CN100398664C - 浮萍在高通量筛选中的应用 - Google Patents

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Abstract

公开了在浮萍中进行高通量筛选的方法。一方面，这些方法用于鉴定编码目的多肽的核苷酸序列。另一方面，这些方法用于鉴定调节靶核苷酸序列表达的核苷酸序列。这些方法将整株植株筛选的预测好处与高通量系统的速度和效率集于一身。

Description

浮萍在高通量筛选中的应用
发明领域
本发明涉及应用浮萍进行高通量筛选的方法。
发明背景
浮萍是单子叶浮萍科植物的唯一成员。4个属和34个种全部是小的、自由漂浮的淡水植物，它分布的地理范围遍及全球(Landolt(1986)Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds：The Family ofLemnaceae-A Monograph Study Geobatanischen Institut ETH，Stiftung Rubel，Zurich)。虽然浮萍是已知的形态上最简化的植物，但它的大多数种具有较大植物所具有的全部组织和器官，包括根、茎、花、种子和叶。浮萍的各个种被广泛研究，有大量的文献用来详细说明它们的生态学、系统分类学、生命周期、新陈代谢、疾病和害虫易感性，以及它们的生殖生物学，遗传结构和细胞生物学(Hillman(1961)Bot.Review 27：221；Landolt(1986)Biosystematic Investigation on theFamily of Duckweeds：The Family of Lemnaceae-A Monograph StudyGeobatanischen Institut ETH，Stiftung Rubel，Zurich)。
浮萍的生活习性使之适于微生物培养方法。这种植物以宏观上类似于酵母无性繁殖的方式通过新叶的营养出芽快速增殖。这种增殖通过从分生细胞营养出芽而发生。分生组织区域是小的，被发现位于叶腹面的表面上。分生细胞位于两个叶窝(pocket)中，叶中脉的每侧各有一个叶窝。小的中脉区域也是根发生和茎长出的部位，所述茎使每一个叶与其母叶连接起来。分生叶窝由一个组织盖保护起来。叶从这些叶窝中交替出芽。倍增时间依种而变，可短至20-24小时(Landolt(1957)Ber.Schweiz.Bot.Ges.67：271；Chang等人(1977)Bull.Inst.Chem.Acad.Sin.24：19；Datko和Mudd(1970)Plant Physiol.65：16；Venkataraman等人(1970)Z.Pflanzenphysiol.62：316)。
浮萍植株或浮萍结节培养物能被包括农杆菌介导的基因转移、微弹轰击或电穿孔等许多方法中的任何一种高效转化。通过把目的核苷酸序列和赋予对一种筛选试剂抗性的基因转化到浮萍中，然后将被转化细胞培养在含有所述筛选试剂的培养基中，稳定的浮萍转化体能被分离出来。参见美国专利第6,040,498号和美国临时专利申请60/221,705；此处整体引用作为参考。
近来，在植物基因组测序方面的进展提供了大量的关于编码新多肽的基因序列以及相关的用于调节这些编码序列表达的核苷酸序列的信息。然而，这些序列数据没有提供关于这些核苷酸序列在生理重要的过程中所起精确作用的信息。
为了确定或进一步证实这些新基因的功能，一般地，在体内表达这些基因是必要的。在筛选核苷酸序列以确定它们在植物中的活性时，最高的预测成功来自于该序列在整个植株中活性的试验。然而对种植在土壤中的完整植株所做的温室试验是耗费时间和空间的，需要大量的劳动去准备、照料以及评价这些筛选，并且这些步骤通常不适用于自动化。
在一个组合了整株植株筛选的预测成功和高通量筛选的缩小的规模和费用的系统中筛选核苷酸序列的方法是吸引人的。因此，本发明提供了在浮萍系统中进行高通量筛选的方法。
发明概述
提供了在浮萍系统中确定核酸分子生物学功能以及鉴定目的核酸分子的高通量方法。
本发明的方法适用于自动化，以允许对核酸分子的快速、高效表征和鉴定。本方法可以以高密度形式被执行，以便使多个样品能同时被处理。另外，本方法的多个步骤可以以同样的高密度形式被执行。例如，在一个实施方案中，浮萍培养物的转化、筛选、以及浮萍组织的再生都能在相同的高密度形式平板中进行。这些方法提供了核苷酸序列的高速筛选，以使目的核酸分子可以在转化浮萍培养物后的短时间内被鉴别出来。最后，这些方法提供了被转化浮萍株系的高效恢复。
这些方法包括用核苷酸序列转化浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物或者浮萍原生质体细胞培养物。浮萍系统于是被操作以鉴定目的核酸分子。
在一个实施方案中，浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物或者浮萍原生质体细胞培养物被一段测试核苷酸序列转化，接着该测试核苷酸的生物学功能被确定，从而确定了该测试核苷酸序列是否是目的核酸分子。
在另一个实施方案中，浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物或者浮萍原生质体细胞培养物被报告核苷酸序列在该报告核苷酸能被整合入浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物或者浮萍原生质体细胞培养物的DNA的条件下转化，接着目的核酸分子通过确定报告核苷酸序列是否整合入浮萍DNA并进而有效地与目的核酸分子相连而被鉴定出来。
发明详述
本发明涉及在浮萍系统中进行核酸分子的高通量筛选以表征和鉴定目的核酸分子的方法。这些方法组合了整株植株筛选的预测成功和一般与单细胞技术相关的高通量筛选的规模、劳动、时间和费用效率。
定义
本发明的方法是高通量的筛选方法。用于此处的“高通量方法”指的是这样一种方法，即其至少符合下述一个特性：
(1)这种方法以高密度形式被执行，也就是一个以上的样品可以被同时处理的形式。例如，在一些实施方案中，至少12或更多、至少24或更多、至少48或更多、至少96或更多，或者至少384或更多的样品可以在单个的平板或其它容器中被处理。该平板或其它容器可以通过在每一个孔中加入多孔支持系统而被特殊改造适用于浮萍培养物的生长、维持及自动化处理。参见，例如2001年5月30日提交的序列号为60/294430的美国临时专利申请，及2002年5月28日提交的标题为“高通量筛选的平板和方法”的美国实用专利申请。
(2)本方法可以这样进行，即多个步骤(例如浮萍培养物的转化、筛选以及再生)都能在同一高密度形式平板或容器中进行。在一个实施方案中，两个或更多的从转化步骤、筛选步骤及再生步骤中挑选出的步骤都在同一平板中进行，以至于步骤之间的浮萍培养物的转移就不需要了。
(3)本方法适用于自动化，也就是说本方法的一个或多个步骤可以利用实验室自动机器人技术工作站被执行。
(4)本方法允许对核苷酸序列的高速筛选。例如，在本发明的一些实施方案中，被转化的浮萍可以在转化后短至4-16周被分析检测以鉴定目的核酸分子，例如在4周内或更短、在5周内或更短、在6周内或更短、在7周内或更短、在8周内或更短、在9周内或更短、在10周内或更短、在11周内或更短、在12周内或更短、在13周内或更短、在14周内或更短、在15周内或更短或者在16周内或更短。
(5)本方法为被转化浮萍株系的恢复提供了高的效率，从而至少30％或更多、至少35％或更多、至少40％或更多、至少45％或更多、至少50％或更多、至少55％或更多、至少60％或更多、至少65％或更多、至少70％或更多、至少约75％或更多、至少约80％或更多、至少约85％或更多、至少约90％或更多，或者至少约95％或更多的本方法转化的浮萍培养物生长成包含有测试核苷酸序列或报告核苷酸序列的转基因浮萍株系。
在这里应用的“浮萍系统”或“浮萍培养物”包括浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物及浮萍原生质体细胞培养物。
用于此处的“浮萍植株培养物”指的是主要包含了完全分化的浮萍植株的培养物。
用于此处的“浮萍结节培养物”指的是这样一种培养物，即它包含的浮萍细胞中至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的细胞是分化细胞。用于此处的“分化细胞”是指细胞有至少一种表型特征(例如一种区别性的细胞形态或标志核酸或蛋白的表达)使其同未分化细胞或其它组织类型中发现的细胞区分开来。在一些实施方案中，浮萍结节培养物包括本文别处描述的浮萍微结节(micronodules)。
用于此处的“浮萍悬浮培养物”指的是这样一种培养物，它包含有分散的浮萍细胞，例如分散的浮萍愈伤组织细胞。一般地，浮萍悬浮培养物会包括单个细胞和大小不同的未形成组织的细胞聚集体。
“浮萍原生质体细胞培养物”一词是指这样一种培养物，它所包含的浮萍细胞中至少约50％、60％、70％、80％或90％的浮萍细胞缺少细胞壁。把植物细胞制备成原生质体细胞的方法被描述在例如Eriksson(1995)Plant Protoplasts，Fowke等人编辑，CRC出版社，此处引用作为参考。
用于此处的“生物学功能”指的是核酸分子或多肽的生物学活性或性质。例如，核酸分子的生物学功能包括调节生物学反应，编码多肽，及调节靶核苷酸序列的表达。多肽生物学功能的例子包括调节生物学反应，赋予目的结构特性、赋予目的生化活性及赋予目的调节活性。调节活性的特殊的非限定性的例子包括结合目的底物的能力、结合目的配体的能力、催化目的反应的能力、调节对植物激素反应的能力、调节对植物生长调节因子反应的能力、调节对环境干扰反应的能力、调节对生理干扰的反应的能力、调节对一种或多种病原体反应的能力以及调节对一种或多种毒素反应的能力。
此处用到的“表达”指的是核苷酸序列的转录或翻译。
“浮萍”一词指的是浮萍科植物的成员。目前这个科被分成如下的浮萍的4个属和34个种：浮萍属(Lemna)(L.aequinoctialis，L.disperma，L.ecuadoriensis，L.gibba，L.japonica，L.minor，L.miniscula，L.obscura，L.perpusilla，L.tenera，L.trisulca，L.turionifera，L.valdiviana)；紫萍属(Spirodela)(S.intermedia，S polyrrhiza，S.punctata)；芜萍属(Wolffia)(Wa.angusta，Wa.arrhiza，Wa.australina，Wa.borealis，Wa.brasiliensis，Wa.columbiana，Wa.elongata，Wa.globosa，Wa.microscopica，Wa.neglecta)和Wolfiella属(Wl.caudata，Wl.denticulata，Wl.gladiata，Wl.hyalina，Wl.lingulata，Wl.repunda，Wl.rotunda及Wl.neotropica)。浮萍的任何其它属或种，如果它们存在的话，也是本发明的方面。浮萍属的各个种可以利用Landolt(1986)Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds：The Family ofLemnaceae-A Monograph Study Geobatanischen Institut ETH，Stiftung Rubel，Zurich中所描述的分类系统来分类。
此处用到的关于核苷酸序列的“有效连接”指的是多段核苷酸序列以彼此之间具有功能关系的方式定位。例如，一段启动子核苷酸序列当被安排在能驱动第二段核苷酸序列转录的位置时，它是有效地与第二段核苷酸序列相连的。
鉴定目的核酸分子的方法包括用核苷酸序列转化浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物或浮萍原生质体细胞培养物的步骤。在一些实施方案中，核苷酸序列是一段测试核苷酸序列或报告核苷酸序列。本领域中已知的任何方法都可以用来转化浮萍培养物。在一个实施方案中，被稳定转化的浮萍通过一种基因转移方法获得，这些基因转移方法在Stomp等人的美国专利第6,040,498号或美国专利申请号60/221,705中被阐述，此处引用作为参考。这些参考文献中描述的方法包括利用襄有核酸(包含目的核苷酸序列)的微粒来进行弹果轰击的基因转移法(也被称作生物弹轰击、微粒轰击或微颗粒轰击)、电穿孔基因转移法及由包含有一种载体(其中含有目的核苷酸序列)的农杆菌介导的基因转移法。转基因浮萍株系的选择和再生在这些文献中以及本文别处被述及。在一个实施方案中，被稳定转化的浮萍经由任何一种农杆菌介导的方法获得，这些方法在Stomp等人的美国专利第6040498号中被公开。所用的农杆菌是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)。在另一个实施方案中，浮萍培养物通过利用PEG介导的转化方法被转化。参见，例如，Lazerri(1995)Methods Mol.Biol.49：95-106，Mathur等人(1998)Methods Mol.Biol.82：267-276及Datta等人(1999)Methods Mol.Biol.111：335-347；此处引用作为参考.
在一个实施方案中，浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物或浮萍原生质体培养物在高密度形式的平板或其它容器中被转化，例如24孔板、48孔板或96孔板。平板可以通过在每个孔中加入多孔支持物而被改造成能自动处理浮萍培养物。参见，例如，2001年5月30日提交的美国临时专利申请序列号60/294,430以及2002年5月28日提交的题目为“高通量筛选所用的平板和方法”的美国实用专利申请；此处引用作为参考。在其它实施方案中，浮萍培养物在单一容器中被转化，然后浮萍被转移到高密度形式。浮萍可以通过手工被转移成高密度形式，或者浮萍植株、结节、悬浮细胞或原生质体的转移可以通过本领域已知的方法而自动化。
本发明提供了制备浮萍结节培养物的方法，所述浮萍结节培养物利用自动化步骤可以容易地被操纵。方法包括打散较大的浮萍结节制成浮萍“微结节”培养物。“微结节”是指尺寸足够小的浮萍结节，利用自动的液体处理器的喷嘴，它们能被吸起或打散。在一些实施方案中，自动液体处理器或自动液体处理器吸管头被改造，以扩大圆筒及吸头口的尺寸，以便使微结节能自由地出入吸管头。打散浮萍结节制备微结节的任何方法可以应用，包括机械法、酶法，或在促使微结节形成的条件下培养浮萍的方法。在一个实施方案中，微结节培养物可以通过把浮萍结节挤压透过一层或多层网眼筛而制得。在一些特别的实施方案中，30个网眼筛被应用。微结节然后可以被转移至高密度形式平板或其它容器中。微结节的浓度可以被调节，以使高密度形式平板或容器的大多数孔只发生一次转化事件。本发明的微结节表现了与没有打散成小块的浮萍结节中观察到的相似的叶再生效率。
在本发明的一些实施方案中，浮萍被含有测试核苷酸序列的核酸分子转化。在一些特殊的实施方案中，测试核苷酸序列被包含于具有有效地与该测试核苷酸序列连接在一起的转录起始区域的表达盒中。转录起始区域(如启动子)可以是宿主本身的，或与宿主是同源的、外源的或异源的，或者可能是自然发生的序列或合成创造出来的序列。对于外源的转录起始区域，它是指转录起始区域在待导入该转录起始区域的野生型宿主中不存在.
本领域中已知的任何合适的启动子都可以根据本发明被使用(包括细菌的、酵母的、真菌的、昆虫的、哺乳动物的及植物的启动子)。例如，植物启动子，包括浮萍启动子，可以被应用。作为范例的启动子包括，但不仅限于，花椰菜花叶病毒35S启动子、冠瘿碱合成酶启动子(如nos、mas、ocs等)、泛素启动子、肌动蛋白启动子、核酮糖二磷酸(RubP)羧化酶小亚基启动子及醇脱氢酶启动子。浮萍RubP羧化酶小亚基启动子在本领域中是已知的(Silverthrone等人(1990)Plant Mol.Biol.15：49)。其它的来源于能感染植物(优选浮萍)的病毒的启动子也是适用的，包括，但不仅限于，从芋花叶病毒、小球藻病毒(如小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶启动子；Mitra等人(1994)Plant Mol.Biol.26：85)、番茄斑萎病毒、烟草脆裂病毒、烟草坏死病毒、烟草环斑病毒、番茄环斑病毒、黄瓜花叶病毒、花生残干病毒(peanut stump virus)、苜蓿花叶病毒、sugarcane baciliform badnavirus等等中分离出来的启动子。
最后，启动子可以被选择来给出期望水平的调节。例如，在某些例子中，使用组成型表达的启动子(例如，根癌农杆菌的甘露碱合成酶启动子)可能是有利的。作为选择地，在其它情形下，使用能应答特殊环境刺激(如，热休克基因启动子、干旱诱导型基因启动子、病原体诱导型基因启动子、创伤诱导型基因启动子及光/黑暗诱导型基因启动子)或植物生长调节因子(如，能被脱落酸、植物生长素、细胞分裂素及赤霉素诱导的基因的启动子)而被激活的启动子可能是有利的。作为进一步的选择，可以选择组织特异性表达的启动子(如，根、叶及花特异性启动子)。
一个给定启动子的总体强度能通过与顺式核苷酸序列(如上游激活序列)的结合和空间组织而被影响。例如，由根癌农杆菌章鱼碱合成酶基因衍生而来的激活核苷酸序列能增强根癌农杆菌甘露碱合成酶启动子的转录(参见Gelvin等人的美国专利5,955,646)。在本发明中，表达盒能含有插入启动子序列上游的激活核苷酸序列，以增强测试核苷酸序列的表达。在一个实施方案中，表达盒包括三个有效地与衍生自根癌农杆菌甘露碱合成 酶基因的启动子相连的衍生自根癌农杆菌章鱼碱合成酶基因的上游激活序列(参见美国专利5,955,646，此处引用作为参考)。
表达盒可以另外地包括在植物中起作用的转录和翻译终止区域。本领域中已知的任何合适的终止序列都可以根据本发明被使用。终止区域可以与转录起始区域天然相关，也可以与目的核苷酸序列天然相关，或者可以衍生自其它来源。方便合适的终止区域可以从根癌农杆菌的Ti-质粒中得到，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶的终止区域。也见于Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.262：141；Proudfoot(1991)Cell 64：671；Sanfacon等人(1991)Genes.Dev.5：141；Mogen等人(1990)Plant Cell 2：1261；Munroe等人(1990)Gene 91：151；Ballas等人(1989)Nucleic Acids Res.17：7891；及Joshi等人(1987)NucleicAcids Res.15：9627。另外的范例性终止序列是豌豆RubP羧化酶小亚基终止序列及花椰菜花叶病毒35S终止序列。其它的合适的终止序列对于本领域技术人员是显而易见的。
表达盒可以包含一个以上的将被转移并在被转化植物中表达的基因或核酸序列。因此，每段核酸序列都有效地与5’和3’调节序列相连。可选择的，也可提供多个表达盒。
一般地，表达盒会包含选择标记基因，以便筛选被转化的细胞或组织。选择标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如那些编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予除草剂化合物抗性的基因。除草剂抗性基因一般编码对除草剂不敏感的被修饰的靶蛋白，或者编码一种酶，该酶在除草剂在植物中起作用之前降解或去除除草剂的毒性。参见DeBlock等人(1987)EMBOJ.6：2513；DeBlock等人(1989)Plant Physiol.91：691；Fromm等人(1990)BioTechnology 8：833；Gordon-Kamm等人(1990)Plant Cell2：603。例如针对glyphosphate和磺酰脲除草剂的抗性已经利用编码突变靶酶-5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)和乙酰乳酸合成酶(ALS)的基因而被获得.针对草铵膦、溴苯腈(boromoxynil)及2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的抗性已经利用编码能分别解除所述除草剂毒性的膦丝菌素乙酰转移酶、腈水解酶或2，4-二氯苯氧乙酸单加氧酶的细菌基因而获得。
在本发明中，选择标记基因包括，但不局限于，编码以下的基因：新霉素磷酸转移酶II(Fraley等人(1986)CRC Critical Reviews in PlantScience 4：1)；氨腈水合酶(Marier-Greiner等人(1991)Proc..Natl.Acad.Sci.USA 88：4250)；天冬氨酸激酶；二氢吡啶二羧酸(dihydrodipicolinate)合成酶(Perl等人(1993)Bio Technology 11：715)；bar基因(Toki等人(1992)Plant Physiol.100：1503；Meagher等人(1996)Crop Sci.36：1367)；色氨酸脱羧酶(Goddijn等人(1993)Plant Mol.Biol.22：907)；新霉素磷酸转移酶(NEO；Southern等人(1982)J.Mol.Appl.Gen.1：327)；潮霉素磷酸转移酶(HPT或HYG；Shimizu等人(1986)Mol.Cell.Biol.6：1074)；二氢叶酸还原酶(DHFR；Kwok等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：4552)；膦丝菌素乙酰转移酶(DeBlock等人(1 987)EMBO J.6：2513)；2，2-二氯丙酸脱卤素酶(Buchanan-Wollatron等人(1989)J.Cell.Biochem.13D：330)；乙酰羟酸合成酶(Anderson等人的美国专利第4761373号；Haughn等人(1988)Mol.Gen.Genet.221：266)；5-烯醇丙酮酰莽草酸磷酸合成酶(aroA；Comai等人(1985)Nature 317：741)；卤芳基腈水解酶(Stalker等人WO 87/04181)；乙酰辅酶A羧化酶(Parker等人(1990)Plant Physiol.92：1220)；二氢蝶酸(dihydropteroate)合成酶(sulI；Guerineau等人(1990)Plant Mol.Biol.15：127)；及32kDa光系统II多肽(psbA；Hirschberg等人(1983)Science 222：1346(1983)。
也包括编码对庆大霉素(Carrer等人(1991)Plant Mol.Biol.17：301-303)；氯霉素(Herrera-Estrella等人(1983)EMBO J.2：987)；氨甲喋呤(Herrera-Estrella等人(1983)Nature 303：209；Meijer等人(1991)Plant Mol.Biol.16：807)；潮霉素(Waldron等人(1985)Plant.Mol.Biol.5：103；Zhijian等人(1995)Plant Science 108：219；Meijer等人(1991)Plant Mol.Biol.16：807)；链霉素(Jones等人(1987)Mol.Gen.Genet.210：86)；壮观霉素(Bretagne-Sagnard等人(1996)Transgenic Res.5：131)；博来霉素(Hille等人(1986)Plant Mol.Biol.7：171)；磺胺(Guerineau等人(1990)Plant Mol.Biol.15：127)；溴苯腈(Stalker等人(1988)Science 242：419)；2，4-D(Streber等人(1989)BioTechnology 7：811)；及膦丝菌素(DeBlock等人(1987)EMBO J.6：2513)产生抗性的基因。
Bar基因赋予对草铵膦型除草剂，例如膦丝菌素(PPT)或双丙氨酰膦等等的除草剂抗性。上文已指出，其它能用于载体构建体中的选择标记包括，但不局限于，也对双丙氨酰膦和膦丝菌素具有抗性的pat基因，对咪唑啉酮具有抗性的ALS基因，对潮霉素有抗性的HPH或HYG基因，对草甘膦有抗性的EPSP合成酶基因，对Hc-毒素有抗性的Hm1基因，及其它常规使用的本领域普通技术人员所知的选择试剂。参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506；Christopherson等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314；Yao等人(1992)Cell 71：63；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419；Barkley等人(1980)The Operon 177-220；Hu等人(1987)Cell 48：555；Brown等人(1987)Cell 49：603；Figge等人(1988)Cell 52：713；Deuschle等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5400；Fuerst等人(1989)Proc.Natl. Acad.Sci.USA 86：2549；Deuschle等人(1990)Science 248：480；Labow等人(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343；Zambretti等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3952；Baim等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072；Wyborski等人(1991)Nuc.Acids Res.19：4647；Hillenand-Wissman(1989)Topics in Mol.And Struc.Biol.10：143；Degenkolb等人(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591；Kleinschnidt等人(1988)Biochemistry 27：1094；Gatz等人(1992)Plant J.2：397；Gossen等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547；Oliva等人(1992)Antimicrob.Agents.Chemother.36：913；Hlavka等人(1 985)Handbook of Experimental Pharmacology 78；和Gill等人(1988)Nature 334：721).这些公开文献此处引用作为参考。
以上的选择标记基因的罗列并不意味着是限制性的。任何选择标记基因都可用于本发明。
包含有测试核苷酸序列的表达盒被转化入浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物或浮萍原生质体细胞培养物。被转化的浮萍然后经再生和检测以确定测试核苷酸序列是否有目的生物学功能。已经认识到可以操纵浮萍系统来确定测试核苷酸的功能。
在某一实施方案中，目的生物学功能是调节目的生物或生理反应的能力。生物反应可以是任何反应，包括对温度变化的反应、对日长变化的反应、对水势变化的反应、对光水平变化的反应、对病原体暴露的反应(包括暴露于真菌病原体、病毒、类病毒、线虫、昆虫害虫及细菌病原体)、对毒素暴露的反应(如暴露于高水平的盐、包括重金属的金属、除草剂或其它扰乱重要生理功能的物质)、对植物激素的反应、对植物生长调节因子的反应或者对任何环境干扰的反应。
为了鉴定目的核酸分子(例如编码调节目的反应的多肽的核苷酸序列)，测定了包含有测试核苷酸序列的浮萍的反应。在一些实施方案中，将包含有该测试核苷酸序列的浮萍的反应与不含有这段测试核苷酸序列的浮萍的反应作比较。反应可以通过任何一种表型(包括如生长速率)的变化被测定出来。能检测出来的反应差别表明该测试核苷酸序列是目的核酸分子。目的核酸分子(例如能编码调节目的反应的多肽)然后可以通过把生物反应方面具有可检测差异的转基因浮萍株系与作为该测试核苷酸序列来源的大肠杆菌(E.Coli)或农杆菌株系关联起来的方法而被容易地鉴定出来。
生长速率可以通过本领域已知的任何方法得到确定；例如通过湿重或干重、或含氮量。浮萍培养物可以生长在选择性的或限制性的条件下。此处用到的“选择性的”或“限制性的”生长条件指的是这样一种条件，在此条件下未转化浮萍的生长速率与在最适条件下的生长速率相比降低了。选择性的生长条件的例子包括限制性的光水平、限制性的pH条件或者限制生长的病原体或毒素的存在。
在一些实施方案中，目的核酸分子是编码具有目的生物学功能的多肽的核苷酸序列。目的生物学功能可以是任何生物学功能，例如，赋予结构或机械特性的能力、结合特定底物的能力、结合特定配体的能力、结合特定受体的能力或者催化特定反应的能力。在一些例子中，由测试核苷酸序列编码的多肽是分泌性的，浮萍培养物的培养基可以被移至一个分离的容器而检验目的生物学功能，例如，特定的结构性质、特定的生化活性、或者与特定配体、底物或其它试剂形成复合物的能力。当由测试核苷酸序列编码的多肽保留在浮萍组织中时，可以破碎组织、提取蛋白，并测定具有目的生物学功能的多肽的表达。在一些实施方案中，破碎、提取和/或测定步骤是自动化的。
在一些实施方案中，具有目的生物学功能的多肽是天然多肽的变体，并且具有目的生物学功能的多肽与天然多肽相比，其至少一种性质发生了变化。制造这些变体的方法在本领域中是已知的，本文别处还有所述及。参见，实验部分的实施例2。具有目的生物学功能的多肽(即变体)与天然多肽有差别的性质可以是任何目的性质，包括，但不局限于，结构性质、结合底物的能力、结合配体的能力、催化目的反应的能力、超越生物学范围的条件下起作用的能力，或者调节生物反应的能力。有目的性质的多肽可根据以上所述得以鉴定识别。
每个浮萍培养物样品都可以用一种核酸制品来转化，该核酸制品包含有单一原始核苷酸序列的序列变体。另外一种情况下，每种样品可以用异质核酸制品来转化，这种异质核酸制品包含有几种测试核苷酸序列。每个浮萍培养物可以使用约3、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90或约100个测试核苷酸序列。在这一方法中，包含具有目的生物学功能的核苷酸序列的测试核苷酸序列集合需经过一或多轮再分和筛选，以鉴定单一的目的核酸分子。在每一方法中，被筛选的测试核苷酸序列的总数可能是至少1或更多、至少10或更多、至少100或更多、至少1,000或更多、至少10,000或更多、至少100,000或更多、至少500,000或更多，或者至少1000,000或更多。
本发明的一些实施方案中，目的核酸分子通过用报告核苷酸序列在该报告核苷酸序列整合入浮萍DNA的条件下转化浮萍植株培养物，浮萍结节培养物，浮萍悬浮培养物或浮萍原生质体细胞培养物而被鉴定出来。报告核苷酸序列含有报告多肽的编码序列。报告多肽可以是本领域中任何已知的，包括，但不局限于，β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)，萤光素酶，氯霉素乙酰转移酶(CAT)，或绿色荧光蛋白(GFP)。检测每种报告多肽的方法在本领域中也是已知的。
在一些实施方案中，报告核苷酸序列缺少转录起始核苷酸序列。在其他实施方案中，报告核苷酸序列包括转录起始核苷酸序列。转录起始核苷酸序列可以是本领域中任何已知的，包括那些本文述及的。在一些实施方案中，转录起始序列是一段最小启动子序列。当报告核苷酸序列被整合入浮萍DNA，并进而有效地与增强子序列连接在一起时，这允许对作为转录增强子的核苷酸序列的鉴定。
报告核苷酸序列可能包含上述的某一选择标记，以有助于转基因植物的筛选。本领域中任何已知的选择标记都可被应用。
报告核苷酸序列也包括允许它整合入浮萍DNA的核苷酸序列。在一个实施方案中，这些核苷酸序列是转移DNA(T-DNA)序列。这些序列是为所有有毒力的农杆菌菌株所含有的大Ti(肿瘤诱导性的)质粒的片段。在一个实施方案中，发现于T-DNA序列边界的不完全同向重复序列被插入报告核苷酸序列的5’和3’末端。本发明的T-DNA核苷酸序列优选包括至少一个T-DNA重复序列。参见，例如WO 93/17116，此处引用作为参考。
T-区域向植物细胞的转移由Ti质粒的另一段区域-Vir(毒力)区域介导(见综述Zambryski(1988)Annu Rev.Genet.22：1-30；Zambryski等人(1989)Cell 56：193-201，及Baron和Zambryski(1996)Curr.Biol.6：1567-1569)。所需的Vir区域可能被反式提供，例如在二元质粒系统的第二个质粒上。参见，例如Hoekema等人(1983)Nature 310：115-120及Bevan(1984)Nucl.Acids Res.22：8711-8721。在其他的实施方案中，包含待转移的DNA的载体通过三亲交配或电穿孔方法被导入农杆菌，并且同源重组发生在这个载体与受体Ti质粒之间。
要求保护的方法提供了各种目的核酸分子的鉴定。在一个实施方案中，目的核酸分子作为启动子或增强子调节靶核苷酸序列的转录。因此，这些方法可以用来鉴定参与针对目的刺激的生物反应的启动子和增强子。目的刺激的非限制性的例子包括光的变化、温度变化、水势变化、日长变化、植物激素水平变化、植物生长调节因子水平的变化、对病原体的暴露及对毒素的暴露。为了鉴定参与对刺激作出生物反应的核酸分子，包含有整合的核苷酸序列的浮萍培养物被暴露给刺激，并且报告多肽的表达被确定。在那些报告核苷酸序列已整合入浮萍DNA并进而有效地与被刺激激活的启动子或增强子相连的情况下，报告多肽的表达可以被检测到。报告核苷酸序列的整合位点可以利用报告核苷酸序列的节段(portions)作为标记而被鉴定，也因而能鉴定在对刺激做出反应的过程中起调节活性的核苷酸序列。
本发明的方法可以用于鉴定调节靶核苷酸序列以组织特异性方式进行转录的核苷酸序列。转基因浮萍株系被筛选以鉴定那些只在特定浮萍组织(例如根、茎、花、种子或叶)中表达报告多肽的株系。目的核酸分子然后可以如上所述地被鉴定出来。
调节靶核苷酸序列(例如报告核苷酸序列)翻译的核酸分子包括那些提高转录效率的，比如位于靶核苷酸序列5’非翻译区的前导序列(例如促进核糖体结合的序列)，以及那些提高mRNA稳定性的。这些核苷酸序列可位于一个基因可转录部位之内的任何位置，包括转录本的5’非翻译区，基因内含子区域内，及转录本的3’非翻译区。当报告核苷酸序列整合入基因可转录位点之内时，这些序列可以被鉴定出来。调节的翻译效应通过检测报告多肽的表达而被探测到。在上述转录调节序列中已述及，调节翻译的核苷酸序列可以被特定刺激调控。因此，对目的刺激做出反应的报告多肽的表达可以被探测，以鉴定在对刺激做出反应过程中被激活的调节核苷酸序列。
在一些实施方案中，报告核苷酸序列整合入浮萍DNA，从而有效地与一个基因的编码序列相连，这个编码序列的表达(即转录和/或翻译)受目的刺激的调控。编码报告多肽的核苷酸序列可以与被调控基因一起转录和翻译而形成嵌合多肽，该嵌合多肽能利用与鉴定报告多肽相同的技术被检测出来。对目的刺激作出反应的嵌合多肽的表达可以用于鉴定转基因浮萍株系，该株系中报告核苷酸序列有效地与被调控基因(即目的核酸分子)相连。参见，Springer(2000)Plant Cell 12：1007-1020，此处引用作为参考。
实验
下面提供的例子是为了作为例证，而不是作为限制。
实施例1：高密度形式的浮萍转化和再生
利用液体培养基
在以前所描述的实验中，浮萍的培养是在固体培养基上进行的。本实验的目的是试验浮萍能否被培养于被液体培养基饱和的多孔支持物上。这将使浮萍转化、筛选和再生步骤易于自动化并且证明浮萍系统可用于核苷酸序列的高通量筛选。
用GUS表达构建体通过如下所述的农杆菌介导的转化方法转化浮萍结节培养物(来自Lemna minor株C016)。
用于GUS表达构建体的表达载体是pBMSP-3。这个表达载体源自美国专利第5,955,646号所描述的pBMSP-1，所述文献在此处引用作为参考。pBMSP-3转录盒包含三个拷贝的来源于根癌农杆菌章鱼碱合成酶的转录激活核苷酸序列和另一个来源于根癌农杆菌甘露碱合成酶基因的转录激活核苷酸序列，一个来源于根癌农杆菌甘露碱合成酶基因的启动子区域，用于插入编码目的多肽的核苷酸序列的多接头位点，以及来源于根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止序列。这个表达载体也包括编码新霉素磷酸转移酶II的核苷酸序列作为选择标记。选择标记序列的转录由来源于根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因的启动子驱动。pBMSP-3另外还包含与玉米醇脱氢酶基因(GenBank AccessionNumber X04049)1222-1775核苷酸相对应的核苷酸序列，其插入于启动子和多接头之间。为构建应用于这个实施例的GUS表达构建体，GUS编码序列和卡那霉素抗性基因被插入pBMSP-3表达载体。
用GUS表达构建体转化的根癌农杆菌菌株Egs05被培养于含有500mg/L链霉素，50mg/L壮观霉素和50mg/L卡那霉素硫酸盐的YEB培养基上(1g/L酵母抽提物，5g/L牛肉膏，5g/L蛋白胨，5g/L蔗糖，0.5g/L MgSO4)。
用于转化的浮萍结节培养物按下述方法制备。分离浮萍叶，用无菌刀片割下根，叶腹面朝下放置于pH5.6的Murashige-Skoog培养基上(目录号M-5519；Sigma化学试剂公司，St.Louis，MO)，该培养基补加有5uM 2，4-二氯苯氧乙酸，0.5uM 1-苯基-3(1，2，3-噻二唑-5-基)脲thidiazuron(Sigma P6186)，3％蔗糖，0.4％Difco Bacto-琼脂(FisherScientific)，和0.15％脱乙酰吉兰糖胶(Sigma)。培养叶5-6周。这时结节(小的淡黄色的细胞团)通常从腹面中央部分出现。把这些结节组织块(平均大小3-6mg)从母体叶上分离出来并培养于补加了3％蔗糖，0.4％Difco Bacto-琼脂，1uM 2，4-二氯苯氧乙酸和2uM苄基腺嘌呤的Murashige-Skoog培养基上。
浮萍结节培养物按如下所述进行转化。合适的根癌农杆菌菌株被培养于含有50ug/L卡那霉素和100uM乙酰丁香酮的YEB琼脂平板上，将完全长成的平板重悬于100ml补加了0.6M甘露醇和100uM乙酰丁香酮的Murashige-Skoog培养基中。结节培养物组织通过浸入重悬细菌溶液中1-2分钟而被接种，将培养物组织吸干一下以除去多余液体，并放置在由Murashige-Skoog培养基构成的共培养培养基上。Murashige-Skoog培养基中补加了优化的以促进结节生长的植物生长素和细胞分裂素以及100uM乙酰丁香酮。结节培养物然后在黑暗条件下被培育2天。
为了筛选，转移结节培养物至琼脂平板(处理1，参见下文)或用聚乙烯支持物改造的24孔板(处理2，见下文)，这在2001年5月30日提交的美国临时专利申请编号60/294,430及2002年5月28日提交的题目为“高通量筛选的平板和方法”的美国实用专利申请中被描述。为了制备聚乙烯支持(玻璃料)的24孔板，亲水聚乙烯(1/16英寸厚)被剪成适合24孔板的尺寸，并且为了培养基的更换在中间钻一个孔。这些玻璃料经高压灭菌，干燥后放入24孔板中，光面朝上。这些玻璃料用560ul pH值为5.6、补加了3％蔗糖，1uM 2，4-二氯苯氧乙酸，2uM苄基腺嘌呤及下面处理中一种的Murashige-Skoog培养基湿润。
处理1：(琼脂平板)200mg/L卡那霉素硫酸盐和500mg/L头孢噻肟
处理2：(24孔板)200mg/L卡那霉素硫酸盐和500mg/L头孢噻肟
然后在连续光照(20-40uM/m2.sec)条件下培养4天。在第4天，处理1中被转化的结节培养物被转移至含有0.5×Schenk-Hildebrandt培养基和3％蔗糖，200mg/L卡那霉素硫酸盐及500mg/L头孢噻肟的琼脂平板。对于处理2中的结节培养物，12个孔的培养基被换成含有3％蔗糖，200mg/L卡那霉素和500mg/L头孢噻肟的0.5×Schenk-Hildebrandt培养基，剩下12孔的培养基换成含有200mg/L卡那霉素和300mg/L氯化鲸蜡基吡啶鎓的0.5×Schenk-Hildebrandt培养基。将这些结节培养物培育在完全光照条件下，6天后，取自几个样品的组织被染色以检测GUS表达。结果如下：
Figure C0281260600241
Figure C0281260600251
将结节培养物培育另外的7周并检测浮萍叶的再生。用头孢噻肟培养的来自处理2孔的结果如下所示：
    样品     再生所需周数     GUS染色
    1     无再生叶     N/D
    2     10周     N/D
    3     7周     阳性
    4     无再生叶     N/D
    5     13周     阳性
    6     13周     阳性
    7     9周     阳性
    8     8周     阳性
    9     9周     阳性
    10     13周     阴性
    11     13周     阴性
    12     无再生叶     N/D
本实验的转化效率至少达50％。可以观察到生长在聚乙烯支持物上的浮萍培养物长出再生叶快于长在琼脂平板上的浮萍培养物，并且转化效率要更高。因此，除了证明浮萍可以用液体培养基培养外，这个实验也表明用聚乙烯支持物培养浮萍提高了转化效率，而缩短了长出转基因浮萍株系所需的时间。这些发现证明浮萍系统为核苷酸序列的基于整个植株的筛选提供了有价值的方法。
实施例2：高密度形式的浮萍转化和再生
利用卡那霉素作为选择标记
本实施例中，表达载体、农杆菌菌株及浮萍结节培养物均如实施例1所述。用于本实验中的结节组织为2周龄。共培养按照实施例1所述进行。为了去除污染和筛选，结节培养物被转至含有pH5.6Murashige-Skoog培养基加上3％蔗糖，1uM-2，4-二氯苯氧乙酸，2uM苄基腺嘌呤，500mg/L头孢噻肟和200mg/L卡那霉素硫酸盐的聚乙烯支持物改造的24孔板中。
在接下来的一天，24孔板中的培养基按如下所述进行交换。清除旧的培养基，加入200ul新鲜培养基。弃去多余的培养基。加入另外的200ul培养基，然后按所述除去。再加入另外的200μl培养基。如果培养基漫过聚乙烯支持物水平以上，除去过量培养基。
第二天，24孔板中的培养基如上述方法被替换。培养基然后要每两天更换，约持续另外的2周。在这时候，结节培养物的生长被检测。24孔中的20个含有活的愈伤细胞。
随后，结节培养物被维持在含有3％蔗糖，200mg/L卡那霉素和500mg/L头孢噻肟的0.5×Schenk-Hildebrandt培养基中，培养基每两天进行更换，持续约4周，然后一周更换一次，持续另外的4周。在转移至Schenk-Hildebrandt培养基之后约一周，对5个孔中的细胞进行染色以检测GUS表达。结果如下：
    样品数目     染色
    1   大、小GUS<sup>+</sup>斑块
    4   大、小GUS<sup>+</sup>斑块
    8   大、小GUS<sup>+</sup>斑块
    18   约25％的愈伤细胞是GUS<sup>+</sup>
    21   大的GUS<sup>+</sup>斑块
筛选8周后，浮萍培养物表现出三种生长模式。16％的培养物表现快速生长，所在孔几乎完全充满着浮萍叶；62％的培养物表现出中等生长，所在孔的大约半边充满浮萍叶，12％的样品表现慢速生长，所在孔少于半边充满浮萍叶。
筛选11周后，24个浮萍培养物中的18个含有再生叶，表现出的整体转化效率大于75％。
实施例3：高密度形式的浮萍转化和再生
利用G418作为筛选标记。
本实验的目的是为了试验进一步提高浮萍转化效率并减少转基因浮萍株系再生所需时间的方法。
本实施例中，表达载体和农杆菌株系如实施例1中所述。浮萍结节来自于L.minor株8627。结节培养物的制备基本如实施例1所述，除了以下几点不同：一些结节组织样品被培养于补加了3％蔗糖，0.4％Difco-Bacto-琼脂，1uM 2，4-二氯苯氧乙酸和2uM苄基腺嘌呤的Murashige-Skoog培养基中(作为“对照”样品)以及一些结节组织被培养于包含有相同添加物的0.5×S chenk-Hildebrandt培养基中(作为“预处理”样品)。
共培养如实施例1中所述进行。为了去除污染并筛选，结节培养物被转移至包含560ul/孔 pH5.6的Murashige-Skoog培养基(用聚乙烯支持物改造)和3％蔗糖，1uM 2，4-二氯苯氧乙酸，2uM苄基腺嘌呤，500mg/L头孢噻肟和浓度为25mg/L、50mg/L、100mg/L或200mg/L的G418。
浮萍培养基的更换如实施例2中所述进行。G418提供了强大的选择压力，以至于未被转化的愈伤组织在筛选三周后被杀死。大量的再生浮萍叶在筛选仅6周后被观察到。8周后，所确定的转化效率如下所示：
处理 得到的转基因株的数目(出自12株) 转化率(％)
    G418-25     8     66
    G418-50     10     83
    G418-100(预处理)     10     83
    G418-100(对照)     9     75
    G418-200     9     75
这个实施例证明可以应用本发明的方法在少至6周内得到转基因浮萍株，转化效率大于80％。
实施例4：鉴定具有目的生物学功能的蛋白变体
下面的实施例的目的是鉴定天然发生多肽的变体，所述变体至少有一种性质不同于天然发生的多肽。
为了产生变体，多肽编码序列要经历饱和诱变以产生一个核苷酸序列群体，其中每一个核苷酸序列都编码原始被编码多肽的一个氨基酸变体。这些方法在本领域中是已知的，并且在例如美国专利第6,096,548、6,117,679、6,132,970、6,165,793及6,180,406号中有所描述；此处引用作为参考。
为了鉴定编码具有目的特性的变体的核苷酸序列，变体核苷酸序列群体按上述方法得到，并被克隆入农杆菌二元载体，然后转化大肠杆菌。从这个文库中大约能挑选5,000-10,000个克隆，相应的质粒利用电穿孔方法被转化入农杆菌。单个的农杆菌克隆被挑选以用于浮萍转化，该过程可采用本领域中已知的自动化克隆挑选技术(参见，例如，Uber等人(1991)Biotechniques 11(5)：642-647及Watson等人(1992)Nucleic Acids Res.20：4599-4606，此处引用作为参考)。
单个克隆的农杆菌制品被加入24孔板的孔中(每个农杆菌克隆可加入到1、2或3个孔中)，为了处理浮萍培养物，24孔板通过在每一孔中加入滤器支持物而被特殊改造(参见2001年5月30日提交的美国临时专利申请序列号60/294,430及2002年5月28日提交的题目为“高通量筛选的平板和方法”的美国实用专利申请，此处引用作为参考)，然后浮萍植株、浮萍结节或浮萍悬浮细胞被加入每个孔中。共培养、筛选和再生步骤如前面实施例所述在特殊改造的24孔板中进行。所有的液体转移都利用自动的平板处理和液体处理流程进行。
再生之后，检测转基因浮萍植株中具有目的特性的多肽变体的表达。在一些例子中，原始编码的多肽含有指令其分泌的序列。在这些情况下，培养基被从转基因浮萍去除，然后被检测以确定具有目的特性的变体多肽的存在。这些检测通过本领域中已熟知的高通量筛选方法被执行。
在那些多肽在浮萍组织内部表达的例子中，自动化技术被应用以破损浮萍组织并提取被表达多肽。提取物然后被检测以确定具有目的特性的变体多肽的存在。
如果包含表达目的变体浮萍的孔含有多种转基因株系，这个孔中的叶被分离成单一个体然后被检测以确定哪个个体株系表达具有目的特性的变体多肽。
实施例5：在浮萍中筛选cDNA表达文库
这个实施例的目的是筛选以确定调节目的生物反应的核苷酸序列。
cDNA表达文库通过电穿孔法被转化入农杆菌，并且农杆菌培养物从单个克隆得到并维持在1534孔板中。被转化的农杆菌按照前面实施例中所述方法与浮萍培养物共培养。转基因浮萍植株按已述方法得到再生，然后检测它们对环境干扰变化(例如温度变化、日长、水势变化、光水平变化、病原体暴露及毒素暴露)的反应。转基因浮萍细胞株系的单一集合可以用于筛选参与许多不同反应的被编码蛋白。
在本说明书中提及的所有出版物和专利申请都显示着本发明相关领域技术人员的水平。所有出版物和专利申请此处被相同程度地引用作为参考，就像每个出版物或专利申请都被特别地、各自地被引用作为参考。
虽然为了理解透彻，前文的发明已通过说明和实施例被详细描述，但很明显，在附加的权利要求范围内，可以实施某些改变和修改。

Claims (39)

1.鉴定目的核酸分子的高通量方法，该方法包括以下步骤：
(a)用测试核苷酸序列转化浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物，或浮萍原生质体细胞培养物，其中所述测试核苷酸序列包含多肽的编码序列；
(b)在所述测试核苷酸序列所编码的多肽能表达的条件下培养所述浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物或浮萍原生质体细胞培养物；以及
(c)确定所述测试核苷酸序列所编码的多肽是否调节生物反应，其中将编码调节生物反应的多肽的测试核苷酸序列鉴定为目的核酸序列；
其中步骤(a)和(b)在同一高密度形式平板或容器中进行。
2.权利要求1的方法，其中所述生物反应选自：对温度变化的反应、对日长变化的反应、对水势变化的反应、对光水平变化的反应、对暴露于病原体的反应、对暴露于毒素的反应、对植物激素的反应，或者对植物生长调节因子的反应。
3.权利要求1的方法，其中转化了目的核酸分子的浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物或者浮萍原生质体细胞培养物的生长速率与未转化有目的核酸分子的浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物，或浮萍原生质体细胞培养物的生长速率相比发生了变化，并且所述多肽调节生物反应的能力通过确定转化了上述测试核苷酸序列的浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物、或浮萍原生质体细胞培养物的生长速率而得到确定。
4.权利要求3的方法，其中在选择性的生长条件下转化有目的核酸分子的浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物，或浮萍原生质体细胞培养物的生长速率与在相同选择性的生长条件下未转化有目的核酸分子的浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物，或浮萍原生质体细胞培养物的生长速率相比得到了提高，并且转化有测试核苷酸序列的浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物，或浮萍原生质体细胞培养物的生长速率在选择性生长条件下被确定。
5.权利要求3的方法，其中在选择性的生长条件下转化有目的核酸分子的浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物，或浮萍原生质体细胞培养物的生长速率与在相同选择性的生长条件下未转化有目的核酸分子的浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物，或浮萍原生质体细胞培养物的生长速率相比得到了降低，并且转化有测试核苷酸序列的浮萍植株培养物，浮萍结节培养物，浮萍悬浮培养物，或浮萍原生质体细胞培养物的生长速率在选择性生长条件下被确定。
6.权利要求4的方法，其中选择性生长条件包括下面至少一项：高盐、限制性光水平、限制性pH、病原体的存在，及毒素的存在。
7.权利要求1的方法，其中浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物，或浮萍原生质体细胞培养物通过接种包含有所述测试核苷酸序列的农杆菌而被转化。
8.权利要求1的方法，其中浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物，或浮萍原生质体细胞培养物通过微弹轰击法被转化。
9.权利要求1的方法，其中浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物，或浮萍原生质体细胞培养物通过电穿孔法被转化。
10.权利要求1的方法，其中浮萍原生质体细胞培养物被转化了，并且转化方法是聚乙二醇介导的转化法。
11.权利要求1的方法，其中浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物，或浮萍原生质体细胞培养物选自紫萍属，芜萍属，Wolfiella属和浮萍属。
12.权利要求11的方法，其中所述浮萍植株或浮萍结节选自Lemna minor、Lemna miniscula、Lemna aequinocitalis及Lemnagibba。
13.权利要求1的方法，其中所述多肽调节生物反应的能力通过生化检测法来确定。
14.权利要求1的方法，其中所述多肽调节生物反应的能力通过生理检测法来确定。
15.权利要求1的方法，其中所述多肽调节生物反应的能力通过表型变化来确定。
16.权利要求1的方法，其中调节生物反应的所述多肽具有物质的结合位点，并且通过检测调节生物反应的所述多肽和所述物质之间复合物的形成来确定调节目的生物反应的所述多肽的存在。
17.权利要求5的方法，其中所述选择性生长条件包括下列至少一项：高盐、限制性光水平、限制性pH、病原体的存在和毒素的存在。
18.鉴定目的核酸分子的高通量方法，该方法包括以下步骤：
(a)目的核酸分子通过用报告核苷酸序列在该报告核苷酸序列被整合入浮萍植株培养物，浮萍结节培养物，浮萍悬浮培养物，或浮萍原生质体细胞培养物的DNA中的条件下被转化入浮萍植株培养物，浮萍结节培养物，浮萍悬浮培养物，或浮萍原生质体细胞培养物；
(b)确定该报告核苷酸序列是否与目的核酸分子有效地相连。
19.权利要求18的方法，其中目的核酸分子调节报告核苷酸序列的表达。
20.权利要求19的方法，其中目的核酸分子调节靶核苷酸序列的转录。
21.权利要求20的方法，其中目的核酸分子具有选自下列的活性：
(a)提高报告核苷酸序列转录水平的能力；
(b)降低报告核苷酸序列转录水平的能力；和
(c)调节报告核苷酸序列转录的组织特异性的能力。
22.权利要求20的方法，其中目的核酸分子具有选自下列的活性：
(a)应激于目的刺激时，提高报告核苷酸序列转录水平的能力；
(b)应激于目的刺激时，降低报告核苷酸序列转录水平的能力；
(c)应激于目的刺激时，调节报告核苷酸序列转录的组织特异性的能力。
23.权利要求22的方法，其中所述目的刺激选自：光水平变化、温度变化、水势变化、日长变化、pH变化、植物激素水平的变化、植物生长调节因子水平的变化、暴露于病原体和暴露于毒素。
24.权利要求19的方法，其中核酸分子调节报告核苷酸序列的翻译。
25.权利要求24的方法，其中核酸分子具有选自下列的活性：
(a)提高报告核苷酸序列稳定性的能力；
(b)降低报告核苷酸序列稳定性的能力；
(c)提高报告核苷酸序列翻译效率的能力；以及
(d)降低报告核苷酸序列翻译效率的能力。
26.权利要求24的方法，其中所述核酸分子具有选自下列的活性：
(a)应激于目的刺激时，提高报告核苷酸序列稳定性的能力；
(b)应激于目的刺激时，降低报告核苷酸序列稳定性的能力；
(c)应激于目的刺激时，提高报告核苷酸序列翻译效率的能力；以及
(d)应激于目的刺激时，降低报告核苷酸序列翻译效率的能力。
27.权利要求26的方法，其中所述目的刺激选自：光水平变化、温度变化、水势变化、日长变化、pH变化、植物激素水平的变化、植物生长调节因子水平的变化、暴露于病原体和暴露于毒素。
28.权利要求24的方法，其中报告核苷酸序列是信使RNA。
29.权利要求18的方法，其中所述目的核酸分子选自启动子核苷酸序列、增强子核苷酸序列、前导核苷酸序列、终止子核苷酸序列及内含子核苷酸序列。
30.权利要求18的方法，其中所述报告核苷酸序列包括一段或多段促进其整合入浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物或浮萍原生质体细胞培养物的DNA的核苷酸序列。
31.权利要求30的方法，其中所述促进报告核苷酸序列整合入浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物或浮萍原生质体细胞培养物的DNA的核苷酸序列包含至少一个T-DNA衍生的核苷酸序列。
32.权利要求31的方法，其中所述报告核苷酸序列包含编码报告多肽的核苷酸序列，并且报告多肽的表达被检测以确定报告核苷酸序列是否有效地与目的核酸分子相连。
33.权利要求32的方法，其中所述报告多肽选自GUS、CAT、萤光素酶及GFP。
34.权利要求18的方法，其中浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物或浮萍原生质体细胞培养物通过接种含有所述报告核苷酸序列的农杆菌而被转化。
35.权利要求18的方法，其中浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物或浮萍原生质体细胞培养物通过微弹轰击法被转化。
36.权利要求18的方法，其中浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物或浮萍原生质体细胞培养物通过电穿孔法被转化。
37.权利要求18的方法，其中浮萍原生质体细胞培养物被转化了，并且转化方法是聚乙二醇介导的转化。
38.权利要求18的方法，其中浮萍植株培养物、浮萍结节培养物、浮萍悬浮培养物或浮萍原生质体细胞培养物选自紫萍属、芜萍属、Wolfiella属以及浮萍属。
39.权利要求38的方法，其中所述浮萍植株或浮萍结节选自Lemna minor、Lemna miniscula、Lemna aequinocitalis及Lemna gibba。
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7622573B2 (en) * 2006-01-17 2009-11-24 Biolex, Inc. Expression control elements from the lemnaceae family
AU2007292890A1 (en) 2006-09-05 2008-03-13 Medarex, Inc. Antibodies to bone morphogenic proteins and receptors therefor and methods for their use
RU2515110C2 (ru) * 2007-12-21 2014-05-10 Киджин Н.В. Улучшенный способ мутагенеза с использованием полиэтиленгликоль-опосредованного введения мутагенных нуклеиновых оснований в растительные протопласты
MY159543A (en) 2008-11-28 2017-01-13 Merial Inc Recombinant avian influenza vaccine and uses thereof
WO2010138631A1 (en) 2009-05-26 2010-12-02 Biolex Therapeutics, Inc. Compositions and methods for production of aglycosylated plasminogen
EP3213766A1 (en) 2009-12-28 2017-09-06 Merial Ltd. Recombinant ndv antigen and uses thereof
CA2792117C (en) 2010-03-12 2016-09-20 Merial Limited Foot and mouth disease virus recombinant vaccines and uses thereof
EP2611925B1 (en) 2010-08-30 2017-11-29 Dow AgroSciences LLC Sugarcane bacilliform viral (scbv) enhancer and its use in plant functional genomics
WO2013130813A1 (en) 2012-02-29 2013-09-06 Dow Agrosciences Llc Sugarcane bacilliform viral (scbv) enhancer and its use in plant functional genomics
KR101282980B1 (ko) * 2013-01-09 2013-07-08 박상오 주문식 맞춤형 애완동물 사료의 온라인 판매 방법
CN107964530B (zh) * 2016-10-19 2019-08-27 天津师范大学 浮萍原生质体制备方法
CN107964531B (zh) * 2016-10-19 2019-08-27 天津师范大学 浮萍活体原生质体制备方法
CN106834433A (zh) * 2016-12-05 2017-06-13 浙江海洋大学 利用特异性引物对紫背浮萍Sp10微卫星标记检测的方法
RU2740004C1 (ru) * 2019-09-05 2020-12-30 Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Биоорганической Химии Им. Академиков М.М. Шемякина И Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук Способ скрининга регуляторов роста растений и комплект скрининга, основанный на заявленном способе

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5792931A (en) * 1994-08-12 1998-08-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Fumonisin detoxification compositions and methods
US6040498A (en) * 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US6096546A (en) * 1998-01-30 2000-08-01 Board Of Trustees, Rutgers, The State University Of New Jersey Methods for recovering polypeptides from plants and portions thereof
CN1272762A (zh) * 1997-08-12 2000-11-08 北卡罗莱纳州立大学 基因工程浮萍

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3762909A (en) * 1971-06-10 1973-10-02 Steel Corpus Phosphorus borate glass frits as plant micro nutrient carriers
JPH086445Y2 (ja) * 1991-03-08 1996-02-28 積水化成品工業株式会社 水耕栽培用栽培物保持器
USH1919H (en) * 1995-12-01 2000-11-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Agricultural product microscreen method and apparatus
AU4570397A (en) 1997-10-10 1999-05-03 Yeda Research And Development Co. Ltd. Transgenic lemnaceae

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5792931A (en) * 1994-08-12 1998-08-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Fumonisin detoxification compositions and methods
CN1272762A (zh) * 1997-08-12 2000-11-08 北卡罗莱纳州立大学 基因工程浮萍
US6096546A (en) * 1998-01-30 2000-08-01 Board Of Trustees, Rutgers, The State University Of New Jersey Methods for recovering polypeptides from plants and portions thereof
US6040498A (en) * 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed

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