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复溶性聚氰基丙烯酸酯纳米粒,其制备方法及制药用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种复溶性聚氰基丙烯酸酯纳米粒，主要由聚氰基丙烯酸酯、DEAE-Dextran、Dextran-70、葡萄糖和甘露醇组成，各组份的质量百分数为聚氰基丙烯酸酯 2.0～16.3%、DEAE-Dextran 1.9～8.8%、Dextran-703.3～19.0%、葡萄糖 30.3～79.6%、甘露醇 8.3～52.8%。同时提供了其制备方法，该方法以氰基丙烯酸酯为原料，通过聚合乳化方法制备聚氰基丙烯酸酯纳米粒，然后加入一定量的保护剂，冷冻干燥，制得产物。该产物能够完全复溶，具有纳米粒的特殊性质，可以作为核酸的载体，具有防止DNA酶降解，提高细胞摄入率，靶向肿瘤细胞的作用。

Description

复溶性聚氰基丙烯酸酯纳米粒，其制备方法及制药用途
所属技术领域
本方法属于具有一个或更多的不饱和脂族基化合物的均聚物或共聚物的组合物技术领域，具体涉及一种聚氰基丙烯酸酯纳米粒及其制备技术。
背景技术
基因治疗是目前药学和医学领域研究的热点，核酸治疗是其中的重要领域之一，但核酸进入体内后容易被体内DNA酶降解，而且细胞摄入率低，难以达到理想的治疗效果。聚氰基丙烯酸酯纳米粒是核酸的理想载体，具有防止DNA酶降解，提高细胞摄入率，抑制肿瘤细胞等特点。《中国现代医学杂志》2004年第14卷第1期登载的张阳德等撰写的论文“聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒基因载体的制备及相关性质的体外研究”和Andreas.Zimmer撰写并在《Methods》1999，18，286-295上发表的“Antisense Oligonucleotide Deliverywith Polyhexylcyanoacrylate Nanoparticles as Carriers.”中公开了一种采用乳化聚合法制备聚氰基丙烯酸酯纳米粒的方法，该方法是：在50ml(pH2.0)的盐酸溶液中，加入0.2g DEAE-Dextran(二乙基氨基乙基-葡聚糖)和0.3gDextran-60(葡聚糖-60)，然后缓慢加入氰基丙烯酸己酯单体，20℃下搅拌24h。但采用该方法制得的产物，其溶液不适宜长期保存，室温放置易发生聚沉，霉变，一般采用低温存放，使用和保存均不方便；采用冷冻干燥和加热方法得到的干燥制品，使用时不能用水等介质复溶，往往出现粘连等现象，失去了原来的纳米级微粒的性质，无法将其作为核酸载体使用。因此，寻找一种新方法制备聚氰基丙烯酸酯纳米粒干燥品，使其不但能够长期在室温下保存，而且用水等介质复溶后，能保持聚氰基丙烯酸酯纳米粒干燥前的性质，适合于作为核酸载体用于基因治疗，就成了本领域技术人员研究的对象。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可复溶的聚氰基丙烯酸酯纳米粒冻干制品的制备方法，冻干制品既能够长期存放，又可以在水，生理盐水或其他用水中能够完全复溶，不会出现粘连现象，在使用时可以提高细胞摄入率。同时提供了该产品作为核酸载体用于基因治疗的用途。
本发明技术方案如下。
一种复溶性聚氰基丙烯酸酯纳米粒，其特征在于，主要由聚氰基丙烯酸酯、DEAE-Dextran、Dextran-70、葡萄糖和甘露醇组成，各组份的质量百分数为聚氰基丙烯酸酯2.0～16.3％、DEAE-Dextran 1.9～8.8％、Dextran-70 3.3～19.0％、葡萄糖30.3～79.6％、甘露醇8.3～52.8％。其中，聚氰基丙烯酸酯为聚氰基丙烯酸甲酯、聚氰基丙烯酸乙酯、聚氰基丙烯酸丁酯或聚氰基丙烯酸己酯中的一种。
制备上述复溶性聚氰基丙烯酸酯纳米粒的方法包括以下步骤：
以DEAE-Dextran、Dextran-70、氰基丙烯酸酯单体为原料，以葡萄糖和甘露醇为保护剂，按照0.9～1.5：1.5～3.5的质量比称取DEAE-Dextran和Dextran-70共2～4.5份，将其溶于80～250份pH为1.5～2.5的盐酸溶液中，在搅拌条件下，向上述混合溶液中滴加氰基丙烯酸酯单体1～3份，滴加完毕后，继续搅拌3～8h，然后加入葡萄糖10～25份、甘露醇3～15份，搅拌10～30min，得聚氰基丙烯酸酯纳米粒混悬液，其中，氰基丙烯酸酯单体为氰基丙烯酸甲酯单体，氰基丙烯酸乙酯单体，氰基丙烯酸丁酯单体和氰基丙烯酸己酯单体中的一种；
将上述混悬液放入—30～—50℃的低温冷冻室预冻1～5h，预冻结束，取出预冻样品，快速放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，除去水分，即制得复溶性聚氰基丙烯酸酯纳米粒冻干制品，其粒径为120～180nm。
在使用时，取上述制得的聚氰基丙烯酸酯甲酯纳米粒冻干粉一定量，加超纯水适量复溶，成纳米粒混悬液，纳米粒浓度为180～230mg/L；取核酸一定量，加超纯水使成核酸溶液，核酸浓度为15～25mg/L。分别取等量的上述纳米粒混悬液和核酸溶液，涡旋混匀即得核酸纳米粒。
采用上述方法制得的复溶性聚氰基丙烯酸酯纳米粒冻干制品，用水等介质复溶后，具有纳米级粒子性质，可作为核酸载体用于基因治疗，对核酸起到保护作用，防止DNA酶降解，提高细胞摄入率，达到抑制肿瘤细胞、治疗疾病的目的。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1.解决了现有技术制备的该类制品干燥后不能复溶的问题。采用本发明提供的技术制备的聚氰基丙烯酸酯纳米粒所得到的干燥品，用水等介质复溶后，能保持干燥前纳米粒的性质，具有形态规整，大小均匀，表面Zeta电势高等特点。
2.本发明所得的冻干制品载核酸效率高，复溶前后载核酸能力不降低，稳定性好，室温下能长期保存。
附图说明
图1为激光共聚焦荧光显微镜观察细胞摄入核酸纳米粒结果图。
图2为激光共聚焦荧光显微镜观察细胞摄入游离核酸结果图。
图3为琼脂糖凝胶电泳分析图，其中1—6样品为酶切后的样品，1’—6’为相对应的未酶切的对照样品。
附图含义说明见实施例9。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述，但不局限于下列实施例。
实施例1
称取DEAE-Dextran 1.2份，Dextran-70 3.0份，将其溶于pH为2.0的250份盐酸溶液中，在搅拌条件下，向上述混合溶液中滴加1.6份氰基丙烯酸甲酯单体，滴加完毕后，继续搅拌6h，然后加入葡萄糖25份，甘露醇10份，搅拌15min，即得聚氰基丙烯酸甲酯纳米粒混悬液；在-40℃的低温下进行预冻约5h，完成预冻后取出，迅速放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，直到水分完全除去，即得复溶性聚氰基丙烯酸甲酯纳米粒冻干制品，呈白色，疏松块状。
复溶方法：在使用时，取上述制得的聚氰基丙烯酸酯甲酯纳米粒冻干粉一定量，加超纯水适量复溶，成纳米粒混悬液；
表1 聚氰基丙烯酸甲酯纳米粒复溶前后主要指标
 
样品 粒径(nm) Zeta电势(mv) 载核酸量
干燥前 136.8 32.6 79.36μg/mg
复溶后 135.9 31.8 78.98μg/mg
实施例2
称取DEAE-Dextran 1.2份，Dextran-70 2.4份，将其溶于pH为2.5的250份盐酸溶液中，在搅拌条件下向上述混合溶液中滴加2.3份的氰基丙烯酸甲酯单体，滴加完毕后，继续搅拌6h，然后加入葡萄糖25份，甘露醇10份，搅拌15min，即得聚氰基丙烯酸甲酯纳米粒混悬液；在-40℃的低温下进行预冻约5h，完成预冻后取出，迅速放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，直到水分完全除去，即得冻复溶性聚氰基丙烯酸甲酯纳米粒冻干制品，呈白色，疏松块状。
复溶方法同实施例1。
表2 聚氰基丙烯酸甲酯纳米粒复溶前后主要指标
 
样品 粒径(nm) Zeta电势(mv) 载核酸量
干燥前 145.6 34.2 81.6μg/mg
复溶后 146.2 33.9 82.2μg/mg
实施例3
称取DEAE-Dextran 1.5份，Dextran-70 1.5份，将其溶于100份pH为2.2的盐酸溶液中，在搅拌条件下向上述混合溶液中滴加2.6份氰基丙烯酸乙酯单体，滴加完毕后，继续搅拌4h，然后加入葡萄糖20份，甘露醇15份，搅拌20min，即得聚氰基丙烯酸乙酯纳米粒混悬液；在-40℃的低温下进行预冻约5h，完成预冻后取出，迅速放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，直到水分完全除去，即得复溶性聚氰基丙烯酸乙酯纳米粒冻干制品，呈白色，疏松块状。
复溶方法同实施例1。
表3 聚氰基丙烯酸乙酯纳米粒复溶前后主要指标
 
样品 粒径(nm) Zeta电势(mv) 载核酸量
干燥前 153.2 36.5 68.8μg/mg
复溶后 153.8 35.9 67.6μg/mg
实施例4
称取DEAE-Dextran 0.9份，Dextran-70 1.5份，将其溶于pH为2.3的120份盐酸溶液中，在搅拌条件下向上述混合溶液中滴加1.2份氰基丙烯酸乙酯单体，滴加完毕后，继续搅拌8h，然后加入葡萄糖15份，甘露醇10份，搅拌20min，即得聚氰基丙烯酸乙酯纳米粒混悬液；在-40℃的低温下进行预冻约5h，完成预冻后取出，迅速放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，直到水分完全除去，即得复溶性聚氰基丙烯酸乙酯纳米粒冻干制品，呈白色，疏松块状。
复溶方法同实施例1。
表4 聚氰基丙烯酸乙酯纳米粒复溶前后主要指标
 
样品 粒径(nm) Zeta电势(mv) 载核酸量
 
干燥前 140.5 33.7 70.2μg/mg
复溶后 142.2 32.3 71.3μg/mg
实施例5
称取DEAE-Dextran 1.2份，Dextran-70 1.8份，将其溶于200份pH为1.6的盐酸溶液中，在搅拌条件下向上述混合溶液中滴加1.9份的氰基丙烯酸丁酯单体，滴加完毕后，继续搅拌4h，然后加入葡萄糖25份，甘露醇12份，搅拌30min，即得聚氰基丙烯酸丁酯纳米粒混悬液；在-40℃的低温下进行预冻约5h，完成预冻后取出，迅速放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，直到水分完全除去，即得复溶性聚氰基丙烯酸丁酯纳米粒冻干制品，呈白色，疏松块状。
复溶方法同实施例1。
表5 聚氰基丙烯酸丁酯纳米粒复溶前后主要指标
 
样品 粒径(nm) Zeta电势(mv) 载核酸量
干燥前 145.6 35.7 85.9μg/mg
复溶后 151.5 36.1 85.3μg/mg
实施例6
称取DEAE-Dextran 1.2份，Dextran-70 2.4份，将其溶于180份pH为1.6的ml盐酸溶液中，在搅拌条件下向上述混合溶液中滴加1.6份的氰基丙烯酸丁酯单体，滴加完毕后，继续搅拌4h，然后加入葡萄糖25份，甘露醇12份，搅拌30min，即得聚氰基丙烯酸丁酯纳米粒混悬液；在-40℃的低温下进行预冻约5h，完成预冻后取出，迅速放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，直到水分完全除去，即得复溶性聚氰基丙烯酸丁酯纳米粒冻干制品，呈白色，疏松块状。
复溶方法同实施例1。
表6 聚氰基丙烯酸丁酯纳米粒复溶前后主要指标
 
样品 粒径(nm) Zeta电势(mv) 载核酸量
干燥前 123.5 33.7 81.6μg/mg
复溶后 125.9 32.3 80.8μg/mg
实施例7
称取DEAE-Dextran 1.0份，Dextran-70 3.2份，将其溶于140份pH为2.5的盐酸溶液中，在搅拌条件下向上述混合溶液中滴加2.0份的氰基丙烯酸己酯单体，滴加完毕后，继续搅拌3h，然后加入葡萄糖20份，甘露醇6份，搅拌20min，即得聚氰基丙烯酸己酯纳米粒混悬液；在-50℃的低温下进行预冻约3h，完成预冻后取出，迅速放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，直到水分完全除去，得干燥品，呈白色，疏松块状。
复溶方法同实施例1。
表7 聚氰基丙烯酸己酯纳米粒复溶前后主要指标
 
样品 粒径(nm) Zeta电势(mv) 载核酸量
干燥前 171.7 39.5 80.1μg/mg
复溶后 169.5 38.1 79.6μg/mg
实施例8
称取DEAE-Dextran 1.0份，Dextran-70 1.8份，将其溶于150份pH为2.5的盐酸溶液中，在搅拌条件下向上述混合溶液中滴加1.8的氰基丙烯酸己酯单体，滴加完毕后，继续搅拌3h，然后加入葡萄糖16份，甘露醇4份，搅拌20min，即得聚氰基丙烯酸己酯纳米粒混悬液；在-45℃的低温下进行预冻约4h，完成预冻后取出，迅速放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，直到水分完全除去，得干燥品，呈白色，疏松块状。
复溶方法同实施例1。
表8 聚氰基丙烯酸己酯纳米粒复溶前后主要指标
 
样品 粒径(nm) Zeta电势(mv) 载核酸量
干燥前 165.3 37.5 78.6μg/mg
复溶后 166.2 36.9 78.3μg/mg
实施例9
取上述制备的聚氰基丙烯酸酯甲酯纳米粒冻干粉冻一定量，加超纯水或生理盐水或其他纯水适量复溶，使纳米粒的浓度为200mg/L；取核酸一定量，加超纯水使成20mg/L。分别取等量的上述纳米粒混悬液和核酸溶液，涡旋混匀20min即得核酸纳米粒。
在96孔板上按5×103/孔接种A549细胞。24h后吸弃旧培养基，加入新培养基50μL，将上述所得核酸纳米粒加入到细胞培养基中，并保证96孔板的每个孔内液体总量达100μL，且每孔内核苷酸总量浓度为16μmol/L。30min后用滴管吸取细胞培养液适量点在载波片上，用激光共聚焦荧光显微镜观察。附图1、2表明：核酸纳米粒与游离核酸相比，细胞摄入量明显增多。
取一定量核酸纳米粒和核酸，分别加入适量DNase，混匀，37℃恒温水浴30分钟，然后进行琼脂糖凝胶电泳分析。
               表9 凝胶电泳分析实验表
Figure C200610048453D00091
从图3可以看出，未酶切对照品1’4’5’6’向正极方向出现亮条带，这些亮条带均为游离的ODNs条带；未酶切对照品2’3’4’5’在原点处出现条带，这些均为纳米粒上的ODNs结合后所发出的荧光。酶切后样品在正极方向没有出现条带，表明游离的ODNs已经分解；负极方向及原点处与对应的对照品有相似的结果，这表明DEAE-Dextran-NP可有效抑制核酸酶对ODNs的酶解，对ODNs有较好的保护作用。

Claims (4)

1.一种复溶性聚氰基丙烯酸酯纳米粒，其特征在于：主要由聚氰基丙烯酸酯、DEAE-Dextran、Dextran-70、葡萄糖和甘露醇组成，各组分的质量百分数为聚氰基丙烯酸酯2.0～16.3％、DEAE-Dextran 1.9～8.8％、Dextran-70 3.3～19.0％、葡萄糖30.3～79.6％、甘露醇8.3～52.8％，
复溶性聚氰基丙烯酸酯纳米粒的制备方法为：以葡萄糖和甘露醇为保护剂，
a.按照0.9～1.5：1.5～3.5的质量比称取DEAE-Dextran和Dextran-70共2～4.5份，将其溶于80～250份pH为1.5～2.5的盐酸溶液中，在搅拌条件下，向上述混合溶液中滴加氰基丙烯酸酯单体1～3份，滴加完毕后，继续搅拌3～8h，然后加入葡萄糖10～25份、甘露醇3～15份，搅拌10～30min，得聚氰基丙烯酸酯纳米粒混悬液，
b.将上述混悬液放入一30～—50℃的低温冷冻室预冻1～5h，然后冷冻干燥，除去水分，即得产物。
2.依照权利要求1所述复溶性聚氰基丙烯酸酯纳米粒，其特征在于：所说聚氰基丙烯酸酯为聚氰基丙烯酸甲酯、聚氰基丙烯酸乙酯、聚氰基丙烯酸丁酯或聚氰基丙烯酸己酯中的一种。
3.依照权利要求1所述的复溶性聚氰基丙烯酸酯纳米粒，其特征在于：氰基丙烯酸酯单体为氰基丙烯酸甲酯单体，氰基丙烯酸乙酯单体，氰基丙烯酸丁酯单体和氰基丙烯酸己酯单体中的一种。
4.依照权利要求1所述的复溶性聚氰基丙烯酸酯纳米粒，其特征在于：复溶性聚氰基丙烯酸酯纳米粒作为核酸载体用于基因治疗，对核酸起到保护作用，防止DNA酶降解，提高细胞摄入率，达到抑制肿瘤细胞的目的。
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