CN100417726C - 人源参与微丝组装调控的核蛋白及其制备和应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及的是人源参与微丝组装调控的核蛋白及其制备和应用方法。它来源于人正常肺上皮细胞，它是由173个氨基酸残基组成的蛋白质。首先提取正常人类肺组织的总RNA，通过逆转录PCR的方法合成cDNA，用特异性引物扩增所述的人P18基因蛋白编码序列，将所述人源参与微丝组装调控的核蛋白编码序列插入真核细胞表达载体，得到含有所述人源参与微丝组装调控的核蛋白编码序列的重组表达载体，将该重组表达载体导入真核细胞，通过免疫印迹的方法确认了所述的人源参与微丝组装调控的核蛋白的表达。
Description
(一)技术领域
本发明属于生物基因领域，具体地说是一种人源参与微丝组装调控的核蛋白，本发明也涉及这种人源参与微丝组装调控的核蛋白的制备和应用方法。
(二)背景技术
微丝是胞浆中一组由纤维状结构组成的网架。微丝几乎遍布于一切真核细胞，不仅仅是活细胞的支撑结构，形成微绒毛，而且在细胞器的运动、质膜的流动性、胞质环流以及顶体反应等细胞活动中扮演重要的角色。肌肉的收缩也主要靠微丝的运动来实现，当细胞受到外来信号的刺激时，也是依靠细胞膜下肌动蛋白结构的变化而进行信号的转导的。
微丝是由一些小的蛋白分子通过组装形成的网状结构，而且微丝一些重要功能(如参与细胞运动、细胞黏附)都是通过骨架蛋白的组装和解聚来实现的，因此研究微丝的组装和解聚，尤其是研究发现参与微丝组装和解聚的分子具有十分重要的意义。
通过差异显示技术从人肺上皮细胞中发现了一种mRNA序列，同时通过生物信息学分析确定其编码区，并推测其是一种膜结合相关蛋白。本发明从肺上皮细胞中分离了其编码蛋白P18的基因序列，并对其功能进行了研究，发现P18蛋白参与了微丝的组装和细胞黏附。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种来自于人源的参与微丝组装和细胞黏附的核蛋白。本发明的目的还在于提供这种人源参与微丝组装调控的核蛋白的制备和应用方法。
本发明的目的是这样实现的：人源参与微丝组装调控的核蛋白来源于人正常肺上皮细胞，它是由173个氨基酸残基组成的蛋白质，具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。其名称为：大肠杆菌JM 109/pET-28b-p18(Escherichia coli JM109/pET-28b-p18)；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学(邮政编码430072)；保藏日期为2005年8月25日；保藏编号：CCTCC NO：M205092。
本发明的蛋白质是采用下列方法来制备的：首先提取正常人类肺组织的总RNA，通过逆转录PCR的方法合成cDNA，用特异性引物、采用巢式PCR扩增所述的人源参与微丝组装调控的核蛋白编码序列，将所述人源参与微丝组装调控的核蛋白编码序列插入真核细胞表达载体，得到含有所述人源参与微丝组装调控的核蛋白编码序列的重组表达载体，将该重组表达载体导入真核细胞，通过免疫印迹的方法确认了所述的人源参与微丝组装调控的核蛋白的表达，所述的用特异性引物、采用巢式PCR扩增所用的特异性引物为：第一次所用的上游引物为5′-GGACTAAGAGGGGAGCAAGGCGAGGAG-3′，下游引物为5′-CTCTGGCTGTTCCCAAGAGCAGGCTC-3′；第二次所用的上游引物为5′-CACCATGCTCCCGCCGCCCCCGCGCCAG-3′，下游引物为5′-AGCCGCCACCTCCTGCTTGCCCTGGCAG-3′。
本发明的蛋白质在参与微丝组装与细胞黏附方面的应用是采用下列方法来进行的：将所述人源参与微丝组装调控的核蛋白编码序列插入真核细胞表达载体，得到含有所述人源参与微丝组装调控的核蛋白编码序列的重组表达载体，将该重组表达载体导入真核细胞，从导入了所述的人源参与微丝组装调控的核蛋白编码序列的重组表达载体的细胞中观察到细胞微丝结构的变化。
在概括和以特定的实施方案描述本发明前，列举在描述本发明的上下文中所用的缩写及代号。未在下文或说明书的其他部分定义的那些缩写及代号具有本领域认同的意义。
缩写“P18”是指本发明所提供的人源的参与微丝组装和细胞黏附的核蛋白，具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
代号“Invitrogen公司”指的是一家总部在美国的生物公司。
代号“TRIZOL”指的是Invitrogen公司的一种提取RNA的试剂的商标。
代号“Dnase I”指的是脱氧核糖核酸酶I，是一种将单链和双链的DNA降解为寡聚脱氧核糖核酸的酶。
代号“ThermoScriptTM RT-PCR System”指的是Invitrogen公司的一种逆转录试剂盒的名称。
缩写“ORF”指的是基因中的开放读码框，其是蛋白质的编码基因。
缩写“PCR”指的是聚合酶链式反应，是一种将核酸片段大量扩增的技术。
代号“pcDNA3.1D/V5-His-TOPO”指的是Invitrogen公司的一种真核表达质粒的名称。
缩写“LB”指的是Luria-Bertani培养基，是一种细菌生长用的培养基。
代号“Roche公司”指的是一家总部在德国的生物公司。
代号“FuGENETM6 Transfection Reagent”指的是Roche公司的细胞转染试剂。
代号“NIH3T3”指的是一种小鼠成纤维细胞株。
缩写“FBS”指的是胎牛血清。
代号“Western blot”指的是蛋白质免疫印迹反应。
代号“anti-P18-IgY”指的是鸡抗人P18抗体。
缩写“K4M”指的是一种细胞或组织的包埋剂。
缩写“FITC”指的是异硫氰酸荧光黄，是一种荧光染料。
代号“Northern blot”指的是RNA印迹反应。
(四)附图说明
图1是P18蛋白表达的分析图；
图2、3是P18蛋白的亚细胞定位图；
图4、5是P18蛋白参与微丝组装的激光共聚焦图片；
图6是P18mRNA表达的组织分布图。
(五)具体实施方式
下面结合附图举例对本发明作更详细的描述：
1、人参与微丝组装与细胞黏附的核蛋白全编码区的克隆
步骤1cDNA第一条链的合成
(1)正常肺组织总RNA的提取
应用Invitrogen公司TRIZOL RNA提取试剂，按说明书提供的方法提取正常肺组织的总RNA。并用DNase I处理所提组织总RNA，然后再用TRIZOL总RNA提取试剂纯化RNA，通过RNA/DNA计算器测定RNA含量，调整浓度约为1μg/μl，于1％甲醛变性琼脂糖凝胶上电泳检测所提RNA标本的完整性。
(2)采用Invitrogen公司的ThermoScriptTM RT-PCR System，采用随机六碱基引物(random hexamer)进行高温逆转录合成cDNA的第一条链。反应条件：25℃10min→60℃ 60min→85℃ 5min。
步骤2 PCR扩增P18蛋白的ORF区
为增强反应的特异性，采用巢式PCR扩增P18 ORF区。根据软件预测的ORF区设计引物。第一次PCR所用的上游引物为5′-GGACTAAGAGGGGAGCAAGGCGAGGAG-3′，下游引物为5′-CTCTGGCTGTTCCCAAGAGCAGGCTC-3′。第二次PCR所用的上游引物为5′-CACCATGCTCCCGCCGCCCCCGCGCCAG-3′，下游引物为5′-AGCCGCCACCTCCTGCTTGCCCTGGCAG-3′。第一次PCR所用引物位于第二次PCR所用引物的外侧。同时，为减少PCR过程中的错误碱基掺入，采取增大模板量，尽量减少PCR循环数的策略。
步骤3真核表达载体的构建
(1)连接与转化
采用Invitrogen公司pcDNA3.1D/V5-His-TOPO质粒作为真核表达载体。参照说明书的方法进行连接，并参照《分子克隆》(1989)所述的方法进行转化大肠杆菌。涂布于含有氨苄青霉素抗性的LB平板。
(2)重组体的确认
随机挑选40个菌落，置于5ml含氨苄青霉素(100ng/ml)的LB培养基中，37℃振荡培养16h，取1ml细菌培养物用于重组质粒序列测定(上海英骏生物技术有限公司)。
2、P18真核表达载体稳定转染细胞系的建立
步骤1细胞转染
采用Roche公司的FuGENETM6 Transfection Reagent作为转染试剂，并参照说明书将P18重组质粒转染NIH3T3细胞。
步骤2筛选稳定表达的细胞克隆
(1)转染后72h，将细胞以1∶6的比例传代，此时用含新霉素(G418)的培养基进行培养。
(2)根据细胞状态，每3天换液一次，直至抗性克隆形成。
(3)将已形成的抗性克隆细胞转移到24孔板中，加入新鲜的含10％FBS的全培养基进行传代培养，直至有足够的细胞数量用于后续试验，其间维持G418的筛选浓度。
步骤3 Western blot确认P18蛋白的表达
用鸡抗人anti-P18-IgY抗体用作一抗，参照《分子克隆》(1989)所述方法进行Western blot分析。结果如图1所示，从图中清晰可见转染后，蛋白表达量明显增加。
3、P18蛋白的亚细胞定位
步骤1 K4M低温包埋电子显微镜标示的制备
稳定表达P18蛋白的细胞经戊二醛和多聚甲醛溶液固定，重蒸水洗涤，乙醇系列脱水，包埋剂渗透，乙醇/K4M混合液浸透，再经纯K4M浸透。样品在-30℃下紫外照射聚合24h以上，然后将样品放在室温下继续用紫外照射聚合2-3天。
步骤2抗P18抗体免疫电镜观察
细胞经K4M包埋后，超薄切片。切片浸入PBSTT(磷酸盐缓冲液+BSA+TritonX100+Tween-20)中室温下作用15min，PBS充分洗涤。用鸡抗人P18抗体室温下作用60min。PBS洗涤3次，每次5min。再与15nm蛋白A-胶体金复合物于室温下作用60min。PBS和重蒸水充分洗涤，5％醋酸双氧铀染色15min。重蒸水充分洗涤后，在透射电子显微镜下观察照相。
对照实验中，一抗用抗体稀释液代替抗P18抗体。其他步骤与抗P18抗体标记步骤相同。结果如图2，上图为转染前，下图为转染后。箭头所示为转染后在核内大量出现金颗粒，表明此蛋白主要定位于细胞核内。
4、P18蛋白对微丝组装的影响
从培养皿中取出细胞培养片后，PBS洗涤；室温下用多聚甲醛固定，并用PBS洗涤。然后将载有细胞的盖玻片浸入TritonX-100中于室温作用10min，并用PBS洗涤。经BSA封闭后，用FITC标记的鬼笔环肽在室温下进行。然后用PBS洗涤两次。最后滴加n-Propyl gallate(n-丙基没石子酸酯)进行封片，用激光共聚焦显微镜观察。结果如图3所示，上图为转染前，下图为转染后。从图中可以清晰地看出，转染含有P18序列的质粒后，细胞微丝结构发生紊乱，细胞间连接消失，说明P18蛋白参与了细胞微丝的组装调控，对细胞间连接产生了直接的影响。
5、P18 mRNA在人类12种组织的分布
以P18基因的cDNA为探针，对人正常多组织杂交膜(Clontech公司)进行Northern blot分析。参照说明书所提供的方法，结果如图4所示。
序列表
SEQ ID No.1序列信息
<110>哈尔滨工业大学
<120>人源参与微丝组装调控的核蛋白P18编码序列
<160>2
<210>1
<211>522
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
atg ctc ccg ccg ccc ccg cgc cag ccg ccg ccc cag gcg cgt gcg gcc cgc ggc gcg gtg 60
Met Leu Pro Pro Pro Pro Arg Gln Pro Pro Pro Gln Ala Arg Ala Ala Arg Gly Ala Val
5 10 15 20
cgc ctg cag cgg ccc ttc ctg cgc agc ccg ctg ggc gtg ttg cgg ctg ctg cag ctg ctg 120
Arg Leu Gln Arg Pro Phe Leu Arg Ser Pro Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Gln Leu Leu
25 30 35 40
gcc ggc gct gcc ttc tgg atc act atc gcc acc agc aag tac cag ggc ccc gtg cac ttc 180
Ala Gly Ala Ala Phe Trp Ile Thr Ile Ala Thr Ser Lys Tyr Gln Gly Pro Val His Phe
45 50 55 60
gcg ctc ttc gtg tcc gtg ctc ttc tgg ctg ctc acc ctg ggc ctc tac ttc ctc acg ctg 240
Ala Leu Phe Val Ser Val Leu Phe Trp Leu Leu Thr Leu Gly Leu Tyr Phe Leu Thr Leu
65 70 75 80
ctg ggc aag cac gag ctg gtc ccc gtg ctg ggc tcg cgc tgg ctc atg gtc aac gtg gcg 300
Leu Gly Lys His Glu Leu Val Pro Val Leu Gly Ser Arg Trp Leu Met Val Asn Val Ala
85 90 95 100
cac gat gtg ctg gcg gcc gcg ctc tac ggc gcc gcc acc ggc atc atg agc gac cag atg 360
His Asp Val Leu Ala Ala Ala Leu Tyr Gly Ala Ala Thr Gly Ile Met Ser Asp Gln Met
105 110 115 120
cag cgc cac agc tac tgc aac ctc aag gat tac ccg ctc ccc tgc gcc tac cac gcc ttc 420
Gln Arg His Ser Tyr Cys Asn Leu Lys Asp Tyr Pro Leu Pro Cys Ala Tyr His Ala Phe
125 130 135 140
ctg gcg gcc gcc gtc tgc ggc ggc gtc tgc cac ggc ctc tac ctg ctt tcg gcg ctc tat 480
Leu Ala Ala Ala Val Cys Gly Gly Val Cys His Gly Leu Tyr Leu Leu Ser Ala Leu Tyr
145 150 155 160
ggc tgc ggg cgt cgc tgc cag ggc aag cag gag gtg gcg tga 522
Gly Cys Gly Arg Arg Cys Gln Gly Lys Gln Glu Val Ala
165 170
<210>2
<211>173
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
Met Leu Pro Pro Pro Pro Arg Gln Pro Pro Pro Gln Ala Arg Ala
5 10 15
Ala Arg Gly Ala Val Arg Leu Gln Arg Pro Phe Leu Arg Ser Pro
20 25 30
Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Gln Leu Leu Ala Gly Ala Ala Phe
35 40 45
Trp Ile Thr Ile Ala Thr Ser Lys Tyr Gln Gly Pro Val His Phe
50 55 60
Ala Leu Phe Val Ser Val Leu Phe Trp Leu Leu Thr Leu Gly Leu
65 70 75
Tyr Phe Leu Thr Leu Leu Gly Lys His Glu Leu Val Pro Val Leu
80 85 90
Gly Ser Arg Trp Leu Met Val Asn Val Ala His Asp Val Leu Ala
95 100 105
Ala Ala Leu Tyr Gly Ala Ala Thr Gly Ile Met Ser Asp Gln Met
110 115 120
Gln Arg His Ser Tyr Cys Asn Leu Lys Asp Tyr Pro Leu Pro Cys
125 130 135
Ala Tyr His Ala Phe Leu Ala Ala Ala Val Cys Gly Gly Val Cys
140 145 150
His Gly Leu Tyr Leu Leu Ser Ala Leu Tyr Gly Cys Gly Arg Arg
155 160 165
Cys Gln Gly Lys Gln Glu Val Ala
170
Claims (3)
1. 一种人源参与微丝组装调控的核蛋白，其特征是：人源参与微丝组装调控的核蛋白来源于人正常肺上皮细胞，它是由173个氨基酸残基组成的蛋白质，具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
2. 一种人源参与微丝组装调控的核蛋白的制备方法，其特征是：首先提取正常人类肺组织的总RNA，通过逆转录PCR的方法合成cDNA，用特异性引物、采用巢式PCR扩增所述的人源参与微丝组装调控的核蛋白编码序列，将所述人源参与微丝组装调控的核蛋白编码序列插入真核细胞表达载体，得到含有所述人源参与微丝组装调控的核蛋白编码序列的重组表达载体，将该重组表达载体导入真核细胞，通过免疫印迹的方法确认了所述的人源参与微丝组装调控的核蛋白的表达，所述的用特异性引物、采用巢式PCR扩增所用的特异性引物为：第一次所用的上游引物为5′-GGACTAAGAGGGGAGCAAGGCGAGGAG-3′，下游引物为5′-CTCTGGCTGTTCCCAAGAGCAGGCTC-3′；第二次所用的上游引物为5′-CACCATGCTCCCGCCGCCCCCGCGCCAG-3′，下游引物为5′-AGCCGCCACCTCCTGCTTGCCCTGGCAG-3′。
3. 一种如权利要求1所述的人源参与微丝组装调控的核蛋白的应用方法，其特征是：将所述人源参与微丝组装调控的核蛋白编码序列插入真核细胞表达载体，得到含有所述人源参与微丝组装调控的核蛋白编码序列的重组表达载体，将该重组表达载体导入真核细胞，从导入了所述的人源参与微丝组装调控的核蛋白编码序列的重组表达载体的细胞中观察到细胞微丝结构的变化。
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| 真核生物中的微小RNA及其功能研究进展. 马中良等.遗传学报，第30卷第7期. 2003 |
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