CN100421673C - 糖缀合物chb在制备防治流感或禽流感药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了糖缀合物CHB在制备防治流感或禽流感药物中的应用。本发明的技术方案是糖缀合物CHB在制备防治流感或禽流感药物中的应用。本发明提供了糖缀合物CHB在制备防治流感或禽流感药物中的应用，一方面可缓解禽流感防治药物的缺乏，另一方面由于糖缀合物CHB为提取的天然物质，副作用较小，并且糖缀合物CHB通过提高机体免疫力，可对多种流感或禽流感病毒亚型发挥防治作用。
Description
技术领域
本发明属于制药领域，涉及糖缀合物CHB在制备防治流感或禽流感药物中的应用。
背景技术
糖缀合物CHB是从鳖或/和龟的血清中分离、提取得到的一种多糖化合物。公开号为CN1566151、名称为“用鳖或/和龟的血清提取的糖缀合物CHB和制备工艺及其在制药中的应用”的专利文献公开了CHB的提取方法和理化性质：
一、分离提取：
1.分离：将经预处理的鳖和/或龟的血清用膜分离一次，或对水透析12～36小时，以除去小分子物质，离心分离得上清液(I)；
2.提取：在上清液(I)中加入乙醇或丙酮，直至沉淀完全；
3.再分离：取出沉淀，用适量水溶解、离心分离后得上清液(II)；将上清液(II)再用膜分离一次或对水透析16～32小时，离心得上清液(III)；
4.后处理：将上清液(III)进行减压浓缩、冷冻干燥，得糖缀合物；必要时可用乙醇或丙酮精制。
二、理化性质：
(一)性状
本品为白色或类白色粉末状固体、无臭、易溶于水，水溶液pH为6.5～7.0。
(二)化学组成
1.中性糖含量为5～10％。
2.元素分析结果：C在40.36～42.61％，H在6.8～7.18％，N在9.97％～13.29％。根据含N量计算，蛋白质含量在60～80％。
3.氨基酸分析结果：糖缀合物CHB含18种氨基酸(色氨酸未测)，各种氨基酸的含量比例如表1：
表1：糖缀合物CHB中氨基酸含量的测定结果
(三)物理性质：
1、紫外光谱：除了在远紫外区有-OH等强烈吸收外，在275mm附近有明显蛋白质吸收峰。
2.红外光谱：3392cm-1为-OH伸缩振动吸收，1658cm-1为酰氨键羰基特征峰，1200～1010cm-1处有三个吸收峰为糖环吸收。
3.高效液相色谱(HPLC)行为：色谱柱为TSK-G2000SW，流动相为水，流速为1.0ml/min。在14.0min附近有一吸收峰，含量在80～90％。
4.分子量估测：用上述TSK-G2000SW柱条件，糖缀合物CHB主峰的分子量分布约为2000～5000。
该文献还公开了CHB具有较强的免疫活性作用和调节造血功能，可用于制备治疗或预防与免疫相关疾病、与造血系统相关疾病和肝病及抗肿瘤的药物。
流感背景知识：
流感在公元前希波克拉底时代就有记述，是人类最常见的传染病，病毒极小，直径约100纳米，大致分A、B、C三种类型，在冬季流行的是A型和B型。
在3种流感病毒中，A型攻击力最强，原因是A型病毒表面密布两种蛋白质，即血细胞凝集素(H)和神经氨酸苷酶(N)两种蛋白质，在病毒感染生物后它们能够迅速增殖。其中，H有15个亚型，N有9个亚型。二者组合不同，病毒的毒性和传播速度也不相同。从理论上说，A型病毒可以有135种类型。
人感染流感病毒之后，体内可产生抗体，抗体有阻碍病毒活动、保护身体不受侵害的作用。经过发烧、浑身酸痛、出汗等过程，大多数流感患者可以自愈，但有些患者由于自身免疫力差，病情会恶化。因此，每个流感流行季节都会有大约1万人因流感死亡。
种类多样的A型病毒可以从野生动物传给家畜家禽等，在鸡、鸭、猪等身上广泛传播。这些家畜家禽携带的病毒如果发生基因变异，获得在人群中传染的能力，会对人类造成巨大危害。
长时间以来，在人身上发现的流感病毒只有H1、H2、H3型。因此，人类一直以这3种病毒为目标进行预防。而最近几年暴发流行的禽流感病毒H5型在A型中属于新面孔，主要发生在鸡、鸭、鹅、鸽子等身上。按病原体的类型，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性三大类。高致病性禽流感因其传播快、危害大，被世界动物卫生组织列为A类动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。人类在直接接触受H 5N 1病毒感染的家禽及其粪便或直接接触H5N1病毒都会受到感染，甚至出现人类感染H5N1型禽流感病毒死亡的病例，而且一旦病毒在人身上发生变异，有可能获得在人群中传染的能力。另外人们还发现了H7、H9型病毒。
禽流感是一种高死亡率的接触性病毒性传染病，且为人畜共患病，危害极大，世界卫生组织称，禽流感是一种非常危险的病毒，可能导致全球危机。近几年一些国家遭受的禽流感使这些国家经济受到很大打击并造成多人因感染此病而死亡。由于长期以来对病毒尤其是动物源传染病毒的研究较少，能有效控制病情的药物也少，因而免疫预防显得相当重要，通常采用接种禽流感病毒(AIV)油乳苗进行免疫，但AIV抗原具有多样性，各亚型之间的抗原性存在一定的差异，亚型间缺乏坚强的交叉保护作用，而且弱毒疫苗还存在着使用使用后变异和返强的危险，因此AIV的完全免疫预防比较困难。国内曾有将少数植物类中药应用于禽流感的预防，国外有奥司他韦(商品名：达菲)对禽流感疗效较好，但该药有一定的副作用，并且该药的专利权人生产能力有限，远不能满足禽流感全球性暴发所带来的对抗禽流感药的需求，不少国家甚至曾考虑过对该药的生产采取强制许可。因此，迫切需要开发更多的能够防治禽流感且副作用少的药物，各国科学家在此领域都进行了大量的研究，目前尚未见有特效药物面世。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题提供糖缀合物CHB在制备防治流感或禽流感药物中的应用。
我们采用按公开号为CN1566151、名称为“用鳖或/和龟的血清提取的糖缀合物CHB和制备工艺及其在制药中的应用”的专利文献介绍的糖缀合物CHB的提取方法和理化性质制备得到的糖缀合物CHB进行实验研究，发现糖缀合物CHB对H1N1、H3N2和H5N1亚型流感病毒都有一定的抑制作用，提出糖缀合物CHB在制备防治流感或禽流感药物中的应用。
本发明提供的糖缀合物CHB在制备防治流感或禽流感药物中的应用，一方面可缓解禽流感防治药物的缺乏，另一方面由于糖缀合物CHB为提取的天然物质，副作用较小，并且糖缀合物CHB通过提高机体免疫力，实现免疫清除病毒，从而对多种流感或禽流感病毒亚型发挥防治作用(实验数据见效果实施例)。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步的阐述。
制备实施例：
取经预处理(除去杂物)后的鳖或/和龟的血清500毫升，用截留分子量为500～1000道尔顿的钠滤膜分离后，加入5倍体积的无水乙醇提取得沉淀，静置过夜，取出沉淀，先用适量的水溶解，再用截留分子量500～1000道尔顿钠滤膜分离。母液经离心后将上清液减压浓缩、冷冻干燥得糖缀合物CHB 980mg，得率1.97mg/mL。该糖缀合物含中性糖5.1％，含氮量为9.97％，含18种氨基酸(色氨酸未测，具体数据参见表1)。
效果实施例：
1.目的
糖缀合物CHB的化学结构由中性糖和18种氨基酸组成，具有很强的免疫活性，本实施例利用糖缀合物CHB的免疫活性，研究其对流感病毒的清除和抑制作用。
2材料
2.1受试药：CHB口服液，30mL/瓶，CHB含量为1.5mg/ml，由上海宁康生物有限公司提供(按照制备实施例的内容制得，即按公开号为CN1566151、名称为“用鳖或/和龟的血清提取的糖缀合物CHB和制备工艺及其在制药中的应用”的专利文献公开的内容制备)。
2.2对照药：磷酸奥司他韦(商品名：达菲)，75mg/粒。
2.3试验动物：SPF级BALB/C小鼠，购自北京维通利华试验动物有限公司。
2.4病毒株：流感病毒，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室保存提供的从动物体内分离的流感病毒A/swine/Guangdong/716/03(H1N1亚型)；A/swine/Guangdong/08/03(H3N2亚型)；A/swine/Fujian/1/03(H5N1亚型)株。
3.方法
3.1病毒的准备
取出冻存于一70℃的病毒复苏，接种10日龄SPF鸡胚增殖，置于35℃培养箱内培养，收获病毒液，分装于冻存管内，冻存于一70℃，使用时置于冰上缓慢融化。
3.2病毒对小鼠半数感染量(MID50)的测定
将病毒稀释100-10-6倍，然后每个10倍稀释梯度经鼻腔接种SPF级BALB/C小鼠7只，每只0.05ml，小鼠接种前用干冰麻醉。接种后第5天杀死小鼠，无菌取出肺脏，用研钵研磨碎后，制成20％的悬液，3000rpm/min离心10min后，取上清液接种SPF鸡胚，0.1ml/胚，逐个取尿囊液做血凝HA试验，HA试验(+)者判为鸡胚感染。
采用REED-MUENCH方法计算获得毒株对小鼠的半数感染剂量(MID50)。
3.3CHB在小鼠体内对流感病毒的抑制试验
本实验以BALB/C小鼠为实验动物模型，每个病毒亚型均分别取小鼠随机分为11组，10只/组，以含有100MID50、10MID50不同剂量病毒液攻击小鼠，在攻毒同时，以CHB通过灌服方式给药，同时设立达菲对照组，试验分组方式见表2，连续通过灌胃方式给药，1次/日。同时对攻毒对照组和空白对照组给予同样剂量的安慰剂。
观察小鼠的各项生命指标，并与空白对照组和攻毒对照组进行比较。在攻毒后第5天、第7天，各杀死小鼠5只，并对其肺脏的病毒含量进行滴定，从而确定在小鼠体内的CHB对流感病毒复制的抑制作用。
表2试验分组方式
说明：X代表病毒亚型(如在表3中X取1则代表H1N1亚型组，在表4中X取3则代表H3N2亚型组，在表5中X取5则代表H5N1亚型组)。PBS为安慰剂，0.1M磷酸盐缓冲液。
4.结果：
4.1病毒对小鼠半数感染量(MID50)的测定
A/swine/Guangdong/716/03(H1N1亚型)、A/swine/Guangdong/08/03(H3N2亚型)和A/swine/Fujian/1/03(H5N1亚型)毒株的MID50分别为：1045、10233、10167。
4.2CHB在小鼠体内对流感病毒的抑制试验
具体结果见表3、4和5。
表3CHB在BALB/C小鼠体内对H1N1亚型流感病毒的抑制试验
表4CHB在BALB/C小鼠体内对H3N2亚型流感病毒的抑制试验
表5CHB在BALB/C小鼠体内对H5N1亚型流感病毒的抑制试验
5.分析
5.1用BALB/C小鼠进行的体内试验显示，攻毒后给予安慰剂组小鼠肺脏中大部分都分离到了病毒，病毒分离率在90％及以上，试验结果成立。
5.2糖缀合物CHB治疗禽流感H5N1实验组的结果显著优于达菲对照组：
5.2.1糖缀合物CHB治疗禽流感H5N1实验组的四天给药最高转阴率达80％，达菲的四天给药最高转阴率40％，糖缀合物CHB高于达菲100％。
5.2.2糖缀合物CHB治疗禽流感H5N1实验组的四天给药转阴率平均达55％，达菲对照组的四天给药转阴率平均为25％。糖缀合物CHB高于达菲120％。
5.2.3糖缀合物CHB治疗禽流感H5N1实验组的六天给药总转阴率平均达50％，达菲对照组的六天给药总转阴率平均达45％。糖缀合物CHB高于达菲11％。
5.3糖缀合物CHB治疗流感H3N2实验组的结果显著优于达菲对照组：
5.3.1糖缀合物CHB治疗流感H3N2实验组的四天最高转阴率为20％，而达菲的四天最高最高转阴率为0。
5.3.2糖缀合物CHB治疗流感H3N2实验组的四天给药转阴率平均为5％，而达菲的四天给药转阴率平均为为0。
5.3.3糖缀合物CHB治疗流感H3N2实验组的六天给药总转阴率平均达35％，达菲对照组的六天给药总转阴率平均为27.5％，糖缀合物CHB高于达菲27.3％。
5.4糖缀合物CHB治疗流感H1N1实验组的结果与达菲对照组相近：
5.4.1糖缀合物CHB治疗流感H1N1实验组的四天最高转阴率达80％，达菲的四天最高转阴率为40％，糖缀合物CHB高于达菲100％。
5.4.2糖缀合物CHB治疗流感H1N1实验组的四天给药转阴率平均达40％，达菲对照组的四天给药转阴率平均为35％，糖缀合物CHB高于达菲14.3％。
5.4.3糖缀合物CHB治疗流感H1N1实验组的六天给药总转阴率平均为35％，达菲对照组的六天给药总转阴率平均为55％，达菲高于糖缀合物CHB 57％。
6.讨论
6.1糖缀合物CHB的早期的治疗的效果优于磷酸奥司他韦(达菲)。从单一亚型流感病毒实验结果统计分析，H3N2和H5N1亚型CHB给药组的效果均略优于磷酸奥司他韦，H1N1亚型CHB给药组效果略低于磷酸奥司他韦。
6.2据上海第二医科大学免疫研究所的研究报告，糖缀合物CHB是很强的免疫双向调节剂，其抑制病毒的作用机理为免疫调节，而病毒感染后免疫应答能力决定了病毒复制或清除的速度，本实验表明，糖缀合物CHB通过免疫调节可以用于预防、治疗流感及禽流感。
6.3达菲是通过抑制神经氨酸酶阻断流感、禽流感病毒的复制，但不能清除用药前的病毒，用药前的病毒只有通过免疫应答清除而实现转阴。因此达菲的早期治疗效果显著低于糖缀合物CHB，且不宜用于预防。
6.4达菲是化学药物，据《中国社会报-健康周刊》2006年1月12日报道，有毒副作用；糖缀合物CHB是天然的糖缀合物，无毒副作用。
6.5病毒极易变异，如变异后的病毒复制的主要酶不是达菲药物设计的酶，达菲将失去药效。据美国《新英格兰医学杂志》报道，禽流感病毒已对达菲产生抗药性。而糖缀合物CHB的免疫机理是对任何病毒起作用，病毒变异对糖缀合物CHB的药效影响较小。从本实验的情况分析，糖缀合物CHB对H1N1、H3N2、H5N1的六天治疗的总转阴率分别为35％、35％、50％，而达菲对H1N1、H3N2、H5N1的六天治疗的总转阴率分别为55％、27.5％、45％。
6.6试验总体效果较好，显示出剂量和治疗效果之间有一定规律。小鼠体内实验结果表明糖缀合物CHB对H1N1、H3N2和H5N1亚型流感病毒都有一定的抑制作用。
Claims (1)
1. 糖缀合物CHB在制备防治由流感病毒H1N1亚型、H3N2亚型、H5N1亚型引起的流感或禽流感药物中的应用；
其中：糖缀合物CHB是从鳖或/和龟的血清中分离、提取得到的一种多糖化合物，通过下列方法制备得到：
1.分离：将经预处理的鳖和/或龟的血清用膜分离一次，或对水透析12～36小时，以除去小分子物质，离心分离得上清液(I)；
2.提取：在上清液(I)中加入乙醇或丙酮，直至沉淀完全；
3.再分离：取出沉淀，用适量水溶解、离心分离后得上清液(II)；将上清液(II)再用膜分离一次或对水透析16～32小时，离心得上清液(III)；
4.后处理：将上清液(III)进行减压浓缩、冷冻干燥，得糖缀合物。
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