CN100391984C - 具有高谷胱甘肽过氧化物酶活性的含碲透明质酸的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明的具有高谷胱甘肽过氧化物酶活性的含碲透明质酸的制备方法属于制备具有GPX活性的人工酶的方法。工艺过程有透明质酸的活化、碲氢化钠的制备、透明质酸的碲化反应、碲化透明质酸的氧化和后处理。先用对甲苯磺酰氯活化透明质酸，制得透明质酸苯磺酰酯，在蒸馏水中透析；将碲粉和硼氢化钠加入无水乙醇，在通氮气体系加热回流，再加入无氧冰醋酸，制得碲氢化钠的乙醇溶液；再用碲氢化钠的乙醇溶液与透明质酸苯磺酰酯水溶液反应，生成含-TeH的透明质酸；最后反应体系暴露在空气中氧化离心、乙醇沉淀，洗涤。本发明制备的含碲透明质酸，具有更高的抗氧化活性和GPX活性；并且工艺简单，产率高，产品易纯化，可大量生产。

Description

具有高谷胱甘肽过氧化物酶活性的含碲透明质酸的制备方法

技术领域

本发明属于生物化学领域，涉及制备具有较高谷胱甘肽过氧化物酶活性的人工酶的方法，具体而言，本发明涉及碲化透明质酸的化学制备方法。

背景技术

透明质酸有很强的保水作用；在化妆品中能起到增稠和稳定的作用；在皮肤中可清除活性氧自由基，起到防晒作用。因此，透明质酸在化妆品领域中有诸多方面的应用。透明质酸及其衍生物又作为基础药物与各类治疗药物组成的复方制剂中的载体，把不同的治疗药物导向并保留在人体的病理部位，使药物作用到更精确的靶位上，大大增加疗效的同时，避免了药物的全身性副作用。以透明质酸为载体的抗癌靶向药物如：透明质酸-氟尿嘧啶，透明质酸-二氯灭痛等，已经进入了三期临床阶段。

碲属于类金属元素，碲醇具有较高分解氢过氧化物的能力。无机碲的毒性很小。对有机碲研究表明其生物学作用类似于谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性。碲酵母菌产生的亚碲氨酸可作为抗癌剂应用到临床治疗中。有机碲化物(AS101)具有抑制白血病细胞增殖作用，增加脾细胞NK活性，提高外周血白细胞吞噬功能及氧化杀菌能力。

谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)在机体的活性氧代谢中具有防止畸变、预防衰老及参与前列腺素合成等重要生理作用。理论上人源GPX应是最有效的抗氧化药物，但由于来源极其有限；从动物中提取GPX不能完全解决来源有限、价格昂贵的弊端。于是，人们开始应用化学合成法人工模拟GPX酶。如中国专利03119444.3公开了环糊精衍生物在化妆品中的应用，但与透明质酸比较，环糊精为小分子化合物，缺乏化妆品应具有的保湿和营养作用，而且不具有润滑性和增稠性。中国专利03119443.5公开了环糊精衍生物的药物用途及其药物组合物，但与透明质酸比较，环糊精不具备靶向性药物载体的作用，而且以环糊精为底物合成的含硒化合物应用于临床治疗，具有副作用大，药物疗效低的特点。

与本发明相近的现有技术是中国专利03127134.0公开的，名称为“化学修饰法制备具有谷胱甘肽过氧化物酶活性的含硒透明质酸化合物”，介绍了采用简单的化学合成法，制备含硒透明质酸的方法，硒化后的透明质酸具有较高的GPX活性，而且还具有较好的抗氧化活性。所说的含硒透明质酸为硒和透明质酸的化合物。其制备工艺为：NaHSe与透明质酸水溶液进行硒化反应生成含-she的透明质酸；反应结束后将反应体系暴露于空气中氧化，除去过量的硒；产物经乙醇沉淀、离心，收集沉淀，用乙醇、丙酮反复洗涤，挥去有机溶剂，样品冷冻干燥，得含硒透明质酸纯品。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种简单工艺，以NaHTe作为修饰剂，修饰透明质酸分子中的-OH部位，制备具有GPX活性及抗氧化活性的含碲透明质酸。

本发明的含碲透明质酸为碲和透明质酸的化合物。含碲透明质酸为淡黄色粉末状物。所含碲价态为-1价。GPX活性为80.2～174.2U/umol。

本发明的具有谷胱甘肽过氧化物酶活性的含碲透明质酸化合物的制备工艺过程有透明质酸的活化、碲氢化钠(NaHTe)的制备、透明质酸的碲化反应、碲化透明质酸的氧化、后处理。所说的透明质酸的活化，用对甲苯磺酰氯活化透明质酸，制备出透明质酸苯磺酰酯，再在蒸馏水中透析；所说的碲氢化钠的制备，所说的碲氢化钠的制备，是将碲粉和硼氢化钠加入无水乙醇，在密闭体系反应，得到碲氢化钠的乙醇溶液；所说的透明质酸的碲化反应，是用碲氢化钠的乙醇溶液与透明质酸苯磺酰酯水溶液反应，生成含-TeH的透明质酸。所说的碲化透明质酸的氧化，是将生成含-TeH的透明质酸反应体系暴露在空气中氧化；所说的后处理，是产物经离心、乙醇沉淀，离心收集沉淀，分别用乙醇和丙酮反复洗涤，挥去有机溶剂，样品冷冻干燥，得到含碲透明质酸纯品。

与背景技术相比，原料使用了碲氢化钠，增加了透明质酸的活化过程。碲化透明质酸的氧化和后处理过程与背景技术的相应过程相同。

碲氢化钠的制备的具体过程，是将碲粉和硼氢化钠加入无水乙醇，在通氮气使体系保持无氧条件下加热回流0.6～1.5小时，冷却至室温再加入无氧冰醋酸，加热至沸腾，有黑色沉淀产生，得到碲氢化钠的乙醇溶液。碲氢化钠的制备可以参考《合成化学》第4卷第1期(1996)P73～75的文章，题目是“碲氢化钠存在于3-氧代硫代羧酸酯的一步合成法”。

透明质酸的活化具体过程，是将透明质酸溶于NaOH溶液中，室温滴加浓度为0.4g/ml的对甲苯磺酰氯(p-TsCL)乙腈溶液，使体系的pH＞12.5，滴加完毕经搅拌再用HCl调至中性，加入甲醇，滤去不溶物，减压蒸去甲醇在5℃环境下析出盐，滤去不溶物，制得透明质酸苯磺酰酯，再在蒸馏水中透析1～3天，备用。透明质酸与对甲苯磺酰氯用量的质量比为1∶2～5。

透明质酸的碲化反应的具体过程，是将透明质酸苯磺酰酯用水溶解至浓度为8～15mg/ml，通氮气使反应体系在惰性环境下加入碲氢化钠醇溶液，密闭反应体系并置于30～70℃水浴中，反应12～60小时。透明质酸苯磺酰酯与NaHTe的用量摩尔比为1∶1000～15000，其最佳摩尔比为1∶5000。

本发明的有益效果是：

本发明的方法制备的含碲透明质酸，具有较原透明质酸更高的抗氧化活性，还增添了GPX活性。含碲透明质酸的理化性质稳定。并且，碲与硒属于同一主族元素，他们具有相同的氧化还原特性，且碲醇更易分解氢过氧化物。无机碲的毒性明显小于无机硒的毒性。含碲透明质酸作为药物或化妆品的添加剂可以克服天然GPX的不稳定，来源有限，分子量大会引起人体免疫反应等缺点。因此，含碲透明质酸在化妆品领域和医药领域有巨大应用潜力。含碲透明质酸国内外未见报道，本发明合成了含碲透明质酸，为酶的模拟物开发提供了一条新的思路。

透明质酸作为主要的生产原料，可通过生物体内提取和微生物发酵大量制备，这就很好的解决了成本高的问题。对甲苯磺酰氯是较为廉价的活化剂，以该物质活化透明质酸，碲化后纯化产物，这样就简化了产品的制备、分离提纯等步骤，使模拟物的成本大大降低，而生物活性较环糊精碲化产物提高近4倍。因此，本发明的含碲透明质酸的制备工艺简单，合成步骤少，产率高，产品易纯化，可大量生产。

具体实施方式

实施例1含碲透明质酸的合成路线：

(1)透明质酸苯磺酰酯的制备

取2.0g透明质酸溶于80ml NaOH(0.15mol/L)溶液中，室温滴加p-TsCL的乙腈溶液(8.0g/20ml)滴加过程中不断加入1mol/L的NaOH使溶液pH＞12.5，3小时滴加完毕再搅拌1小时，用1mol/LHCl调至中性，加入100ml甲醇，滤去不溶物，减压蒸去甲醇至80ml，放入5℃冰箱，八天后有盐析出，滤去不溶物，在蒸馏水中透析2天，备用。

(2)碲氢化钠(NaHTe)的制备

将2.54g碲粉、1.8g硼氢化钠加入40ml无水乙醇，有气体产生，并伴随有热量放出。通氮气数分钟使体系保持无氧。小火加热回流约1小时，冷却至室温，加入2.4ml无氧冰醋酸，加热至沸腾。有黑色沉淀产生，溶液呈无色透明。冷却后，溶液即可使用。

(3)将活化的透明质酸苯磺酰酯用水充分溶解至浓度为10mg/ml，取100ml该水溶液在容器中通高纯氮气25分钟，保证反应体系的惰性环境，将制备好的碲氢化钠醇溶液迅速加入该容器中，迅速密闭反应体系，防止碲氢化钠被氧化，开始碲化反应。

将碲化反应体系置于60℃水浴中，反应48小时。

(4)透明质酸碲化反应后，产物充分暴露于空气中，使过量的碲氢化钠充分氧化。用12000rpm离心10分钟，收取含有碲化透明质酸黄色上清液。

(5)将碲化透明质酸用1mol/L的NaOH调pH值至7.0。用乙醇将含碲透明质酸沉淀，收集沉淀，经乙醇、丙酮反复洗涤后，冷却干燥，得含碲透明质酸纯品。

实施例2碲化透明质酸活性的测定

1、碲化透明质酸的GPX活性

测活体系500ul，含50mmol/L磷酸钾缓冲液，pH7.0、1mmol/L叠氮钠。1mmol/L谷胱甘肽，0.25mmol/L辅酶(NADPH)，1U谷胱甘肽还原酶，加入0.5mmol/L过氧化氢启动反应，在340nm处监测NADPH被氧化的吸光度变化。测定酶活时，以蒸馏水代替含碲多糖作为空白对照。酶活力单位定义为每分钟每微摩尔含碲多糖消耗1微摩尔NADPH为一个活力单位。最终测定在上述条件下得到的含碲多糖的比活力为174.2U/umol。

2、碲化透明质酸的抗氧化活性研究

测活体系为3ml，取用上述制备的碲化透明质酸溶液100ul，加入2ml蒸馏水，依次加入20mmol/L的水杨酸钠300ul，0.5mmol/L的硫酸亚铁300ul，最后加入60mmol/L的过氧化氢300ul，将反应体系在32℃的水浴中反应1小时后，在752分光光度计上测定其在510nm处的吸光度值。测定活力时以蒸馏水代替糖溶液作参比，以相同浓度的纯透明质酸水溶液代替糖溶液作对照，最终测定其抗-OH的活性在15ug/ml时的抑制率达到81％，是未经修饰的透明质酸的460多倍。

实施例3活化条件对产物GPX活力的影响

按实施例1的工艺过程，只是将透明质酸与对甲苯磺酰氯用量的质量比分别为1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5。对得到的含碲透明质酸按实施例2的检测方法分别测得其GPX活力，结果为62.5，91.3，130.5，174.2，178.3U/umol。除了1∶1的配比外，结果均大于背景技术的75.2U/umol的结果。最终得到在活化过程中，透明质酸与对甲苯磺酰氯最佳质量比为1∶4，其产物含碲透明质酸兼具GPX活力高和对甲苯磺酰氯利用率高的特点。

实施例4碲化条件对产物GPX活力的影响

按实施例1的工艺过程，只是将透明质酸苯磺酰酯用水溶解至不同浓度，浓度分别为，5mg/ml，8mg/ml，10mg/ml，12mg/ml，15mg/ml。取100ml该水溶液进行碲化反应，对得到的含碲透明质酸按实施例2的检测方法测得其GPX活力分别为51.3，95.6，135.7，174.2，152.3。透明质酸苯磺酰酯的水溶液浓度除了5mg/ml比外，GPX活力结果均大于背景技术的结果。最后得到在透明质酸苯磺酰酯水溶液最佳浓度为10mg/ml时，其产物含碲透明质酸兼具GPX活力高和溶解性好的特点。

将10mg/ml的透明质酸苯磺酰酯与NaHTe的用量摩尔比分别配制成1∶1000，1∶2500，1∶5000，1∶10000，1∶15000，用不同的透明质酸苯磺酰酯与NaHTe用量摩尔比按实施例1的工艺过程进行碲化反应，对得到的含碲透明质酸按实施例2的检测方法测得其GPX活力分别为120.1，140.3，171.5，178.2，180.2。上述比例的结果均好于背景技术。在活化的透明质酸苯磺酰酯与碲氢化钠的用量摩尔比为1∶5000时为最佳配比，其产物含碲透明质酸兼具GPX活力高和碲利用率高的特点。

将10mg/ml的活化的透明质酸苯磺酰酯进行碲化，反应时间分别为12，24，36，48，60小时，用不同的透明质酸碲化时间按实施例1的工艺过程进行碲化反应，产品按实施例2的检测方法测得其GPX活力分别为80.2，110.3，140.8，174.5，176.3。上述反应时间的结果均好于背景技术。并确定透明质酸碲化反应最佳时间为48小时，其产物含碲透明质酸具有GPX活力高的特点。

将10mg/ml的活化的透明质酸苯磺酰酯进行碲化，反应温度分别为20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，用不同的透明质酸碲化温度按实施例1的工艺进行碲化反应，所得含碲透明质酸按实施例2方法测得其GPX活力分别为40.1，76.1，90.5，135.8，172.5，176.1。可以确定透明质酸碲化反应温度在30～70℃均能达到本发明的效果。并且可以确定透明质酸碲化反应最佳温度为60℃，其产物含碲透明质酸兼具GPX活力高和透明质酸降解程度小的特点。

Claims (3)

1.一种具有高谷胱甘肽过氧化物酶活性的含碲透明质酸的制备方法，工艺过程有碲化透明质酸的氧化、后处理；所说的碲化透明质酸的氧化，是将生成含-TeH的透明质酸反应体系暴露在空气中氧化；所说的后处理，是产物经离心、乙醇沉淀，离心收集沉淀，分别用乙醇和丙酮反复洗涤，挥去有机溶剂，样品冷冻干燥，得到含碲透明质酸纯品；其特征在于，在碲化透明质酸的氧化之前，有透明质酸的活化、碲氢化钠的制备、透明质酸的碲化反应的工艺过程；所说的透明质酸的活化，用对甲苯磺酰氯活化透明质酸，制备出透明质酸苯磺酰酯，再在蒸馏水中透析；所说的碲氢化钠的制备，是将碲粉和硼氢化钠加入无水乙醇，在密闭体系反应，得到碲氢化钠的乙醇溶液；所说的透明质酸的碲化反应，是用碲氢化钠的乙醇溶液与透明质酸苯磺酰酯水溶液反应，生成含-TeH的透明质酸。

2.按照权利要求1所述的具有高谷胱甘肽过氧化物酶活性的含碲透明质酸的制备方法，其特征在于，所说的透明质酸的活化，是将透明质酸溶于NaOH溶液中，室温滴加浓度为0.4g/ml的对甲苯磺酰氯乙腈溶液，使体系的pH＞12.5，滴加完毕经搅拌再用HCl调至中性，加入甲醇，滤去不溶物，减压蒸去甲醇，在5℃环境下析出盐，滤去不溶物，制得透明质酸苯磺酰酯，再在蒸馏水中透析1～3天；透明质酸与对甲苯磺酰氯用量的质量比为1∶2～5。

3.按照权利要求1或2所述的具有高谷胱甘肽过氧化物酶活性的含碲透明质酸的制备方法，其特征在于，所说的透明质酸的碲化反应，是将透明质酸苯磺酰酯用水溶解至浓度为8～15mg/ml，通氮气使反应体系在惰性环境下加入碲氢化钠醇溶液，密闭反应体系并置于30～70℃水浴中，反应12～60小时；透明质酸苯磺酰酯与碲氢化钠的用量摩尔比为1∶1000～15000。