CN100410661C - 一种具有清热解毒作用的双花感康注射液的质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有清热解毒作用的双花感康注射液的质量控制方法，质量控制方法包括指纹图谱和/或含量测定；指纹图谱方法采用液相色谱法及气相色谱法，含量测定法中公开了总酸的测定方法、绿原酸测定方法、芳樟醇的气相测定方法。本发明质量控制方法能够较全面、有效地控制双花感康注射液的质量。

Description

一种具有清热解毒作用的双花感康注射液的质量控制方法

技术领域

本发明涉及一种中药注射液的质量控制方法，特别涉及一种具有清热解毒作用的双花感康注射液的质量控制方法。

背景技术

金银花的有效成分为挥发油、有机酸类、少量黄酮类、三萜皂甙类化合物等，其中主要药效成分为挥发油及有机酸类。现代药理研究表明金银花具有解热、抗病毒、抗炎等药理作用。目前，金银花主要用于多种感染、各类炎症、高热症、高脂血症等临床药物治疗。现临床应用复方金银花制剂的频率较高。金银花单味药材临床常用制剂有金银花露、金银花合剂、金银花胶囊等。上述常用制剂制备工艺技术层次低，有效成分含量少，制剂稳定性差且作用缓慢，未完全发挥金银花的临床疗效。目前临床尚无综合利用金银花水溶性成分及挥发性成分的注射剂剂型。本品为在上市常用制剂的研究基础上，以金银花为原料，采用现代提取、精制工艺，综合利用金银花水溶性及挥发性有效成分研制而成的中药注射液。本品采用静脉给药，以期达到起效快速、生物利用度高的金银花解热、抗病毒等临床疗效。

信息检索结果表明：金银花单味药材制成的注射液目前已有文献公开及专利申报。浙江省诸暨市人民医院1998年12月3日委托绍兴市专利事务所申请了一项“金银花注射液及其制备方法”专利(专利申请号：98122062.2)。此项专利申请中应用金银花单味药材，仅仅选用水蒸气蒸馏提取法提取其挥发油有效成分，挥发油蒸馏液重蒸馏后进行常规注射液配液处理如活性炭吸附、微滤等操作制成注射液。此项申请所涉及的金银花注射液适用于感冒、发烧及病毒感染引起的诸症。此专利中对金银花制备注射液药材配方进行了限定，但是限定范围较窄(90-100g/百份)。同时，文献检索可见，《中国现代应用药学杂志》2000年2月第17卷第1期中公开了题为“金银花注射液的制备及应用”一文，文中对金银花注射液处方、制法、作用及用途、用法用量进行了公开报道。

由对上述专利申请文本及文献资料的综合分析发现：目前金银花注射液为诸暨市人民医院的医院制剂，临床应用仅利用其挥发油有效成分而对其有机酸类成分未加以综合利用。同时，其质量标准控制能力较低，不能实现产品质量的准确控制。

发明内容

本发明的目的在于公开一种具有清热解毒作用的双花感康注射液的质量控制方法的质量控制方法。

本发明质量控制方法包括以下指纹图谱检测方法和/或含量测定：

发明质量控制方法所述的指纹图谱检测方法包括以下方法中的一种和/或两种：

A.液相色谱法包括以下步骤：

Agilent 1100液相色谱仪，色谱柱：waters symmetry shield RP₁₈(4.6×250mm 3.5μm)；乙腈-0.1％磷酸水溶液系统为流动相，洗脱程序为：

时间(分钟)        乙腈(％)                0.1％磷酸(％)

0                 5                       95

50                25                      75

60                25                      75

流速为1ml/min；检测波长为225nm；理论板数按参照物(绿原酸)峰计算，应不低于6000；参照物溶液的制备，取绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，即得；供试品溶液的制备，取双花感康注射液1ml，置25ml量瓶中，加水溶液稀释至刻度，摇匀，即得；精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定，供试品指纹图谱与质量标准所附的对照指纹图谱经指纹图谱相似度计算软件计算，相似度应大于0.9。

双花感康注射液液相色谱法的标准指纹图谱，共有13个峰，其中10号峰为S峰；1号峰：52.592mAU，2号峰61.79mAU，3号峰：669.256mAU，4号峰：127.878mAU，5号峰：387.721mAU，6号峰：170.852mAU，7号峰：811.979mAU，8号峰：68.598mAU，9号峰：419.465mAU，10号峰：1498.514mAU，11号峰：185.009mAU，12号峰：68.71mAU，13号峰：193.442mAU。

B.气相色谱法包括以下步骤：

Agilent 6890气相色谱仪，气相色谱顶空进样法测定，顶空恒温箱温度95℃，传输管温度110℃，进样环温度125℃，平衡时间：60min；用5％二苯基-95％二甲基硅烷共聚物为固定相的毛细管色谱柱(HP-5：30m×0.32mm×0.25μm)；进样口温度：240℃；检测器温度(FID)：240℃；顶空进样测定，分流比：1∶1；程序升温：初始温度50℃，保持5分钟，以每分钟10℃升至80℃，保持10分钟，以每分钟10℃升至130℃，保持6分钟，再以每分钟5℃升至240℃，保持9分钟，测定；载气流速：2.0ml/min；理论板数按对照品樟脑峰计算，应不低于30000；对照品溶液的制备，取芳樟醇对照品，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，精密吸取1ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置20ml顶空瓶中，轧盖，即得；供试品溶液的制备，精密吸取双花感康注射液10ml，置20ml顶空瓶中，轧盖，即得；顶空进样测定：供试品指纹图谱中与参照物峰相应的峰为S峰，计算相对保留时间和峰面积比值，应符合下列要求：双花感康注射液指纹图谱应与标准指纹图谱相似；指纹图谱应有13个共有峰；

相对保留时间(峰号)：0.091～0.169(1)、0.099～0.183(2)、0.123～0.229(3)、0.160～0.298(4)、0.294～0.546(5)、0.313～0.581(6)、0.356～0.662(7)、0.540～1.002(8)、0.628～1.166(9)、1(s)、0.844～1.568(10)、0.885～1.643(11)、0.927～1.72(12)

峰面积比值(峰号)：0.125～0.293(5)、0.153～0.357(6)、0.154～0.358(8)、1(S)、0.106～0.248(11)；非共有峰面积不得过总峰面积的20％。发明质量控制方法含量测定法包括以下方法中的一种和/或几种：

总酸含量测定：取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加水制成每ml含0.1mg的溶液，作为储备液；分别精密吸取上述溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml置于10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，照分光光度法，以水为空白对照，在327nm波长处测定吸收度为A1，以在400nm波长下测定吸收度为A2，以ΔA(A1-A2)为纵坐标，以浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线；测定法，精密吸取装置差异项下双花感康注射液2ml，置25ml棕色量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，再精密吸取上述溶液1ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；依法测定，根据标准曲线计算，双花感康注射液每1ml含总酸不得少于3mg；

绿原酸含量测定：色谱条件与系统适应性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-0.1％磷酸8-12∶85-95为流动相；检测波长327nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于4000；对照品溶液的制备，取得原酸对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含40μg的溶液，即得；供试品溶液的制备，精密吸取装置差异项下双花感康注射液1ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得；测定法，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；双花感康注射液含金银花以绿原酸(C₁₆H₁₈O₉)计，每1ml不得少于1.5mg；

芳樟醇含量测定：色谱条件与系统适应性试验，以5％二苯基-95％二甲基硅烷共聚物为固定相的毛细管色谱柱(30m×0.32mm×0.25μm)；进样口温度：200-250℃；检测器温度(FID)：200-250℃；分流进样测定，分流比：10-20∶1，柱温：45-55℃，以每分钟10℃升温至70-90℃，保持8-12min，载气流速：1.5-2.5ml/min；理论塔板数按芳樟醇峰计，应不少于20000；芳樟醇峰与内标物峰的分离度应大于1.5；校正因子测定，取樟脑对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.4mg的溶液，作为内标溶液；取芳樟醇对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含芳樟醇0.4mg的溶液，精密吸取芳樟醇对照品溶液1ml及内标溶液1ml置10ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取2μl，注入气相色谱仪，计算校正因子；测定法：精密量取装量差异项下双花感康注射液50ml，氯仿萃取三次，分别为40ml、30ml、30ml，合并氯仿液，减压回收氯仿至约5ml，定量转移至10ml量瓶中，加氯仿定容至刻度，摇匀；精密吸取上述溶液9ml，置10ml量瓶中，再精密加入1ml樟脑储备液，摇匀，吸取2μl，注入气相色谱仪，测定，即得；双花感康注射液含金银花以芳樟醇计，不得少于6.0μg/ml。

本发明所述双花感康注射液是按如下方法制备：

金银花           300-500g

葡甲胺           6-10g

氯化钠           1-4g

亚硫酸氢钠       1-4g

                 制成1000ml

制法：取金银花，加16-20倍量水，进行水蒸汽蒸馏，收集药材6-9倍量的蒸馏液，蒸馏液进行重蒸馏，收集药材1-3倍量的蒸馏液，备用；蒸馏器内药液滤过，滤液备用，药渣再加7-9倍量的水煎煮0.3-1小时，滤过，合并滤液，放冷，用10％NaHCO₃溶液调至pH值6，上大孔树脂柱(树脂用量为药材量的1-4倍)，收集流出液，用盐酸调至pH2-3，继续上已处理好的大孔树脂柱(树脂用量为药材量的1-4倍)，用60-80％乙醇上柱洗脱，收集醇洗脱液，回收至无醇味，得金银花提取物浸膏，备用；上述金银花提取物浸膏加500ml注射用水溶解后，加入葡甲胺5-7调pH值，滤过，药液超滤(膜分子量1万)，得超滤液；重蒸馏液加入适量1，2-丙二醇溶解后与超滤液合并，加入氯化钠及亚硫酸氢钠，搅拌使溶解，加入葡甲胺1-3g调pH值，用注射用水稀释，混合均匀，微滤，滤液分装，轧盖，即得。

本发明质量控制方法能够较全面、有效地控制制剂质量，使双花感康注射液液质量稳定，易于控制。

以下实验例进一步说明本发明。

实验例1液相色谱法指纹图谱研究

参照物溶液的制备

双花感康注射液主要有效成分为绿原酸等，在《中国药典》附有对照品，纯度也符合含量测定要求。选择较稳定的绿原酸作为参照物，由中国药品生物制品检定所提供(批号：110749-200202，供含量测定用)。

供试品溶液的制备

双花感康注射液，采用水稀释后进样，所得到得指纹图谱较为理想，各色谱峰分离度较好，具体制备方法为：精密吸取双花感康注射液1ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，即得供试品溶液。

检测方法

(1)仪器和试剂

仪器：Agilent 1100液相色谱；MWD多波长紫外-可见检测器，G1313A全自动进样器，Agilent LC色谱工作站。色谱柱：waters symmetry shieldRP18(4.6×250mm 3.5μm)；流动相：乙腈-0.1％磷酸水溶液，线性梯度洗脱；检测波长：225nm；柱温：30℃；流速：1ml/min。

试剂：乙腈为色谱纯(Tedia company)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

(2)色谱柱：①C18柱：waters symmetry shield RymmetrP₁₈(250×4.5mm，3.5μm)，waters公司。②C18柱：Kromasil C18(250×4.5mm，5μm)，THMO公司。③C18柱：phenomenex luna C₁₈(250×4.6mm，5μm)，菲罗门公司。④C18柱：Alltima C18(250×4.6mm，5μm)，Alltech公司。

(3)流动相：乙腈-0.1％磷酸水溶液系统、梯度洗脱。

经试验考察，发现普通ODS色谱柱对制剂中各成分分离效果虽然较好，但个别色谱峰保留时间漂移较为严重，导致制剂指纹图谱测定重复性差，所以我们选用以symmetry shield RP₁₈为填料的色谱柱，经多次试验，结果精密度、重复性均符合指纹图谱测定要求，因此选择用该类型色谱柱作为双花感康注射剂指纹图谱测定专用色谱柱。

(4)测定波长：根据紫外光谱可见该制剂中主要成分绿原酸的最大吸收波长分别为327nm。为了能更全面的反映制剂中的成分，我们检测了225、235、270、245、327nm五个波长的下的指纹图谱，在327nm波长下的制剂指纹图谱中绿原酸虽有较大的吸收，但其余色谱峰则相对偏小，不能全面反映制剂所含成分的情况，经比较分析，确定225nm为制剂指纹图谱的检测波长，在该波长下的制剂指纹图谱中，除已知成分绿原酸能够较好的检测出外，其它成分指纹峰也能被较好地体现，且各峰分离度好。见附图1：

在上述条件下，共试验二支symmetry shield RP₁₈柱，均能达到同样分离结果。经过进一步优选确定了制剂指纹图谱的检测方法。为了保证该方法的可行性与准确性，对该检测方法进行方法学考察，以保证其有较好的重复性及能够有效地控制制剂的质量。

(5)延长时间(改变流动相)测试滞后峰

延长测试时间1倍至2小时，结果未见滞后峰出现。见附图4、5：实验例2采用液相色谱法指纹图谱质量检测的稳定性试验

取批号为021108的双花感康注射液，按本发明供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，每隔一定时间测定一次其指纹图谱，共测5次，以0小时进样所得指纹图谱为对照计算相似度，相似度结果均不小于0.99，表明供试品溶液12小时内成分是稳定的。符合指纹图谱的技术要求(应不小于0.95)。

实验例3采用液相色谱法指纹图谱质量检测的精密度试验

取批号为021108的双花感康注射液，按本发明供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，连续进样6次进行测定。结果表明，供试品溶液中各共有峰的保留时间及主要峰(占总峰面积5％以上)的峰面积基本一致(RSD＜5％)，又以第1次进样所得指纹图谱做为对照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度结果均不小于0.99，均符合指纹图谱的技术要求。表明该方法精密度良好。

实验例4采用液相色谱法指纹图谱质量检测的重复性试验

取批号为021108的双花感康注射液，按本发明供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，同法制备供试品溶液6份，依法测定，结果计算相似度，相似度结果均不小于0.98，符合指纹图谱的技术要求(不小于0.950)。

根据以上方法学考察结果，表明该方法测定双花感康注射液的指纹图谱，精密度、重复性、稳定性均较好，能够准确测定该制剂的指纹图谱。

实验例5采用液相色谱法指纹图谱质量检测的双花感康注射液十批成品的测定及对照指纹图谱的获得

十批成品均由江苏康缘药业股份有限公司生产，批号分别为：021108、021112、021116、021120、021124、021128、030205、030208、030211、030214。按本发明中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，依法测定，结果计算相似度，用相似度软件中以这十批供试品指纹图谱为基础获得“共有模式”作为对照指纹图谱，其结果均大于0.90，我们根据大生产实际，为有效控制产品质量，规定双花感康注射液指纹图谱与对照指纹图谱经相似度软件计算，相似度应大于0.90。

双花感康的标准指纹图谱见附图6，共有13个峰，其中10号峰为S峰。

峰号	保留时间	峰面积
			1	6.7	52.592
2	7.8	61.79
			3	14.558	669.256
4	17.519	127.878
			5	18.49	387.721
6	19.343	170.852
			7	21.732	811.979
8	24.018	68.598
			9	26.721	419.465
10	27.961	1498.514
			11	30.7	185.009
12	33.928	68.71
			13	37.159	193.442

供试品指纹图谱与标准指纹图谱相比较，经公式计算相似度，相似度应当大于0.9。

公式： $S=\frac{\mathrm{\Σ}{X}_i{Y}_i}{\sqrt{\mathrm{\Σ}{\left(X_i\right)}^2\sqrt{\mathrm{\Σ}{\left(Y_i\right)}^2}}}$

S为相似度，X为标准指纹图谱峰面积，Y为供试品指纹图谱峰面积，i＝1-13。

说明：相似度的计算只与峰面积有关，与保留时间无关。保留时间不固定，是通过计算机自动校正

实验例6采用气相色谱法指纹图谱质量检测的研究

金银花重蒸液为该制剂主要组成部分，为了控制其质量，采用气相色谱法测定其挥发性成分的指纹图谱，以达到全面控制成品质量的目的。

参照物

双花感康注射液挥发性成分主要金银花挥发性成分，成分较为复杂，通过试验研究，挥发油中可测出的已知成分为芳樟醇，且能得到其标准品，所以选其做为参照峰，计算比较。结果较为理想，能够较真实地反应成品中挥发性成分的情况。

芳樟醇为由中国药品生物制品检定所提供(批号：111503-200001供含量测定用)。

供试晶溶液的制备

双花感康注射液的挥发性成分浓度较低，采用直接进样气相色谱法，其挥发性成分出峰面积小，重复性差。试验采用气相色谱顶空进样法，进样量为1ml，增大了进样体积，使样品不须富集处理便能很好的进行分析。该方法最大限度地保留了样品中的化学成分，从而能够客观准确地对成品中挥发性成分进行分析，达到有效控制成品质量的目的。

取本品，精确吸取10ml，置20ml顶空瓶中，扎盖，即得。

检测方法

(1)仪器和试剂

仪器：Agilent 6890气相色谱仪；Agilent 7694E顶空进样器

(2)色谱柱：因挥发性成分多为非极性成分，且成分复杂，所以选用非极性固定相的细口径毛细管色谱柱：HP-5(5％二苯基-95％二甲基硅烷共聚物为固定相的毛细管色谱柱，30m×0.32mm×0.25μm)。经试验研究，该色谱柱对制剂中各成分分离效果好，所以我们固定选择用该类型色谱柱作为双花感康注射剂指纹图谱测定专用色谱柱。

(3)色谱条件：经过试验优选，最终确定测定条件为：顶空恒温箱温度95℃，传输管温度110℃，进样环温度125℃，进样口温度：240℃；检测器温度(FID)：240℃；顶空进样测定，分流比为1∶1；程序升温：初始温度50℃，保持5分钟，以每分钟10℃升至80℃，保持6分钟，以每分钟10℃升至130℃，保持10分钟，再以每分钟5℃升至240℃，保持10分钟，测定；载气流速：2.0ml/min；理论板数按对照品(芳樟醇)峰计算，应不低于30000。

顶空进样条件：VIAL TEMPS 95℃；LOOP TEMPS 110℃；TR LINE 125℃；GC CRCLE TIME 75min；VIAL EQ TIME 60min；PRESSURIZ TIME 0.5min；LOOP EQ TIME 0.05min；LOOP FILL TIME 0.3min；INJECT TIME 1.00min；CARR PRESS PSI 8.9；VIAL PRESS PSI 15.7。

在上述条件下，样品的GC色谱图见下图。为了保证该方法的可行性与准确性，发明人对该检测方法进行了方法学考察，以保证其有较好的重复性及能够有效地控制制剂的质量。见附图7

(4)延长时间测试滞后峰

延长测试时间1倍至2小时，结果未见滞后峰出现。

实验例7采用气相色谱法指纹图谱质量检测的稳定性试验

取批号为021108的双花感康注射液，按本发明方法每隔一定时间精密吸取10ml置20ml顶空瓶中，测定，共测定5次。结果表明，供试液中各共有峰的保留时间及主要峰(占总峰面积5％以上)的峰面积基本一致(RSD＜5％)，表明供试品溶液12小时内成分是稳定的。符合指纹图谱的技术要求。

实验例8采用气相色谱法指纹图谱质量检测的精密度试验

取批号为021108的双花感康注射液10支，置100ml干燥量瓶中，混匀，分别精密吸取10ml，置6个20ml顶空瓶中，连续进样6次进行测定。测定结果表明，供试液中各共有峰的保留时间及主要峰(占总峰面积5％以上)的峰面积基本一致(RSD＜5％)。表明该方法精密度良好。

实验例9采用气相色谱法指纹图谱质量检测的重复性试验

取批号为021108的双花感康注射液，分别精密吸取10ml，置5个20ml顶空瓶中，进样测定，测定结果表明，供试液中各共有峰的相对保留时间及主要峰(占总峰面积3％以上)的相对峰面积基本一致(RSD＜5％)，符合指纹图谱的技术要求。表明该方法重复性良好，符合指纹图谱的技术要求。表明该方法测定双花感康注射液的指纹图谱，精密度、重复性、稳定性均较好，能够准确测定该制剂的指纹图谱。

实验例10采用气相色谱法指纹图谱质量检测的双花感康注射液十批成品的测定及对照指纹图谱的获得

十批成品均由江苏康缘药业股份有限公司生产，批号分别为：021108、021112、021116、021120、021124、021128、030205、030208、030211、030214。依法测定。结果见表1、2。表1列出了10个批次样品的共有峰的保留时间及相对保留时间，表2是单峰面积占总峰面积大于5％的共有峰的峰面积百分比和相对峰面积以及其范围。

表2双花感康注射液指纹图谱测定结果(示主要峰相对峰面积)

根据十批成品指纹图谱计算结果，因挥发性成分较难控制，根据大生产实际，为有效控制产品质量，制定本品气相指纹图谱如下：

指纹图谱应有13个共有峰；

相对保留时间(峰号)：、0.091～0.169(1)0.099～0.183(2)、0.123～0.229(3)、0.160～0.298(4)、0.294～0.546(5)、0.313～0.581(6)、0.356～0.662(7)、0.540～1.002(8)、0.628～1.166(9)、1(s)0.844～1.568(10)、0.885～1.643(11)、0.927～1.72(12)

峰面积比值(峰号)：0.125～0.293(5)、0.153～0.357(6)、0.154～0.358(8)、1(S)、0.106～0.248(11)，非共有峰面积不得过总峰面积的20％。标准指纹图谱见附图8。

实验例11总酸的含量测定法研究

1.仪器和试剂

仪器：岛津UV-2401紫外分光光度计

试剂：水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

2.测定波长的选择

采用紫外分光光度法：以金银花有机酸类主要成分绿原酸为对照品，对绿原酸对照品溶液进行全波长扫描，扫描结果表明其在327nm下有最大吸收，在400nm下有最小吸收，又根据对双花感康注射液供试品溶液进行全波长扫描，其在327nm下也有最大吸收，所以确定测定波长为327nm，又考虑到供试品溶液成分较为复杂，为了避免其它成分的干扰，保证测定结果的准确，以400nm为参比波长，进行测定。

3.供试品溶液的配制

本品为注射液，样品直接稀释测定，方法为：取装量差异项下本品2ml，置于25ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，再精密吸样品1ml，置于10ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

4.标准曲线的测定

精确称取绿原酸对照品2.58mg，置于25ml容量瓶中，以水溶解并定容至刻度，得绿原酸对照品溶液(103.2μg/ml)。分别吸取标准品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml置于10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，以水为空白对照，测定结果如下：

表3标准曲线数据

以吸收度ΔA为纵坐标，对照品浓度C(μg/ml)为横坐标，得线性回

归方程：Y＝0.0507x+0.005        r＝0.9999

5.稳定性实验

取批号为(021108)的样品按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，在327nm及400nm波长处分别测定吸光度，每隔一定时间测定一次，共测6次，测得结果见下表。

表4稳定性的考察结果

6、重复性实验：

取同一批号(021108)双花感康注射液，按供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，依法测定，结果RSD为0.02％，见下表：

表5重复性试验结果

7.加样回收率实验

取含量已知的同一批成品(批号：021108，含量：4.234mg/ml)，进行加样回收率试验。精密吸取样品0.5ml6份，分别置6个25ml量瓶中，再分别精密加入浓度为0.9821mg/ml的绿原酸标准品溶液1.5ml，2ml，2.4ml各两份，加水稀释至刻度，摇匀，再分别精密吸上述溶液1ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得供试品溶液。依法测定吸光度，计算，试验结果平均回收率为101.55％，RSD为1.73％，表明回收率良好。

表6加样回收率试验结果

8.样品总酸含量测定

取批号为(021108、021112、021116)的三样品，每批2份，精密吸取样品2ml，置于25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，再精密吸样品1ml，置于10ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。依法测定吸光度，由回归方程计算样品含量，结果如下表。

表7总酸含量测定结果

根据对以上三批制剂总酸的含量测定，结合新药研制技术要求及生产实际，我们确定：本品每1ml含总酸不得少于3mg。

实验例11绿原酸的含量测定法研究

双花感康注射液处方为金银花单味药材，其具有清热解毒，凉散风热的功效，绿原酸(chlorogenic acid)是金银花的主要有效成分，见于报道的分析方法有紫外法、薄层层析结合紫外分光光度法、薄层扫描法、高效液相色谱法等，2000年药典采用高效液相色谱法测定金银花药材中绿原酸含量。故将绿原酸定为本制剂含量测定的指标成分。

1.仪器和试剂

Agilent 1100高效液相色谱仪；VWD紫外检测器；双花感康注射液(江苏康缘药业股份有限公司)；乙腈为色谱纯(进口分装)，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

2.对照品来源  绿原酸对照品由中国药品生物制品检定所提供，批号：110749-200202供含量测定用。

3.色谱条件的选择

色谱柱：phenomenex C18色谱柱。

流动相：绿原酸以乙腈-磷酸水溶液系统为流动相进行色谱分析，经试验研究表明，在乙腈-0.1％磷酸(10∶90)(V/V)的条件下，可使绿原酸和其它成分均呈现良好的分离度。故所选流动相为乙腈-0.1％磷酸(10∶90)(V/V)。

测定波长：根据紫外光谱(图2)可见绿原酸的最大吸收波长分别为327nm，经试验验证，样品中绿原酸峰在327nm下响应较高，与其他杂质峰分离度符合要求，经阴性试验，无干扰，所以确定绿原酸含量测定波长为327nm。

在上述条件下，样品的HPLC色谱图见附图。为使绿原酸达到基线分离，确保定量分析的准确，规定在系统实验中绿原酸理论塔板数均不得低于4000。我们再重复二支phenomenex C18色谱柱，均能达到上述分离指标。

表8绿原酸对照品溶液的精密度

取浓度为74μg/ml的对照品，隔0.2.4.8.12.24小时测一次，共测6次，测定结果见下表。结果表明，对照品液中绿原酸在10小时内稳定。其稳定性RSD分别为0.39％。

表9绿原酸对照品溶液的稳定性

4.供试品溶液的制备

精密吸取本品1ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

5.阴性试验

除金银花药材后按制剂工艺法进行制备得缺金银花的阴性样品。取阴性制剂1ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，按含量测定方法分析，阴性样品色谱与绿原酸对照品色谱相应保留时间上没有干扰峰，阴性无干扰。

6.线性关系考察

精密量取绿原酸对照品溶液(396μg/ml)0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、和1.2ml，分别置5ml量瓶中，分别加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，照高效液相色谱法(中国药典2000版一部附录VI D)测定，以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果见下表和下图。

表10线性关系考察结果

由回归方程可见，绿原酸量在.15.84μg/ml～95.04μg/ml范围内，色谱峰面积与浓度之间有良好的线形关系。

7.精密度试验

取浓度为43.4μg/ml的对照品溶液，连续进样6针，结果见下表：

表11精密度考察试验结果

8.稳定性试验

同一样品(批号021108)供试品溶液，共测6次，测定结果见下表。结果表明，供试品溶液中绿原酸在12小时内稳定。其稳定性RSD为0.30％。

表12稳定性考察试验结果

9.重复性试验

同一批号(021108)样品5份，依法测定，重复性结果见下表。

表13重复性试验结果

10.加样回收试验

取已知含量的双花感康注射液(批号021108，含量：1.812mg/ml)，进行加样回收率试验。由于样品中绿原酸含量较高，加样回收试验时采用将样品稀释后，再加入一定量的对照品，进行测定。

精密量取本品1ml，5份，分别置10ml量瓶中，加水稀释并定容到刻度，摇匀，分别精密吸取1ml至10ml量瓶中再分别精密加入绿原酸对照品溶液(217.5μg/ml)1.0ml，加水稀释至刻度，摇匀，依法测定，结果见下表。

表14加样回收试验结果

以上绿原酸含量测定方法学考察结果表明：该方法精密度、重复性、回收率结果均较好，能够准确、快捷地测定成品中绿原酸的含量。

11.样品测定

取三批双花感康注射液(批号021108、021112、021116)成品，按正文绿原酸含量测定方法测定成品中绿原酸的含量。结果见下表。

表15绿原酸含量测定结果

根据测定结果，考虑规模生产时批量投料量更大，制剂过程中受热时间更长，损失要大一些，将绿原酸含量限度暂定为：本品每ml含金银花以绿原酸计，不得少于1.5mg。

实验例12芳樟醇含量测定法研究

双花感康注射液另一主要组成部分为金银花挥发性成分-金银花重蒸液，其中芳樟醇为金银花挥发性成分中的主要有效成分，选择其作为质量控制指标，采用GC色谱法测定其含量，由于其在制剂中浓度较低，供试品溶液的制备选择氯仿萃取，浓缩的方法，经过试验研究，建立了芳樟醇含量测定方法并进行了方法学考察，结果表明，该方法能准确、快捷的测定芳樟醇的含量。

1.仪器和试剂

Agilent 6890气相色谱仪；FID检测器；双花感康注射液(江苏康缘药业股份有限公司)；试剂均为分析纯。

2.对照品来源及纯度检查  芳樟醇对照品由中国药品生物制品检定所提供，批号：111503-200001(供鉴别用)。以对照品浓度为1mg/ml进行纯度检查，结果芳樟醇对照品纯度大于98％，可以作为含量测定用。

3.色谱条件的选择

色谱柱：选择非极性色谱柱：Agilengt HP-5(以5％二苯基-95％二甲基硅烷共聚物为固定相)毛细管色谱柱(30m×0.32mm×0.25μm)。

色谱条件：经试验选择了测定芳樟醇的较佳色谱条件，如下：进样口温度：240℃；检测器温度(FID)：240℃；分流进样测定(分流比：15∶1)，柱温：50℃，以每分钟10℃升温至80℃，保持10min；载气流速：2.0ml/min；理论塔板数按芳樟醇峰计，不少于20000；

4、内标物的选择

为避免进样等操作带来的误差，确定采用内标定量的方法。选择了樟脑、薄荷脑、丹皮酚等作为内标物进行试验，结果表明樟脑峰与芳樟醇峰较为接近，且分离度大于2，较为适宜作为该方法的内标物。

5.对照品溶液的制备

取樟脑对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.4mg的溶液，作为内标溶液。取芳樟醇对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含芳樟醇0.4mg的溶液，精密吸取芳樟醇对照品溶液1ml及内标溶液1ml置10ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

6.供试品溶液的制备

精密量取装量差异项下本品50ml，氯仿萃取三次(40ml、30ml、30ml)，合并氯仿液，减压回收氯仿至约5ml，定量转移至10ml量瓶中，加氯仿定容至刻度，摇匀。精密吸取上述溶液9ml，置10ml量瓶中，再精密加入1ml樟脑对照品溶液(内标溶液)，摇匀，吸取2μl，注入气相色谱仪，测定，即得。

7.阴性试验

除金银花药材后按制剂工艺法进行制备得缺金银花的阴性样品。取阴性制剂供试品溶液的方法制备阴性供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液各2μl，注入气相色谱仪，测定，结果表明阴性无干扰。见图5。

8.线性关系考察

精密称取芳樟醇对照品27.35mg，置25ml量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密吸取上述溶液(1.094mg/ml)0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、2ml，分别置10ml量瓶中，再分别精密加入1ml樟脑内标溶液(459.6μg/ml)，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取2μl注入气相色谱仪，测定。以芳樟醇峰面积Ai与内标峰面积As的比值(Ai/As)为纵坐标Y，浓度(C)为横坐标X，绘制标准曲线。结果见下表和下图。

表16芳樟醇线性关系考察

由回归方程可见，芳樟醇在57.35μg/ml～917.60μg/ml范围内，芳樟醇峰面积Ai与内标峰面积As的比值(Ai/As)与浓度(C)之间有良好的线形关系。

9.精密度试验

取浓度为43.75μg/ml的对照品溶液，连续进样6针，结果见下表：

表17精密度考察试验结果

10.稳定性试验

同一样品(批号021108)供试品溶液，共测6次，测定结果见下表。结果表明，供试品溶液中在12小时内稳定。其稳定性RSD为0.30％。

表18稳定性考察试验结果

11.重复性试验

同一批号(021108)样品5份，照正文芳樟醇含量测定方法测定，重复性结果见下表：

表19重复性试验结果

12.加样回收试验

取已知含量的双花感康注射液(批号021108，含量：35.91μg/ml)，进行加样回收率试验。精密量取本品25ml，5份，分别芳樟醇对照品溶液(0.32mg/ml)，氯仿萃取三次(40ml、30ml、30ml)，合并氯仿液，减压回收氯仿至约5ml，定量转移至10ml量瓶中，加氯仿定容至刻度，摇匀。精密吸取上述溶液9ml，置10ml量瓶中，再精密加入1ml内标溶液(浓度：459.6μg/ml)，摇匀，按本发明芳樟醇含量测定方法测定，结果见表：

表20加样回收试验结果

以上芳樟醇含量测定方法学考察结果表明：该方法精密度、重复性、回收率结果均较好，能够准确、快捷的测定成品中芳樟醇的含量。

13.样品测定

取三批双花感康注射液(批号021108、021112、021116)成品，按正文芳樟醇含量测定方法测定成品中芳樟醇的含量。结果见下表

表21芳樟醇含量测定结果

根据测定结果，考虑规模大生产的损失，将芳樟醇含量限度暂定为：本品含金银花以芳樟醇计，不得少于6.0μg/ml。

下述实施例均能实现上述实验例的效果。

下述实施例所述“本品”为双花感康注射液。

附图说明：

附图1双花感康注射液液相指纹图谱测定波长的选择

附图2绿原酸参照物溶液指纹图谱

附图3双花感康注射液液相指纹图谱

附图4双花感康注射液2小时液相指纹图谱

附图5空白溶液(50％甲醇)2小时液相指纹图谱

附图6双花感康液相色谱法的标准指纹图谱

附图71为芳樟醇气相指纹图谱，2为双花感康注射气相指纹图谱

附图8气相标准指纹图

实施例1：双花感康注射液

金银花          400g

葡甲胺          8g

氯化钠          2g

亚硫酸氢钠      2g

                制成1000ml

制法：取金银花400g，加18倍量水，进行水蒸汽蒸馏，收集药材7倍量(2800ml)的蒸馏液，蒸馏液进行重蒸馏，收集药材1.25倍量(500ml)的蒸馏液，备用。蒸馏器内药液滤过，滤液备用，药渣再加8倍量的水煎煮0.5小时，滤过，合并滤液，放冷，用10％NaHCO₃溶液调至pH值6，上大孔树脂柱(树脂用量为药材量的2倍)，收集流出液，用盐酸调至pH2.5，继续上已处理好的大孔树脂柱(树脂用量为药材量的2倍)，用70％乙醇上柱洗脱，收集醇洗脱液，回收至无醇味，得金银花提取物浸膏，备用。上述金银花提取物浸膏加500ml注射用水溶解后，加入葡甲胺6g调pH值，滤过，药液超滤(膜分子量1万)，得超滤液。重蒸馏液加入适量1，2-丙二醇溶解后与超滤液合并，加入氯化钠及亚硫酸氢钠各2g，搅拌使溶解，加入葡甲胺2g调pH值，用注射用水稀释至含生药0.4g/ml(1000ml)，混合均匀，微滤(0.22μm)，滤液分装(每瓶250ml)，轧盖，热压灭菌(115℃，68.6KPa)30min，贴标签，即得。

实施例2：双花感康注射液指纹图谱质量控制方法

Agilent 1100液相色谱仪，色谱柱：waters symmetry shield RP₁₈(4.6×250mm 3.5μm)；乙腈-0.1％磷酸水溶液系统为流动相，洗脱程序为：

时间(分钟)          乙腈(％)           0.1％磷酸(％)

0                   5                  95

50                  25                 75

60                  25                 75

流速为1ml/min；检测波长为225nm。理论板数按参照物(绿原酸)峰计算，应不低于6000。

参照物溶液的制备取绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，即得。供试品溶液的制备取本品1ml，置25ml量瓶中，加水溶液稀释至刻度，摇匀，即得。测定法精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定。本品指纹图谱的主要特征：供试品指纹图谱与质量标准所附的对照指纹图谱经计算软件计算，相似度应大于0.9。

双花感康的标准指纹图谱，共有13个峰，其中10号峰为S峰；1号峰：52.592mAU，2号峰61.79mAU，3号峰：669.256，4号峰：127.878，5号峰：387.721，6号峰：170.852，7号峰：811.979，8号峰：68.598，9号峰：419.465，10号峰：1498.514，11号峰：185.009，12号峰：68.71，13号峰：193.442。

计算软件为中国药品生物制品检定所、浙江大学、空军雷达学院所提供的中药色谱图分析和数据管理系统。

实施例3：双花感康注射液指纹图谱质量控制方法

Agilent 6890气相色谱仪，气相色谱顶空进样法测定，顶空恒温箱温度95℃，传输管温度110℃，进样环温度125℃，平衡时间：60min；用5％二苯基-95％二甲基硅烷共聚物为固定相的毛细管色谱柱(HP-5：30m×0.32mm×0.25μm)；进样口温度：240℃；检测器温度(FID)：240℃；顶空进样测定，分流比：1∶1；程序升温：初始温度50℃，保持5分钟，以每分钟10℃升至80℃，保持10分钟，以每分钟10℃升至130℃，保持6分钟，再以每分钟5℃升至240℃，保持9分钟，测定；载气流速：2.0ml/min；理论板数按对照品(樟脑)峰计算，应不低于30000。

对照品溶液的制备：取芳樟醇对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，精密吸取1ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置20ml顶空瓶中，轧盖，即得。供试品溶液的制备：精密吸取本品10ml，置20ml顶空瓶中，轧盖，即得。测定法，顶空进样测定。

供试品指纹图谱中与参照物峰相应的峰为S峰，计算相对保留时间和峰面积比值，应符合下列要求：

本品指纹图谱应与标准指纹图谱相似；

指纹图谱应有13个共有峰；

相对保留时间(峰号)：0.091～0.169(1)0.099～0.183(2)、0.123～0.229(3)、0.160～0.298(4)、0.294～0.546(5)、0.313～0.581(6)、0.356～0.662(7)、0.540～1.002(8)、0.628～1.166(9)、1(s)0.844～1.568(10)、0.885～1.643(11)、0.927～1.72(12)

峰面积比值(峰号)：0.125～0.293(5)、0.153～0.357(6)、0.154～0.358(8)、1(S)、0.106～0.248(11)

非共有峰面积不得过总峰面积的20％。

实施例4：双花感康注射液指纹图谱质量控制方法

本方法为实施例1及实施例2两种方法的结合。

实施例5：双花感康注射液含量测定质量控制方法

总酸：取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加水制成每ml含0.1mg的溶液，作为储备液。分别精密吸取上述溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml置于10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，照分光光度法，以水为空白对照，在327nm波长处测定吸收度为A1，以在400nm波长下测定吸收度为A2，以ΔA(A1-A2)为纵坐标，以浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线；测定法，精密吸取装量差异项下本品2ml，置25ml棕色量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，再精密吸取上述溶液1ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。依法测定，根据标准曲线计算，即得；本品每1ml含总酸不得少于3mg。

实施例6：双花感康注射液含量测定质量控制方法

绿原酸：色谱条件与系统适应性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-0.1％磷酸(10∶90)为流动相；检测波长327nm。理论板数按绿原酸峰计算应不低于4000；对照品溶液的制备，取绿原酸对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含40μg的溶液，即得；供试品溶液的制备，精密吸取装量差异项下本品1ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。测定法，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。本品含金银花以绿原酸(C₁₆H₁₈O₉)计，每1ml不得少于1.5mg。

实施例7：双花感康注射液含量测定质量控制方法

芳樟醇：色谱条件与系统适应性试验，以5％二苯基-95％二甲基硅烷共聚物为固定相的毛细管色谱柱(30m×0.32mm×0.25μm)；进样口温度：240℃；检测器温度(FID)：240℃；分流进样测定(分流比：15∶1)，柱温：50℃，以每分钟10℃升温至80℃，保持10min；载气流速：2.0ml/min；理论塔板数按芳樟醇峰计，应不少于20000；芳樟醇峰与内标物峰的分离度应大于1.5；校正因子测定，取樟脑对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.4mg的溶液，作为内标溶液。取芳樟醇对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含芳樟醇0.4mg的溶液，精密吸取芳樟醇对照品溶液1ml及内标溶液1ml置10ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取2μl，注入气相色谱仪，计算校正因子。测定法：精密量取装量差异项下本品50ml，氯仿萃取三次(40ml、30ml、30ml)，合并氯仿液，减压回收氯仿至约5ml，定量转移至10ml量瓶中，加氯仿定容至刻度，摇匀。精密吸取上述溶液9ml，置10ml量瓶中，再精密加入1ml樟脑储备液，摇匀，吸取2μl，注入气相色谱仪，测定，即得。本品含金银花以芳樟醇计，不得少于6.0μg/ml。

实施例8：双花感康注射液质量控制方法

本方法为实施例5及实施例6方法的组合。

实施例9：双花感康注射液质量控制方法

本方法为实施例5及实施例7方法的组合。

实施例10：双花感康注射液质量控制方法

本方法为实施例6及实施例7方法的组合。

实施例11：双花感康注射液质量控制方法

本方法为实施例4及实施例5-7方法的组合。

实施例12：双花感康注射液质量控制方法

本方法在以实施例11方法的基础上，增加下述标准：

鉴别：取本品20ml，加稀盐酸调pH到2，用醋酸乙酯萃取3次，分别为30、30、20ml，合并醋酸乙酯液，挥干，残渣加甲醇溶解并定容至10ml，作为供试品溶液。另取绿原酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸丁酯-甲酸-水(7∶2.5∶2.5)的上层液为展开剂，展开，晾干，置紫外光灯下(365nm)下检视。供试品色谱图中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点。

总酸占总固体物百分比：总酸占总固体物百分比应在25％-50％范围内。

实施例13：双花感康注射液质量控制方法

本方法为实施例2及实施例5方法的组合。

实施例14：双花感康注射液质量控制方法

本方法为实施例4及实施例5方法的组合。

实施例15：双花感康注射液质量控制方法

本方法为实施例4及实施例6方法的组合。

Claims (5)

1. 一种具有清热解毒作用的双花感康注射液的质量控制方法，其特征在于该方法中的指纹图谱方法是以下方法的一种或两种：

A、液相色谱法：Agilent 1100液相色谱仪，色谱柱：waters symmetryshield RP₁₈，4.6×250mm，3.5μm；乙腈-0.1％磷酸水溶液系统为流动相，洗脱程序为：初始时，乙腈浓度为5％，0.1％磷酸浓度为95％；50分钟时，乙腈浓度线性升至25％，0.1％磷酸浓度为线性降为75％；以此比例保持至60分钟，乙腈浓度为25％，0.1％磷酸浓度为75％；流速为1ml/min；检测波长为225nm；理论板数按绿原酸峰计算，应不低于6000；参照物溶液的制备，取绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，即得；供试品溶液的制备，取双花感康注射液1ml，置25ml量瓶中，加水溶液稀释至刻度，摇匀，即得；测定法，精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定，供试品指纹图谱与质量标准所附的对照指纹图谱经指纹图谱相似度计算软件计算，相似度应大于0.9；双花感康注射液液相色谱法的标准指纹图谱，共有13个峰，其中10号峰为S峰；1号峰：52.592mAU，2号峰61.79mAU，3号峰：669.256mAU，4号峰：127.878mAU，5号峰：387.721mAU，6号峰：170.852mAU，7号峰：811.979mAU，8号峰：68.598mAU，9号峰：419.465mAU，10号峰：1498.514mAU，11号峰：185.009mAU，12号峰：68.71mAU，13号峰：193.442mAU；

B.气相色谱法：Agilent 6890气相色谱仪，气相色谱顶空进样法测定，顶空恒温箱温度95℃，传输管温度110℃，进样环温度125℃，平衡时间：60min；用5％二苯基-95％二甲基硅烷共聚物为固定相的毛细管色谱柱HP-5：30m×0.32mm×0.25μm；进样口温度：240℃；检测器温度：240℃；顶空进样测定，分流比：1∶1；程序升温：初始温度50℃，保持5分钟，以每分钟10℃升至80℃，保持10分钟，以每分钟10℃升至130℃，保持6分钟，再以每分钟5℃升至240℃，保持9分钟，测定；载气流速：2.0ml/min；理论板数按对照品樟脑峰计算，应不低于30000；对照品溶液的制备，取芳樟醇对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，精密吸取1ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置20ml顶空瓶中，轧盖，即得；供试品溶液的制备，精密吸取双花感康注射液10ml，置20ml顶空瓶中，轧盖，即得；测定法，顶空进样测定：供试品指纹图谱中与参照物峰相应的峰为S峰，计算相对保留时间和峰面积比值，应符合下列要求：双花感康注射液指纹图谱应与标准指纹图谱相似；指纹图谱应有13个共有峰；

相对保留时间：1号峰：0.091～0.169、2号峰：0.099～0.183、3号峰：0.123～0.229、4号峰：0.160～0.298、5号峰：0.294～0.546、6号峰：0.313～0.581、7号峰：0.356～0.662、8号峰：0.540～1.002、9号峰：0.628～1.166、s峰：1、10号峰：0.844～1.568、11号峰：0.885～1.643、12号峰：0.927～1.72；峰面积比值：5号峰：0.125～0.293、6号峰：0.153～0.357、8号峰：0.154～0.358、s峰：1、11号峰：0.106～0.248；非共有峰面积不得过总峰面积的20％；

上述双花感康注射液是按如下方法制备：

金银花                        300-500g

葡甲胺                        6-10g

氯化钠                        1-4g

亚硫酸氢钠                    1-4g

制成                          1000ml

制法：取金银花，加16-20倍量水，进行水蒸汽蒸馏，收集药材6-9倍量的蒸馏液，蒸馏液进行重蒸馏，收集药材1-3倍量的蒸馏液，备用；蒸馏器内药液滤过，滤液备用，药渣再加7-9倍量的水煎煮0.3-1小时，滤过，合并滤液，放冷，用10％NaHCO₃溶液调至pH值6，上大孔树脂柱，树脂用量为药材量的1-4倍，收集流出液，用盐酸调至pH2-3，继续上已处理好的大孔树脂柱，树脂用量为药材量的1-4倍，用60-80％乙醇上柱洗脱，收集醇洗脱液，回收至无醇味，得金银花提取物浸膏，备用；上述金银花提取物浸膏加500ml注射用水溶解后，加入葡甲胺5-7调pH值，滤过，药液超滤，膜分子量1万，得超滤液；重蒸馏液加入适量1，2-丙二醇溶解后与超滤液合并，加入氯化钠及亚硫酸氢钠，搅拌使溶解，加入葡甲胺1-3g调pH值，用注射用水稀释，混合均匀，微滤，滤液分装，轧盖，即得。

2. 一种具有清热解毒作用的双花感康注射液的质量控制方法，其特征在于该方法中的含量测定方法可以是以下方法的一种或几种：

总酸：取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加水制成每ml含0.1mg的溶液，作为储备液；分别精密吸取上述溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml置于10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，照分光光度法，以水为空白对照，在327nm波长处测定吸收度为A1，以在400nm波长下测定吸收度为A2，以ΔA为纵坐标，ΔA＝A1-A2，以浓度C为横坐标，绘制标准曲线；测定法，精密吸取装量差异项下双花感康注射液2ml，置25ml棕色量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，再精密吸取上述溶液1ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；依法测定，根据标准曲线计算，即得；双花感康注射液每1ml含总酸不得少于3mg；

绿原酸：色谱条件与系统适应性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-0.1％磷酸8-12∶85-95为流动相；检测波长327nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于4000；对照品溶液的制备，取绿原酸对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含40μg的溶液，即得；供试品溶液的制备，精密吸取装量差异项下双花感康注射液1ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得；测定法，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；双花感康注射液含金银花以绿原酸计，每1ml不得少于1.5mg；

芳樟醇：色谱条件与系统适应性试验，以5％二苯基-95％二甲基硅烷共聚物为固定相的毛细管色谱柱，规格为：30m×0.32mm×0.25μm；进样口温度：200-250℃；检测器温度FID：200-250℃；分流进样测定，分流比：10-20∶1，柱温：45-55℃，以每分钟10℃升温至70-90℃，保持8-12min；载气流速：1.5-2.5ml/min；理论塔板数按芳樟醇峰计，应不少于20000；芳樟醇峰与内标物峰的分离度应大于1.5；校正因子测定，取樟脑对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.4mg的溶液，作为内标溶液；取芳樟醇对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含芳樟醇0.4mg的溶液，精密吸取芳樟醇对照品溶液1ml及内标溶液1ml置10ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取2μl，注入气相色谱仪，计算校正因子；测定法：精密量取装量差异项下双花感康注射液50ml，氯仿萃取三次，分别为40ml、30ml、30ml，合并氯仿液，减压回收氯仿至约5ml，定量转移至10ml量瓶中，加氯仿定容至刻度，摇匀；精密吸取上述溶液9ml，置10ml量瓶中，再精密加入1ml樟脑储备液，摇匀，吸取2μl，注入气相色谱仪，测定，即得；双花感康注射液含金银花以芳樟醇计，不得少于6.0μg/ml；

上述双花感康注射液是按如下方法制备：

金银花                                300-500g

葡甲胺                                6-10g

氯化钠                                1-4g

亚硫酸氢钠                            1-4g

制成                                  1000ml

制法：取金银花，加16-20倍量水，进行水蒸汽蒸馏，收集药材6-9倍量的蒸馏液，蒸馏液进行重蒸馏，收集药材1-3倍量的蒸馏液，备用；蒸馏器内药液滤过，滤液备用，药渣再加7-9倍量的水煎煮0.3-1小时，滤过，合并滤液，放冷，用10％NaHCO₃溶液调至pH值6，上大孔树脂柱，树脂用量为药材量的1-4倍，收集流出液，用盐酸调至pH2-3，继续上已处理好的大孔树脂柱，树脂用量为药材量的1-4倍，用60-80％乙醇上柱洗脱，收集醇洗脱液，回收至无醇味，得金银花提取物浸膏，备用；上述金银花提取物浸膏加500ml注射用水溶解后，加入葡甲胺5-7调pH值，滤过，药液超滤，膜分子量1万，得超滤液；重蒸馏液加入适量1，2-丙二醇溶解后与超滤液合并，加入氯化钠及亚硫酸氢钠，搅拌使溶解，加入葡甲胺1-3g调pH值，用注射用水稀释，混合均匀，微滤，滤液分装，轧盖，即得。

3. 如权利要求2所述注射液的质量控制方法，其特征在于：绿原酸含量测定中，乙腈-0.1％磷酸为流动相的浓度为10∶90；芳樟醇含量测定中，以5％二苯基-95％二甲基硅烷共聚物为固定相的30m×0.32mm×0.25μm毛细管色谱柱，进样口温度为240℃，检测器温度为240℃，分流进样测定，分流比：15∶1，柱温50℃，以每分钟10℃升温至80℃，保持10min；载气流速2.0ml/min。

4. 如权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于该方法包括如下方法中的一种或几种：

A.总酸含量测定：取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加水制成每ml含0.1mg的溶液，作为储备液；分别精密吸取上述溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml置于10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，照分光光度法，以水为空白对照，在327nm波长处测定吸收度为A1，以在400nm波长下测定吸收度为A2，以ΔA为纵坐标，ΔA＝A1-A2，以浓度C为横坐标，绘制标准曲线；测定法，精密吸取装量差异项下双花感康注射液2ml，置25ml棕色量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，再精密吸取上述溶液1ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；依法测定，根据标准曲线计算，即得；双花感康注射液每1ml含总酸不得少于3mg；

B.绿原酸含量测定：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，10∶90的乙腈-0.1％磷酸为流动相；检测波长327nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于4000；对照品溶液的制备，取绿原酸对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含40μg的溶液，即得；供试品溶液的制备，精密吸取装量差异项下双花感康注射液1ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得；测定法，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；双花感康注射液含金银花以绿原酸计，每1ml不得少于1.5mg；

C：芳樟醇含量测定：以5％二苯基-95％二甲基硅烷共聚物为固定相的毛细管色谱柱，规格为：30m×0.32mm×0.25μm；进样口温度：240℃；检测器温度：240℃；分流进样测定，分流比：15∶1，柱温：50℃，以每分钟10℃升温至80℃，保持10min；载气流速：2.0ml/min；理论塔板数按芳樟醇峰计，应不少于20000；芳樟醇峰与内标物峰的分离度应大于1.5；校正因子测定，取樟脑对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.4mg的溶液，作为内标溶液；取芳樟醇对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含芳樟醇0.4mg的溶液，精密吸取芳樟醇对照品溶液1ml及内标溶液1ml置10ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取2μl，注入气相色谱仪，计算校正因子；测定法：精密量取装量差异项下双花感康注射液50ml，氯仿萃取三次，分别为40ml、30ml、30ml，合并氯仿液，减压回收氯仿至约5ml，定量转移至10ml量瓶中，加氯仿定容至刻度，摇匀；精密吸取上述溶液9ml，置10ml量瓶中，再精密加入1ml樟脑储备液，摇匀，吸取2μl，注入气相色谱仪，测定，即得；双花感康注射液含金银花以芳樟醇计，不得少于6.0μg/ml。

5. 一种具有清热解毒作用的注射液的质量控制方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

A.液相色谱法：Agilent 1100液相色谱仪，色谱柱：waters symmetryshield RP₁₈，4.6×250mm，3.5μm；乙腈-0.1％磷酸水溶液系统为流动相，洗脱程序为：初始时，乙腈浓度为5％，0.1％磷酸浓度为95％；50分钟时，乙腈浓度线性升至25％，0.1％磷酸浓度为线性降为75％；以此比例保持至60分钟，乙腈浓度为25％，0.1％磷酸浓度为75％；流速为1ml/min；检测波长为225nm；理论板数按绿原酸峰计算，应不低于6000；参照物溶液的制备，取绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，即得；供试品溶液的制备，取双花感康注射液1ml，置25ml量瓶中，加水溶液稀释至刻度，摇匀，即得；测定法，精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定，供试品指纹图谱与质量标准所附的对照指纹图谱经指纹图谱相似度应大于0.9；双花感康注射液液相色谱法的标准指纹图谱，共有13个峰，其中10号峰为S峰；1号峰：52.592mAU，2号峰61.79mAU，3号峰：669.256mAU，4号峰：127.878mAU，5号峰：387.721mAU，6号峰：170.852mAU，7号峰：811.979mAU，8号峰：68.598mAU，9号峰：419.465mAU，10号峰：1498.514mAU，11号峰：185.009mAU，12号峰：68.71mAU，13号峰：193.442mAU；

B.气相色谱法：Agilent 6890气相色谱仪，气相色谱顶空进样法测定，顶空恒温箱温度95℃，传输管温度110℃，进样环温度125℃，平衡时间：60min；用5％二苯基-95％二甲基硅烷共聚物为固定相的毛细管色谱柱HP-5：30m×0.32mm×0.25μm；进样口温度：240℃；检测器温度：240℃；顶空进样测定，分流比：1∶1；程序升温：初始温度50℃，保持5分钟，以每分钟10℃升至80℃，保持10分钟，以每分钟10℃升至130℃，保持6分钟，再以每分钟5℃升至240℃，保持9分钟，测定；载气流速：2.0ml/min；理论板数按对照品樟脑峰计算，应不低于30000；对照品溶液的制备，取芳樟醇对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，精密吸取1ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置20ml顶空瓶中，轧盖，即得；供试品溶液的制备，精密吸取双花感康注射液10ml，置20ml顶空瓶中，轧盖，即得；测定法，顶空进样测定：供试品指纹图谱中与参照物峰相应的峰为S峰，计算相对保留时间和峰面积比值，应符合下列要求：双花感康注射液指纹图谱应与标准指纹图谱相似；指纹图谱应有13个共有峰；

相对保留时间：1号峰：0.091～0.169、2号峰：0.099～0.183、3号峰：0.123～0.229、4号峰：0.160～0.298、5号峰：0.294～0.546、6号峰：0.313～0.581、7号峰：0.356～0.662、8号峰：0.540～1.002、9号峰：0.628～1.166、s峰：1、10号峰：0.844～1.568、11号峰：0.885～1.643、12号峰：0.927～1.72；峰面积比值：5号峰：0.125～0.293、6号峰：0.153～0.357、8号峰：0.154～0.358、s峰：1、11号峰：0.106～0.248；非共有峰面积不得过总峰面积的20％；

C.总酸含量测定：取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加水制成每ml含0.1mg的溶液，作为储备液；分别精密吸取上述溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml置于10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，照分光光度法，以水为空白对照，在327nm波长处测定吸收度为A1，以在400nm波长下测定吸收度为A2，以ΔA为纵坐标，ΔA＝A1-A2，以浓度C为横坐标，绘制标准曲线；测定法，精密吸取装量差异项下双花感康注射液2ml，置25ml棕色量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，再精密吸取上述溶液1ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；依法测定，根据标准曲线计算，即得；双花感康注射液每1ml含总酸不得少于3mg；

D.绿原酸含量测定：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，10∶90的乙腈-0.1％磷酸为流动相；检测波长327nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于4000；对照品溶液的制备，取绿原酸对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含40μg的溶液，即得；供试品溶液的制备，精密吸取装量差异项下双花感康注射液1ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得；测定法，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；双花感康注射液含金银花以绿原酸计，每1ml不得少于1.5mg；

E：芳樟醇含量测定：以5％二苯基-95％二甲基硅烷共聚物为固定相的毛细管色谱柱，规格为：30m×0.32mm×0.25μm；进样口温度：240℃；检测器温度：240℃；分流进样测定，分流比：15∶1，柱温：50℃，以每分钟10℃升温至80℃，保持10min；载气流速：2.0ml/min；理论塔板数按芳樟醇峰计，应不少于20000；芳樟醇峰与内标物峰的分离度应大于1.5；校正因子测定，取樟脑对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含0.4mg的溶液，作为内标溶液；取芳樟醇对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml含芳樟醇0.4mg的溶液，精密吸取芳樟醇对照品溶液1ml及内标溶液1ml置10ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取2μl，注入气相色谱仪，计算校正因子；测定法：精密量取装量差异项下双花感康注射液50ml，氯仿萃取三次，分别为40ml、30ml、30ml，合并氯仿液，减压回收氯仿至约5ml，定量转移至10ml量瓶中，加氯仿定容至刻度，摇匀；精密吸取上述溶液9ml，置10ml量瓶中，再精密加入1ml樟脑储备液，摇匀，吸取2μl，注入气相色谱仪，测定，即得；双花感康注射液含金银花以芳樟醇计，不得少于6.0μg/ml；

上述双花感康注射液是按如下方法制备：

金银花                    300-500g

葡甲胺                    6-10g

氯化钠                    1-4g

亚硫酸氢钠                1-4g

制成                      1000ml

制法：取金银花，加16-20倍量水，进行水蒸汽蒸馏，收集药材6-9倍量的蒸馏液，蒸馏液进行重蒸馏，收集药材1-3倍量的蒸馏液，备用；蒸馏器内药液滤过，滤液备用，药渣再加7-9倍量的水煎煮0.3-1小时，滤过，合并滤液，放冷，用10％NaHCO₃溶液调至pH值6，上大孔树脂柱，树脂用量为药材量的1-4倍，收集流出液，用盐酸调至pH2-3，继续上已处理好的大孔树脂柱，树脂用量为药材量的1-4倍，用60-80％乙醇上柱洗脱，收集醇洗脱液，回收至无醇味，得金银花提取物浸膏，备用；上述金银花提取物浸膏加500ml注射用水溶解后，加入葡甲胺5-7调pH值，滤过，药液超滤，膜分子量1万，得超滤液；重蒸馏液加入适量1，2-丙二醇溶解后与超滤液合并，加入氯化钠及亚硫酸氢钠，搅拌使溶解，加入葡甲胺1-3g调pH值，用注射用水稀释，混合均匀，微滤，滤液分装，轧盖，即得。

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