CN100404662C - 提取自螺旋藻的新的抗逆转录病毒的硫脂、其制备方法,含有其的组合物及其作为hiv病毒逆转录酶抑制物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从螺旋藻中提取的新的硫脂、获得所述硫脂的方法、含有所述硫脂的组合物及其作为HIV-1和HIV-2的抑制物的用途。本发明还涉及富含具有抑制HIV-1和HIV-2逆转录酶活性的硫脂的螺旋藻生物体,以及所述硫脂或富含所述硫脂的螺旋藻生物体在制备预防或治疗AIDS的药物中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及从螺旋藻中提取的新的抗逆转录病毒的硫脂、获得所述硫脂的方法、含有所述硫脂的组合物、所述硫脂作为人类免疫缺陷病毒HIV-1和HIV-2的抑制物的用途和含有所述硫脂的生物体。
背景技术
糖脂广泛分布于真核生物和原核生物中,并与其中的类囊体的膜相关。在蓝细菌中,糖脂通常与异形细胞壁相关(1)。蓝细菌例如螺旋藻含有四种类型的膜脂:三种糖脂(两种半乳糖脂和一种硫脂)和一种磷脂(磷脂酰甘油)。
一些研究结果显示,这类糖脂具有抗炎、抗肿瘤或抗病毒活性(2)。Gustafson等人(3)已经研究了从微藻类赖氏鞘丝藻(LyngbyalagerheimiI)和纤细席藻(Phormidium tenue)中提取得到的硫脂对HIV-1的抗病毒活性。该研究结果显示,在四唑实验中纯原核生物来源的硫脂具有抑制HIV-1的活性,并且在与合胞体形成及人淋巴细胞系蛋白质P24相关的实验中也具有所述活性。
最近Loya等人(4)指出,来自于伪枝藻属(Scytonema sp.)、Oscillatoria trichoides、Oscillatoria raoi、沼泽颤藻(Oscillatoria limnetica)和纤细席藻的原核硫脂是HIV-1逆转录酶的强效抑制物,所述逆转录酶被认为是HIV生命周期中的关键酶。
逆转录酶是一种多功能酶,其具有DNA(脱氧核糖核酸)聚合酶和RNase-H(核糖核酸酶H)两种酶活性。所述两种酶活性负责将病毒基因组DNA转变为原病毒的双链DNA。然后,后者从细胞质被转运入宿主细胞的核内,进而被整合入细胞的DNA中。抑制所述逆转录酶两个催化功能能够防止在宿主细胞中产生病毒,因此该酶是寻找AIDS(获得性免疫功能丧失综合症)治疗方法的主要目标之一。
在寻找AIDS治疗方法的过程中,还对病毒感染的其他必需步骤的抑制也进行了许多尝试,所述步骤为:
-病毒与被感染细胞结合;
-病毒膜与被感染细胞融合;
-在整合酶的辅助下,原病毒DNA整合入宿主细胞的DNA中;
-在病毒蛋白酶的作用下,病毒蛋白质重塑而产生新的病毒。
为了尽可能控制感染的发展而对联合用药进行了研究。
存在如下两种类型的逆转录酶抑制物:
1)AZT(叠氮胸苷)型核苷抑制物:ddI(双脱氧肌苷)、ddC(双脱氧胞苷)、3TC(双脱氧硫代胞苷)、d4T(双氢双脱氧胸苷)、abacarir;
2)非核苷抑制物:硫脂和其他分子(奈韦拉平、依法韦仑等)。
被描述为逆转录酶抑制物的硫脂是从微藻类赖氏鞘丝藻和纤细席藻中提取得到的原核硫脂,其能够抑制HIV-1的细胞病变效应(3),所述硫脂组合物在专利WO 91/02521中有所描述,C18/C16和C16/C16原核硫脂由Loya S.等人从Oscillatoria raoi、O.trichoides、沼泽颤藻、伪枝藻属和纤细席藻中得到(21)。
硫脂也是螺旋藻的组分,而螺旋藻是对营养不良的儿童具有特殊营养价值的蓝绿微藻类。螺旋藻富含具有营养价值和生物医学价值的化合物,例如必需氨基酸、维生素(A、B12、E)或必需多元不饱和脂肪酸,其主要生长于干旱地带许多热带湖的含钠的水中。
所述微藻类属于蓝藻门(Phyllum cyanophyta),蓝藻纲(Cyanophyceae),念珠藻目(Nostocales),颤藻科(Oscillatoriaceae),螺旋藻属(Spirulina)或节旋藻属(Arthrospira)。
也存在不同种的藻类,尤其是钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)和极大螺旋藻(Spirulina maxima)(Bourrelly P.1970年,Les algues bleuesou cyanophycées(蓝藻),见《Les Algues d’eau douce(淡水藻类)》第三卷,N.Boubée出版)。
共同申请人在专利FR 2 768 744中描述了混合营养培养螺旋藻的方法,该方法用来产生富含Ω-6-多元不饱和脂肪酸和/或硫脂的生物体。所述方法包括至少一个在亚油酸铵存在的条件下培养螺旋藻的步骤。
发明内容
在从事研究的过程中,共同申请人目前已经发现,可以从在油酸铵或棕榈酸铵存在的条件下培养的螺旋藻的提取物中,分离得到原核型和真核型硫脂,所述硫脂具有更好的HIV-1和HIV-2逆转录酶抑制物活性。
在蓝细菌类中,具体而言是在螺旋藻中,脂类(半乳糖脂、磷脂和硫脂)甘油骨架上脂肪酸的典型分布分别与1位和2位碳上酯化的C18和C16脂肪酸相对应。这种分布形成了称为“原核的”C18/C16和C16/16分子的特征,这些分子或多或少存在不饱和性。
在下文中,“原核型硫脂”(或“原核硫脂”)可理解为如分子式(I)所示的硫脂:
其中,R1是C18不饱和脂肪酸基或者是C16饱和或不饱和脂肪酸基,R2是C16饱和或不饱和脂肪酸基;“真核型硫脂”(或“真核硫脂”)可理解为上述分子式所示的硫脂,其中R1和R2是相同的或者不同的C18不饱和脂肪酸,即C18/C18硫脂。
“饱和脂肪酸基”可理解为不含有双键的烃链。
“不饱和脂肪酸基”可理解为含有一个或一个以上双键的烃链,优选含有1、2或3个双键。
令人惊讶的是,目前已经发现在螺旋藻培养基中补加油酸铵或棕榈酸铵能够改变总硫脂的组成,并增加如上所定义的真核型和原核型硫脂,从而提高硫脂对HIV-1和HIV-2逆转录酶的抑制活性,所述硫脂从补加的培养基中培养的螺旋藻中提取得到。
因此,本发明的第一方面涉及一种新的培养螺旋藻的方法,其中,在培养基中补加了油酸铵或棕榈酸铵形式的外源性脂肪酸,以选择性地增加特定种类的硫脂分子。
所述生物体被用于提取脂质,然后各类脂质被分离以收获总硫脂,得到的总硫脂再被分成不同种类的硫脂分子。
本发明进一步涉及所述硫脂、含有所述硫脂的组合物、所述硫脂作为HIV-1和HIV-2逆转录酶的抑制物的用途及其在制备治疗AIDS的药物中的用途。
本发明所述的培养方法可应用于目前所有的螺旋藻株,尤其是那些在前引用的出版物中所描述的螺旋藻。所用的螺旋藻例如可选自以下藻株:
-钝顶螺旋藻PCC 8005(Institut Pasteur,巴黎)
-极大螺旋藻和特斯科科螺旋藻(Spirulina texcoco)(特斯科科,墨西哥)
-Spirulina crater(Laboratoire La Roquette,法国)
-螺旋藻8818(ENS,巴黎)
螺旋藻在补加有亚油酸铵的培养基中生长得非常良好。螺旋藻吸收亚油酸铵形式的外源性亚油酸,以在其脂质中合成γ-亚油酸,所述脂质例如单半乳糖二酰基甘油(MGDG)、二半乳糖二酰基甘油(DGDG)、硫代异鼠李糖二酰基甘油(SQDG)和磷脂酰甘油(PG)。
目前已经发现,特定的培养条件有可能获得特别富含能够抑制HIV-1和HIV-2逆转录酶的硫脂的螺旋藻生物体,所述特定的培养条件即在优选的温度和光照条件下补加油酸铵或棕榈酸铵。
所述螺旋藻生物体可在罐内或无菌的光生物反应器中生成。其中所用的合适的罐和光生物反应器为本领域的技术人员所熟知。
因此,本发明的一个优选的方面涉及螺旋藻的混合营养培养方法,该方法用于产生富含能够抑制HIV-1和HIV-2逆转录酶的硫脂的生物体,该方法包括至少一个在油酸铵或棕榈酸铵存在的条件下培养螺旋藻的步骤。
在优选的情况下,补加入培养基的油酸铵或棕榈酸铵的浓度为35-75μmol/l(微摩尔每升)。
在有利的情况下,存在油酸铵或棕榈酸铵的培养步骤中的温度为20-30℃。在优选的情况下,所述步骤中的光照条件为100-125μE/m2/s,且进行8-12小时白光和16-12小时黑暗的24小时交替光照循环,其中优选为12小时白光和12小时黑暗。
特别有利的用于产生富含能够抑制HIV-1和HIV-2逆转录酶的硫脂的螺旋藻生物体的培养条件包括:
-每小时每升培养基中鼓入含1%(体积比)CO2的25-60L(升)空气;
-生长期间培养基的pH维持在8.5-10.5,优选为9-10,以避免被不能在很强碱性的培养基中生长的其他微生物的污染。
-维持适合螺旋藻生长期间所需的最低浓度的碳酸氢根、磷酸根和硝酸根离子。
在一个有利的方面,所述方法包括如下步骤:
-在培养基中补加油酸铵或棕榈酸铵,光照强度为75-100μE/m2/s,且进行约8-12小时白光和约16-12小时黑暗的24小时交替光照循环,优选为约12小时白光和约12小时黑暗,温度维持在约30℃,维持上述条件48小时;
-然后在24℃、光照强度为100-125μE/m2/s的条件下继续维持48-72小时,且进行约8-12小时白光和约16-12小时黑暗的24小时交替光照循环,优选为约12小时白光和约12小时黑暗。
-然后在22℃、光照强度为100-125μE/m2/s的条件下继续维持72-96小时,所述光照也可以在20℃维持达168小时(即7天),且进行约8-12小时白光和约16-12小时黑暗的24小时交替光照循环,优选为约12小时白光和约12小时黑暗;可以选择性地在补加油酸铵或棕榈酸铵后的24-48小时内,以每小时每升培养基25L的速率鼓入含1%CO2的空气,在之后的48-96小时内再以每小时每升培养基40-60L的速率鼓入含1%CO2的空气。
本发明的最后的一个方面进一步涉及富含硫脂的螺旋藻生物体,其中含有占总脂质的至少40重量%的硫脂,所述硫脂具有抑制HIV-1和HIV-2逆转录酶的活性。
所述包含在生物体中的硫脂为原核硫脂或真核硫脂。
在优选的情况下,所述磷脂具有分子式(I)的结构:
其中,
-R1是油酰基,R2是棕榈酰基,或
-R1是亚油酰基,R2是棕榈酰基,或
-R1是棕榈酰基,R2是棕榈酰基,或
-R1是γ-亚麻酰基,R2是棕榈酰基,或
-R1是γ-亚麻酰基,R2是棕榈油酰基,或
-R1是棕榈油酰基,R2是棕榈酰基。
根据以上定义的术语,这些硫脂是分子式(I)的硫脂,其中R1和R2的定义如下:
R<sub>1</sub> | R<sub>2</sub> |
C18:1 | C16:0 |
C18:2 | C16:0 |
C16:0 | C16:0 |
γC18:3 | C16:0 |
γC18:3 | C16:0 |
C16:1 | C16:0 |
其他有利的硫脂是分子式(I)的真核硫脂,其中R1是C18不饱和脂肪酸基,R2是C18不饱和脂肪酸基,所述基团可以是相同的,也可以是不同的。
其中,有利的硫脂是那些符合分子式(I)的硫脂,其中:
-R1是油酰基,R2是亚油酰基,或
-R1是亚油酰基,R2是油酰基,或
-R1是亚油酰基,R2是亚油酰基,或
-R1是油酰基,R2是油酰基。
所述真核硫脂具有分子式(I)的结构,其中R1和R2的定义如下:
R<sub>1</sub> | R<sub>2</sub> |
C18:1 | C18:2 |
C18:2 | C18:1 |
C18:2 | C18:2 |
C18:1 | C18:1 |
本发明进一步涉及含有如上定义的真核硫脂和/或原核硫脂的混合物,所述混合物也被称为“总硫脂”。
在有利的情况下,通过不同种类硫脂分子的提取、分离和纯化步骤,所述硫脂从上文所述的富含硫脂的螺旋藻生物体中分离出来,这也代表了本发明的另一个方面。
所述脂类化合物可以通过例如一些溶剂提取而得到,所述溶剂例如甲醇和氯仿。可以使用为本领域的技术人员所知晓的技术来进行分离操作,所述技术例如薄层色谱法或高效液相色谱法。优选使用高效液相色谱法来分离各种不同种类的硫脂分子。
本发明的另一个方面涉及上文定义的分子式(I)的硫脂。
本发明进一步涉及所述硫脂或者上述富含原核和真核硫脂的螺旋藻生物体的提取物作为HIV-1或HIV-2逆转录酶抑制物的用途。
本发明进一步涉及含有所述硫脂以及药用载体的药物组合物,还涉及所述硫脂或富含硫脂的螺旋藻生物体的提取物在制备用于预防或治疗AIDS的药物中的用途。
具体实施方式
实施例
通过下列实施例来说明本发明,但这并非意在限制本发明的范围。
实施例1:在外源性脂肪酸(油酸铵或棕榈酸铵)存在的条件下培养螺旋藻,以产生富含硫脂的生物体。
所使用的螺旋藻株为钝顶螺旋藻PC 8005(Institut Pasteur,法国巴黎)。
在油酸铵或棕榈酸铵存在的条件下,在光生物反应器中培养富含硫
脂的螺旋藻的方法
a)钝顶螺旋藻的繁殖
如专利FR 2 767 744中的实施例3.1中所描述的方法,对该藻株进行繁殖。
b)如专利FR 2 768 744中的实施例3.2)a)中所描述的步骤,在第一个光生物反应器(容量为7L)中制备5L培养物。
c)从第一个光生物反应器中取出4L培养物,然后用4L新鲜的Zarrouk无菌培养基(组成成分在专利FR 2 768 744中给出)补充所述光生物反应器,以继续制备另一批培养物。作为接种物,在无菌条件下将取出的4L培养物转入第二个7L的光生物反应器中,之后的5-7天中在培养基中补加入35-75μmol/L的油酸铵或棕榈酸铵,并以如下条件培养:
c.1)第一个步骤,其包含2个连续阶段
-阶段1:培养物在30℃、光照强度为75-100μE/m2/s的条件下维持48小时。在此期间,24小时的光照循环设置为约8-12小时白光/16-12小时黑暗。此外,必需降低鼓入含1%CO2空气的速率,以每小时每升培养物25-35L空气的速率维持24-48小时。振荡速率维持在100-150rpm(转每分)。
-阶段2:将培养物在24℃和100-125μE/m2/s的更强的光照强度的条件下维持48小时。24小时光照循环为约8-12小时白光/16-12小时黑暗。增加鼓入含1%CO2空气的速率,以每小时每升培养物40-50L含1%CO2空气的速率维持48-72小时。振荡速率维持在约100-150rpm。
c.2)在第二个步骤中,培养温度降至20-22℃,光照强度为100-125μE/m2/s。24小时光照循环为约12小时白光/12小时黑暗,持续72-96小时直到收获生物体。pH维持在约9-10.5,以使螺旋藻细胞中硫脂的合成最优化。以每小时每升培养物50-60L的速率鼓入含1%CO2的空气。振荡速率维持在约100-150rpm。根据培养的藻株和使用的光生物反应器的类型的不同,第二个步骤的持续时间可有变化。
d)采用以下方法收获富含硫脂的生物体:
在20-24℃、光照强度为30-50μE/m2/s的条件下,在倾析器中培养螺旋藻24-48小时,以去除上清。生物体沉淀在倾析器底部,再通过过滤或者5000rpm离心15分钟将其收获,然后在24℃条件下用10g/L(克每升)的NaCl(氯化钠)溶液漂洗。通过5000rpm离心15分钟再次收获所述生物体,然后在冻干或雾化前以20-24℃的条件用蒸馏水或软水漂洗3次。
e)结果
根据本发明方法培养的螺旋藻中的总脂质的比例约为干重的6.7-7.2%。所述培养物的产率达1.6-2.1g干重/L。提高初始细胞的浓度,可以减少培养时间并且增加产率(2.2-2.6g/L)。
e.1)在油酸铵、亚油酸铵或棕榈酸铵(重量百分比)存在的条件下,所培养的螺旋藻的脂质组成
获得硫脂的比例约为总脂质的38-41.5%,如表1所示。
表1.
培养物 | MGDG<sup>1</sup> | DGDG<sup>2</sup> | PG<sup>3</sup> | SQDG<sup>4</sup> |
对照<sup>5</sup> | 31-33 | 15.7-17.3 | 24.8-26.2 | 24.8-26.6 |
补加油酸盐 | 34-35 | 10-10.8 | 13-13.5 | 40-41.5 |
补加棕榈酸盐 | 40.0-43.5 | 8.5-9.3 | 10-11 | 38.0-39.7 |
1:单半乳糖二酰基甘油
2:二半乳糖二酰基甘油
3:磷脂酰甘油
4:硫代异鼠李糖二酰基甘油
5:无添加剂
上述结果显示,当培养基中加入油酸铵或棕榈酸铵时,硫代异鼠李糖二酰基甘油形式的硫脂的比例显著增加了。
e.2)在没有添加剂或者在油酸铵或棕榈酸铵存在的情况下,培养的钝顶螺旋藻PC 8005中的硫脂的总脂肪酸组成和脂肪酸组成(表2和表3)。
所述硫脂具有如下分子式:
其中,R1和R2的定义如下:
R1 R2
γC18:3(γ-亚麻酰) C16:0(棕榈酰)
C18:2(亚油酰) C16:0(棕榈酰)
C18:1(油酰) C16:0(棕榈酰)
C16:1(棕榈油酰) C16:0(棕榈酰)
相应于所述R1和R2定义的分子式如下:
表2.总脂肪酸组成(重量百分比)*
培养物 | 16:0 | 16:1 | 18:0 | 18:1 | 18:2 | γ18:3 | C16/C18比率 |
对照 | 50.2 | 1.2 | 1.3 | 10.5 | 16.0 | 20.8 | 51.4/48.6 |
补加油酸盐 | 34.7 | 1.2 | 1.0 | 20.1 | 18.0 | 25.0 | 35.9/64.1 |
补加棕榈酸盐 | 55.4 | 1.9 | 1.6 | 3.7 | 12.8 | 24.6 | 57.3/42.7 |
*标准差≤0.3
结果显示,在培养基中加入油酸铵显著增加了C18总脂肪酸的含量,并降低了C16总脂肪酸的含量。
加入棕榈酸铵导致C16总脂肪酸含量的轻度增加(6%)和C18总脂肪酸含量的降低。
表3.硫脂的脂肪酸组成(重量百分比)*
培养物 | 16:0 | 16:1 | 18:0 | 18:1 | 18:2 | γ18:3 | C16/C18比率 |
对照 | 55.8 | 1.0 | 1.0 | 11.1 | 27.0 | 4.1 | 56.8/43.2 |
补加油酸盐 | 45.2 | 1.5 | 0.5 | 18.6 | 29.0 | 5.2 | 46.7/53.3 |
补加棕榈酸盐 | 58.9 | 1.9 | 1.0 | 9.0 | 25.5 | 4.7 | 60.8/39.2 |
*标准差≤0.4
上述结果显示,在培养基中加入油酸铵显著增加了硫脂中C18脂肪酸的含量,降低了C16脂肪酸的含量。
加入棕榈酸铵则具有相反的作用。
这表明,在油酸盐存在的条件下,螺旋藻优先使用该外源性脂肪酸合成真核(C18/C18)硫脂,而在棕榈酸铵存在的条件下,原核(C16/C16)硫脂的合成增加。
实施例2:提取、分离和纯化所述种类的硫脂分子
2.1.采用TLC(薄层色谱)或HPLC(高效液相色谱)提取和分离所述种类的脂质
2.1.1.提取
采用Bligh和Dyer(1959年)的方法,使用甲醇和氯仿来提取所述脂质(5)。吸出氯仿相,在氮气中干燥后转入一定量的氯仿或苯/乙醇(4∶1,体积比)中。
2.1.2.分离
a)采用TLC方法:
在氮气中将所述总脂质提取物置于0.25mm厚的硅胶板(SilicagelG60,Merck)上。在一个密封槽内进行单向迁移,该槽内含有氯仿/丙酮/甲醇/乙酸/双蒸水(50∶20∶10∶10∶5,体积比)的混合物(6)。通过喷雾蒸馏水显现斑点,而脂质对照通过喷雾樱草黄溶液(10mg樱草黄溶于10ml 80%的丙酮水溶液)显现,并在UV(紫外线)下观察。收集上述斑点,然后将其回收至含有氯仿/甲醇/水(2∶1∶0.5,体积比)的混合物的试管中。所述样品在-20℃放置24小时,然后收集每只试管中的脂质成分(氯仿相),在真空旋转蒸发器上或者氮气中蒸发干燥。最后,将所述各种脂质重溶于已知体积的氯仿中,以分析其分子种类。
b)采用HPLC方法:
将经Millipore膜(直径0.5μm)过滤的所述脂质提取物在氮气中蒸发干燥,然后溶于100μl氯仿中。根据Demandre等人(7,8)的方法,在Waters HPLC装置(美国马萨诸塞州的Milford)中使用300×7.8mm的Parasil 10μm硅胶柱分离各种脂质;其中首先使用溶剂A洗脱所述脂质提取物2分钟,溶剂A包含异丙醇和己烷(4∶3,体积比)的混合物。然后用两种溶剂的混合物洗脱所述脂质20分钟,所述两种溶剂的混合物符合以100%溶剂A开始和100%溶剂B结束的线性梯度,其中溶剂B包含异丙醇/己烷/H2O(水)(8∶6∶1.5,体积比)。最后以每分钟2ml的速度用溶剂B洗脱上述硅胶柱20分钟。收集在205nm(纳米)处检测到的脂质。采用薄层色谱方法对所述脂质进行鉴定,该方法根据Lepage方法(6)而使用了对照(MGDG、DGDG、SQDG和PG)和特定试剂,所述特定试剂包括用于半乳糖脂的α-萘酚和硫酸及用于磷脂的Zinzadze试剂(9)。
为了用于HIV实验,所述各种脂质可重溶于乙醇。
2.1.3.脂肪酸和脂质的检测
将挖出的硅胶板上的脂质斑点用于其脂肪酸的甲基化。将总脂质提取物的脂肪酸或者经TLC分离的各种脂质的脂肪酸进行甲基化,该TLC分离采用C17:0为内标(十七烷酸)。然后在样品中加入3ml甲醇/硫酸(97.5∶2.5,体积比)(10)。在75℃的密封试管中放置40分钟后立即冷却所述样品,然后用2ml己烷和1ml双蒸水萃取甲酯。
所述甲酯在惠普(Hewlett Packard)气相色谱仪上分析。通过与C17:0内标比较,计算出每种脂肪酸的含量。
2.2.通过HPLC分离不同种类的硫脂分子
2.2.1.通过HPLC分离各种硫脂分子
在反相柱中将由TLC或HPLC得到的硫脂分离成各种分子。所使用的固定相是ODS(十八烷基硅胶)5μm相(在4.6×250mm的Altex或Spherisorb柱中)或者是Bondapak C18 10μm相(在3.9×300mm的Waters柱中),前者用含有20mM(毫摩尔每升)氯化胆碱的溶剂洗脱,该溶剂为甲醇/乙腈/H2O(90.5∶2.5∶4,体积比)组合物,后者用含有20mM氯化胆碱的溶剂洗脱,该溶剂由甲醇/乙腈/H2O(90.5∶2.5∶7,体积比)的混合物组成。所述溶剂的流速为1.5ml/分钟。所述各种硫脂分子被分离开,并同时在205nm处检测。采用GC(气相色谱)分析所述各种硫脂分子的脂肪酸,使这些分子得以识别和定量(7)。
2.2.2.鉴定各种原核和真核硫脂分子
通过分析硫脂分子的甘油上脂肪酸的位置来鉴定各种硫脂分子。
挖出用TLC或HPLC分离开的硫脂,并用双蒸水湿润。所述硫脂用甲醇/氯仿(1∶2,体积比)的混合物萃取三次,然后用纯甲醇萃取一次。在氮气中将该硫脂萃取物干燥。
此处所用的方法如Fischer等人(1973年)(14)所述:将20ml TritonX-100(100mg Triton X-100溶于2ml氯仿)和100μl氯仿加入到上述干燥样品中。然后把1ml 0.04M(摩尔每升)Tris-HCl缓冲液(pH=7.5)和20μl来自少根根霉(Rhizopus arrhizus)的脂肪酶A1(50,000U/ml(单位每毫升),Boehringer)加入到装有所述再次干燥样品的试管中。在Vortex上剧烈振荡1-2分钟后,将试管在30℃轻柔摇动的水浴中放置30-60分钟,以分析硫脂和磷脂(对于半乳糖脂则放置20-30分钟)。脂肪酶A1仅水解甘油分子1位上的酯基。加入15μl 1.8N(当量)的乙酸或异丙醇,在冰浴中终止反应。在氮气中蒸发掉溶剂,再将3ml氯仿/甲醇(1∶1,体积比)加入到水解后的样品中。将所述水解后的样品剧烈振荡,然后以400g(相对离心力)离心10分钟,取上清进行TLC分析。该上清含有脂肪酶A1的水解产物(游离脂肪酸和2-酰基-lyso SQDG),用Lepage溶剂(6)在薄层硅胶(Silicagel G60,Merck)上将该产物分离,Lepage溶剂包含氯仿/丙酮/甲醇/乙酸/H2O(50∶20∶10∶10∶5,体积比)的混合物。用于硫脂衍生物的溶剂是氯仿/甲醇/乙酸/H2O(65∶35∶4∶4,体积比)的混合物。在迁移后,用樱草黄溶液显现来自甘油分子1位的游离脂肪酸和2-酰基-lyso SQDG,挖出所述斑点,然后将其在1%甲醇钠(0.2ml)和甲醇/1.1N盐酸(0.2ml)(或甲醇/硫酸(97.5∶2.5))存在的条件下进行甲基化,再用气相色谱分析之。
2.3.各种原核(C18/C16)和真核(C18/C18)硫脂分子的纯化
可以用Seppaks硅筒(silica cartridge)分离中性脂质、半乳糖脂、磷脂和硫脂。
用氯仿移除中性脂质,然后分别用二氯甲烷/甲醇(93∶7,体积比)的混合物和甲醇分离出半乳糖脂和磷脂。在使用所述溶剂系统后,硫脂以稀释的形式存在于磷脂成分(甲醇)中。然后在MAXISIL 5μm SI柱(150×10mm)(Phenomenex,加里弗尼亚州的Torrance)上采用正相HPLC方法从磷脂成分中(甲醇成分)分离出硫脂。
移动相是流速为1.5ml/分钟的庚烷/异丙醇/0.001M KCl(氯化钾)(40∶52∶8,体积比)的混合物。在208nm处检测发现了硫脂峰(在稀释25分钟后)。最后,在每次操作后用100%异丙醇清洗柱子,并用100%庚烷重平衡(15)。
上述操作的结果显示在表4中。
表4.各种硫脂分子的组成(总硫脂重量的百分比)
*未检测
上述结果显示,根据培养基中的补加物的不同,各种硫脂分子的组成是不同的。事实上,当在培养基中补加油酸铵时,在总C18/C16与总C18/C18的比率中,C18/C16(原核)硫脂的比例降低,而C18/C18(真核)硫脂的比例显著增加。
实施例3:通过螺旋藻中各种硫脂分子抑制HIV-1和HIV-2逆转录酶
3.1.实验方法
3.1.1.酶
本研究中所用的逆转录酶是重组酶,其表达于E.coli(大肠杆菌)中,且从细菌提取物中纯化得到(16)。HIV-1逆转录酶表达质粒源自原病毒分离物BH-10(17),而HIV-2逆转录酶表达质粒源自分离物pRod(18)。HIV-1和HIV-2逆转录酶分别是p.66/p.51和p.68/p.55异源二聚体。
3.1.2.酶实验
本处所用的缩写如下:
dTTP:脱氧胸苷三磷酸
dATP:脱氧腺苷三磷酸
dGTP:脱氧鸟苷三磷酸
dCTP:脱氧胞苷三磷酸
dNTP:脱氧核苷三磷酸
根据Loya等人(19)的方法进行酶实验。在不同浓度硫脂存在的条件下,通过监测在三氯乙酸(TCA)中不溶的、以poly(rA)n.oligo(dT)12-18掺入[3H]dTTP的产物的量,来检测DNA聚合酶的活性。通过检测从合成底物[3H]poly(rA)n.poly(dT)n中释放出的TCA可溶产物的量来检测RNase-H的活性。该底物按Hizi等人(1991年)(20)的方法制备。在全部抑制实验中,在不同浓度抑制物存在或不存在的情况下,先将所述酶在30℃预孵育5分钟。通过在37℃加入合适底物并温育30分钟来启动酶促反应。
计算相对于不存在硫脂时观察到的(线性)反应的起始速率的残余酶活性。
根据作为抑制物(硫脂)浓度的函数的抑制曲线,计算得到引起抑制50%酶促活性(IC50)的抑制物浓度。
所述酶活性的定义如下:
(a)一个单位的DNA聚合酶活性定义为,在37℃、30分钟的标准实验条件下,将1pmol(皮摩尔)dNTP催化掺入DNA产物中所需的酶量。
(b)一个单位的RNase-H活性定义为,在37℃、30分钟的标准实验条件下,催化1pmol AMP(单磷酸腺苷)水解所需的酶量。
3.2.结果
实验结果显示在下表5、6和7中。
表5.总硫脂对HIV-1逆转录酶的作用
总硫脂 | 硫脂浓度(μg/ml) | 残余酶活性(%) |
对照 | 332-374.7(±4.7) | 10±2 |
补加油酸盐 | 215-267.7(±5.0) | 10±2 |
补加棕榈酸盐 | 347.5-393.0(±4.7) | 10±2 |
上述结果显示,来自于在油酸盐存在下培养的螺旋藻的总硫脂,对HIV-1逆转录酶的抑制活性显著高于对照。
事实上,对于提取自在油酸盐存在下培养的螺旋藻的总硫脂而言,低剂量即215和291.5μg/ml即可抑制90%的HIV-1逆转录酶活性;而在未加添加剂的培养基中培养的螺旋藻的剂量为332μg/ml。
所述现象可通过在培养基中补加其他物质引起总硫脂组成的改变来解释,所述改变即原核(C18/C16)硫脂含量增加和出现真核(C18/C18)硫脂。
表6
各种硫脂分子对HIV-1逆转录酶的DNA聚合酶和RNase-H活性的抑制
(a)IC50和IC90:分别抑制50%和90%初始酶活性的抑制物(硫脂)浓度。抑制浓度表示为μg/ml。
(b)在浓度为100μM的每种硫脂分子的抑制物存在下检测RNase-H活性。
(c)残余酶活性以不存在抑制物的对照活性的百分比计算。
结果显示,各种原核分子对HIV-1逆转录酶的DNA聚合酶的抑制活性均强于除了C18:1/C18:1之外的各种真核分子,其中活性最强的分子种类是C18:1/C18:1、C18:1/C16:0和C18:2/C16:0。
对于HIV-1逆转录酶的RNase-H的抑制活性,活性最强的分子种类是C16:1/C16:0、C16:0/C16:0、C18:1/C18:1和原核种类C18:1/C16:0。
表7各种硫脂分子对HIV-2逆转录酶的DNA聚合酶活性的作用
分子种类 | 硫脂浓度(μg/ml) | 残余酶活性(%) |
C18:1/C16:0 | 4.8±0.99.6±0.919.1±0.933.5±2.038.3±1.876.5±2.0 | 100±193±274±250±142±224±2 |
C18:2/C16:0 | 9.5±0.923.8±0.947.7±1.895.4±2.0105.0±5.0190.8±4.8 | 100±196±270±256±250±125±2 |
C16:1/C16:0 | 10.2±0.525.0±0.648.9±0.997.5±1.5108.0±3.0198.5±3.4 | 100±196±169±158±250±124±2 |
C18:1/C18:1 | 4.0±0.58.0±0.616.0±0.726.1±1.836.0±1.071.9±1.0 | 100±192±170±250±135±122±2 |
上述结果显示,C18:1/C16:0和C18:2/C16:0种类的硫脂分子对HIV-2逆转录酶的DNA聚合酶活性也有抑制活性,其中C18:1/C18:1硫脂的抑制活性最强。
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