CN101519663B - 重组creg蛋白及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种携带人E1A激活基因阻遏子(hCREG)基因的真核表达载体及一种携带糖基化位点突变的hCREG基因的真核表达载体，本发明还涉及所述真核表达载体用于制备重组hCREG蛋白及糖基化位点突变的hCREG蛋白，两种蛋白抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth musclecells，VSMCs)增殖的作用及用于制备对PCI术后再狭窄具有抑制作用的药物及其用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种携带人E1A激活基因阻遏子(hCREG)基因的真核表达载体及一种携带糖基化位点突变的hCREG基因的真核表达载体，本发明还涉及所述真核表达载体用于制备重组hCREG蛋白及糖基化位点突变的hCREG蛋白，两种蛋白抑制血管平滑肌细胞(vascular smoothmuscle cells，VSMCs)增殖的作用及用于制备对PCI术后再狭窄具有抑制作用的药物及其用途。
背景技术
蛋白质糖基化是真核生物蛋白质翻译后修饰的重要方式，生物体内大约50％的蛋白质都是糖基化蛋白，包括酶、载体蛋白、激素、毒素、各种凝集素和结构蛋白。糖基化蛋白中的蛋白质是其生理功能的主要承担者，而糖链则通过识别和调控作用直接影响蛋白质的整体构象，进而影响由构象决定的蛋白质的生物学功能。由于多糖分子自身存在的高可变性，使得由不同宿主细胞、不同培养条件以及不同纯化工艺所制备的重组糖蛋白的糖基形式存在显著差异。这种糖基化形式的变异对糖蛋白正常的理化性质和生物学功能都存在严重的影响，从而制约了重组糖蛋白工程的发展。
人CREG(human cellular repressor of E1A-stimulated gene，hCREG)基因是1998年哈佛医学院Gill克隆的一个细胞分化调控基因(Veal E，Mol Cell Biol，1998；18(9)：5032-5041)。本室前期研究证实，hCREG蛋白表达能明显抑制体外培养的人胸廓内动脉平滑肌细胞-HITASY的增殖并促进其分化(Han Ya-Ling，Chinese Journalof Cellular and Molecular Immunology，2005；21(5)：570-574；HanYa-Ling，Prog Biochem Biophys，2004；31(12)：1099-1105；Han Ya-Ling，Prog Biochem Biophys，2005；32(6)：517-522)。同时，经外膜包裹导入的pLNCX2-hCREG逆转录病毒有效抑制了球囊拉伤后小鼠颈动脉狭窄的发生(Han Ya-Ling，Chinese Journal ofPathophysiology(already accepted，to be published))。Veal等的研究发现hCREG为分泌型糖蛋白，其蛋白结构中含有三个N-连接的糖链，可与细胞膜胰岛素样生长因子受体2(IGF2R)的6-磷酸甘露糖(M6P)配基结合，通过自分泌和旁分泌发挥其生物学功能(Veal E，Oncogene，2000；19(17)：2120-2128)。上述研究提示，hCREG糖蛋白可能是诱导VSMCs分化的重要调控因子，在临床经皮腔内冠状动脉介入治疗术后再狭窄的防治研究中具有潜在意义。
作为分泌型糖蛋白，hCREG蛋白合成过程中进行正确的糖基化修饰是其具有正常结构和功能的保证。据文献报道，CREG诱导的细胞生长抑制依赖于M6P/IGF2R，M6P/IGF2R优先与糖基化的CREG结合，只有极少量与非糖基化的CREG结合(Alessandra Di Bacco，Oncogene，2003；22(35)：5436-5445)。
为准确表达重组hCREG糖蛋白的结构和功能，本研究构建了pcDNA3.1myc-His/hCREG真核表达载体及糖基化位点突变的pcDNA3.1myc-His/hCREG真核表达载体，并选择了外源性蛋白的人胚胎肾工程细胞系293F进行重组hCREG/myc-His融合蛋白及糖基化位点突变的融合蛋白的表达。两种蛋白可用于比较CREG的糖基化形式对其功能的影响。糖基化的CREG蛋白能够最大限度地发挥其生物学功能；同时，具有生物学功能的去糖基CREG蛋白也可应用原核表达载体制备，满足大量生产的要求，从而克服糖基化的CREG蛋白必须应用真核表达载体制备及产量较低的不足。
发明内容
本发明的一个方面，涉及一种携带人E1A激活基因阻遏子(hCREG)基因的真核表达载体及一种携带糖基化位点突变的hCREG基因的真核表达载体，在本发明中，所述CREG基因是指人CREG基因，其序列如 SEQ ID NO：1所示(参见GenBank登录号NM003851)，糖基化位点突变的CREG指第160、193、216位点氨基酸序列由N突变为A，此序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。真核表达载体为pcDNA3.1 myc-His(美国Invitrogen公司)。
本发明还涉及所述真核表达载体用于制备重组CREG蛋白及糖基化位点突变的CREG蛋白，两种蛋白抑制VSMCs增殖的作用及用于制备对PCI术后再狭窄具有抑制作用的药物的用途。
重组的hCREG蛋白氨基酸序列如下：
MAGLSRGSARALLAALLASTLLALLVSPARGRGGRDHGDWDEASRLPPLPPREDAARVARFVTHVSDWGALATISTLEAVRGRPFADVLSLSDGPPGAGSGVPYFYLSPLQLSVSNLQENPYATLTMTLAQTNFCKKHGFDPQSPLCVHIMLSGTVTKV 
ETEMDIAKHSLFIRHPEMKTWPSSHNWFFAKL 
ITNIWVLDYFGGPKIVTPEEYY 
VTVQCEFCRYPAQWRPLESRGPFEQKLISEEDLNMHTGHHHHHH&(SEQ ID NO：1)
糖基化位点突变的重组hCREG蛋白氨基酸序列如下：
MAGLSRGSARALLAALLASTLLALLVSPARGRGGRDHGDWDEASRLPPLPPREDAARVARFVTHVSDWGALATISTLEAVRGRPFADVLSLSDGPPGAGSGVPYFYLSPLQLSVSNLQENPYATLTMTLAQTNFCKKHGFDPQSPLCVHIMLSGTVTKV 
ETEMDIAKHSLFIRHPEMKTWPSSHNWFFAKL 
ITNIWVLDYFGGPKIVTPEEYY 
VTVQCEFCRYPAQWRPLESRGPFEQKLISEEDLNMHTGHHHHHH&(SEQ ID NO：2)
双化线大号字体标记为突变的糖基化位点。
本发明的SEQ ID NO：1所对应的核苷酸序列如下：
ATGGCCGGGCTATCCCGCGGGTCCGCGCGCGCACTGCTCGCCGCCCTGCTGGCGTCGACGCTGTTGGCGCTGCTCGTGTCGCCCGCGCGGGGTCGCGGCGGCCGGGACCACGGGGACTGGGACGAGGCCTCCCGGCTGCCGCCGCTACCACCCCGCGAGGACGCGGCGCGCGTGGCCCGCTTCGTGACGCACGTCTCCGACTGGGGCGCTCTGGCCACCATCTCCACGCTGGAGGCGGTGCGCGGCCGGCCCTTCGCCGACGTCCTCTCGCTCAGCGACGGGCCCCCGGGCGCGGGCAGCGGCGTGCCCTATTTCTACCTGAGCCCGCTGCAGCTCTCCGTGAGCAACCTGCAGGAGAATCCATATGCTACACTGACCATGACTTTGGCACAGACCAACTTCTGCAAGAAACATGGATTTGA TCCACAAAGTCCCCTTTGTGTTCACATAATGCTGTCAGGAACTGTGACCAAGGTGAATGAAACAGAAATGGATATTGCAAAGCATTCGTTATTCATTCGACACCCTGAGATGAAAACCTGGCCTTCCAGCCATAATTGGTTCTTTGCTAAGTTGAATATAACCAATATCTGGGTCCTGGACTACTTTGGTGGACCAAAAATCGTGACACCAGAAGAATATTATAATGTCACAGTTCAGTGCGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCTTCGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATATGCATACCGGTCATCATCACCATCACCAT(SEQ IDNO：3)
本发明的SEQ ID NO：2所对应的核苷酸序列如下：
ATGGCCGGGCTATCCCGCGGGTCCGCGCGCGCACTGCTCGCCGCCCTGCTGGCGTCGACGCTGTTGGCGCTGCTCGTGTCGCCCGCGCGGGGTCGCGGCGGCCGGGACCACGGGGACTGGGACGAGGCCTCCCGGCTGCCGCCGCTACCACCCCGCGAGGACGCGGCGCGCGTGGCCCGCTTCGTGACGCACGTCTCCGACTGGGGCGCTCTGGCCACCATCTCCACGCTGGAGGCGGTGCGCGGCCGGCCCTTCGCCGACGTCCTCTCGCTCAGCGACGGGCCCCCGGGCGCGGGCAGCGGCGTGCCCTATTTCTACCTGAGCCCGCTGCAGCTCTCCGTGAGCAACCTGCAGGAGAATCCATATGCTACACTGACCATGACTTTGGCACAGACCAACTTCTGCAAGAAACATGGATTTGATCCACAAAGTCCCCTTTGTGTTCACATAATGCTGTCAGGAACTGTGACCAAGGTGGCAGAAACAGAAATGGATATTGCAAAGCATTCGTTATTCATTCGACACCCTGAGATGAAAACCTGGCCTTCCAGCCATAATTGGTTCTTTGCTAAGTTGGCGATAACCAATATCTGGGTCCTGGACTACTTTGGTGGACCAAAAATCGTGACACCAGAAGAATATTATGCAGTCACAGTTCAGTGCGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCTTCGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATATGCATACCGGTCATCATCACCATCACCAT(SEQ IDNO：4)
本发明的具体实施方案如下：
1、用RT-PCR技术扩增终止密码突变的hCREG开放读码框(包括hCREG及糖基化位点突变的hCREG)并构建pcDNA3.1 myc-His/hCREG真核表达载体。
2、Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)转染人293F细胞株并筛选稳定表达细胞克隆，Western blotting方法鉴定 hCREG/myc-His融合蛋白(包括hCREG及糖基化位点突变的hCREG)的表达，糖苷酶法及Western blotting行hCREG/myc-His融合蛋白的糖基化分析。
3、根据6×His亲和层析原理，应用Ni-NTA柱(美国Invitrogen公司)纯化重组hCREG蛋白及糖基化位点突变的重组hCREG蛋白，纯化后蛋白过HiTrap去盐柱(GE Healthcare Bio-Sciences AB)脱盐。
4、用流式细胞周期分析及假尿嘧啶(BrdU)掺入实验证实，重组hCREG/myc-His融合蛋白及糖基化位点突变的重组hCREG/myc-His融合蛋白与对照组相比均可抑制体外培养的人动脉平滑肌细胞增殖，但重组hCREG/myc-His融合蛋白的抑制作用强于糖基化位点突变的重组hCREG/myc-His融合蛋白。
具体实施方式
下列实施例是对本发明的进一步解释和说明。实施例：
1.pcDNA3.1 myc-His/hCREG(包括hCREG及糖基化位点突变的hCREG)真核表达载体的构建及鉴定
根据GenBank(NM003851)登录的hCREG cDNA序列中的开放阅读框，设计并合成终止密码突变的hCREG RT-PCR引物。
上游引物为：5’-aa ggatcc atggccgggctatcccgc-3’
基础Tm＝66℃，盐(50mM)调节Tm＝74℃；
下游引物为：5’-gc gaattc Gcactgaactgtgacattataatattcttctgg-3’
基础Tm＝64℃，盐(50mM)调节Tm＝74℃；
其中大写字母代表C/G突变的终止密码。
从人体外培养的VSMCs中提取mRNA并反转录成cDNA(TakaRa公司的cDNA第一链合成试剂盒。扩增条件是：25℃，5分钟；42℃，50分钟，95℃，10分钟)，通过下列反应体系和反应条件扩增出人CREGcDNA编码序列共667个碱基。
具体条件：
dH2O3 6.5μl
dNTP 4μl
缓冲液 5μl
引物(1) 1.5μl
引物(2) 1μl
模板 1μl
DNA聚合酶(TakaRa公司) 0.25μl
94℃ 15秒
58℃ 30秒
72℃ 40秒45循环
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收后，将其克隆至pMD18-T载体(TakaRa公司，No：D101A)。用亚克隆技术通过BamH I和EcoRI两个酶切位点将pMD18-T/hCREG载体中hCREG cDNA亚克隆至pcDNA 3.1myc-His载体(美国Invitrogen公司，No：V800-20)，获得带有myc和His标签的真核表达载体pcDNA3.1 myc-His/hCREG，送TakaRa公司测序鉴定，证实序列与GenBank(NM003851)及上海生工生物工程技术服务有限公司合成的糖基化位点突变的hCREG序列完全一致。
2.稳定转染细胞克隆的筛选及鉴定
应用Lipofectamine 2000试剂将pcDNA3.1 myc-His/hCREG载体转染至人293F细胞中。转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺至6孔板，使其在转染日密度为90％。细胞铺板在2mL含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。转染前每孔细胞换为2mL不含血清不含抗生素的DMEM培养基。用250μl无血清培养基(DMEM培养基)稀释4μgDNA(即hCREG及糖基化位点突变的hCREG真核表达载体)，250μl DMEM培养基稀释8μl Lipofectamine 2000试剂，5分钟内同稀释的DNA混合，室温保温20分钟。直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。37℃，5％CO2培养6小时后，弃掉每孔中的培养基，重新加 入2mL含10％新生牛血清及抗生素的DMEM培养基。37℃，5％的CO2中培养24小时后1∶10传代，次日加入G418(1000μg/mL)筛选稳定转染的细胞克隆。将稳定转染的293F细胞及未转染的对照细胞分别在10cm培养皿中培养至80％～90％融合，加蛋白裂解液100μl(含蛋白酶抑制剂2μl)提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE后，分别以1∶3500Anti-myc、1∶2500 Anti-His(美国Invitrogen公司)及1∶5000Anti-hCREG单克隆抗体(美国Santa cruz公司)作为一抗，以辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠抗体(中杉公司)作为二抗行Western blotting检测，用ECL试剂盒(Amersham公司)发光显影。稳定转染hCREG及糖基化位点突变的hCREG真核表达载体的293F细胞裂解产物，用hCREG抗体、myc抗体及His抗体分别可检测到大小约为30KD及25KD的融合蛋白表达条带。
3.hCREG/myc-His融合蛋白(包括hCREG及糖基化位点突变的hCREG)的糖基化鉴定
将稳定转染hCREG及糖基化位点突变的hCREG真核表达载体的人293F细胞及未转染的对照细胞分别取20μl样品，加入1×糖蛋白变性缓冲液2μl 100℃煮沸10分钟后，加入10×G7缓冲液2μl及10％NP-40 2μl，再加入2μl肽N-糖苷酶F(PNGaseF)(美国Bio-labs公司)，37℃温育1小时。取正常样品及PNGaseF处理后的样品经SDS-PAGE后，分别以1∶3500 Anti-myc、1∶2500 Anti-His及1∶5000节Anti-hCREG单克隆抗体作为一抗，以辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠抗体作为二抗行Western Blotting检测，用ECL试剂盒发光显影。经PNGaseF处理后，对照组hCREG蛋白及hCREG融合蛋白分子量降低大约10KD左右，电泳条带下移，证明两种条件下分泌的hCREG蛋白均为糖基化蛋白。Anti-myc及Anti-His的Western blotting结果显示对照组细胞中无His及myc蛋白表达，而转染组细胞中可见30KD的蛋白条带，经PNGase F处理后，分子量降低，条带下移，证实了转染组细胞中表达的重组hCREG/myc-His蛋白为一种糖基化蛋白。糖基化位点突变的hCREG蛋白经PNGaseF处理前后Anti-hCREG、Anti-myc及Anti-His的 Western blotting条带分子量无变化，均为25KD左右。
4.重组hCREG(包括hCREG及糖基化位点突变的hCREG)蛋白的纯化及浓缩、脱盐
将稳定转染hCREG及糖基化位点突变的hCREG真核表达载体的人293F细胞接种于直径为10cm培养皿上(含10％胎牛血清的DMEM培养基中)扩增培养，分别收集200皿的细胞，PBS洗两次后用细胞刮刮除细胞，每10个皿的细胞收集到1个锥形管中，1500rpm离心10分钟，弃上清。纯化所需试剂配制及操作过程如下：
①裂解缓冲液 贮存浓度 剂量
50mM Tris(pH7.5) 0.5M 10mL
100mM咪唑 3M 3.3mL
400mM NaCl 4M 10mL
5mM β-巯基乙醇 360μl(14.3M)
5％甘油 5mL
1％Triton X-100 1mL
蛋白抑制剂(no EDTA) 100μl
(去离子水补至100mL)
每个锥形管中加入1～2mL裂解缓冲液，反复吹打混匀，冰上放置30分钟后，分装1.5mL Eppendorf管，13000rpm离心30分钟，取8mL上清加入0.5mL用去离子水清洗并与裂解缓冲液预结合过的Ni-NTA树脂中，4℃旋转过夜。使树脂通过重力沉降，仔细吸抽上清，4℃保存用于SDS-PAGE。
②洗液I 贮存浓度 剂量
50mM Tris(pH 8.0) 0.5M 10mL
150mM咪唑 3M 5mL
400mM NaCl 4M 10mL
5mMβ-巯基乙醇 360μl(14.3M)
5％甘油 5mL
1％Triton X-100 1mL
(去离子水补至100mL)
③洗液II 贮存浓度 剂量
50mM Tris(pH 8.0) 0.5M 10mL
200mM咪唑 3M 6.6mL
1M NaCl 4M 25mL
5mM β-巯基乙醇 360μL(14.3M)
5％甘油 5mL
1％Triton X-100 1mL
(去离子水补至100mL)
④洗液III 贮存浓度 剂量
50mM Tris(pH 8.0) 0.5M 10mL
200mM咪唑 3M 6.6mL
400mM NaCl 4M 10mL
5mM β-巯基乙醇 360μL(14.3M)
5％甘油 5mL
(去离子水补至100mL)
加入8mL洗液I，反复混匀10-15分钟，使树脂通过重力沉降，仔细吸抽上清，4℃保存作SDS-PAGE用。加入洗液II和洗液III，各洗涤1次，方法同上。
⑤洗脱缓冲液 贮存浓度 剂量
50mM Tris(pH 8.0) 0.5M 10mL
250mM咪唑 3M 8.3mL
200mM NaCl 4M 5mL
5mMβ-巯基乙醇 360μL(14.3M)
5％甘油 5mL
(去离子水补至100mL)
加入5mL洗脱缓冲液，垂直固定纯化柱，去除底端的帽，洗脱蛋白，收集洗脱液，重复3次。分别将收集的两种蛋白洗脱液各15mL用Centriprep柱子(法国Millipore公司)超滤浓缩至600μl。经过 HiTrap去盐柱(GE Healthcare Bio-Sciences AB)脱盐。重组的hCREG蛋白及糖基化位点突变的hCREG蛋白分别经BCA法测定并与蛋白标准曲线比较，浓度分别为1.2mg/mL和1.6mg/mL。考染后经image-J软件分析，纯度分别为92％和90％。
5.重组hCREG蛋白((包括hCREG及糖基化位点突变的hCREG))抑制体外培养的人动脉平滑肌细胞增殖
本室研究发现，有血清条件下培养的人动脉平滑肌细胞CREG表达量低，去血清后CREG的mRNA表达上调(Han Ya-Ling，Prog BiochemBiophys，2003；30(6)：868-873)。故本实验将重组CREG蛋白添加至有血清培养的人动脉平滑肌细胞中，以研究其对细胞增殖的影响。
将人动脉平滑肌细胞分别在3个直径为10cm培养皿中培养至60％～70％融合，无血清培养72小时后进行细胞周期同步化，其后更换为含10％新生牛血清的DMEM，分别设为对照组、添加2μg/mL hCREG蛋白组及添加2μg/mL糖基化位点突变的重组hCREG蛋白，继续培养48小时。0.25％胰蛋白酶消化并收获细胞，75％冰乙醇固定2小时，碘化乙碇染色1小时，流式细胞仪分析细胞周期。
结果提示重组hCREG蛋白及糖基化位点突变的重组hCREG蛋白与对照组相比均可显著抑制体外培养的人动脉平滑肌细胞增殖，G0/G1期细胞比率(共计数2万个细胞)显著增加(表1)。证实重组hCREG蛋白的抑制作用强于糖基化位点突变的重组hCREG蛋白。
表1添加重组hCREG蛋白后人VSMCs的细胞周期分布(％)
| 对照组 | 糖基化位点突变 hCREG蛋白 | 重组hCREG 蛋白 | |
| G0/G1 | 64.70 | 66.92 | 68.59 |
| S | 30.19 | 32.26 | 31.41 |
| G2/M | 5.11 | 0.82 | 0 |
注：数据是各细胞周期占总计数细胞的比率
于6孔板中每孔分别接种1×104个人VSMCs，分别设为对照组、添加2μg/mL hCREG蛋白组及添加2μg/mL糖基化位点突变的hCREG蛋白组，每组细胞平行做两个复孔。37℃，5％的CO2中培养48小时后换液，加入10mg/mL BrdU，继续培养2小时后，常规固定、通透，浓盐酸变性5min，封闭后加Anti-BrdU抗体(1∶100)4℃过夜，二抗(1∶100)室温2小时，加入DAB，待显色明显时PBS终止反应，并以苏木素复染细胞核。显微镜下观察细胞核着色情况。每孔计数10个视野，计算着色细胞比例。阳性结果判断：细胞核内着染棕黄色颗粒者为BrdU阳性细胞。
表2添加不同重组hCREG蛋白的BrdU阳性细胞率(％)
| 对照组 | 糖基化位点突变 hCREG蛋白 | 重组hCREG蛋白 | |
| BrdU染色阳性细胞 | 68 | 44 | 28 |
注：数据是各组BrdU阳性细胞的比率
结果提示添加重组hCREG蛋白及糖基化位点突变的重组hCREG蛋白与对照组相比均可显著抑制体外培养的人VSMCs增殖，BrdU阳性细胞的比率降低(表2)。其中重组hCREG蛋白的抑制作用强于糖基化位点突变的重组hCREG蛋白。组间比较均有统计学差异(P＜0.05)。
6.实验的统计学处理方法
本研究实验数据均为百分数。两样本率的比较应用卡方检验，统计学处理均应用SPSS 11.0软件包处理。P＜0.05为有统计学差异。
序列表
<110>中国人民解放军沈阳军区总医院
<120>重组CREG蛋白及其用途
<130>IDC080028
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>260
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Met Ala Gly Leu Ser Arg Gly Ser Ala Arg Ala Leu Leu Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Ala Ser Thr Leu Leu Ala Leu Leu Val Ser Pro Ala Arg Gly Arg
20 25 30
Gly Gly Arg Asp His Gly Asp Trp Asp Glu Ala Ser Arg Leu Pro Pro
35 40 45
Leu Pro Pro Arg Glu Asp Ala Ala Arg Val Ala Arg Phe Val Thr His
50 55 60
Val Ser Asp Trp Gly Ala Leu Ala Thr Ile Ser Thr Leu Glu Ala Val
65 70 75 80
Arg Gly Arg Pro Phe Ala Asp Val Leu Ser Leu Ser Asp Gly Pro Pro
85 90 95
Gly Ala Gly Ser Gly Val Pro Tyr Phe Tyr Leu Ser Pro Leu Gln Leu
100 105 110
Ser Val Ser Asn Leu Gln Glu Asn Pro Tyr Ala Thr Leu Thr Met Thr
115 120 125
Leu Ala Gln Thr Asn Phe Cys Lys Lys His Gly Phe Asp Pro Gln Ser
130 135 140
Pro Leu Cys Val His Ile Met Leu Ser Gly Thr Val Thr Lys Val Asn
145 150 155 160
Glu Thr Glu Met Asp Ile Ala Lys His Ser Leu Phe Ile Arg His Pro
165 170 175
Glu Met Lys Thr Trp Pro Ser Ser His Asn Trp Phe Phe Ala Lys Leu
180 185 190
Asn Ile Thr Asn Ile Trp Val Leu Asp Tyr Phe Gly Gly Pro Lys Ile
195 200 205
Val Thr Pro Glu Glu Tyr Tyr Asn Val Thr Val Gln Cys Glu Phe Cys
210 215 220
Arg Tyr Pro Ala Gln Trp Arg Pro Leu Glu Ser Arg Gly Pro Phe Glu
225 230 235 240
Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Met His Thr Gly His His
245 250 255
His His His His
260
<210>2
<211>260
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
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20 25 30
Gly Gly Arg Asp His Gly Asp Trp Asp Glu Ala Ser Arg Leu Pro Pro
35 40 45
Leu Pro Pro Arg Glu Asp Ala Ala Arg Val Ala Arg Phe Val Thr His
50 55 60
Val Ser Asp Trp Gly Ala Leu Ala Thr Ile Ser Thr Leu Glu Ala Val
65 70 75 80
Arg Gly Arg Pro Phe Ala Asp Val Leu Ser Leu Ser Asp Gly Pro Pro
85 90 95
Gly Ala Gly Ser Gly Val Pro Tyr Phe Tyr Leu Ser Pro Leu Gln Leu
100 105 110
Ser Val Ser Asn Leu Gln Glu Asn Pro Tyr Ala Thr Leu Thr Met Thr
115 120 125
Leu Ala Gln Thr Asn Phe Cys Lys Lys His Gly Phe Asp Pro Gln Ser
130 135 140
Pro Leu Cys Val His Ile Met Leu Ser Gly Thr Val Thr Lys Val Ala
145 150 155 160
Glu Thr Glu Met Asp Ile Ala Lys His Ser Leu Phe Ile Arg His Pro
165 170 175
Glu Met Lys Thr Trp Pro Ser Ser His Asn Trp Phe Phe Ala Lys Leu
180 185 190
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210 215 220
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225 230 235 240
Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Met His Thr Gly His His
245 250 255
His His His His
260
<210>3
<211>780
<212>DNA
<213>入工序列
<400>3
atggccgggc tatcccgcgg gtccgcgcgc gcactgctcg ccgccctgct ggcgtcgacg 60
ctgttggcgc tgctcgtgtc gcccgcgcgg ggtcgcggcg gccgggacca cggggactgg 120
gacgaggcct cccggctgcc gccgctacca ccccgcgagg acgcggcgcg cgtggcccgc 180
ttcgtgacgc acgtctccga ctggggcgct ctggccacca tctccacgct ggaggcggtg 240
cgcggccggc ccttcgccga cgtcctctcg ctcagcgacg ggcccccggg cgcgggcagc 300
ggcgtgccct atttctacct gagcccgctg cagctctccg tgagcaacct gcaggagaat 360
ccatatgcta cactgaccat gactttggca cagaccaact tctgcaagaa acatggattt 420
gatccacaaa gtcccctttg tgttcacata atgctgtcag gaactgtgac caaggtgaat 480
gaaacagaaa tggatattgc aaagcattcg ttattcattc gacaccctga gatgaaaacc 540
tggccttcca gccataattg gttctttgct aagttgaata taaccaatat ctgggtcctg 600
gactactttg gtggaccaaa aatcgtgaca ccagaagaat attataatgt cacagttcag 660
tgcgaattct gcagatatcc agcacagtgg cggccgctcg agtctagagg gcccttcgaa 720
caaaaactca tctcagaaga ggatctgaat atgcataccg gtcatcatca ccatcaccat 780
<210>4
<211>780
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
atggccgggc tatcccgcgg gtccgcgcgc gcactgctcg ccgccctgct ggcgtcgacg 60
ctgttggcgc tgctcgtgtc gcccgcgcgg ggtcgcggcg gccgggacca cggggactgg 120
gacgaggcct cccggctgcc gccgctacca ccccgcgagg acgcggcgcg cgtggcccgc 180
ttcgtgacgc acgtctccga ctggggcgct ctggccacca tctccacgct ggaggcggtg 240
cgcggccggc ccttcgccga cgtcctctcg ctcagcgacg ggcccccggg cgcgggcagc 300
ggcgtgccct atttctacct gagcccgctg cagctctccg tgagcaacct gcaggagaat 360
ccatatgcta cactgaccat gactttggca cagaccaact tctgcaagaa acatggattt 420
gatccacaaa gtcccctttg tgttcacata atgctgtcag gaactgtgac caaggtggca 480
gaaacagaaa tggatattgc aaagcattcg ttattcattc gacaccctga gatgaaaacc 540
tggccttcca gccataattg gttctttgct aagttggcga taaccaatat ctgggtcctg 600
gactactttg gtggaccaaa aatcgtgaca ccagaagaat attatgcagt cacagttcag 660
tgcgaattct gcagatatcc agcacagtgg cggccgctcg agtctagagg gcccttcgaa 720
caaaaactca tctcagaaga ggatctgaat atgcataccg gtcatcatca ccatcaccat 780
Claims (4)
1.一种携带Seq ID No：4所示核苷酸序列的真核表达载体。
2.由权利要求1所述真核表达载体制备的Seq ID No：2所示的糖基化位点突变的重组hCREG蛋白。
3.含有权利要求2的重组蛋白的药物组合物。
4.Seq ID No：2所示的糖基化位点突变的重组hCREG蛋白在制备用于对PCI术后再狭窄具有抑制作用的药物中的用途。
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