CN100447245C - 钠通道调制剂BmKαⅣ基因及其克隆、重组蛋白表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种钠通道调制剂BmK αIV基因及其克隆、重组表达及功能鉴定方法。属分子生物学和生物技术领域。本发明提供了BmK αIV全基因克隆操作的技术路线。建立了基因工程方法重组表达、纯化功能性BmK αIV多肽的技术体系。提供了BmK αIV与大鼠突触体膜和蟑螂神经索突触体膜钠通道标本结合的动力学参数。本发明提供了BmK αIV对大鼠DRG神经元钠通道调节的作用和技术参数。本发明提供了BmK αIV对rNav1.2钠通道调节的作用和技术参数。从上述实验可知，BmK αIV是一个新型的具有独特结构和功能的肽类钠通道调制剂，可作为研究钠通道组成和生物化学信号特征的工具药，并可开发为调节和治疗钠通道相关生理和病理现象的药物或药物先导。BmK αIV的基因工程表达技术为以后的工厂化表达提供了可行、可靠的强有力技术保障。

Description

钠通道调制剂BmKαⅣ基因及其克隆、重组蛋白表达方法

技术领域

本发明涉及一种钠通道调制剂BmKαIV基因及其克隆、重组表达方法。属分子生物学和生物技术领域。

背景技术

电压门控钠通道在生物体可兴奋细胞动作电位产生和传播的过程中起了极其重要的作用。神经毒素已经作为一种探针已经被广泛用于钠通道亚型及特性的鉴定和识别。目前发现，在钠通道蛋白上至少有七种完全不同的特异性神经毒素受体位点已经被鉴定。

蝎毒是一类丰富的多肽类神经毒素资源，它能与可兴奋细胞膜上多种离子通道特异性的结合。绝大多数已知的蝎毒致死成分主要是由60～70个残基组成、分子内含4对二硫键的单链多肽。根据与钠通道不同受体位点作用模式和药理学结合特性，蝎毒素可被划分为α-和β-两种类型。α-型蝎神经毒素作用于钠通道的第3结合位点，它可以抑制钠通道的失活化从而延长动作电位。根据其对哺乳动物和昆虫作用的偏爱性以及药理学结合特性，α-蝎神经毒素又被分为三种不同的类型。经典的α-蝎神经毒素对大鼠脑的钠通道有较高亲和力，对哺乳动物有较强的毒性，但是对昆虫几乎没有毒性；α-昆虫毒素与昆虫的钠通道具有高亲和力，但对哺乳动物作用不显著；类α-蝎神经毒素对哺乳动物和昆虫的中枢神经系统均有明显作用。β-型蝎毒素被认为可识别并结合到钠通道第4受体位点并易化钠通道的电压依赖性激活。根据它们的药理学结合特征，β-型蝎毒素又被分为如下几类：β-哺乳动物类毒素，β-昆虫及哺乳类毒素，选择性兴奋型昆虫毒素，选择性抑制型昆虫毒素以及类β毒素。

多肽类蝎神经毒素功能和结构的特异性为研究钠通道的结构、功能和分布提供了新的分子模板。新型肽类神经毒素的发现将加快我们对各种钠通道受体结合位点的认识，更有利于筛选和设计选择性作用于钠通道的新型特效药物，并有助于理解多肽类毒素以及蝎种的进化。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种钠通道调制剂BmKαIV基因。

本发明的目的之二在于提供该钠通道调制剂BmKαIV基因的克隆方法。

本发明的目的之三在于提供该钠通道调制剂BmKαIV基因的重组蛋白表达方法。

本发明的目的之四在于提供该钠通道调制剂BmKαIV基因在制备研究钠通道组成和生物化学信号特征的工具药中的应用。

本发明的目的之五在于提供该钠通道调制剂BmKαIV基因在制备调节和治疗钠通道相关生理和病理现象的药物或药物先导中的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种钠通道调制剂BmKαIV基因的克隆方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.利用TRIZOL试剂盒，从东亚钳蝎的毒腺中提取总RNA，将提取的总RNA反转录为cDNA，在5’RACE中作为模板；

b.根据已知的经典a毒素的和BmK α1的保守序列设计引物：

Primer 1：5′-TTATGATACATTCCATCTTA-3′

Primer 2：5’-CTTTCCCAGAAAATTCCGTAAAACGGTTC-3’；

c.进行聚合酶链式反应；

d.将扩增产物纯化，取5μl纯化产物克隆到pGEM-T Easy载体，转化DH5α细胞，平板过夜培养，挑取5个白斑，提取质粒，用于序列测定，得到BmKαIV的基因组DNA片断，长度为896bp。

上述的聚合酶链式反应的试剂与条件如下：

首先将下列试剂混在一起，

10Taq聚合酶缓冲液      5微升

模板基因组DNA          1微升

1.25ug/ul primer1      1微升

1.25ug/ul primer2      1微升

脱氧核苷酸混和物dNTP   4微升

Taq DNA聚合酶          0.25微升

灭菌水                 37.75微升

总体积                 50微升

PCR反应条件为：首先94℃变性3分钟，然后进入下列循环：94℃30秒，55℃45秒，72℃45秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟，4℃保存。经过上述克隆过程得到以下序列：

序列表

(1)SEQ ID NO 1的信息

(a)序列特征：

长度：896碱基对

类型：核酸

链型：双链

拓扑结构：线性

(b)分子类型：Genomic DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：东亚钳蝎毒腺

(f)序列描述：SEQ ID NO.1。BmKαIV的基因组序列全长为896bp。它由两个外显子组成，中间为503bp的内含子(小写，116-618)。5′和3′的剪切位点分别是GTAAGATTTA和CTGACTACAG。加工后的多肽链由两部分组成：19个氨基酸的信号肽(大写斜体，70-115和619-629)和66个氨基酸的多肽链(大写，630-830)。终止信号(AATAAA)位于终止密码子(TAA)的下游47bp处。

1AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGGCAACAATCTTTCCCAGAAAATTCCGTAAAA   60

61CGGTTCAAAATGAATTATTTGGTATTTTTTAGTTTGGCACTTCTTCTAATGACAGgtaag  120

121atttacatattcatagaataagtcttacaaatattgtagttggccggatatccgcgtggt 180

181gaagctttgaatcttcggcttaacatgtggaagatccggattcaaatccgggtccatcac 240

241cctcagattttcagcagaggaccagccaacctgttgaaccacatccttcagccatccggt 300

301tgaccccatcaagggtggtggccagcctggtatggggtctctaaatggccgccgccagat 360

361atagaatatcccatcaggatatggcggcttaatctaattaacctaacctaatctaacgaa 420

421tattgtatatggtattaagatttttttgactgcaaaatattccattcttgtaaactatga 480

481aaaatggaaaatcgtgtttgcaggatatagtcttcaaaagattcatgactgacctgcaaa 540

541catcaaatttgatgattctaatttaatgttttctaacattttataattttattaatagag 600

601ttatttttctgactacagGTGTGGAGAGTGTACGCGATGGTTATATTGCCGACGATAAAA 660

661ATTGCGCATATTTTTGTGGTAGAAATGCGTATTGCGATGACGAATGTAAGAAGAAGGGTG 720

721CTGAGAGTGGCTATTGCCAATGGGCAGGTGTATACGGAAACGCCTGCTGGTGCTATAAAT 780

781TGCCCGATAAAGTACCTATTAGAGTACCAGGAAGATGCAATGGCGGTTAAATTGTAAGAT 840

841GGAATGTATCATAAATATAACTGTTAAATAATTAAATAATAAAATTACATTTTTCA(n)  896

本发明涉及设计引物克隆BmKαIV的全序列，推导出成熟的BmKαIV由66个氨基酸组成。利用Vector NTI 5.5biosoftware(Informax，USA)进行序列分析比较发现，BmKαIV的氨基酸序列与已知的大多数钠通道调制剂多肽有高的同源性。

SEQ ID NO.2的信息

(a)序列特征

长度：66氨基酸

类型：氨基酸

(b)分子类型：多肽

(c)序列描述

1VRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKKGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNGG 66

根据权利要求1所述的钠通道调制剂BmKαIV基因的表达方法，其特征在于，根据上述序列设计的引物是：

正向引物：5’-TGGAGTTAACATATGGTACGCGATGGTTATATTG-3’

反向引物：5’-GTGCACTGGATCCTTAACCGCCATTGCATCTTCC-3’

将BmKαIV基因组DNA片断插入表达载体pET-28a(+)，构建成重组表达质粒；重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，然后细胞裂解液经His亲和柱、凝血酶切割和HPLC纯化得到BmKαIV多肽，通过质谱鉴定了其分子量为7733.59Da。

上述钠通道调制剂BmKαIV基因在制备研究钠通道组成和生物化学信号特征的工具药中的应用。

上述钠通道调制剂BmKαIV基因在制备调节和治疗钠通道相关生理和病理现象的药物或药物先导中的应用。

BmKαIV是一个新型的具有独特结构和功能的肽类钠通道调制剂，可作为研究钠通道组成和生物化学信号特征的工具药，并可开发为调节和治疗钠通道相关生理和病理现象的药物或药物先导。BmKαIV的基因工程表达技术为以后的工厂化表达提供了可行、可靠的强有力技术保障。

附图说明

图1.BmKαIV的生化分析图

A.凝血酶切割融合蛋白之后的Tricine蛋白胶分析M：标准分子量；1-2：细胞上清中的融合蛋白；4-5：复性后沉淀组分中的融合蛋白；3，6：凝血酶切割后的融合蛋白；

B.融合蛋白的western杂交1：细胞上清；2：沉淀组分.3：对照；

C.重组BmKαIV的质谱分析

图2.BmKαIV与部分已知的α和β-蝎毒素的氨基酸序列比对

序列比对采用Vector NTI软件包的ALIGN程序.重要区域用黑灰色标注.BmKαIV与其它毒素的相似性在各个序列的右侧表示.Amm V来源于A.mauretanicusmauretanicus；Lqq V和Lqq III来源于L.quinquestriatus quinquestriatus；AaHII来源于Androctonus australis hector；Lqh II，Lqh III和LqhαIT来源于L.quinquestriatus hebraeus；KurTx来源于Parabuthus transvaalicus.CsE V来源于Centruroides Sculpturatus；Ts IV-5和TS V来源于Tityus serrulatus.BotI来源于Buthus occitanus tunetanus；Bom III来源于B.occitanus mardochei；BukaTx(Bukatoxin)，BmK I，BmK IT2，BmK AS和BmK abT来源于Buthus martensiiKarsch；

图3.BmKαIV结合到大鼠脑突触体膜和蟑螂神经索突触体膜上的动力学图例

BmKαIV被固定在BIAcore CM5芯片上，不同浓度的大鼠脑突触体膜(A)或者蟑螂神经索突触体膜(B)流经芯片表面。0-240秒为注射相，240-480秒为解离相.10mMNaOH注射使得芯片再生并且使基线回到起始，所有的操作在室温下进行。所示图为减去非特异性的结合后所得。

图4.BmKαIV结合到大鼠脑突触体膜和蟑螂神经索突触体膜的竞争分析

大鼠脑突触体膜(375μg/ml)或者蟑螂神经索突触体膜(50μg/ml)和不同浓度的神经毒素预孵育，然后流经芯片。结合水平(结合单位，RU)在380秒处记录并减去非特异性结合。结合反应(RU)的百分率以没有竞争毒素存在的RU为对照，孵育后流经芯片的结合单位除以无竞争毒素的结合单位(对照)得到竞争百分率(percentage of inhibition)，且结果以mean±SEM(n＝3)的形式表示。*P＜0.05，**P＜0.01和***P＜0.001

图5.BmKαIV结合到大鼠脑突触体膜和蟑螂神经索突触体膜的电压依赖性分析

大鼠脑突触体膜(375μg/ml)或者蟑螂神经索突触体膜(50μg/ml)与各种浓度的KCL在室温孵育30分钟。结合的反应值在380记录并减去非特异性的结合。以未经KCL孵育处理的神经膜与BmKαIV结合的RU为对照，孵育后的神经膜流经芯片的结合单位除以对照的结合单位得到竞争百分率(percentage of inhibition)，且结果以mean±SEM(n＝3)的形式表示。*P＜0.05，**P＜0.01和***P＜0.001

图6.BmKαIV对表达于爪蟾卵母细胞的rNav1.2钠电流的调节作用

A.100nM BmKαIV对rNav12钠电流的作用。膜电位钳制在-80mV，刺激为从-80mV到+20mV的一个步进刺激；B.失活的时间常数与电压作图；C.BmKαIV对Nav1.2激活的影响；D.BmKαIV对rNav1.2失活化的影响。*，P＜0.05；**，P＜0.01vs.control(对照)(n＝6).

图7.BmKαIV对大鼠DRG神经元的TTX-敏感钠通道的调节

A.500nM BmKαIV对DRG神经元钠电流的影响，膜电位钳制在-70mV，刺激为从-70mV到0mV的一个步进刺激；B.BmKαIV作用的时间依赖性。每分钟记录一次钠电流。在BmKαIV加入15分钟后，钠电流达到最大，并且这种效应可以被TTX所阻断。C.BmKαIV对DRG神经元峰钠电流的影响；D.BmKαIV对DRG神经元钠电流失活化相的影响。***，P＜0.001vs.control(对照)(n＝6)。

具体实施方案

实施例1BmKαIV的基因克隆

总RNA从新鲜采集的2g的蝎子尾节中提取，用TRIZOL试剂盒(Invitrogen，USA).BmKαIV基因被克隆用Clontech SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit(BDBiosciences Clontech，USA).5′-RACE的反向引物(毒素基因内部引物，定义为primer 1)采用兼并引物<degenerate primer>，序列源自经典α-蝎毒素AaH II和BmKα1的C端非编码区序列：[5′-TTATGATACATTCCATCTTA-3′]；正向引物为UPM引物(universal primer mix，Clontech Laboratories Inc.，USA).引物2为5′-CTTTCCCAGAAAATTCCGTAAAACGGTTC-3′对应于根据5′-RACE确定的BmKαIV的5′非翻译区域.PCR用引物2和UPM引物扩增。基因组DNA根据Wizard Genomic DNAKit(Promega，USA)纯化而得，PCR扩增用引物1和引物2。然后连接到pGEM-T载体(Promega，USA)，然后转化到感受态大肠杆菌E.coli DH5α。重组质粒被分离然后进行DNA测序。聚合酶链式反应的试剂与条件如下：

首先将下列试剂混在一起，

10Taq聚合酶缓冲液       5微升

模板基因组DNA           1微升

1.25ug/ul primer 1      1微升

1.25ug/ul primer 2      1微升

脱氧核苷酸混和物dNTP    4微升

Taq DNA聚合酶           0.25微升

灭菌水                  37.75微升

总体积                  50微升

PCR反应条件为：首先94℃变性3分钟，然后进入下列循环：94℃30秒，55℃45秒，72℃45秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟，4℃保存。

分析BmKαIV的基因组序列可知，序列全长为896bp。它由两个外显子组成，中间为503bp的内含子。5′和3′的剪切位点分别是GTAAGATTTA和CTGACTACAG。BmKαIV的内含子富含A+T(62.0％)。加工后的多肽链由两部分组成：19个氨基酸的信号肽和66个氨基酸的多肽链。终止信号(AATAAA)位于终止密码子(TAA)的下游47bp处。与其他已知的部分α类毒素相比，BmKαIV的序列和它们有较高的相似性，BukaTx(84.8％)，Lqq V/Amm V(75.8％)，AaH II/Lqq III/Lqh αIT(68.2％)，Lqh II(66.7％)，BmK I(65.2％)，Bom III(62.1％)and Bot I(62.0％)，CsEV(42.4％)，TsIV-5(45.6％)，Ts V(42.3％)，KurTX(40.3％)，尤其Lqh III其相似性高达48.5％，但是与β类毒素的相似性却不高BmK IT2(34.3％)，BmK AS(26.1％)，过渡性毒素BmK abT(25.0％)。此外，Gly-Gly序列特异的存在于BmKαIV的C末端(见图2)。

实施例2BmKαIV多肽重组表达及分离纯化

pET-28a(+)为可表达N端含6个组氨酸残基融合蛋白的表达载体(购自Novagen公司)。用BamH I和Nde I双酶切阳性克隆BmKαIV和pET-28a(+)，纯化回收切下的BmKαIV片段和切开的pET-28a(+)载体(QIA quick PCRpurification kit)。将BmKαIV片段插入表达载体pET-28a(+)，构建成重组表达质粒。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司产品)，在对转化的大肠杆菌进行IPTG诱导培养后，收集表达菌，悬浮于裂解缓冲液中(30mM Tris-HCl，2.5mM EDTA，pH 8.0，0.5mM PMSF，10μg/ml Lysozyme)中，超声波破菌，13000g离心15min，再用25％sucrose，5mM EDTA，1％Triton X-100，PBS)重复洗涤沉淀3次，离心。沉淀组分的分离纯化步骤参照QIAGEN公司变性条件下的纯化条件。收集纯化过程中的洗脱组分(纯化得到的融合蛋白组分)，装入透析袋中，置于0.2M乙酸胺(pH8.0)中4℃透析过夜，至盐酸胍完全析出。取出透析袋中液体，4000g离心，为复性后的目的蛋白。表达于上清中的融合蛋白参照QIAGEN公司正常条件下的纯化条件纯化。复性后的表达产物经SDS-PAGE电泳后，将蛋白转移至PVDF膜(Amersham公司产品)上，进行Western blot鉴定(Western blotting检测试剂盒为Amersham公司产品)。

质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导后较诱导前有一分子量约为11kDa的明显表达条带，与理论蛋白分子量一致。表明重组质粒pET-28a(+)/BmKαIV在大肠杆菌中表达了外源蛋白。大肠杆菌的菌体经超声破碎后离心，可溶性蛋白存在于上清部分，而包涵体等不可溶性蛋白被沉淀。取上清液和沉淀悬浮液分别进行SDS-PAGE电泳，分析表达产物的可溶性，结果表明表达产物主要以包涵体形式存在。利用Ni2+树脂对表达产物进行了纯化研究(见图1A)。pET-28a(+)/BmKαIV表达产物经纯化后，SDS-PAGE电泳，将凝胶上蛋白转移至PVDF膜上，进行Western blot分析，可见约在11kDa处出现特异性反应区带。我们采用抗His抗体的免疫化学识别的方法对已表达融合蛋白进行鉴定(见图1B)。重组多肽BmKαIV(约8KD)由凝血酶消化所得(见图1A)。进一步，用HPLC的方法进行纯化，经质谱分析，其分子量为7733.59Da(见图1C)，这与根据cDNA氨基酸序列推断的分子量7734.84Da相吻合。

实施例3BmKαIV与大鼠脑和蟑螂神经索突触体膜的药理结合及竞争特性

选用5-8周龄，200-250g的成年雄性SD大鼠，按照Dodd等(1981)描述的大鼠脑突触体膜制备方法制备大鼠突触体膜。蟑螂神经索突触体膜的制备按照deLima等(1989)描述的昆虫神经索突触体膜制备方法进行。突触体膜悬浮保存液：140mM氯化胆碱；1.8nM CaCl₂；5.4mM KCl；0.8mM MgSO₄；25mM HEPES；10mM葡萄糖；0.1mM PMSF；1.0μM pepstatin A；1.0mM iodoacetamide；1.0mM 1，10-phenanthroline。Tris调pH至7.4。大鼠脑突触体膜悬浮液和蟑螂神经索突触体膜悬浮液中的蛋白浓度测定是以BSA作为标准蛋白，利用Bio-Rad蛋白分析方法测定的。

通过注射40μl体积比为1∶1的400mM的N-ethyl-N-(dimethylaminepropyl)-carbodiimide和100mM的N-hydroxy-succimide的混和液，CM5传感器芯片上的偶联基团-COOH得以激活。BmKαIV溶于10mM醋酸钠(pH 5.0)中配制成40μg/ml的溶液，取40μl溶液以5μl/min的速度注射，将BmKαIV结合到芯片上。最后注射35μl的1M ethanolamine hydrochloride(pH 8.0)使芯片表面上过量的偶联基团去活化。整个过程中使用专用的HBS缓冲液：150mMNaCl；3.5mM EDTA；0.05％

表面活性剂P-20和10mM HEPES，pH调至7.4。传感器芯片可以用10mMNaOH再生。

一系列不同浓度的新鲜制备的大鼠脑突触体膜(125-625μg/ml)和蟑螂神经索突触体膜(12.5-500μg/ml)以5μl/min的流速通过结合有BmKαIV的传感器芯片表面。在与受体结合反应以后，单独使用结合缓冲液流过芯片表面，检测受体和BmKαIV的解离。流速5μl/min，共计10分钟。与

相连接的计算机记录反应信号，并使用BIA Evaluation 3.1软件包分析数据。每次反应后用10mM NaOH再生，可获高达95％以上的再生率。高浓度的BmK abT、BmKAS、BmK IT2、AaHII和BmK I以及藜芦碱分别和新鲜制备的大鼠脑突触体膜和新鲜制备的蟑螂神经索突触体膜在室温条件下孵育30分钟，然后分别取30μl混合物在室温条件下以5μl/min的速度流经上述固定有BmKαIV的CM5传感器芯片，以研究BmKαIV和其它神经毒素与大鼠脑突触体膜和蟑螂神经索突触体膜中受体竞争性结合的特性。

在冰水浴条件下，通过递增突触体膜悬浮液中K⁺离子浓度和递减choline浓度，逐步改变突触体膜的膜电位。[K⁺]和[choline]的最终浓度保持在145mM。分别将与大鼠脑突触体膜和蟑螂神经索突触体膜反应的混合物在室温下孵育30分钟，然后分别取30μl混合物在室温条件下以5μl/min的速度流经上述固定有BmKαIV的CM5传感器芯片。

BmKαIV和传感器芯片的结合以及BmKαIV和大鼠脑突触体膜的结合量表现为RU值。BmKαIV能与大鼠脑突触体膜以及蟑螂神经索突触体膜剂量依赖性的结合，流动缓冲液洗涤后不能完全从结合位点解离。动力学特征显示，BmKαIV与大鼠脑突触体膜的结合随着检测时间的延长而显著增加。分离时却是先快后慢的一个过程(Figure 3A)。BmKαIV与蟑螂神经突触体膜的结合则不同，它迅速与突触体膜结合，并在注射后240s内逐渐达到饱和。而其解离过程则是随着时间的延长逐渐减少(Figure 3B)。经计算，在280-400s内BmKαIV与大鼠脑突触体膜和蟑螂神经神经索突触体膜的动力学解离常数分别为(1.71±0.127)×10-3S^-1和(4.16±0.15)×10-3S^-1。由于突触体膜中靶蛋白的浓度未知，故无法计算其他的动力学参数。

Figure 4A和Figure 4B为BmK αIV与大鼠脑突触体膜及蟑螂神经索突触体膜膜结合的竞争结合实验。BmKαIV的结合可被自身抑制，也可被极低剂量(10^-10M)的AaH II强有力的抑制。AaH II对大鼠脑突触体膜结合的抑制(70.11±6.0％)远强于对蟑螂神经索突触体膜结合的抑制(43.86±0.75％)。10^-4M芦藜碱能够部分抑制BmKαIV与大鼠脑突触体膜(73.43±5.78％)以及蟑螂神经索突触体膜(56.15±2.36％)的结合。另外，BmKαIV与大鼠脑突触体膜以及蟑螂神经元细胞膜的结合能够被BmKabT和BmK AS完全竞争抑制。BmK IT2对BmKαIV与大鼠脑突触体膜的结合竞争抑制率约为81.23±0.95％，而可以完全竞争抑制与蟑螂神经索突触体膜的结合。但是，意外地发现BmK I，类α毒素对BmKαIV与大鼠脑突触体膜以及蟑螂神经索突触体膜的结合没有任何抑制作用。另外，BmKαIV与大鼠脑突触体膜的结合呈电压依赖性，但是与蟑螂神经索突触体膜的结合则无该特征(Figure 5A和Figure 5B).

实施例4BmKαIV对rNav1.2电压门控钠通道的调制

取一只六周内未被取过卵母细胞的爪蟾，挑选出黑白半球(分别对应动物极和植物极)界限分明，且细胞膜表面光滑有光泽的V～VI期卵母细胞于ND96液中(Goldin，1991)。Nav1.2的mRNA线性化由Not I酶完成，转录过程使用T7RNApolymerase Message Machine transcription试剂盒(Ambion，Austin，TX)。用微量注射器(World presicion instruments，Nanoliector 2000)将mRNA注射至细胞浆(植物极)，注射后细胞会轻微膨胀。同时选未注射卵母细胞作对照，置于带有庆大霉素的ND96培养液中，20℃恒温孵箱中培养40h。全细胞电流记录使用双微电极电压钳法，放大器为TURBO TEC-03X(npi electronic Instruments，Germany)，数据采集器为INT-20(npi electronic Instruments，Germany)，由Cellwork E 5.5(npielectronic Instruments，Germany)软件控制。

卵母细胞被钳制在-80mV。给一个从-80mV到20mV的一系列刺激可引起一个短暂的钠电流。100nM的BmKαIV可以显著增加钠电流的幅度(Figure 6A)。当加入BmKαIV后，不同电压条件下失活的时间常数Tau显著增加(Figure 6B)。BmKαIV(100nM)部分引起向去极化方向移动，这种活化依赖于电压。V_1/2从-35.72±1.11mV变至-30.62±0.75mV。K_1/2从-6.52±0.97变至-10.31±0.73(P＞0.05)(Figure6C)。加入100nM BmKαIV后，失活化所依赖的电压显著的移动。V_1/2从-49.59±0.23mV变化至-44.12±0.37mV。K_1/2从-6.08±0.19变化至-4.60±0.29(P＜0.05)(Figure 6D)。

实施例5BmKαIV对大鼠DRG神经元TTX-S钠电流的调制

从成年SD大鼠(120±12g)急性分离得到背根节(DRG)神经元。选取小直径DRG神经元(10-25μm)进行全细胞记录。电信号通过3kHz带宽滤波，采样频率为50kHz。漏电流用P/4模式在记录中去除，入路电阻部分补偿(70-80％)。Ag-AgCl盐桥作为参考电极。加药系统为自制重力加药系统。

观察BmKαIV对急性分离的大鼠小DRG神经元(10-25μm)上TTX-S钠电流的影响。500nM BmKαIV可以显著增加峰钠电流并延长失活化时间(Figure 7A)。500nMBmKαIV使得TTX-S峰钠电流增加2.39±0.14倍(n＝6)(Figure 7B)。失活化的时间常数以单指数方程拟合，500nM BmKαIV使得钠电流失活常数从5.02±0.91ms显著增至16.41±0.87ms(Figure 7C).BmKαIV对峰钠电流具有时间依赖性增强作用，约在15min后作用达到最大，记录持续40分钟，该效应可被1μMTTX完全阻断(Figure 7D)。

从上述实验可知，BmKαIV是一个新型的具有独特结构和功能的肽类钠通道调制剂，可作为研究钠通道组成和生物化学信号特征的工具药，并可开发为调节和治疗钠通道相关生理和病理现象的药物或药物先导。BmKαIV的基因工程表达技术为以后的工厂化表达提供了可行、可靠的强有力技术保障。

Claims (6)

1.一种钠通道调制剂BmKαIV基因，其特征在于，它具有SEQ NO 1所示的序列：

1 AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGGCAACAATCTTTCCCAGAAAATTCCGTAAAA  60

61 CGGTTCAAAATGAATTATTTGGTATTTTTTAGTTTGGCACTTCTTCTAATGACAGgtaag 120

121 atttacatattcatagaataagtcttacaaatattgtagttggccggatatccgcgtggt 180

181 gaagctttgaatcttcggcttaacatgtggaagatccggattcaaatccgggtccatcac 240

241 cctcagattttcagcagaggaccagccaacctgttgaaccacatccttcagccatccggt 300

301 tgaccccatcaagggtggtggccagcctggtatggggtctctaaatggccgccgccagat 360

361 atagaatatcccatcaggatatggcggcttaatctaattaacctaacctaatctaacgaa 420

421 tattgtatatggtattaagatttttttgactgcaaaatattccattcttgtaaactatga 480

481 aaaatggaaaatcgtgtttgcaggatatagtcttcaaaagattcatgactgacctgcaaa 540

541 catcaaatttgatgattctaatttaatgttttctaacattttataattttattaatagag 600

601 ttatttttctgactacagGTGTGGAGAGTGTACGCGATGGTTATATTGCCGACGATAAAA 660

661 ATTGCGCATATTTTTGTGGTAGAAATGCGTATTGCGATGACGAATGTAAGAAGAAGGGTG 720

721 CTGAGAGTGGCTATTGCCAATGGGCAGGTGTATACGGAAACGCCTGCTGGTGCTATAAAT 780

781 TGCCCGATAAAGTACCTATTAGAGTACCAGGAAGATGCAATGGCGGTTAAATTGTAAGAT 840

841 GGAATGTATCATAAATATAACTGTTAAATAATTAAATAATAAAATTACATTTTTCA(n)896。

2.一种根据权利要求1所述的钠通道调制剂BmKαIV基因的克隆方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.利用TRIZOL试剂盒，从东亚钳蝎的毒腺中提取总RNA，将提取的总RNA反转录为cDNA，在5’RACE中作为模板；

b.根据已知的经典a毒素的和BmKα1的保守序列设计引物：

Primer 1：5′-TTATGATACATTCCATCTTA-3′

Primer 2：5’-CTTTCCCAGAAAATTCCGTAAAACGGTTC-3’；

c.进行聚合酶链式反应；

d.将扩增产物纯化，取5μl纯化产物克隆到pGEM-T Easy载体，转化DH5α细胞，平板过夜培养，挑取5个白斑，提取质粒，用于序列测定，得到BmKαIV的基因组DNA片段，长度为896bp。

3.根据权利要求2所述的钠通道调制剂BmKαIV基因的克隆方法，其特征在于上述的聚合酶链式反应的试剂与条件如下：

首先将下列试剂混在一起，

10Taq聚合酶缓冲液5微升

模板基因组DNA          1微升

1.25ug/ul primer       11微升

1.25ug/ul primer       21微升

脱氧核苷酸混和物dNTP   4微升

Taq DNA聚合酶          0.25微升

灭菌水                 37.75微升

总体积                 50微升

PCR反应条件为：首先94℃变性3分钟，然后进入下列循环：94℃30秒，55℃45秒，72℃45秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟，4℃保存。

4.一种根据权利要求1所述的钠通道调制剂BmKαIV基因的表达方法，其特征在于，根据上述序列设计的引物是：

正向引物：5’-TGGAGTTAACATATGGTACGCGATGGTTATATTG-3’

反向引物：5’-GTGCACTGGATCCTTAACCGCCATTGCATCTTCC-3’

将BmKαIV基因组DNA片段插入表达载体pET-28a(+)，构建成重组表达质粒；重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，然后细胞裂解液经His亲和柱、凝血酶切割和HPLC纯化得到BmKαIV多肽，通过质谱鉴定了其分子量为7733.59。

5.一种根据权利要求1所述的钠通道调制剂BmKαIV基因在制备研究钠通道组成和生物化学信号特征的工具药中的应用。

6.一种根据权利要求1所述的钠通道调制剂BmKαIV基因在制备调节和治疗钠通道相关生理和病理现象的药物或药物先导中的应用。

Images