CN100387715C - 构建串联重复顺式作用元件的方法及其专用引物与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种构建串联重复顺式作用元件的方法及其专用引物与应用，其目的是提供一种用于扩增多拷贝、方向相同的顺式作用元件的串联重复序列的引物对，以及提供一种应用该引物对构建串联重复顺式作用元件的方法，将该方法构建的多拷贝、方向相同的顺式作用元件的串联重复序列连接到Pmin基本启动子的上游形成酵母单杂交系统的报告子。该构建报告子的方法快速、准确，不仅能控制串联顺式作用元件的个数，而且可以使顺式作用元件按同一个方向串联，减少了筛选报告子所需要的时间和费用，简化了构建酵母单杂交系统报告子的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种构建串联重复顺式作用元件的方法及其专用引物与应用，特别涉及一种构建串联重复顺式作用元件的方法及其专用引物与在构建酵母单杂交系统报告子中的应用。
背景技术
近年来酵母单杂交系统已经被广泛应用于克隆和鉴定各种动植物的转录因子。酵母单杂交系统是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报告基因表达的原理来克隆编码目的转录因子的基因(cDNA)(原理如图1)。该方法也是在细胞内分析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效方法。在酵母单杂交系统中，构建带有不同DNA顺式作用元件的报告子是建立筛选不同转录因子的酵母单杂交系统的关键。报告子的结构是将已知的特定顺式作用元件构建到最基本的启动子(minimal promoter，Pmin)上游，Pmin启动子下游连接报告基因。进行cDNA融合表达文库筛选时，编码目的转录因子的cDNA融合表达载体被转化进入酵母细胞后，目的转录因子与特定顺式作用元件结合就可以激活Pmin启动子，并促使报告基因表达。根据报告基因的表达，筛选出与已知顺式作用元件结合的转录因子，从而克隆编码目的转录因子的基因。在构建报告子的过程中，为了提高筛选的效率(即转录因子与顺式作用元件的识别率)，需要在Pmin启动子上游构建三个或三个以上方向相同的顺式作用元件的重复序列。目前，构建这种重复序列的方法主要是随机串联的方法，首先合成扩增特定顺式作用元件的引物，在两个引物的外侧增加一个相同的限制性内切酶的识别位点，通过PCR扩增一个顺式作用元件，经过酶切处理使扩增产物末端露出粘性末端，然后使用T4 DNA连接酶将露出粘性末端的顺式作用元件随机串联起来，由于片段两端的粘性末端相同，所以串联产物的长短和串联片段的方向无法控制，大部分只连接成两个顺式作用元件，少数可以连接成三个或四个顺式作用元件(机率约为2％)，而且串联的顺式作用元件的方向必须相同才有效果，因此采用这种方法构建报告子费时、费力，筛选报告子的费用也比较高。除此之外还有一种方法，首先通过PCR的方法在一个顺式作用元件的两侧分别引入BamHI和BglII两个限制性内切酶位点，PCR产物经过酶切处理后在两侧分别产生BamHI和BglII的粘性末端，在经过酶切处理的PCR产物中加入T4 DNA连接酶进行多聚体串联，与上一种方法不同的是在连接体系中加入少量BamHI和BglII两个限制性内切酶，BamHI和BglII两个酶是同尾酶，当BamHI的粘性末端与BglII的粘性末端连接后将不会被这两种酶再切开，而当BamHI的粘性末端与BamHI的粘性末端连接后由于连接产物中有BamHI所以连接好的片段将重新被切开，利用这个原理可以保证顺式作用元件按照相同的方向串联起来，减少了筛选报告子所需要的时间和费用。但是这种方法添加限制性内切酶的量不易掌握，而且将串联产物(通过高温灭活内切酶)与载体相连的时候还要加入连接酶，这时由于还有顺式作用元件的片段存在，还是有可能连上方向相反的顺式作用元件，因此这种方法也不是十分准确。目前急需一种快速、准确的方法构建多拷贝、方向相同的顺式作用元件序列。
发明创造内容
本发明的目的是提供一种用于扩增多拷贝方向相同的顺式作用元件的串联重复序列的的引物对。
本发明所提供的用于扩增多拷贝方向相同的顺式作用元件的串联重复序列的的引物对：上游引物包括5’端的一个限制性内切酶a的酶切位点序列及连接于所述限制性内切酶a酶切位点序列的3’端的能扩增目的顺式作用元件全序列的引物序列；下游引物包括5’端的至少两个串连的限制性内切酶c和b的酶切位点序列及连接于所述限制性内切酶b的酶切位点序列的3’端的能扩增目的顺式作用元件全序列的引物序列，所述限制性内切酶b的酶切位点序列位于所述能扩增目的顺式作用元件全序列的引物序列和所述限制性内切酶c的酶切位点序列之间；，所述限制性内切酶a和所述限制性内切酶b互为同尾酶。
所述同尾酶常用的为BamHI和BglII；SpeI和NheI，XbaI；Sau3AI和MboI，BamHI，BglII，XhoII，BclII，NdeII；SalI和XhoI；PstI和NsiI。
本发明的第二个目的是提供一种构建串联重复顺式作用元件的方法，该方法可构建多拷贝、方向相同的顺式作用元件的串联重复序列。
本发明所提供的构建串联重复顺式作用元件的方法，包括以下步骤：
1)构建引物对，所述引物对为：上游引物包括5’端的一个限制性内切酶a的酶切位点序列及连接于所述限制性内切酶a酶切位点序列的3’端的能扩增目的顺式作用元件全序列的引物序列；下游引物包括5’端的至少两个串连的限制性内切酶c和b的酶切位点序列及连接于所述限制性内切酶b的酶切位点序列的3’端的能扩增目的顺式作用元件全序列的引物序列，所述限制性内切酶b的酶切位点序列位于所述能扩增目的顺式作用元件全序列的引物序列和所述限制性内切酶c的酶切位点序列之间，所述限制性内切酶a和所述限制性内切酶b互为同尾酶；
2)采用步骤1)中设计的引物对，PCR扩增目的顺式作用元件，得到含有限制性内切酶a，b和c的酶切位点序列的目的顺式作用元件；
3)分别用所述限制性内切酶a和c酶切所述步骤2)中得到的含有限制性内切酶a，b和c的酶切位点序列的目的顺式作用元件和在多克隆位点包括限制内切酶a和c的酶切位点序列的载体A，用连接酶将含有所述目的顺式元件的酶切片段连接到所述经酶切的限制内切酶a和c的酶切位点序列之间，得到含有一个所述目的顺式作用元件的载体B；
4)重复步骤2)，得到含有限制性内切酶a，b和c的酶切位点序列的目的顺式作用元件；
5)用所述限制性内切酶b和c酶切所述载体B，用所述限制性内切酶a和c酶切步骤4)得到的含有限制性内切酶a，b和c的酶切位点序列的目的顺式作用元件，用连接酶将含有所述目的顺式元件的酶切片段连接到所述载体B的限制内切酶b和c的酶切位点序列之间，得到含有两个方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列的载体C；
6)按上述原理经扩增、酶切及连接可得到所需数量且方向相同的目的顺式作用元件的串联重复序列的载体F；
7)用限制性内切酶a和c酶切步骤6)中得到的载体F，得到所需数量且方向相同的目的顺式作用元件的串联重复序列。
在实际应用中，三个方向相同的目的顺式作用元件的串联重复序列可以按照以下两种方法得到，第一种方法为：在得到含有两个方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列的载体C之后，用所述限制性内切酶b和c酶切所述载体C，用所述限制性内切酶a和c酶切步骤4)或步骤2)得到的含有限制性内切酶a，b和c的酶切位点序列的目的顺式作用元件，用连接酶将含有所述目的顺式元件的酶切片段连接到所述载体C的限制内切酶b和c的酶切位点序列之间，得到含有三个方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列的载体D。第二种方法为：在得到含有两个方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列的载体C之后，用所述限制性内切酶b和c酶切所述载体B，用所述限制性内切酶a和c酶切PCR扩增得到的所述载体C中所含有的两个方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列，用连接酶将含有两个方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列的酶切片段连接到所述载体B的限制内切酶b和c的酶切位点序列之间，得到含有三个方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列的载体D。
根据实际需要，所需数量方向相同的目的顺式作用元件的串联重复序列可以按照以下方法得到：用所述限制性内切酶b和c酶切含有偶数个或奇数个方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列的载体E，用所述限制性内切酶a和c酶切PCR扩增得到的所述载体E中所含有的偶数个或奇数个方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列，用连接酶将含有偶数个或奇数个方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列的酶切片段连接到所述载体E的限制内切酶b和c的酶切位点序列之间，得到含有偶数个或奇数个方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列的载体F。
本发明的第三个目的是提供一种构建酵母单杂交系统报告子的方法。
本发明所提供的构建酵母单杂交系统报告子的方法，是将含有所需数量的方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列连接到Pmin基本启动子的上游形成酵母单杂交系统的报告子；所述含有所需数量的方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列可通过以下步骤得到：1)构建引物对，所述引物对为：上游引物包括5’端的一个限制性内切酶a的酶切位点序列及连接于所述限制性内切酶a酶切位点序列的3’端的能扩增目的顺式作用元件全序列的引物序列；下游引物包括5’端的至少两个串连的限制性内切酶c和b的酶切位点序列及连接于所述限制性内切酶b的酶切位点序列的3’端的能扩增目的顺式作用元件全序列的引物序列，所述限制性内切酶b的酶切位点序列位于所述能扩增目的顺式作用元件全序列的引物序列和所述限制性内切酶c的酶切位点序列之间，所述限制性内切酶a和所述限制性内切酶b互为同尾酶；
2)采用步骤1)中设计的引物对，PCR扩增目的顺式作用元件，得到含有限制性内切酶a，b和c的酶切位点序列的目的顺式作用元件；
3)分别用所述限制性内切酶a和c酶切所述步骤2)中得到的含有限制性内切酶a，b和c的酶切位点序列的目的顺式作用元件和在多克隆位点包括限制内切酶a和c的酶切位点序列的载体A，用连接酶将含有所述目的顺式元件的酶切片段连接到所述经酶切的限制内切酶a和c的酶切位点序列之间，得到含有一个所述目的顺式作用元件的载体B；
4)重复步骤2)，得到含有限制性内切酶a，b和c的酶切位点序列的目的顺式作用元件；
5)用所述限制性内切酶b和c酶切所述载体B，用所述限制性内切酶a和c酶切步骤4)得到的含有限制性内切酶a，b和c的酶切位点序列的目的顺式作用元件，用连接酶将含有所述目的顺式元件的酶切片段连接到所述载体B的限制内切酶b和c的酶切位点序列之间，得到含有两个方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列的载体C；
6)按上述原理经扩增、酶切及连接可得到所需数量且方向相同的目的顺式作用元件的串联重复序列的载体F；
7)用限制性内切酶a和c酶切步骤6)中得到的载体F，得到所需数量且方向相同的目的顺式作用元件的串联重复序列。
其中，所述限制性内切酶a可为BamHI，所述限制性内切酶b可为BglII，所述限制性内切酶c可为SacI，所述载体A可为pBluesrcipt KS(+/-)。
为了解决现有的构建酵母单杂交系统报告子费时、筛选费用高的问题，本发明提供了一种用于扩增多拷贝、方向相同的顺式作用元件的串联重复序列的引物对，同时也提供了一种应用该引物对构建串联重复顺式作用元件的方法，将该方法构建的多拷贝、方向相同的顺式作用元件的串联重复序列连接到Pmin基本启动子的上游形成酵母单杂交系统的报告子。该构建报告子的方法快速、准确，不仅能控制串联顺式作用元件的个数，而且可以使顺式作用元件按同一个方向串联，减少了筛选报告子所需要的时间和费用，简化了构建酵母单杂交系统报告子的方法。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
附图说明
图1为酵母单杂交系统原理图
图2为带有所需数量的方向相同的DRE的串联重复序列的酵母单杂交系统报告子的构建过程示意图
图3为载体pKS-DRE2带有的两个DRE的PCR鉴定结果
图4为对带有两个DRE的载体pKS-DRE2进行测序鉴定的结果
图5为载体pKS-DRE3带有的三个DRE的PCR鉴定结果
图6为对带有三个DRE的载体pKS-DRE2进行测序鉴定的结果
具体实施方式
实施例1、带有所需数量的方向相同的DRE的串联重复序列的酵母单杂交系统报告子的构建
其构建过程如图2所示，图2中，BglII，SacI，BamHI，KpnI，ApaI，XhoI，SalI，ClaI，HindIII，EcoRV，EcoRI，PstI，SmaI，，SpeI，XbaI，NotI，SacII为限制性内切酶的名称；f1 origin和ColE1 origin为质粒的复制起点；T3 primer和T7primer为T3和T7引物；DRE为干旱反应元件；LacZ为半乳糖苷酶基因；Ampr为氨苄青霉素抗性基因；具体包括以下步骤：
1)设计扩增DRE的引物
DRE为干旱反应元件，其序列如序列表中的序列1所示。
设计可在DRE的5’端外侧增加BamHI位点，在3’端外侧增加BglII和SacI位点，且BhlII位点在内侧的引物。所设计的一对引物序列为
上游引物：5’＞TGCGGATCCCAGTTTGAAAGGAAAGGG＜3’和
下游引物：5’＞GTGAGCTCGCAGAGATCTTGCTTTTTGGAACTCATG＜3’
2)在DRE的5’端外侧增加BamHI位点，在3’端外侧增加BglII和SacI位点，且BglII位点在内侧
具体过程如下：
以人工合成的DRE元件为模板，在步骤1)中的5’端引物和3’端引物的引导下，按常规PCR程序扩增得到产物BamHI-DRE-BglII-SacI。
3)用BamHI和SacI分别酶切BamHI-DRE-BglII-SacI和pBluesrciptKS(+/-)，然后用T4 DNA连接酶将得到的含有DRE序列的酶切片段连接到载体pBluesrciptKS(+/-)多克隆位点的BamHI和SacI位点之间，得到载体pKS-DRE1。
4)用pKS-DRE1多克隆位点两侧的通用引物(T7和T3引物)扩增顺式作用元件BamHI-DRE-BglII-SacI，得到的扩增产物用BamHI和SacI进行酶切，同时，用BglII和SacI酶切已经连接了顺式作用元件的载体pKS-DRE1，由于BamHI和BglII是同尾酶，可以将扩增的顺式作用元件连接到载体pKS-DRE1上顺式作用元件的一侧，而且方向相同，这样就形成了含有两个方向相同的顺式作用元件的载体pKS-DRE2。
使用通用引物T3和T7 PCR扩增载体pKS-DRE2中含有的DRE的串联重复序列，结果如图3所示，表明重组子3、5、6包含两个DRE。图3中，1为100bp DNA Ladder；2为PCR阴性对照；3、5、6为两个DRE重组子；4为多聚DRE重组子。用常规方法对带有两个DRE的载体pKS-DRE2进行测序鉴定，结果如图4所示，表明两个方向相同的DRE顺式作用元件按预先的设计被串联起来，而且两侧的酶切位点和中间突变的BamHI位点与设计相符。图4中BamHI，BglII SacI为限制性酶切位点，图中粗线所示为两个串联的干旱反应元件(DRE)。
5)由于BamHI末端和BglII末端连接的产物不能被这两种酶再切开，可以通过相同的办法串联多个方向相同的顺式作用元件，而且为了提高效率可以用通用引物扩增多个顺式作用元件串联的片段连接到已经串联的顺式作用元件的一侧。
使用通用引物T3和T7 PCR扩增载体pKS-DRE3中含有的DRE的串联重复序列，结果如图5所示，表明重组子4、5包含三个DRE。图5中，1为100bp DNA Ladder；2为PCR阴性对照；4、5为带有3个DRE的重组子pKS-DRE3；3为不带有DRE的对照载体。用常规方法对带有三个DRE的载体pKS-DRE3进行测序鉴定，结果如图6所示，表明三个方向相同的DRE顺式作用元件按预先的设计被串联起来，而且两侧的酶切位点和中间突变的BamHI位点与设计相符。图6中BamHI，BglII，SacI为限制性酶切位点，图中粗线所示为三个串联的干旱反应元件(DRE)。
6)将多个顺式作用元件串联的片段连接到Pmin基本启动子的前面形成酵母单杂交系统的报告子。
序列表
<160>1
<210>1
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
cagtttgaaa ggaaagggaa aaaaagaaaa aataaataaa agatatacta ccgacatgag 60
ttccaaaaag ca 72
Claims (10)
1.一种用于扩增多拷贝方向相同的顺式作用元件的串联重复序列的引物对，上游引物包括5’端的一个限制性内切酶a的酶切位点序列及连接于所述限制性内切酶a酶切位点序列的3’端的能扩增目的顺式作用元件全序列的引物序列；下游引物包括5’端的至少两个串连的限制性内切酶c和b的酶切位点序列及连接于所述限制性内切酶b的酶切位点序列的3’端的能扩增目的顺式作用元件全序列的引物序列，所述限制性内切酶b的酶切位点序列位于所述能扩增目的顺式作用元件全序列的引物序列和所述限制性内切酶c的酶切位点序列之间，所述限制性内切酶a和所述限制性内切酶b互为同尾酶。
2.一种构建串联重复顺式作用元件的方法，包括以下步骤：
1)构建引物对，所述引物对为：上游引物包括5’端的一个限制性内切酶a的酶切位点序列及连接于所述限制性内切酶a酶切位点序列的3’端的能扩增目的顺式作用元件全序列的引物序列；下游引物包括5’端的至少两个串连的限制性内切酶c和b的酶切位点序列及连接于所述限制性内切酶b的酶切位点序列的3’端的能扩增目的顺式作用元件全序列的引物序列，所述限制性内切酶b的酶切位点序列位于所述能扩增目的顺式作用元件全序列的引物序列和所述限制性内切酶c的酶切位点序列之间，所述限制性内切酶a和所述限制性内切酶b互为同尾酶；
2)采用步骤1)中设计的引物对，PCR扩增目的顺式作用元件，得到含有限制性内切酶a，b和c的酶切位点序列的目的顺式作用元件；
3)分别用所述限制性内切酶a和c酶切所述步骤2)中得到的含有限制性内切酶a，b和c的酶切位点序列的目的顺式作用元件和在多克隆位点包括限制内切酶a和c的酶切位点序列的载体A，用连接酶将含有所述目的顺式元件的酶切片段连接到所述经酶切的载体A限制内切酶a和c的酶切位点序列之间，得到含有一个所述目的顺式作用元件的载体B；
4)重复步骤2)，得到含有限制性内切酶a，b和c的酶切位点序列的目的顺式作用元件；
5)用所述限制性内切酶b和c酶切所述载体B，用所述限制性内切酶a和c酶切步骤4)得到的含有限制性内切酶a，b和c的酶切位点序列的目的顺式作用元件，用连接酶将含有所述目的顺式元件的酶切片段连接到所述载体B的限制内切酶b和c的酶切位点序列之间，得到含有两个方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列的载体C；
6)按上述原理经扩增、酶切及连接可得到所需数量且方向相同的目的顺式作用元件的串联重复序列的载体F；
7)用限制性内切酶a和c酶切步骤6)中得到的载体F，得到所需数量且方向相同的目的顺式作用元件的串联重复序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法中得到含有两个方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列的载体C之后，用所述限制性内切酶b和c酶切所述载体C，用所述限制性内切酶a和c酶切步骤4)或步骤2)得到的含有限制性内切酶a，b和c的酶切位点序列的目的顺式作用元件，用连接酶将含有所述目的顺式元件的酶切片段连接到所述载体C的限制内切酶b和c的酶切位点序列之间，得到含有三个方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列的载体D。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法中得到含有两个方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列的载体C之后，用所述限制性内切酶b和c酶切所述载体B，用所述限制性内切酶a和c酶切PCR扩增得到的所述载体C中所含有的两个方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列，用连接酶将含有两个方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列的酶切片段连接到所述载体B的限制内切酶b和c的酶切位点序列之间，得到含有三个方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列的载体D。
5.根据权利要求2或3或4所述的方法，其特征在于：用所述限制性内切酶b和c酶切含有偶数个或奇数个方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列的载体E，用所述限制性内切酶a和c酶切PCR扩增得到的所述载体E中所含有的偶数个或奇数个方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列，用连接酶将含有偶数个或奇数个方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列的酶切片段连接到所述载体E的限制内切酶b和c的酶切位点序列之间，得到含有偶数个方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列的载体F。
6.一种构建酵母单杂交系统报告子的方法，是将含有所需数量的方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列连接到Pmin基本启动子的上游形成酵母单杂交系统的报告子；所述含有所需数量的方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列通过以下步骤得到：1)构建引物对，所述引物对为：上游引物包括5’端的一个限制性内切酶a的酶切位点序列及连接于所述限制性内切酶a酶切位点序列的3’端的能扩增目的顺式作用元件全序列的引物序列；下游引物包括5’端的至少两个串连的限制性内切酶c和b的酶切位点序列及连接于所述限制性内切酶b的酶切位点序列的3’端的能扩增目的顺式作用元件全序列的引物序列，所述限制性内切酶b的酶切位点序列位于所述能扩增目的顺式作用元件全序列的引物序列和所述限制性内切酶c的酶切位点序列之间，所述限制性内切酶a和所述限制性内切酶b互为同尾酶；
2)采用步骤1)中设计的引物对，PCR扩增目的顺式作用元件，得到含有限制性内切酶a，b和c的酶切位点序列的目的顺式作用元件；
3)分别用所述限制性内切酶a和c酶切所述步骤2)中得到的含有限制性内切酶a，b和c的酶切位点序列的目的顺式作用元件和在多克隆位点包括限制内切酶a和c的酶切位点序列的载体A，用连接酶将含有所述目的顺式元件的酶切片段连接到所述经酶切的限制内切酶a和c的酶切位点序列之间，得到含有一个所述目的顺式作用元件的载体B；
4)重复步骤2)，得到含有限制性内切酶a，b和c的酶切位点序列的目的顺式作用元件；
5)用所述限制性内切酶b和c酶切所述载体B，用所述限制性内切酶a和c酶切步骤4)得到的含有限制性内切酶a，b和c的酶切位点序列的目的顺式作用元件，用连接酶将含有所述目的顺式元件的酶切片段连接到所述载体B的限制内切酶b和c的酶切位点序列之间，得到含有两个方向相同的所述目的顺式作用元件的串联重复序列的载体C；
6)按上述原理经扩增、酶切及连接可得到所需数量且方向相同的目的顺式作用元件的串联重复序列的载体F；
7)用限制性内切酶a和c酶切步骤6)中得到的载体F，得到所需数量且方向相同的目的顺式作用元件的串联重复序列。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述限制性内切酶a为BamHI，所述限制性内切酶b为BglII，所述限制性内切酶c为SacI，所述载体A为pBluesrciptKS(+/-)。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述目的顺式作用元件为干旱反应元件DRE。
9.权利要求1所述的引物对在构建酵母单杂交系统报告子中的应用。
10.权利要求2所述的构建串联重复顺式作用元件的方法在构建酵母单杂交系统报告子中的应用。
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