CN106434589A - 一种鸡谷胱甘肽s‑转移酶a3、原核表达及其纯化方法 - Google Patents

一种鸡谷胱甘肽s‑转移酶a3、原核表达及其纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸡谷胱甘肽S‑转移酶A3、原核表达及其纯化方法。一种鸡谷胱甘肽S‑转移酶A3，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。纯化步骤为：提取鸡胫骨生长板组织或鸡红细胞的总RNA，以Oligo dT为引物合成cDNA，并以此为模板，设计一对上、下游引物进行PCR扩增，与pGEM‑T Easy载体连接，得到pGEM‑T‑ GSTA3重组质粒，并转化至大肠杆菌感受态细胞，然后经过异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷IPTG诱导重组蛋白表达，通过Ni‑NTA亲和层析柱纯化。本发明GSTA3重组蛋白的高效表达和纯化为进一步制备其单克隆抗体，建立GSTA3快速检测方法奠定了基础。

Description

一种鸡谷胱甘肽S-转移酶A3、原核表达及其纯化方法
技术领域
本发明涉及一种鸡谷胱甘肽S-转移酶A3的原核表达及纯化方法。
背景技术
谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase；GSTs）是一类具有多种生物功能的酶。GSTs具有以下功能：（1）是机体解毒过程中的一个关键酶，调节二期细胞解毒；（2）催化一系列外来化合物如医药、结合重金属、杀虫剂、除草剂、持久性有机污染物（POPs）和聚芳碳氢化合物（多环芳烃）；（3）除了外源性底物，GSTs可催化结合多样化的内源化合物，包括脂质过氧化的产物和氧化应激的下游产物，即4-羟基壬烯酸（4HNE）和丙烯醛，DNA降解；（4）通过过氧化物酶和异构酶酶活、生理上重要的生物分子如白细胞三烯和PGs、类固醇的异构化，以及配体结合（无活性）等参与部分细胞信号通路的调节。最近研究发现，Ex-FABP基因在马立克病鸡发病不同阶段红细胞中的表达与正常对照鸡相比存在显著差异，推测其作为标识物在传染病诊断和防治中具有重要意义。
GSTA3具有类固醇异构酶的活性，参与类固醇激素的合成，例如雌激素，雄激素等。类固醇激素在骨的生长发育和重建方面起着非常重要的作用，过多的糖皮质激素可能会引发骨质疏松，而雄激素和雌激素对骨的生长具有保护的作用。GSTA3可将活性较弱的Δ5-雄激素转化为活性较强的Δ4-雄激素，从而调节激素在骨组织中的作用，在某种程度上可以替代3β-HSD的功能；雌激素可通过抑制雌激素受体来调控关节炎和骨损伤的进程。即，糖皮质激素和性激素在类风湿性关节炎中发挥着重要的作用，具有抗炎和免疫调节的作用。在关节炎发生早期使用低剂量的糖皮质激素能快速缓解关节炎的症状；雄激素在关节炎早期治疗中也可明显缓解症状；雌激素和糖皮质激素联合治疗发现其具有抑制促炎症反应的功能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鸡谷胱甘肽S-转移酶A3（GSTA3）的原核表达及纯化方法，该方法利用RT-PCR技术从鸡胫骨软骨生长板组织或鸡红细胞中扩增出编码GSTA3的DNA片段，将此目的基因克隆至pET-28a原核表达载体上，并利用亲和层析进一步纯化出高浓度的蛋白，为研发针对该蛋白的检测方法奠定了基础。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现：
一种鸡谷胱甘肽S-转移酶A3，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。
一种鸡谷胱甘肽S-转移酶A3，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。
上述鸡谷胱甘肽S-转移酶A3的原核表达及纯化方法，步骤为：
提取鸡胫骨生长板组织或鸡红细胞的总RNA，以Oligo dT为引物合成cDNA，并以此为模板，设计一对上、下游引物进行PCR扩增，与pGEM-T Easy载体连接，得到pGEM-T- GSTA3重组质粒，并转化至大肠杆菌感受态细胞，然后经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG诱导重组蛋白表达，通过Ni-NTA亲和层析柱纯化；
其中所述上游引物：5’-CGGAATTCATGTCGGGGAAGCCCAGGCTCA-3’，
下游引物：5’-AGCTCTCGAGTCAGTTTAGCTTAAAAATTTTTTTCCAGTT-3’，
在上游引物5’端引入EcoRⅠ酶切位点，在下游引物5’端引入XhoⅠ酶切位点。
所述的大肠杆菌感受态细胞为E. coli DH5α或E. coli BL21(DE3)。
本发明引物合成根据GenBank中已知鸡GSTA3的基因序列（NM_204818），利用Primer5.0软件设计针对GSTA3基因的引物对，上游引物：5’-CGGAATTCATGTCGGGGAAGCCCAGGCTCA-3’，下游引物：5’-AGCTCTCGAGTCAGTTTAGCTTAAAAATTTTTTTCCAGTT-3’，在上游引物5’端引入EcoRⅠ酶切位点，在下游引物5’端引入XhoⅠ酶切位点，由上海捷瑞生物工程有限公司负责合成；预期PCR产物大小为690bp；提取鸡胫骨生长板组织，添加液氮并用力研磨直至成粉末状，Trizol法提取鸡胫骨生长板组织或鸡红细胞的总RNA，以Oligo dT为引物合成cDNA，并以此为模板，用合成的引物对进行PCR扩增，PCR条件为95℃预变性3 min，98℃变性10 sec，54℃退火5 sec，72℃延伸1 min，扩增30个循环，最后72℃终延伸5 min，PCR产物经电泳分离，用凝胶成像系统分析结果；将上述PCR扩增用凝胶回收试剂盒进行回收，与pGEM-T Easy载体连接，得到pGEM-T-GSTA3重组质粒，并转化至大肠杆菌感受态细胞，测序正确的重组质粒pGEM-T-GSTA3经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，所释放的GSTA3基因片段与经同样双酶切的原核表达载体pET28a连接，获得pET-28a- GSTA3重组表达质粒，并转化至感受态细胞，命名为pET-28a- GSTA3-BL21，于含100 mg/L卡那霉素抗性的固体LB培养基上挑取单个菌落，用PCR和酶切鉴定；挑取经鉴定确证的单菌落，接种于含100 mg/L卡那霉素的液体LB培养基中，37℃振摇培养过夜，再按1:100的比例接种于含100 mg/L卡那霉素的液体LB培养基中，37℃振摇培养至OD600值达0.5~0.8；加浓度为1.0mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），继续振荡培养，于诱导后1h、3h及5h分别收集菌液，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸5min，取10μl进行SDS-PAGE鉴定，并用转空载体pET28a的BL21菌液作为对照；将pET-28a- GSTA3-BL21菌液于37℃振摇培养至OD600值达0.5~0.8，在30℃、1.0mmol/L的IPTG条件下振摇培养21h，诱导培养物再经4℃、12000 rpm离心10min，收获pET-28a- GSTA3-BL21菌体沉淀；用含50mmol/L的NaH2PO4、500mmol/L的NaCl、1.0g/L的溶菌酶、1mmol/L的PMSF，pH8.0的细菌裂解液20ml重悬菌体，冰上放置20min，超声裂解后，4℃、12000rpm离心10min，收集上清并用0.45μm孔径滤膜过滤，于上清中加入咪唑至终浓度为20mmol/L后，过Ni-NTA亲和层析柱，用含有10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L和40mmol/L咪唑的20 mmol/L的NaH2PO4、500mmol/L的NaCl，pH7.4的洗脱缓冲液洗脱杂质，最后用500mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白效果较好，SDS-PAGE鉴定洗脱目的蛋白的纯度。
本发明应用RT-PCR技术扩增获得了编码GSTA3的cDNA序列，并克隆进pET-28a表达载体中，诱导后振荡培养，利用蛋白亲和层析柱纯化重组蛋白，并最终获得了较高纯度的重组蛋白。结果显示目标蛋白在E. coli中获得了高效表达，GSTA3重组蛋白的高效表达和纯化为进一步制备其单克隆抗体，建立GSTA3快速检测方法奠定了基础。
附图说明
图1为GSTA3的原核表达及纯化路线图；
图2为GSTA3基因的RT-PCR扩增结果；
图3为pGEM-T- GSTA3重组克隆质粒双酶切鉴定结果，其中1：Marker；2：EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切产物；
图4为GSTA3蛋白诱导表达的最适温度摸索结果，其中1：Marker；2-4：IPTG诱导温度分别为25℃、30℃和37℃；
图5为GSTA3蛋白表达形式鉴定结果，其中1：蛋白Marker；2：上清；3：沉淀；
图6为GSTA3蛋白纯化结果，其中1：20 mM咪唑；2：50 mM咪唑；3：200 mM咪唑；4：500 mM咪唑；
图7为GSTA3蛋白的Western Blot检测结果，用His标签抗体对纯化蛋白进行检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案进一步详细地说明。
本发明所用的限制性内切酶、反转录试剂盒均购自大连宝生物工程公司，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，DNA基因提取试剂盒，DNA回收试剂盒购自北京天根生化科技公司，亲和层析柱购自上海碧云天生物技术有限公司，T4 DNA连接酶、pGEM-T Easy载体和pET28a载体Promega公司，其他所用化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。
实施例1鸡谷胱甘肽S-转移酶A3的原核表达及纯化方法，流程如图1所示，步骤为：
1．引物的设计与合成
根据GenBank中已知鸡GSTA3的基因序列（（NM_204818），利用Primer 5.0软件设计针对GSTA3基因的引物对，在上游引物5’端引入EcoRⅠ酶切位点，在下游引物5’端引入XhoⅠ酶切位点；
正、反向引物由上海捷瑞生物工程有限公司负责合成，其中，正、反向引物序列如SEQID No 1和SEQ ID No 2所示，具体如下：
正向引物：5’-CGGAATTCATGTCGGGGAAGCCCAGGCTCA-3’；
反向引物：5’-AGCTCTCGAGTCAGTTTAGCTTAAAAATTTTTTTCCAGTT-3’。
2．目的基因的扩增
提取鸡胫骨生长板组织，添加液氮并用力研磨直至成粉末状，Trizol法提取鸡胫骨生长板组织或鸡红细胞的总RNA，以Oligo dT为引物合成cDNA，并以此为模板；
RT反应程序如下：42℃、30min，99℃、5min，5℃、5min；
RT反应体系如下：
Rnase Free dH2O 3.75µL
MgCl2（25mM） 2µL
10×RT Buffer 1µL
dNTP Mixture（10mM） 1µL
Oligo dT-Adaptor Primer 0.5µL
AMV Reverse Transcripase XL 0.5µL
RNase Inhibitor 0.25µL
RNA 1µL
总体积 10µL
PCR反应程序如下：95℃预变性3 min；98℃变性10 sec，54℃退火5 sec，72℃延伸1min，扩增30个循环；最后72℃终延伸5 min；
PCR反应体系如下：
ddH2O 11.8 μL
5×Buffer 4 μL
dNTP 1.6 μL
上游引物 0.4 μL
下游引物 0.4 μL
HS DNA Polymerase 0.2 μL
cDNA 1.6 μL
总体积 20 μL。
3．PCR产物的回收及连接反应
用0.8%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，电泳结束，将凝胶置于紫外分析仪内，切取含PCR产物的胶块，用DNA凝胶回收试剂盒进行回收，在无菌的EP管中加入：3μL回收产物，1μL的pGEM-T Easy载体，1μL的T4 DNA连接酶，5μL的T4 DNA连接酶Buffer，总体积为10μL。将各组分混匀，22℃连接过夜，得到DNA连接产物。
4．E. coli DH5α感受态细胞的制备
挑取E. coli DH5α单菌落到5mL的液体LB培养基中，于37℃振荡培养过夜，取1mL培养过夜的菌液到含有50mL的液体LB培养基中，37℃振荡培养到OD600值为0.5~0.8之间，将培养好的菌液转移到50mL的离心管中，冰浴15min，4℃、12000rpm条件下离心10min，用2mL预冷的0.1M CaCl2溶液重悬沉淀，4℃、12000rpm条件下再次离心10min，再用2mL预冷的0.1MCaCl2溶液重悬沉淀，按每管100μL分装细胞重悬液与无菌EP管中，于-80℃中保存。
5．连接产物转化E. coli DH5α感受态细胞
在100μL的E. coli DH5α感受态细胞中加入10μL的DNA连接产物，混合均匀，冰上放置30min，42℃水浴热激处理90sec，冰上放置5min，再加入400μL的液体LB培养基，混合均匀后，37℃、180rpm振荡培养45min，400rpm离心5min，吸弃多余LB培养基，剩余100μL液体LB培养基重悬沉淀，然后把菌液涂布于含100μg/mL卡那霉素抗性固体琼脂培养基上，用玻璃棒涂抹均匀，放置在37℃温箱中倒置孵育12h。
6．质粒的小量提取及双酶切鉴定
挑取琼脂培养就平板上生长的单一菌落，接种于4mL含卡那霉素抗性的LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜，在2mL EP管中收集2mL菌液，12000rpm离心，去上清，加入250μL预冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，10mmol/L EDTA(pH 8.0)），重悬菌液；加入250μL的溶液Ⅱ（0.2mol/L NaOH，1% SDS），迅速颠倒混匀4-5次至溶液呈透明粘稠状；再加入300μL的溶液Ⅱ（5mol/L KAc 60mL，冰醋酸 11.5mL，H2O 28.5mL），颠倒混匀4-5次至溶液中白色絮状沉淀呈均匀分散状，静置5min，12000rpm离心10min，将上清转移至新的EP管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），混合均匀，12000rpm离心10min，取上清至新EP管中，加入2倍体积的无水乙醇，混合均匀，静置10min，弃去上清，室温静置15min，待管壁上残余的无水乙醇挥发完全，用50μL的TE洗脱液（pH 8.0，含20μg/mL Dnase-free Rnase A）溶解DNA沉淀，与-20℃保存备用；
取少量质粒用EcoRⅠ和XhoⅠ内切酶进行双酶切，反应体系如下：
ddH20 12μL
10×Buffer 2μL
限制性内切酶EcoRⅠ 1μL
限制性内切酶XhoⅠ 1μL
质粒DNA 4μL
总体积 20μL
将反应液混合均匀，放置在37℃恒温培养箱中孵育12 h。经8%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，双酶切鉴定正确的质粒送公司进行测序分析鉴定。
7．表达质粒的重组构建
待测序结果正确后，用EcoRⅠ和XhoⅠ内切酶同时对pGEM-T- GSTA3和pET28a空载体进行双酶切，把得到的GSTA3基因片段和线性pET28a载体进行连接：3μL GSTA3基因片段，1μL的pET28a载体，1μL的T4 DNA连接酶，5μL的T4 DNA连接酶Buffer，总体积为10μL；将各组分混匀，22℃连接过夜，得到DNA连接产物pET28a- GSTA3，连接产物转化E. coli BL21（DE3）感受态细胞，过程如步骤5，质粒的小量提取及双酶切鉴定过程如步骤6，双酶切鉴定结果如图3所示。
8．重组菌株的诱导表达
将转化表达质粒pET28a- GSTA3的重组菌接种于5mL液体LB培养基（含100μg/mL卡那霉素）中，分别在25℃、30℃和37℃条件下振荡培养至OD600值在0.5~0.8之间，加入1.0mmol/L的IPTG诱导3-4h，取适量菌液离心集菌后进行SDS-PAGE分析GSTA3蛋白的表达情况，取培养好的菌液1mL，12000rpm离心1min集菌，弃上清，100μL ddH2O重悬沉淀，取25μL 5×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸10min，取20μL进行SDS-PAGE分析，电压：80V，30min；120V，90min，然后进行考马斯亮蓝染色、脱色，重组蛋白载30℃的表达量最高，如图4所示。
9．重组蛋白的Ni-NTA亲和层析纯化
将重组菌接种于50mL液体LB培养基（含100μg/mL卡那霉素）中，37℃振荡培养至OD600值在0.5~0.8之间，加入1.0mmol/L的IPTG诱导3-4h，收集菌体后冰浴10min，用超声破碎，4℃、12000rpm离心10min，收集上清和沉淀，用SDS-PAGE分析确定蛋白表达位置，结果显示GSTA3大部分都表达在上清中如图5所示，剩余上清用于蛋白纯化，纯化结果如图6所示，最后用His标签抗体对纯化的蛋白进行Western Blot检测如图7所示；
蛋白纯化用Buffer：超声破碎Buffer（Binding Buffer）：20mM Tris-HCl pH 7.9、0.5MNaCl、10%甘油；洗杂液为20mM Tris-HCl pH 7.9、0.5M NaCl、10%甘油、10 mM/20 mM/30mM/40 mM咪唑；洗脱液为20mM Tris-HCl pH 7.9、0.5M NaCl、10%甘油、30mM/100mM/500 mM咪唑；
具体纯化过程如下：
①装柱及平衡柱：向层析柱内加入75%酒精，检验柱子是否漏液，然后进行装柱，约10mL Ni琼脂糖，静置30 min，将上层液体吸出，用10倍柱体积的binding buffer平衡层析柱，使柱的PH值为8.0；
②Binding Buffer与超声破碎后的样品以1﹕1的比例混匀后过柱，使样品沉降，收集流穿液；
③用10倍柱体积预冷的不同浓度的洗杂液（分别含10 mM，20 mM，30 mM，40 mM咪唑）过柱，收集洗杂液；
④用10倍柱体积预冷的洗脱液（咪唑的含量分别为含20mM、50mM、200mM和500 mM）流速为10倍柱体积/h洗脱目的蛋白，分管收集，作好记录；
⑤收集完毕后先用10倍柱体积的无菌ddH2O洗涤，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡，将收集的流穿液每管吸出20 μL另存，以便SDS-PAGE蛋白电泳进行结果分析，剩余的置于-80℃保存备用。
附：本发明所涉及的DNA核苷酸序列和蛋白质氨基酸序列如下：
SEQUENCE LISTING
SEQUENCE LISTING ID No.1
atgtcgggga agcccaggct cacctatgtc aatgggagag ggcgaatgga gtccatccga 60
tggctgctgt ccgcagctgg agtggagttt gaagaaattt ttctggaaac aagagagcag 120
ttattgaagt tatgccaaga tggatccctg ctgttccatc aactgccact ggttgagatc 180
gatgggatga agttggtgca gtgcagagcc atcctcagct acatcgcagg gaaatacaat 240
ctctatggga aagacctgaa ggagagagcc ctgatcgaca tgtatgtgga aggaatatca 300
gacctgatgc aattgatttt ggtgtttcct ttctctccac ctgaggcaaa ggagaaaaat 360
cttgccacaa ttgcagagaa ggcaacagag aggtacttcc ctgtctttga aaaggttttg 420
aaacagcatg gccaagactt tcttgtggga aaccgattca gctgggcaga tgttcagctc 480
atggaagcca ttttagcagt ggaggagaaa gtgccttctg tgctttctgg gtttcctcag 540
ctgcaggctt ttaaaaccaa aatgagcaac atgcctacaa ttaagaagtt cctgcagcct 600
ggcagcccaa ggaagccccc accagatgaa cattatgtag caactgtgaa aaaaattttt 660
aagctaaact ga 672
SEQUENCE LISTING ID No.2
Met Ser Gly Lys Pro Arg Leu Thr Tyr Val Asn Gly Arg Gly Arg Met Glu Ser Ile Arg
5 10 15 20
Trp Leu Leu Ser Ala Ala Gly Val Glu Phe Glu Glu Ile Phe Leu Glu Thr Arg Glu Gln
25 30 35 40
Leu Leu Lys Leu Cys Gln Asp Gly Ser Leu Leu Phe His Gln Leu Pro Leu Val Glu Ile
45 50 55 60
Asp Gly Met Lys Leu Val Gln Cys Arg Ala Ile Leu Ser Tyr Ile Ala Gly Lys Tyr Asn
65 70 75 80
Leu Tyr Gly Lys Asp Leu Lys Glu Arg Ala Leu Ile Asp Met Tyr Val Glu Gly Ile Ser
85 90 95 100
Asp Leu Met Gln Leu Ile Leu Val Phe Pro Phe Ser Pro Pro Glu Ala Lys Glu Lys As
105 110 115 120
Leu Ala Thr Ile Ala Glu Lys Ala Thr Glu Arg Tyr Phe Pro Val Phe Glu Lys Val Leu
125 130 135 140
Lys Gln His Gly Gln Asp Phe Leu Val Gly Asn Arg Phe Ser Trp Ala Asp Val Gln Leu
145 150 155 160
Met Glu Ala Ile Leu Ala Val Glu Glu Lys Val Pro Ser Val Leu Ser Gly Phe Pro Gln
165 170 175 180
Leu Gln Ala Phe Lys Thr Lys Met Ser Asn Met Pro Thr Ile Lys Lys Phe Leu Gln Pro
185 190 195 200
Gly Ser Pro Arg Lys Pro Pro Pro Asp Glu His Tyr Val Ala Thr Val Lys Lys Ile Phe
205 210 215 220
Lys Leu Asn ***
223
SEQUENCE LISTING ID No.1
atgtcgggga agcccaggct cacctatgtc aatgggagag ggcgaatgga gtccatccga 60
tggctgctgt ccgcagctgg agtggagttt gaagaaattt ttctggaaac aagagagcag 120
ttattgaagt tatgccaaga tggatccctg ctgttccatc aactgccact ggttgagatc 180
gatgggatga agttggtgca gtgcagagcc atcctcagct acatcgcagg gaaatacaat 240
ctctatggga aagacctgaa ggagagagcc ctgatcgaca tgtatgtgga aggaatatca 300
gacctgatgc aattgatttt ggtgtttcct ttctctccac ctgaggcaaa ggagaaaaat 360
cttgccacaa ttgcagagaa ggcaacagag aggtacttcc ctgtctttga aaaggttttg 420
aaacagcatg gccaagactt tcttgtggga aaccgattca gctgggcaga tgttcagctc 480
atggaagcca ttttagcagt ggaggagaaa gtgccttctg tgctttctgg gtttcctcag 540
ctgcaggctt ttaaaaccaa aatgagcaac atgcctacaa ttaagaagtt cctgcagcct 600
ggcagcccaa ggaagccccc accagatgaa cattatgtag caactgtgaa aaaaattttt 660
aagctaaact ga 672
SEQUENCE LISTING ID No.2
Met Ser Gly Lys Pro Arg Leu Thr Tyr Val Asn Gly Arg Gly Arg Met Glu Ser Ile Arg
5 10 15 20
Trp Leu Leu Ser Ala Ala Gly Val Glu Phe Glu Glu Ile Phe Leu Glu Thr Arg Glu Gln
25 30 35 40
Leu Leu Lys Leu Cys Gln Asp Gly Ser Leu Leu Phe His Gln Leu Pro Leu Val Glu Ile
45 50 55 60
Asp Gly Met Lys Leu Val Gln Cys Arg Ala Ile Leu Ser Tyr Ile Ala Gly Lys Tyr Asn
65 70 75 80
Leu Tyr Gly Lys Asp Leu Lys Glu Arg Ala Leu Ile Asp Met Tyr Val Glu Gly Ile Ser
85 90 95 100
Asp Leu Met Gln Leu Ile Leu Val Phe Pro Phe Ser Pro Pro Glu Ala Lys Glu Lys As
105 110 115 120
Leu Ala Thr Ile Ala Glu Lys Ala Thr Glu Arg Tyr Phe Pro Val Phe Glu Lys Val Leu
125 130 135 140
Lys Gln His Gly Gln Asp Phe Leu Val Gly Asn Arg Phe Ser Trp Ala Asp Val Gln Leu
145 150 155 160
Met Glu Ala Ile Leu Ala Val Glu Glu Lys Val Pro Ser Val Leu Ser Gly Phe Pro Gln
165 170 175 180
Leu Gln Ala Phe Lys Thr Lys Met Ser Asn Met Pro Thr Ile Lys Lys Phe Leu Gln Pro
185 190 195 200
Gly Ser Pro Arg Lys Pro Pro Pro Asp Glu His Tyr Val Ala Thr Val Lys Lys Ile Phe
205 210 215 220
Lys Leu Asn ***
223

Claims (5)

1.一种鸡谷胱甘肽S-转移酶A3，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。
2.一种鸡谷胱甘肽S-转移酶A3，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。
3.权利要求1所述的鸡谷胱甘肽S-转移酶A3的原核表达及纯化方法，步骤为：
提取鸡胫骨生长板组织或鸡红细胞的总RNA，以Oligo dT为引物合成cDNA，并以此为模板，设计一对上、下游引物进行PCR扩增，与pGEM-T Easy载体连接，得到pGEM-T-GSTA3重组质粒，并转化至大肠杆菌感受态细胞，然后经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG诱导重组蛋白表达，通过Ni-NTA亲和层析柱纯化；
所述上游引物：5’-CGGAATTCATGTCGGGGAAGCCCAGGCTCA-3’，
下游引物：5’-AGCTCTCGAGTCAGTTTAGCTTAAAAATTTTTTTCCAGTT-3’，
在上游引物5’端引入EcoRⅠ酶切位点，在下游引物5’端引入XhoⅠ酶切位点。
4.根据权利要求3所述的鸡谷胱甘肽S-转移酶A3的原核表达及纯化方法，其特征在于，所述的大肠杆菌感受态细胞为E. coliDH5α或E. coli BL21(DE3)。
5.根据权利要求3所述的鸡谷胱甘肽S-转移酶A3的原核表达及纯化方法，其特征在于，步骤为：
（1）目的基因的扩增：提取鸡胫骨生长板组织，添加液氮并研磨直至粉末状，Trizol法提取鸡胫骨生长板组织或鸡红细胞的总RNA，以Oligo dT为引物合成cDNA，并以此为模板，用合成的引物对进行PCR扩增，PCR条件为：95℃预变性3 min；98℃变性10 sec，54℃退火5sec，72℃延伸1 min，扩增30个循环；最后72℃终延伸5 min；PCR产物经电泳分离，用凝胶成像系统分析结果；
所述上游引物：5’-CGGAATTCATGTCGGGGAAGCCCAGGCTCA-3’，
下游引物：5’-AGCTCTCGAGTCAGTTTAGCTTAAAAATTTTTTTCCAGTT-3’，
在上游引物5’端引入EcoRⅠ酶切位点，在下游引物5’端引入XhoⅠ酶切位点；
（2）重组质粒的构建：上述的PCR扩增用凝胶回收试剂盒进行回收，与pGEM-T Easy载体连接，得到pGEM-T- GSTA3重组质粒，并转化至大肠杆菌感受态细胞，测序正确的重组质粒pGEM-T- GSTA3经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，所释放的GSTA3基因片段与经同样双酶切的原核表达载体pET28a连接，获得pET-28a- GSTA3重组表达质粒，并转化至感受态细胞，命名为pET-28a- GSTA3-BL21，于含100 mg/L卡那霉素抗性的固体LB培养基上挑取单个菌落，用PCR和酶切鉴定；
（3）GSTA3的诱导表达：挑取单菌落，接种于含100 mg/L卡那霉素的液体LB培养基中，37℃振摇培养过夜，再按1:100的比例接种于含100 mg/L卡那霉素的液体LB培养基中，37℃振摇培养至OD600值达0.5~0.8；加浓度为1.0mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，继续振荡培养，于诱导后收集菌液，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸5min，取10μl进行SDS-PAGE鉴定，并用转空载体pET28a的BL21菌液作为对照；
（4）GSTA3的纯化：将pET-28a- GSTA3-BL21菌液于37℃振摇培养至OD600值达0.5-0.8，在30℃、1.0mmol/L的IPTG条件下振摇培养21h，诱导培养物再经4℃、12000 rpm离心10min，收获pET-28a- GSTA3-BL21菌体沉淀；用含50mmol/L的NaH2PO4、500mmol/L的NaCl、1.0g/L的溶菌酶、1mmol/L的PMSF，pH8.0的细菌裂解液20ml重悬菌体，冰上放置20min，超声裂解后，4℃、12000rpm离心10min，收集上清并用0.45μm孔径滤膜过滤，于上清中加入咪唑至终浓度为20mmol/L后，过Ni-NTA亲和层析柱，用含有10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L和40mmol/L咪唑的20 mmol/L的NaH2PO4、500mmol/L的NaCl，pH7.4的洗脱缓冲液洗脱杂质，最后用500mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱即得。
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