CN112156187A - 一种具有可调光热转化能力的聚吡咯纳米颗粒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有可调光热转化能力的聚吡咯纳米颗粒的制备方法，其特征在于，通过常温下的氧化聚合反应制得，并同步实现聚吡咯纳米颗粒的合成及表面修饰。本发明工艺简单，较常规思路不需要制冷等控制温度手段，且制得的PPy‑PVP NPs具有良好的胶体稳定性，生物相容性，该纳米颗粒具有较高的光热转化能力。
Description
技术领域
本发明涉及一种可调光热转化能力的聚吡咯纳米颗粒的制备方法，属于生物纳米材料技术领域。
背景技术
当今使用的大多数光热切除疗法(PTA)，例如金纳米颗粒，钯纳米颗粒，硫化铜纳米颗粒，都是无机和体内不可生物降解的材料，有可能导致长期的生物毒性。
共轭有机聚合物，例如聚吡咯(PPy)，聚多巴胺(PDA)和聚苯胺已成为新的候选物质。其中，PPy因其合成方法简单，近红外吸收强，光热转换效率高而成为热点。然而，传统的PPy合成方法通常需要低温环境来控制聚合速率，这是耗能的。此外，裸露的PPy粒子胶体稳定性差，其微观形貌直接影响PPy的吸光性。因此，重要的是找到合适的方法来实现其形态和光热容量的可控性。
据报道，掺杂剂的添加可以调节PPy的形态和性能。例如，一些研究人员使用聚乙烯醇(PVA)作为稳定剂合成了PPy纳米颗粒。PVP作为具有长期生物安全性的非离子表面活性剂，不仅用作限制纳米颗粒生长的模板。而且作为药物载体来改善药物在血液中的循环半衰期。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：现有PPy粒子胶体稳定性差的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种具有可调光热转化能力的聚吡咯纳米颗粒的制备方法，其特征在于，通过常温下的氧化聚合反应制得，并同步实现聚吡咯纳米颗粒的合成及表面修饰。得到的产物记为PPy-PVP NPs。
优选地，上述制备方法，包括以下步骤：
步骤1)：将PVP置于烧杯中，并将其溶解在蒸馏水中；
步骤2)：将FeCl3·6H2O添加到步骤1)得到的溶液中，在室温下搅拌均匀；
步骤3)：将步骤2)得到的溶液与另一个装有吡咯的容器在封闭盖中平行放置进行反应，通过离心收集形成的两种PPy-PVP NPs，并用蒸馏水洗涤。
更优选地，所述步骤1)中PVP的分子量MW为40000～360000Da。
更优选地，所述步骤1)得到的溶液浓度为10-30mg/mL。
更优选地，所述步骤2)中FeCl3·6H2O的添加量为0.01-1.0g/mL。
更优选地，所述步骤2)中搅拌的时间为1-10min。
更优选地，所述步骤3)中吡咯与FeCl3·6H2O的质量比为10:1-20:1。
更优选地，所述步骤3)中反应的时间为1-15h。
更优选地，所述步骤3)中蒸馏水洗涤的次数为3-5次。
本发明工艺简单，较常规思路不需要制冷等控制温度手段，节约能源。
本发明通过气相沉积合成了PPy纳米复合材料(PPy-PVP)，其中吡咯(Py)的蒸气被PVP(聚乙烯吡咯烷酮)水溶液吸收，并探讨其与化疗药物联合使用时对肿瘤的治疗作用。与传统的PPy合成方法不同，这种缓慢的蒸气产生和吸收过程允许在室温下形成均匀的PPy-PVP纳米颗粒。然后，比较研究了PVP的分子量对光热性能的影响。
本发明所得产物容易制备且无毒，并在细胞及动物水平具有良好的生物相容性、胶体稳定性。通过本发明的方法制备得到的PPy-PVP纳米颗粒具有优异的光热转化能力/效率，有望应用于肿瘤的光热领域。
附图说明
图1为PPy-PVP NPs的SEM显微照片和直径分布直方图；其中，(a)、(b)为PPy-PVP40kDa NPs，(c)、(d)为PPy-PVP 360kDa NPs；
图2为分散在盐水中的PPy-PVP NPs的时间依赖性DLS图谱；其中，(a)为PPy-PVP40kDa，(b)为PPy-PVP 360kDa；
图3为PPy-PVP40kDa和PVP40kDa的FTIR结果；
图4为PPy-PVP NPs溶液的UV-vis-NIR吸收光谱；其中，(a)为不同浓度的PPy-PVP40kDa溶液，(b)为不同浓度的PPy-PVP360kDa溶液，(c)为PPy-PVP40kDa NPs和PPy-PVP360kDa NPs两种浓度为75μg/mL的溶液；
图5为不同光照射下PPy-PVP NPs水溶液的温度与时间的变化曲线；其中，(a)为近红外激光照射下PPy-PVP NPs水溶液的温度变化曲线，(b)为808nm NIR激光照射下PPy-PVP40kDa水溶液的温度变化曲线，(c)为不同功率密度的808nm激光辐照下PPy-PVP 40kDa水溶液的温度变化曲线，(d)为PPy-PVP NPs的稳态光热曲线，(e)为808nm的8个开/关激光循环下PPy-PVP40kDa的光热循环曲线，(f)为1064nm的8个开/关激光循环下PPy-PVP40kDa的光热循环曲线；
图6为不同浓度的PPy-PVP 40kDa共培养的细胞存活情况；其中，(a)为不同浓度的PPy-PVP 40kDa NPs共培养的L929细胞的存活率；(b)-(e)为不同浓度溶液中各组细胞的色氨蓝染色细胞形态学图，(f)-(i)为不同浓度溶液中每组的相应的活/死染色图像；
图7为小鼠生命体征的变化图；其中，(a)为不同浓度的PPy-PVP溶液共孵育小鼠红细胞后的HP，(b)为分别注射PBS和PPy-PVP NPs后的小鼠血液生化指标，(c)为分别注射PBS和PPy-PVP NPs后的小鼠体重变化曲线；
图8为对照组和实验组小鼠H&E切片的染色结果；
图9为不同浓度的PPy-PVP NPs共孵育后，HT29细胞的存活情况；其中，(a)为存活率，(b)-(f)分别为对照组、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL和200μg/mL组中细胞的活/死染色图像；
图10为在808nm激光照射下分别注射PPy-PVP 40kDa、PPy-PVP 360kDa NPs和PBS的裸鼠的温度变化曲线(a)与对应的光热成像图(b)；
图11为不同处理后裸鼠的肿瘤体积随时间变化的曲线(a)与对应的肿瘤图(b)。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
实施例1
本实施例提供了一种聚吡咯复合纳米颗粒的制备方法，具体步骤如下：
步骤1：称量0.2g具有不同分子量(MW＝40kDa和360kDa)的PVP，并将其溶于烧杯中的40mL蒸馏水中。
步骤2：将0.62g FeCl3·6H2O添加到上述溶液中，并在室温下搅拌5分钟以获得均匀的黄色溶液；将上述溶液与另一个装有10mL吡咯的烧杯在封闭盖中平行放置7h。反应后，通过离心收集形成的PPy-PVP NPs，并用蒸馏水洗涤3次。
图1为本发明的实施例的PPy-PVP NPs的扫描电镜图。观察结果如图1及图2所示，在最优的参数条件下，合成的PPy-PVP NPs分散性较好，颗粒大小均匀。
实施例2
使通过分光光度计在紫外可见-近红外(UV-vis-NIR)范围中测量PPy-PVP的光谱特性。使用傅立叶变换红外光谱仪(FTIR)分析PPy-PVP NPs的组成和结构。将冷冻干燥的材料和纯PVP与KBr混合，并使用研磨机(30MPa，130s)压成薄片，以扫描4000-400cm-1范围内的光谱数据。
图3结果表明，在PPy-PVP40kDa的光谱中检测到了与PVP相对应的1290cm-1、1431cm-1和1665cm-1处的特征峰。PPy-PVP40kDa和PPy-PVP360kDa在NIR区域具有明显的吸收。PVP对近红外区域的光吸收没有贡献。因此，在相同浓度下，PPy-PVP40kDa的光吸收能力要高于PPy-PVP360kDa的光吸收能力，如图4中(a)所示。而且，两种材料的光吸收能力与它们的浓度成正比如图4中(b)、(c)所示。
实施例3
PPy-PVP NPs的光热特性测试。将PPy-PVP NPs分散到96孔细胞培养板中，并用808nm和1064nm NIR激光(1W/cm2)连续照射5分钟。FLIR E60红外热像仪用于记录温度随时间的变化以及相应的图像。808nm NIR激光(1W/cm2)辐照不同浓度(50μg/mL，150μg/mL和200μg/mL)的PPy-PVP40kDa水溶液的温度曲线和PPy-PVP40kDa(100μg/mL)的温度曲线还记录了用808nm激光以不同的功率(0.3W/cm2、0.5W/cm2和0.8W/cm2)照射的水溶液。为了计算光热转换效率(η)，使用808nm NIR激光(0.3W/cm2，5分钟)照射PPy-PVP溶液(100μL，100μg/mL，PPy-PVP40kDa和PPy-PVP360kDa)。然后，关闭激光器以将溶液冷却5分钟至室温。对照组用100μL蒸馏水代替。记录10分钟内的温度变化。在光热稳定性研究中，将100μL PPy-PVP水溶液(100μg/mL，PPy-PVP40kDa和PPy-PVP360kDa)分散到细胞培养板(96孔)中。在NIR激光(0.5W/cm2，808nm)照射8个激光开/关循环期间(对于激光开/关为5分钟)，使用FLIR E60红外热像仪记录溶液的温度变化。
结果表明，当用NIR激光(808nm，1W/cm2)照射PPy-PVP NPs(PPy-PVP40kDa和PPy-PVP360kDa，100μg/mL)时，溶液的温度连续升高，如图5中(a)所示。激光照射5分钟后，PPy-PVP40kDa和PPy-PVP360kDa的溶液分别升高35.7℃和33.9℃，这表明通过降低PVP的分子量可以提高材料的光热转化率。当用1064nm激光器更换NIR激光器时，光热转换的差异更加明显：PPy-PVP40kDa和PPy-PVP360kDa的溶液温度分别提高了31.9℃和27.0℃。通过调节PVP的分子量，可以优化材料的光热转化性能。并且由于更好的光吸收，PPy-PVP40kDa显示出较好的光热转换性能。为了研究材料浓度的影响，更改了PPy-PVP40kDa的浓度，发现浓度为200μg/mL，150μg/mL和50μg/mL的PPy-PVP40kDa溶液的溶液温度提高了45.7℃。在相同的激光照射下，温度分别为40℃，42.0℃和28.3℃，如图5中(b)所示。这是因为材料的浓度越高，将吸收更多的能量。此外，光热转换还与激光功率密度有关，如图5中(c)所示。在功率密度分别为0.8W/cm2、0.5W/cm2和0.3W/cm2的情况下，PPy-PVP40kDa的溶液温度分别升高了30.8℃，20.2℃和12.0℃。
实施例4
体外细胞相容性的评估。首先，将细胞接种在细胞培养板(96孔，8000个细胞/孔)中，并在5vol％CO2恒温箱(37℃)中培养。24小时后，分别将含有DMEM溶剂的PPy-PVP NPs(PPy-PVP40kDa，100μL)加入孔中，继续培养24小时。用DMEM处理的细胞组用作对照。吸出DMEM，用PBS洗涤细胞3次，并用Leica DMIL LED观察并拍照。确定不同材料对细胞存活率的影响：将细胞计数试剂盒8溶液缓慢加入到处理过的细胞中，并在450nm处吸收。培养2小时后用微孔板显微镜测定。测定后，将细胞用PBS洗涤3次，并向每个孔中添加100μL色氨蓝染色15分钟。吸入色氨蓝后，将其冲洗(PBS，3次)，并用显微镜观察其存活(死细胞染成蓝色)。
CCK-8分析的结果表明，与不同浓度的PPy-PVP纳米材料一起孵育后，其存活率当材料浓度不高于100μg/mL时(相对百分比分别为94.5±7.0％，91.8±9.6％，82.5±8.5％，75.6±7.4％)，L929细胞超过90％。良好的细胞相容性，如图6中(a)所示。用纳米材料处理过的细胞的形态和结构完整性没有被破坏，如图6中(b)-(e)所示。用活/死试剂染色后，几乎所有细胞都染成绿色(死细胞染成红色，图6中(f)-(i)所示。以上结果证明，当浓度不高于100μg/mL时，PPy-PVP纳米材料具有优异的细胞相容性。
实施例5
体外血液相容性的评估：将1mL昆明(KM)小鼠全血添加到PBS中并洗涤3次。离心后，通过PBS将获得的小鼠红细胞稀释为红细胞悬液的50倍。然后，制备包含0.3mL红细胞悬液和1.2mL PPy-PVP NPs(PPy-PVP40kDa，0.1mg/mL，在PBS中)的1.5mL混合物。将0.3mL红细胞悬浮液与1.2mL PBS和蒸馏水混合，分别作为阴性对照和阳性对照。为了计算溶血率(HP)，将上述处理的细胞在37℃的恒温箱中保温2小时后进行离心。用Uv-vis-NIR分光光度计测定上清液在570nm处的吸光度。
组织分布和生物安全性评估。昆明小鼠随机分为实验组和对照组。在对照组和实验组的小鼠尾静脉中分别注射200μL PBS和PPy-PVP NPs(PPy-PVP40kDa：PBS中的1mg/mL)。在注射材料后的第7天和28天分别麻醉实验组的三只KM小鼠，并获得新鲜血液和主要器官(肾脏，脾脏，心脏，肝脏和肺脏)。对照组的三只KM小鼠分别在PBS注射后第28天麻醉。获得了这些小鼠的新鲜血液和主要器官。分别使用血液分析仪(SYSMEXXS-800I)和生化分析仪(DXC800)进行血液常规和血清生化测试。将器官置于低聚甲醛溶液中，并进行苏木精-曙红(H&E)染色。使用显微镜观察每个组织切片的病理变化。
血液相容性实验结果证明，PPy-PVP NPs不会对KM小鼠的mRBC造成明显损害。从图7中(a)可以看出，用50μg/mL，100μg/mL，150μg/mL和200μg/mL NPs处理的小鼠红细胞的HP分别为1.9％，2.8％，2.8％和3.1％，分别表明红细胞与PPy-PVP NP之间无明显反应。相反，用水处理的红细胞被扩张。因此，PPy-PVP NPs在实验剂量下具有出色的体外血液相容性。
通过测试KM小鼠的血液相容性和组织切片，评估了PPy-PVP NPs的长期生物安全性。与对照组相比，实验组的血液常规和生化指标无明显差异，并随时间的增加而处于正常范围内，如图7中(b)所示。因此，可以推断PPy-PVP NPs在体内具有良好的血液相容性。接下来，我们记录了对照组和实验组小鼠的体重和组织状态，以进一步讨论PPy-PVP NPs在体内的生物相容性。发现在喂养期间，实验组和对照组小鼠的体重波动，但基本上彼此重合，如图7中(c)所示。H&E染色进一步证实PPy-PVP NPs对小鼠组织没有明显的副作用和病态毒性，如图8所示。这些实验结果证明PPy-PVP NPs在体内具有适当的生物安全性。
实施例6
将HT29细胞接种在细胞培养板中(96孔，8000个细胞/孔)，并在5vol％CO2恒温器(37℃)中孵育。培养24小时后，加入PPy-PVP40kDa(50μg/mL，100μg/mL，150μg/mL和200μg/mL)，并与细胞一起温育12小时。在对照组中，用PBS培养细胞。然后，用808nm NIR激光(1W/cm2，5分钟)照射它们。再培养24小时后，进行CCK-8测试和活/死细胞染色(死细胞染成红色)以评估体外肿瘤治疗效果。
鉴于PPy-PVP NPs具有良好的光热性质和生物相容性，选择HT29细胞作为肿瘤模型，以探讨PPy-PVP NPs的体外治疗效果。如图9中(a)所示，在应用808nm NIR激光后，PPy-PVP NPs的光热消融显着抑制了细胞增殖，并且随着材料浓度的增加，抑制作用增强。对应于200μg/mL，150μg/mL，100μg/mL，50μg/mL和对照的细胞存活率分别为5.6％，8.3％，10.1％，38.0％和100.0％，表明该材料具有优良的光热治疗效果。有趣的是，50μg/mL组和100μg/mL组之间的细胞存活率差异大于其他两个相邻组，表明当剂量达到约100μg/mL时，治疗效果可能相对较好。活/死染色的染色结果表明，当物质浓度超过100μg/mL时，几乎所有细胞都是红色的，如图9中(b)-(f)所示，进一步证明了PPy-PVP NPs的光热容量可以抑制癌症的扩散细胞。
实施例7
体内肿瘤治疗：将分散在DMEM中的HT29细胞(1×107)(不添加胎牛血清)皮下注射到Balb/c裸鼠的背部。约2周后，获得Balb/c裸鼠的肿瘤模型。实验组的两组裸鼠经尾静脉分别以200μL 1000μg/mL PPy PVP40kDa和PPy-PVP360kDa的PBS注射。将这些注射的材料进行血液稀释(总体积：～2.0mL)。因此，血液中的最终浓度不超过100μg/mL。最后，用808nm NIR激光(1W/cm2，5分钟)照射裸鼠的肿瘤。用红外热成像仪记录温度变化和相应的图像。在接下来的28天喂养期间，定期测量裸鼠的肿瘤大小，并通过照相观察肿瘤的变化。
在证明PPy-PVP NPs的体外肿瘤治疗效果后，我们选择了Balb/c裸鼠的肿瘤模型以探索该材料在体内的治疗效果。此外，PPy-PVP NPs在体内对肿瘤的治疗作用还与材料的表面性质有关。如图10所示，在808nm激光照射5分钟后，尾静脉注射PPy-PVP40kDa和PPy-PVP360kDa后小鼠的肿瘤温度分别升高了8.8℃和7.0℃。相反，注射PBS的小鼠的肿瘤温度没有明显改变。定期测量裸鼠的肿瘤大小，如图11所示，观察到肿瘤无明显变化。
Claims (9)
1.一种具有可调光热转化能力的聚吡咯纳米颗粒的制备方法，其特征在于，通过常温下的氧化聚合反应制得，并同步实现聚吡咯纳米颗粒的合成及表面修饰。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)：将PVP置于烧杯中，并将其溶解在蒸馏水中；
步骤2)：将FeCl3·6H2O添加到步骤1)得到的溶液中，在室温下搅拌均匀；
步骤3)：将步骤2)得到的溶液与另一个装有吡咯的容器在封闭盖中平行放置进行反应，通过离心收集形成的两种PPy-PVP NPs，并用蒸馏水洗涤。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中PVP的分子量MW为40000～360000Da。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)得到的溶液浓度为10-30mg/mL。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中FeCl3·6H2O的添加量为0.01-1.0g/mL。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中搅拌的时间为1-10min。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中吡咯与FeCl3·6H2O的质量比为10:1-20:1。
8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中反应的时间为1-15h。
9.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中蒸馏水洗涤的次数为3-5次。
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