形成只从腐蚀孔13A向方向61延伸的通孔4。另外，作为上述制造方法的结果，如图16D所示，虽然在通孔4的壁面上有台阶，但由于该台阶与通孔4的直径相比较很小，因此实质上可忽略，则通孔4只在方向61上延伸。

如图17所示，在这个工序中，腐蚀只从腐蚀孔13A在气体离子的行进方向61上进行，形成相对膜片2的厚度方向2A倾斜45°延伸的通孔4。通孔4在距凹部3的最深处3B比开口3A远的位置上形成。另外，由于倾斜地腐蚀基板1，因此通孔4的截面形状与抗蚀剂掩膜13的腐蚀孔13A的形状不同。通过将腐蚀孔13A的形状作成在倾斜基板1方向上有长轴的椭圆形，并将通孔4的截面形状可以形成为圆形。

另外，倾斜基板1的角度由腐蚀孔13A的形状和抗蚀剂掩膜13的厚度所限制。例如，在腐蚀孔13A的直径为1μm、抗蚀形掩膜13的厚度为1μm的情况下，如果来自几何的限制方向61与膜片2的厚度方向2A没有倾斜比45°小的角度，则基板1不能腐蚀。

如图21所示，在使基板1不倾斜而腐蚀的情况下，在凹部3的最深处3B形成通孔14。在被验体细胞8具有容易到达凹部3的最深处3B大小的情况下，也可以在图21所示的位置形成通孔14。

抗蚀剂掩膜13的腐蚀孔13A也可以为上述的图形和椭圆形以外的，矩形U字形或它们组合的形状。

如图22所示，在腐蚀孔13A的形状为矩形的情况下，通过促进腐蚀的气体，得到无棱角的上表面和下表面的大致半圆筒形的凹部16，通孔15的截面成为与腐蚀孔13A相同的矩形。另外，由于矩形的长边的长度比圆形的直径长，所以容易在一个通孔中形成数个检测电极。

此外，如图23所示，在腐蚀孔13A的形状为U字形的情况下，促进腐蚀的气体，从孔13A全方向上腐蚀基板1，所以可得到半球形的凹部18。又图3所示的通孔4同样，通孔17的截面为与腐蚀孔13A相同的U字形。

另外，如图10和图11所示，在一个凹部3中形成数个通孔的情况下，如图19所示，在形成通孔4的工序中，通过改变基板1的倾斜角度而进行腐蚀，可以形成数个通孔。在腐蚀后除去抗蚀剂掩膜13。

其次，如图18所示，通过在基板1的凹部1A的表面1B上形成薄膜的工序，可与通孔4靠近而形成以金为主体的检测电极5a、5b。虽然在基板1的表面1B上有凹凸，但即使在这种有凹凸的表面上也可以涂布光致抗蚀剂、曝光和形成图形。可是在需要极精密的电极的情况下，在如图20所示基板1上形成膜片62后，也可在膜62的凹部1A的表面62B测形成凹部3。通过机械的或化学的方法，可将表面62C比表面62B更精密地加工。检测电极5a、5b需要有高精度，通常地由于凹部3可以没有高于检测电极5a、5b的精密，因此通过这种方法，可以容易地制造装置。

另外，如图10所示，在凹部3中形成通孔10a，10b的情况下，也与上述同样地使用通常的薄膜形成工序，如图11所示地形成检测电极11a、11b。由于通常不需要达到比图3所示一个通孔4与凹部3连接情况下的电极5a、5b的精度高，因此电极11a、11b比电极5a、5b容易形成。

在实施方式1中，在基板1上形成凹部1A，进而形成膜片2的下表面2B，虽然形成由基板1的凸部1C支承膜片2的结构后，形成凹部3和通孔4，但在形成凹部3和通孔4后，在基板1上形成凹部1A，进而形成膜片2的下表面2B，即使形成由基板1的凸部1C支撑膜片2的结构，也可得到相同结构的细胞外电位测定装置。

图24为实施方式1的另外一种细胞外电位测定装置的截面图。在图1～图23所示的细胞外电位测定装置中，使用硅作为基板1。如图24所示，细胞外点为测点装置，也可以使用作为膜片2的硅层82A、氧化硅层83和硅层82B的SOI基板81代替由硅构成的基板1。在膜片2的下表面2B的周边边缘上设置氧化硅层83，在氧化硅层83上设置硅层82B。在SOI基板81中，由于使用氧化硅层83阻止腐蚀，所以即使在使用腐蚀形成基板81的凹部81A的情况下，及在膜片2上使用腐蚀形成通孔的情况下，也会容易地得到高精度的厚度的片2和通孔4。

(实施方式2)

图25为本发明的实施方式2的细胞外电位测定装置151的立体图。图26为用图25所示的装置151的线26—26所截得的截面图。图27为装置151的主要部分的放大图。

在图25～图27中，在硅基板101上形成凹部101A，并形成膜片102的下表面102A。膜片102由基板101的凸部101C所支承。膜片102的材质为与基板101相同的硅，厚度约为25μm。凹部103由半球形的曲面所形成，并在基板101的表面开口的开口部103A的直径约为20μm。在长度方向截面形状均匀的通孔104以贯通膜片102的方式与凹部103连通。通孔104设置在凹部103的最深处103B，并具有直径为5μm的圆或长径为5μm的椭圆形的截面。

在通孔104的凹部103的反对侧上形成向着表面102B扩展的凹部106。如图27所示，在膜片102的凹部1A侧的表面102A上，与凹部106的开口106A靠近而形成以金为主体的检测电极105a、105b。

其次，说明细胞外电位测定装置151的动作。图28A为用于对装置151的动作的主要部分进行说明的截面图。

首先，说明检测培养液的物理化学变化的顺序。如图28A所示，如果用作为电解质的培养液107充满与膜片102的下表面102A的相对一侧的上表面102B的上方，则凹部103和通孔104也依次被培养液107充满。如果将膜片102的上表面102B的上方的空间加压，或将膜片102的下表面102A的下方的空间减压，则培养液107从通孔104向外飞出。这时，如果使加压或减压的压力为适当的值，则可在凹部106的开口106A上，培养液107形成新月形形状而稳定。

由此，培养液107稳定地与检测电极105a和105b接触。检测电压105a和105b相互电气绝缘。可是，通过从通孔106形成的新月形形状，培养液107与检测电极105a、105b接触，通过作为电解质的培养液107，电极105a、105b电气连接。

检测电极105a、105b间的电阻值，与培养液107的离子浓度有关。所以，通过检测电极105a、105b之间的电阻值的变化，可以检测培养液107的离子浓度的变化。此外，如果培养液107的新月形形状不完全，则检测电极105a、105b不能很好连接，它们间的电阻值增大。所以，如果测定该电阻值，则可以知道在凹部106中，培养液107是否形成适当的新月形形状。

通过设置凹部106，从通孔104向着膜片102的下表面102A开口的开口部不为直线形状，而具有由直线部分和凹部106的曲面构成的台阶形状。通过这种结构，在培养液107通过通孔104后，容易在凹部106内形成新月形形状。这是由于凹部106有曲面，培养液107的表面张力增大，即使上下压力差多少变化，也可保持压力均衡。换言之，当一次形成新月形形状时，即使压力多少变动，通过凹部106可稳定培养液107的新月形形状。这种现象也可通过流体力学用的有限元分析法确认。这种新月形形状稳定可使通孔104，凹部106内的培养液107的量稳定，并更稳定地测定离子浓度。

如图26所示，由于检测电极105a、105b延伸至凹部106内而形成，通过培养液107的新月形形状可使该电极与培养液107稳定地接触。

其次，详细地说明测定被验体细胞的外电位或细胞产生的物理化学变化的顺序。

如图28A所示，如果将被验体细胞108培养液107一起投入，并加压膜片102的表面102B上方的空间，或减压膜片102的表面102A的下方空间，则被验体细胞108与培养液107一起被拉入凹部103内。由于凹部103由曲面形成，所以可以有效地保持被验体细胞108。

在被验体细胞108保持在凹部103内后，适当地调整膜片102的上下压力，以便培养液107在凹部106的开口106A处形成适当的新月形形状。如上所述，边可测定检测电极105a、105b之间的电阻值变调整压力。

在凹部103内，以塞住通孔104的开口4A的方式保持在被验体细胞108后，对被验体细108进行刺激。作为这种刺激，除了例如化学药品、毒物等的化学刺激外，还有机械的位移、光、电、电磁等的物理刺激。

在被验体细胞108相对这些刺激活泼地反应的情况下，被实验体胞108，通过保有细胞膜的离子通道而放出或吸收各种离子。这种反应在被验体细胞108与培养液107接触的地方产生，并在通孔104内及凹部106的培养液107A和被验体细胞108之间进行离子交换。结果，通孔104内凹部106的培养液107A的离子浓度变化，所有，可以通过检测电极105a、105b检测该变化。

另外，虽然在图28A中，通过检测电极105a、105b测定变化，但可以使用一个检测电极测定变化。图28B为用于对实施方式2的细胞外电位测定装置的动作的主要部分进行说明的放大截面图。通过测定与充满膜片102的上表面102B的上方的培养液107同电位的参照电极105c和凹部106附近的单个的检测电极105之间的电压，可以测定通孔104内及凹部106内的培养液107A的离子浓度的变化，并可以测定被验体细胞108的细胞外电位或细胞产生的物理化学变化。

另外，不但可以用电阻值，而且可测定电流值、电荷量、电位等别的物理量离子浓度变化。

此外，如图35，图36所示，通孔109a、109b作在接近离开凹部103内的最深处103B的开口103A的位置上，从凹部103相对与膜片102的厚度方向102C成45°角度延伸。通过这种结构，可在凹部103内放置数个通孔109a、109b，还可以在从通孔109a、109b的各自的膜片102开口的部分上，放置向着表面102A的扩大的凹部110a、110b。如图36所示，将以金为主体的检测电极111a、111b中分别设置于凹部110a、110b。由于凹部110a、110b为分离形成的，因此可以容易地形成检测电极111a、111b。

在上述装置中，如果用培养液107充满膜片102的上表面102B的上方，则凹部103、通孔109a、109b也被培养液107A充满。通过膜片102的上下压力差，培养液107A在凹部110a、110b的前端形成新月形形状，并分别与检测电极111a、111b接触。通过测定检测电极111a、111b之间的电阻值，可以知道在凹部110a、110b和凹部110a、110b的前端是否形成适当的新月形形状，可测定通孔109a、109b及凹部110a、110b内的离子浓度的变化。

在与培养液107一起投入被验体细胞108情况下，可以判断被验体细胞108是否被以使其细胞膜覆盖通孔109a、109b的方式而保持。例如，在细胞只塞住通孔109a而不塞住通孔109b的情况下，检测电极111a和与膜片102的上部值的培养液107接触的参照电极111c之间的电阻值变高，检测电极111b和参照电极111c之间的电阻值变低。

当在上述状态下，如果对被验体细胞108进行刺激，则被验体细胞108活动，由于通孔109a、109b内及凹部110a、110b的培养液的离子浓度变化，所以可测定被验体108的细胞的外电位或细胞产生的物理化学变化。

此外，凹部103根据与被验体细胞108可容易地形成适当大小的形状，使得被体细胞108容易地到达最深处103B。

在实验例2中，虽然通孔104、109a、109b的截面形状为圆形或椭圆形，但也可是矩形或U字形也可以。图41，图42为通孔115、117为矩形或U字形的细胞外电位测定装置的立体图。如图41所示，在通孔115为矩形的情况下，凹部116的形状成为上下面无棱角大致圆筒形状。如图42所示，在通孔117为U字形的情况下，凹部118的形状大致为半球形。

大致半圆筒形的凹部116优选用于被验体细胞108细长的情况下，(例如来自耳萝卜螺的神经节细胞)。

半球形的凹部118和截面为U字形的通孔117，对例如在通孔104中容易进行穿过得方式变形的被验体细胞108很有效。换言之，如果通孔117作成U字形，则没有那么减少充满通孔117的培养液107的量，并可以减小开口部117A的最小宽度部分。因此，可防止被验体细胞108在进入通孔117时而被破坏。

凹部103、116、118、通孔104、115、117的直径由被验体细胞108的大小、形状、性质所决定。通过凹部103、116、118的直径为10～100μm，通孔104、115、117的直径为1～10μm，可以测定直径为5～10μm的被验体细胞108的反应。

其次，说明实施方式2的细胞外电测定装置的制造方法。图29～图34为用于对图26所示的细胞外电位测定装置的制造方法进行说明的工序截面图。

如图29所示，在由硅构成的基板101的下表面101A上形成抗蚀剂掩膜112后，如图30所示，通过从下表面101A腐蚀预定的深度形成凹部101B，进而形成膜片102的下表面2B。在基板101上部形成支撑膜片102的凸部101C。然后，除去抗蚀剂掩膜112。

其次，如图31所示，在膜片102的外表面102B上形成抗蚀剂掩膜113。抗蚀剂掩膜113的腐蚀孔113A的形状大致与所希望的通孔104的截面形状相同。

然后，如图32所示，，将促进腐蚀的气体作为腐蚀气体，从腐蚀孔113A脱水腐蚀膜片102。

相对硅基板101，可以使用SF₆、CF₄、XeF₂等作为促进腐蚀的气体。这些气体不但在与抗蚀性掩膜113垂直的方向，而且在与抗蚀性掩膜113平行的方向促进硅基板101的腐蚀。由此，如图32所示，基板101被腐蚀成以腐蚀孔113A为中心的半球形，来形成凹部103。

其次，如图33A所示，从基板101的凹部103形成的孔104。孔104通过交互地使用促进腐蚀的气体和抑制腐蚀的气体进行脱水腐蚀而形成，在贯通膜片102前结束腐蚀。作为抑制腐蚀的气体可以使用CHF₃、C₄F₈。通过调整促进腐蚀的气体和抑制腐蚀的气体的使用时间比，与实施方式1相同，可以只将对基板101的抗蚀剂孔113A的下面部分进行脱水腐蚀。通过这个工序，如图33B所示，可在凹部103和孔104的壁面上。通过抑制腐蚀的的气体，在凹部103的内面103C上和孔104的壁面104A上形成保护膜131。

孔104的截面形状可以使用矩形或U字形，或它们的组合。

其次，如图34所示，只使使用促进腐蚀的气体而腐蚀基板101。由于在凹部103及孔104的壁面上，形成保护膜131，所以如果只用促进腐蚀的气体腐蚀，则只有腐蚀通孔104的膜片102的下表面102A，而形成凹部106。

在保护膜131的厚度不充分的情况下，由于也腐蚀凹部103、孔104的壁面，所以在形成孔104后，也可以在壁面上使用抑制腐蚀的气体，形成厚的保护膜131。通过改变促进腐蚀的气体和抑制腐蚀的气体的时间比，可调整保护膜131的厚度。这样，形成由曲面构成的凹部103、凹部106及连接它们的通孔104。

此后，如图26所示，通过通常的薄膜形成装置在凹部106附近，形成检测电极105a、105b。由于凹部106具有比通孔104大的直径，所以，在形成检测电极105a、105b时，不需要高的精度。所以，容易制造检测电极105a、105b。

其次，说明图35所示的细胞外电位测定装置的制造方法。图37A～图40为用于对图35所示的细胞外电位测定装置的制造方法进行说明的截面图。

首先，使用与图29～图32所示的制造工序相同的方法，形成凹部103。

其次，如图37A所示，相对于腐蚀气体的离子行进方向161倾斜基板101的上表面102B45°而进行脱水腐蚀。可交互地使用促进腐蚀的气体和抑制腐蚀的气体作为腐蚀气体来腐蚀基板101。作为促进腐蚀的气体可以使用XeF₂、CF₄、SF₆等。作为抑制腐蚀的气体可以使用CHF₃、C₄F₈等。通过交互地使用这些气体，腐蚀基板101，在基板101的被腐蚀部分的壁面上，如图37B所示，形成作为CF₂的聚合物的保护膜132。所以，可以只在抗蚀性掩膜113的腐蚀孔113A的下方，腐蚀基板101，形成通孔109a。

由于与实施方式同样，只在腐蚀孔113A的下方腐蚀基板101，所以这里省略其详细说明。

另外，在腐蚀通孔109a时，倾斜基板101的角度由腐蚀孔113A的形状和抗蚀剂掩膜113的厚度所限制。例如，在腐蚀孔113A的直径为1μm，抗蚀形掩膜113的厚度为1μm的情况下，如果来自几何的限制方向161相对与基板101的厚度方向102C倾斜小于45°，则基板101不能腐蚀。

其次，如果只用促进腐蚀的气体腐蚀基板101，则由于通过抑制腐蚀的气体，在凹部103及孔109a的壁面上形成保护膜132，因此，如图39所示，只腐蚀孔109a的膜片102的下表面102A侧形成凹部110a。

然后，如图40所示，相对方向162上倾斜基板101，使其相对厚度方向102C上，与图38所示的方向161的对称方向162上进行的，交互地使用促进进行腐蚀的气体的离子和抑制腐蚀促进腐蚀的气体离子进而形成孔109a，然后，只使用促进腐蚀的气体形成凹部110b。即方向162，即使相对方向102C上，即使不与方向161对称，也可得到同样的效果。在腐蚀后除去抗蚀剂掩膜113。

其次，如图35所示，从基板101的下面，通过通常的薄膜形成工序，将以金为主体的检测电极111a、111b形成靠近凹部110a、110b而形成。由于与凹部103连通形成的通孔109a、109b有比图27所示的电极有105a、105b低的精度，因此可以更简单地形成电极111a、111b。

使用这种方法，在图35所示的凹部103形成通孔109a、109b及凹部110a、110b。在这个腐蚀工序中，腐蚀气体的等离子体中的离子行进方向161和基板101的厚度方向102C产生的倾斜角度为45°。但从生产性来看，优选该角度在89°以下形成通孔109a、109b、凹部110a、110b，更优选为在20°～70°范围内倾斜形成这些孔和凹部。

这样，通过设置数个通孔109a、109b，在被验体细胞108保持在凹部103内时，细胞108可更可靠地覆盖通孔109a、109b。所以，通过设在凹部110a、110b上的检测电极111a、111b，可以更可靠地测定细胞外电位。

凹部103及通孔109a、109b的大小由测定的被验体细胞的大小、形状、性质所决定。通过使凹部103的直径为10～100μm，通孔109a、109b的直径为1～10μm，可以测定直径为5～100μm的细胞的细胞外电位。

凹部110a、110b的直径由通孔109a、109b的直径和培养液107的流体特性所决定。在通过有限元方法得到的流体分析的结果，在培养液107具有与水相同的流体特性的情况下，当使通孔109a、109b的直径为5μm，凹部110a、110b的直径为10μm时，可以得到培养液107可稳定地形成新月形形状。

图44为实施方式2的另外一种细胞外电位测定装置的截面图。在向图3所示的实施方式1的细胞外电位测定装置51的通孔4的表面2B上开口的部分，可以形成与图26所示的凹部106同样的凹部170。在凹部170的周边，形成与图3所示的电极有105a、105b相同的电极171a、171b。

图43为实施方式2的另外一种细胞外电位测定装置的截面图。在图25～图42所示的细胞外电位测定装置中，使用硅基板1作为基板101。在图43所示的装置中，也可以使用具有硅层183A、183B和氧化硅层184的SOI基板181代替硅构成的基板10。在构成膜片182的硅层183A的下表面182B的周边边缘上设置氧化硅层183A，在氧化硅层183A上设置硅层182B。使用氧化硅层184阻止脱水腐蚀，因此膜片182的厚度可达到高精度，而且通过腐蚀容易地形成通孔104。

另外，虽然实施方式2的电极105a、105b、111a、111b、171a、171b延伸至凹部106、170、110a、110b内壁上，但与图3所示的实施方式1的电极5a、5b同样，没有延伸至凹部内壁，也可以形成于膜片102、2的下表面102A、2A。

在实施方式2中，在基板101上形成凹部101A，从而形成膜片102的下表面102A，并在形成由基板1的凸部101C支承膜片102的结构后，形成凹部103和通孔104。可是，在形成凹部103、通孔104后，在基板101上形成凹部101A，形成膜片102的下表面102A，即使形成由基板101的凸部101C支承膜片102的结构，可得到同样结构的细胞外电位测定装置。

另外，在实施方式1、2的装置中，膜片2、102以外的基板1、101的部分，即使是上述形状以外，如果膜片2、102的形状与实施方式1、2的装置相同，也可得到同样的效果。

本发明的细胞外电位测定装置，可以通过检测电极高效稳定地测定细胞活动时产生的物理化学变化。

Claims (61)

1.一种细胞外电位测定装置，其特征在于，

其具有膜片和第一电极，

其中所述膜片具有第一表面和与所述第一表面相对侧的第二表面，并形成有在所述第一表面上开口的开口部的第一凹部，和从比所述第一凹部的最深处更靠近所述第一凹部的所述开口部的第一位置贯通至所述第二表面的第一通孔；

所述第一电极设置在位于所述膜片的所述第二表面上，在所述第一通孔的所述开口部的周围。

2.如权利要求1所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，

还具有设置在位于所述膜片的第二表面的上方，在所述第一通孔的所述开口部的周围的第二电极。

3.如权利要求1所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，

所述膜片在所述第二表面上开口的所述第一通孔的开口部处，形成向所述膜片的所述第二表面的直径渐大的第二凹部。

4.如权利要求3所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，

所述第一电极延伸至所述第二凹部的壁面的至少一部分。

5.如权利要求3所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，

还具有设置在位于所述膜片的第二表面的上方，在所述第一通孔的所述开口部的周围的第二电极。

6.如权利要求5所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，

所述第二电极延伸至所述第二凹部的壁面的至少一部分。

7.如权利要求1所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，

所述第一通孔具有均匀的形状的截面部分。

8.如权利要求1所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，

所述第一通孔的截面为矩形和U字形中的一种。

9.如权利要求1所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，

所述膜片包含硅。

10.如权利要求9所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，

其还具有设置在所述膜片的所述第二表面上的氧化硅层和设置在所述氧化硅层上的硅层。

11.如权利要求10所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，

所述氧化硅层设置在所述膜片的所述第二表面的周边边缘部。

12.如权利要求1所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，

所述第一凹部的所述开口部的直径为10～100μm，在所述第一通孔的所述第一凹部开口的开口部的宽度为1～10μm。

13.如权利要求1所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，

所述膜片形成有第二通孔，该第二通孔从比所述第一凹部的所述最深处的更靠近所述第一凹部的所述开口部的所述第二位置贯通至所述第二表面。

14.如权利要求13所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，

其还具有在所述膜片的第二表面的上方，在所述第二通孔的所述开口部的周围设置有第二电极。

15.如权利要求13所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，

所述膜片在所述第二表面上开口的所述第二通孔的开口部处，形成向着所述膜片的所述第二表面的直径渐大的第二凹部。

16.如权利要求15所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，

其还具有在位于所述膜片的第二表面的上方，在所述第二通孔的所述开口部的周围设置有第二电极。

17.如权利要求16所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，

所述第二电极延伸至所述第二凹部的壁面的至少一部分。

18.如权利要求13所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，

所述第二通孔具有均匀的形状的截面部分。

19.如权利要求13所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，

所述第二通孔的截面为矩形和U字形中的一种。

20.如权利要求13所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，

所述第一凹部的所述开口部的直径为10～100μm，在所述第二通孔的所述第一凹部上开口的开口部的宽度为1～10μm。

21.一种细胞外电位测定装置，其特征在于，

具有膜片和第一电极，

所述膜片，具有第一表面和所述第一表面相反一侧的第二表面，并形成有由具有在所述第一表面上开口的开口部的曲面构成的第一凹部，从所述第一凹部向所述第二表面而形成的具有均匀的截面形状的孔，和从具有所述膜片的所述第二表面上开口的开口部、从所述孔向膜片的所述第二表面而直径渐大的第二凹部，

所述第一电极，设置在所述膜片的所述第二表面上，在所述第二凹部的所述膜片上开口的所述开口部的周围。

22.如权利要求21所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，

所述第一电极延伸至所述第二凹部的壁面的至少一部分上。

23.如权利要求21所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，

还具有在所述膜片的第二表面的上方，在所述第二凹部的所述开口部的周围设置的第二电极。

24.如权利要求23所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，

所述第二电极延伸至所述第二凹部的壁面的至少一部分上。

25.如权利要求21所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，

所述孔的所述截面为矩形和U字形中的一种。

26.如权利要求21所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，

所述膜片包含硅。

27.如权利要求26所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，

还具有在所述膜片的所述第二表面上设置的氧化硅层和在所述氧化硅层上设置的硅层。

28.如权利要求27所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，

所述氧化硅层设置在所述膜片的所述第二表面的周边边缘上。

29.如权利要求21所述的细胞外电位测定装置，其特征在于，

所述第一凹部的所述开口部的直径为10～100μm，所述孔的直径为1～10μm，所述第二凹部的所述开口部的直径为5～10μm。

30.一种细胞外电位测定装置的制造方法，其特征在于，

其包含，

准备具有第一表面和第一表面相反一侧的第二表面的膜片的工序，

在所述膜片的所述第一表面上，设置具有腐蚀孔的的掩膜的工序，

在所述膜片的所述腐蚀孔的周围部分上，通过腐蚀形成具有在所述膜片的所述第一表面上开口的开口部的第一凹部的工序，

形成从比所述第一凹部的最深处更靠近所述第一凹部的所述开口部的第一位置，贯通至所述膜片的所述第二表面的第一通孔的工序，

形成在所述膜片的第二表面上开口的所述第一通孔的开口部周围设置的第一电极的工序。

31.如权利要求30所述的制造方法，其特征在于，

形成所述第一凹部的工序包含通过仅用促进腐蚀的第一气体产生的脱水腐蚀，在所述膜片上形成所述第一凹部的工序。

32.如权利要求30所述的制造方法，其特征在于，

所述第一通孔具有均匀形状的截面的部分。

33.如权利要求30所述的制造方法，其特征在于，

形成所述第一通孔的工序包含，

从所述第一凹部的所述第一位置向所述膜片的所述第二表面形成孔的工序，

从所述孔向所述膜片的所述第二表面而形成渐大的第二凹部，以便在所述膜片的所述第二表面上贯通所述孔的工序。

34.如权利要求33所述的制造方法，其特征在于，

所述第一电极延伸至所述第二凹部的壁面的至少一部分上。

35.如权利要求30所述的制造方法，其特征在于，

形成所述第一通孔的工序包含，通过使用促进腐蚀的第一气体和抑制腐蚀的第二气体产生的脱水腐蚀，在所述膜片上形成所述第一通孔的工序。

36.如权利要求35所述的制造方法，其特征在于，

形成所述第一通孔的工序包含，通过交互使用所述第一气体和所述第二气体产生的脱水腐蚀，在所述膜片上形成所述第一通孔的工序。

37.如权利要求35所述的制造方法，其特征在于，

形成所述第一通孔的工序包含，通过经过所述腐蚀孔而使所述第一气体和所述第二气体在第一方向行进，在所述膜片上形成所述第一通孔的工序。

38.如权利要求37所述的制造方法，其特征在于，

从所述膜片的所述第一表面向着所述第二表面的厚度方向，和所述第一方向产生的夹角为89°以下。

39.如权利要求38所述的制造方法，其特征在于，

所述膜片的所述厚度方向和所述第一方向产生的所述角度为20°～70°。

40.如权利要求39所述的制造方法，其特征在于，

所述膜片的所述厚度方向和所述第一方向间所产生的所述角度为45°。

41.如权利要求30所述的制造方法，其特征在于，

其还包含，

形成从比所述第一凹部的所述最深处更靠近所述第一凹部的所述开口部的第二位置，贯通至所述膜片的所述第二表面的第二通孔的工序，

形成在、在所述膜片的第二表面上开口的、所述第二通孔的开口部周围设置的第二电极的工序。

42.如权利要求41所述的制造方法，其特征在于，

所述第二通孔具有均匀形状的截面的部分。

43.如权利要求41所述的制造方法，其特征在于，

形成所述第二通孔的工序包含，通过使用促进腐蚀的第一气体和抑制腐蚀的第二气体产生的脱水腐蚀，在所述膜片上形成所述第二通孔的工序。

44.如权利要求43所述的制造方法，其特征在于，

形成所述第二通孔的工序包含，通过交互地使用所述第一气体和所述第二气体产生的脱水腐蚀，在所述膜片上形成所述第二通孔。

45.如权利要求41所述的制造方法，其特征在于，

形成所述第二通孔的工序包含，

形成从所述第一凹部的所述第二位置向着所述膜片的所述第二表面的孔的工序；

形成从所述孔向着上膜片的所述第二表面而渐大的第二凹部，使得在所述膜片的所述第二表面上贯通所述孔的工序。

46.如权利要求45所述的制造方法，其特征在于，

所述第一电极延伸至所述第二凹部的壁面的至少一部分上。

47.如权利要求45所述的制造方法，其特征在于，

形成所述第一通孔的工序包含，通过经过所述腐蚀孔而使所述第一气体和所述第二气体在第一方向行进，在所述膜片上形成所述第一通孔的工序，

形成所述第二通孔的工序包含，通过经过所述腐蚀孔而使所述第一气体和所述第二气体在第二方向行进，在所述膜片上形成所述第二通孔的工序。

48.如权利要求47所述的制造方法，其特征在于，

从所述膜片的所述第一表面向着所述第二表面的厚度方向和所述第一方向产生的夹角为89°以下，

所述膜片的所述厚度方向和所述第二方向产生的夹角为89°以下。

49.如权利要求48所述的制造方法，其特征在于，

所述第一方向和所述第二方向关于所述膜片的所述厚度方向对称。

50.如权利要求48所述的制造方法，其特征在于，

所述膜片的所述厚度方向和所述第一方向产生的所述角度为20°～70°。

51.如权利要求50所述的制造方法，其特征在于，

所述膜片的所述厚度方向和所述第一方向产生的所述角度为45°。

52.如权利要求48所述的制造方法，其特征在于，

所述膜片的所述厚度方向和所述第二方向产生的所述角度为20°～70°。

53.如权利要求52所述的制造方法，其特征在于，

所述膜片的所述厚度方向和所述第二方向产生的所述角度为45°。

54.如权利要求31、35或43所述的制造方法，其特征在于，

所述第一气体包含SF₆、CF₄、XeF₂中的一种。

55.如权利要求35或43所述的制造方法，其特征在于，

所述第二气体包含C₄F₈、CHF₃中的至少一种。

56.一种细胞外电位测定装置的制造方法，其特征在于，

其包含，

准备具有第一表面和第一表面相反一侧的第二表面的膜片的工序；

在所述膜片的所述第一表面上设置具有腐蚀孔的掩膜工序；

在所述膜片的所述腐蚀孔的周围部分，通过腐蚀，形成具有在所述膜片的所述第一表面开口的开口部的第一凹部的工序，

形成从所述第一凹部向着所述膜片的所述第二表面的具有均匀的截面形成的孔的工序，

形成具有从所述孔向着所述膜片的所述第二表面而渐大的所述膜片的所述第二表面开口的开口部的第二凹部，使得在所述膜片的所述第二表面贯通所述孔的工序，

在所述膜片的第二表面上，形成在所述第二凹部的所述开口部周围设置的第一电极的工序。

57.如权利要求56所述的制造方法，其特征在于，

形成所述第一凹部的工序包含，通过仅使用促进腐蚀的第一气体产生的脱水腐蚀，在所述膜片上形成所述第一凹部的工序。

58.如权利要求56所述的制造方法，其特征在于，

形成所述通孔的工序包含，通过使用促进腐蚀的第一气体和抑制腐蚀的第二气体产生的脱水腐蚀，形成所述通孔的工序。

59.如权利要求58所述的制造方法，其特征在于，

所述第二气体包含C₄F₈、CHF₃中的至少一种。

60.如权利要求56所述的制造方法，其特征在于，

形成所述第二凹部的工序包含，通过仅使用促进腐蚀的第一气体产生的脱水腐蚀，形成所述第二凹部的工序。

61.如权利要求57、58或60所述的制造方法，其特征在于，

所述第一气体包含SF₆、CF₄、XeF₂中的一种。

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