CN100384862C

CN100384862C - α-选择性糖基化反应方法

Info

Publication number: CN100384862C
Application number: CNB2004800140567A
Authority: CN
Inventors: 安藤弘宗; 今村彰宏; 木曾真; 石田秀治
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2003-05-22
Filing date: 2004-05-19
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2024-05-19
Also published as: EP1626053B1; WO2004104163A2; JPWO2004104163A1; JP4599295B2; US8148505B2; WO2004104163A3; EP1626053A2; CN1795199A; US20060122379A1; EP1626053A4

Abstract

本发明涉及在作为单糖、或者二糖以上的低聚糖或糖链的还原末端的、6碳糖以上的糖结构体的4位和6位的羟基上，环状地形成甲硅烷基乙缩醛结构的保护基团，在此基础上，通过在该糖结构体和上述醇性羟基或硫羟基之间进行糖基化反应，以高比率得到含有α-糖苷的糖结构体糖苷的α-选择性糖基化反应方法。通过以上的构成，能够用简单且方便的方法实现糖结构体中的高度选择性α-糖基化反应。

Description

α-选择性糖基化反应方法

技术领域

本发明涉及α-选择性糖基化反应方法，更具体而言，涉及具有半乳糖及其他一定基本结构的糖结构体或其衍生物化合物、或者在还原末端具有这些糖结构体或衍生物化合物的二糖或二糖以上的低聚糖乃至糖链中的选择性α-糖基化反应方法。

背景技术

近年来，迎来了后染色体组(post-genome)时代，作为多细胞生物、尤其是高等生物的细胞内外的膜成分以及细胞外分子而存在的含糖链高分子，因与其在生物体内的功能的关系，而尤其受人关注。作为含糖链高分子的代表性一例，可举出糖蛋白。

虽然有一定的例外，但以人为首的大多数动物的细胞表面膜或血清蛋白的大部分为糖蛋白。抗体、受体、激素、酶等也大多不是单纯的蛋白质，而是糖蛋白。而且，以往关于这些糖蛋白在生物体内的功能，仅从蛋白质结构方面进行说明的例子很多。但是，自从发现ABO(H)式血液型抗原的特异性由糖链部分的微妙的结构差异决定这一事实以来，在多细胞生物的成立和维持所必需的各种识别现象中，糖链在糖蛋白中作为信号的作用逐渐变大，为人们大书特书。

即自从发现在动植物的组织、器官中广为分布的糖蛋白中，通过遗传信息表达蛋白质后，通过糖基化(糖链的加成)，对蛋白质自身的功能赋予了极其特异的生物学选择性。鉴于糖链在糖蛋白中的这种重要性，已经累积了以例如来源于糖链的癌症特异性抗原的研究等大范围、且庞大的研究，与此同时糖链结构(其序列或立体结构)的解析也获得飞越性进展。

糖蛋白糖链可大致分为与构成多肽的氨基酸残基的L-天冬酰胺相结合的N-糖苷结合型(Asn结合型)、以及与L-丝氨酸或L-苏氨酸相结合的O-糖苷结合型(O结合型)。其中，O结合型的糖链在各种粘液蛋白、血清蛋白、膜蛋白等中广泛被发现。作为这样的O结合型的糖链，通过以N-乙酰基-D-半乳糖胺为供体、以L-丝氨酸或者L-苏氨酸的醇性羟基为受体的亲核反应而形成α-O-糖苷键的糖链为其代表性例子。

但是，对作为糖蛋白糖链、或者特异性识别糖蛋白糖链的功能性蛋白质而受人关注的外源凝集素等进行研究·分析发现，需要准备例如微克数量级以上的量的糖蛋白作为试样。但是，通常在动植物的组织或细胞等中，作为目标的糖蛋白，仅以纳克/毫升数量级这一极其微小的量存在，因此要准备必需量的糖蛋白试样是很难的。

因此，Asn结合型或O结合型的糖蛋白的化学合成研究，在世界各国均一直在积极进行。Asn结合型糖蛋白的化学合成研究暂且不提，在O结合型的糖蛋白的化学合成中，由对易与糖化学适应的O-糖苷键进行处理这一点来讲，参照糖残基之间的糖基化反应方法的技术开发，迄今为止已经提出了种种方法。

但是，在O结合型的糖蛋白的化学合成中，存在如何还原末端的半乳糖胺和氨基酸的醇性羟基之间的糖基化反应α-选择性地进行这一难关。即，在N-乙酰基-D-半乳糖胺的糖基化反应中，2位的N-乙基氨基通过邻基参与(隣接基関与)而干扰糖基化反应，因此存在以相当高的比率进行β-糖基化反应的问题。

对于这个问题，Paulsen等提出了利用2-叠氮基衍生物的方法。该方法如图1所示，通过叠氮基阴离子使1，6；2，3-二脱水糖(i)立体特异性地开裂，得到2-叠氮化物(ii)后，对其进行转化，合成α-溴化物(iv)，接着通过用氯化四乙基铵对其进行处理，得到β-氯化物(v)。由此，在Koenigs-Knorr反应条件下，生成α-糖苷。

然后，Lemieux和Ractcliffe开发出了简便的2-叠氮基糖的合成方法，如图2所示，Ferrari和Pavia对利用该合成法而得到的(x)化合物进行了转化，制备出β-氯化物(xi)，接着使用汞盐作为助催化剂(promoter)尝试与L-丝氨酸的缩合，以66％的收率得到了α-糖苷(xii)。

上述的Paulsen等为了对图2中的化合物(xi)中不需要的正位异构化作用进行抑制，在非极性的二氯甲烷/甲苯混合溶剂中，将高氯酸银-碳酸银(1∶10)用在助催化剂中。而且，通过该方法，得到了收率85％、αβ选择性为19∶1的结果。

以上的各种合成方法，尤其是Paulsen等的将高氯酸银-碳酸银用于助催化剂的方法，就使糖基化反应α选择性地进行这一问题本身而言，获得了优异的效果，但是在供体的制备阶段、或反应控制的难度等方面，仍存在缺乏实际的广泛应用性这一共同的缺点。

本发明的目的在于使包括O结合型糖蛋白的化学合成在内，在一定的糖结构体中高度选择性的α-糖基化反应，能够通过简单且方便的方法进行。

发明内容

本发明人发现仅在半乳糖等的糖结构体中的一定的羟基上形成甲硅烷基缩醛(silyl acetal)结构的保护基团，就能够对糖链受体引发高度选择性的α-糖基化反应。

本申请的第1发明，是在作为供体的糖结构体和受体化合物的醇性羟基或硫羟基(thiol group)之间进行糖基化反应的方法，其中

(1)作为上述糖结构体，使用满足如下结构条件的糖结构体，其为单糖或者二糖或二糖以上的低聚糖或糖链的还原末端的6碳糖或6碳糖以上的糖结构体，并且至少在4位和6位具有羟基，且4位的羟基是直立键，5位的基团是平伏键，

(2)在该糖结构体的4位和6位羟基上，环状地形成甲硅烷基缩醛结构的保护基团，在此基础上，

(3)通过在该糖结构体和上述醇性羟基或硫羟基之间进行糖基化反应，

(4)得到在α/β比中以80％或以上的比率含有α-糖苷的糖结构体糖苷。

根据第1发明的α-选择性糖基化反应方法，在规定糖结构体的4位和6位羟基上环状地形成甲硅烷基缩醛结构的保护基团的基础上，通过与作为受体化合物的醇性羟基或硫羟基之间进行糖基化反应这一极为简单的方法，能够引发高度选择性的α-糖基化反应。得到的糖苷中的α-端基异构体的比例通常为80％或以上。

在本申请的发明人发现该效果的合成实验中，作为供体的N-乙酰基半乳糖胺中，除上述甲硅烷基缩醛结构的保护基团外，还存在2，2，2-三氯乙氧基羰基(Troc基)等，受体化合物为二唾液酸半乳糖(disialylgalactose)。但是，在实施例中，如后文所述，通过按顺序对这些要素进行验证实验，确认能够使高度的α-选择性糖基化反应成为可能的条件是形成上述甲硅烷基缩醛结构的保护基团。

该α-选择性糖基化反应方法，如后文所述，不会受到在O结合型的糖蛋白的化学合成中一直成问题的N-乙酰基氨基对糖基化反应的干扰。进而，与根据同一观点而提出的现有技术，例如上述Paulsen等的利用2-叠氮基衍生物的方法、Ferrari和Pavia的改良方法等相比，是操作极为简便、具有实际的广泛实用性的化学合成法。因此，能够通过简单的化学合成，制备对糖蛋白糖链或外源凝集素等进行研究·分析时作为研究试样的糖蛋白。

此外，第1发明的α-选择性糖基化反应方法，通常在具有给定条件的糖结构体(供体)和至少具有醇性羟基或硫羟基的受体化合物之间成立，并不限于上述O结合型的糖蛋白的合成。即，供体可以为单糖或者低聚糖，作为受体化合物，只要具有醇性羟基或硫羟基，可以使用氨基酸、肽链、单糖、糖链以及其他种类的任意的有机化合物。

在本发明的第2发明中，上述第1发明涉及的糖结构体为下述(a)～(d)中的任一个：

(a)D-半乳糖或者L-半乳糖；

(b)D-古洛糖或者L-古洛糖；

(c)2-脱氧-D-半乳糖或者2-脱氧-L-半乳糖；

(d)以上述(a)～(c)中的任一个为基本结构的7碳糖。

在α-选择性糖基化反应方法中，作为供体的糖结构体必须满足第1发明中所述的一定的结构条件，作为满足该结构条件的代表性的例子，可以列举第2发明中的(a)～(d)中列举的任一个的糖结构体。

本申请的第3发明中，上述第1发明或者第2发明涉及的糖结构体，在D型中为C1立体构象(即“⁴C₁”吡喃糖苷结构)，在L型中为1C立体构象(即“¹C₄”吡喃糖苷结构)。

作为供体的糖结构体，在D型糖结构体中的C1立体构象，在L型糖结构体中的1C立体构象分别变为优先构象，因而尤其优选。但是，对于D型糖结构体中的1C立体构象、以及L型糖结构体中的C1立体构象，也不能否定其能够实现第1发明的作用·效果的可能性。

本申请的第4发明中，上述第1发明～第3发明中任一项涉及的甲硅烷基缩醛结构的保护基团为二烷基亚甲硅基(dialkylsilylene)。

跨在上述糖结构体的4位和6位羟基上形成的环状保护基团，只要是甲硅烷基缩醛结构即可，没有特殊限定，更优选可以形成二烷基亚甲硅基。

本申请的第5发明中，上述第4发明涉及的二烷基亚甲硅基为二-(叔丁基)-亚甲硅基(DTBS基)。

作为二烷基亚甲硅基，尤其优选二-(叔丁基)-亚甲硅基(DTBS基)。

本申请的第6发明中，上述第1发明～第5发明中形成任一项涉及的甲硅烷基缩醛结构的保护基团时，预先对糖结构体中规定的反应性官能团进行保护基团修饰。

进行第6发明那样的一定的保护基团修饰对抑制形成糖结构体中上述甲硅烷基缩醛结构的保护基团时，或者在其后的α-选择性糖基化反应时的不需要的副反应有效。进一步地，为了防备想对作为供体或受体的构成部分的糖或者氨基酸等中的特定官能团进一步加成其他的糖等的情况，在不对其他保护基团造成影响的条件下，用能够脱保护的保护基团预先对该官能团进行修饰也是有效的。

本申请的第7发明中，上述第6发明中涉及的保护基团修饰中，氨基酸的保护基团为2，2，2-三氯乙氧基羰基(Troc基)。

糖结构体(尤其是2位上)具有氨基时，例如在保护半乳糖胺或葡糖胺等氨基糖中的氨基时，以往广泛应用苯二甲酰基(Phth基)。但是，Phth基的导入效率差，不适合大量合成。此外，例如在反应体系中共存氰尿酸等时，在Phth基脱保护时，通常使用肼，因此为了避免因对其甲酯的攻击而引起的酰胺类的生成，就必然伴随先除去甲酯，然后将游离的羧酸再次甲酯化这一脱保护时面临的麻烦问题。鉴于这些情况，本申请的发明人发现，由有效合成α-糖苷的观点来看，用Troc基来保护氨基比较适当。

本申请的第8发明中，上述第1发明～第7发明中任一项涉及的糖结构体，在2位具有通过邻基参与而干扰α-选择性糖基化反应的取代基。

在上述第1发明的作用·效果中，尤其有利的一点在于，在通常的糖基化反应中，即使是在2位具有通过邻基参与而严重干扰α-选择性糖基化反应的取代基的糖结构体中，也能确保高度选择性的α-糖基化反应。

本申请的第9发明中，上述第8发明涉及的2位的取代基为与Troc基或乙酰基相结合的氨基。

糖结构体的2位的取代基为与Troc基或乙酰基相结合的氨基时(包含通过第6发明或第7发明用Troc基或乙酰基修饰的情况)，公知通常显示出很强的邻基参与。此外，如前所述，这一事实已经成为O-结合型糖蛋白的化学合成中的一大障碍。因此，这种情况下，使用第1发明的α-选择性糖基化反应方法的优点尤其大。

本申请的第10发明中，作为上述第1发明～第9发明中任一项涉及的受体化合物，使用具有醇性羟基或者硫羟基的氨基酸、含有这些氨基酸中任一种作为构成残基的肽链、单糖或者二糖或二糖以上的低聚糖或糖链。

作为α-选择性糖基化反应方法中使用的受体化合物，只要具有醇性羟基或硫羟基即可，没有特殊限制，但可优选列举第10发明中限定的化合物中的任意一种。

附图说明

图1为表示现有技术涉及的α-选择性糖基化反应方法的流程图。图2为表示现有技术涉及的α-选择性糖基化反应方法的流程图。图3为表示本发明实施例涉及的α-选择性糖基化反应的图。

具体实施方式

接着，对用于实施本申请各发明的方式，包含其最佳方式在内进行说明。以下，单说“本发明”时，指的是本申请中的各发明。

(α-选择性糖基化反应方法)

本发明的α-选择性糖基化反应方法，是在糖结构体(糖供体)和具有醇性羟基或硫羟基的化合物(糖受体)之间进行糖基化反应的方法。其特征在于，在糖结构体的4位和6位羟基上环状地形成甲硅烷基缩醛结构的保护基团的基础上，与受体化合物之间进行糖基化反应。其结果，在得到的糖结构体糖苷中，在α/β比中以80％或以上的比率含有α-糖苷这一高度的α-选择性糖基化反应方法得以成为可能。

由“第8发明的作用·效果”栏中记载的各种理由可知，在形成甲硅烷基缩醛结构的保护基团时，优选预先对糖结构体中4位和6位羟基以外的反应性官能团进行保护基团修饰。待预先进行保护基团修饰的反应性官能团的种类及在糖结构体中的位置不作限定，根据需要适当地进行保护基团修饰即可，但可以代表性地列举对糖结构体2位的氨基或者羟基、3位的羟基进行保护基团修饰。

作为2位的氨基的保护基团，可举出乙酰基、三卤代乙酰基、乙酰丙酰基(levulinoly group)、苯二甲酰基、Troc基等所有酰基类保护基团。作为2位的羟基的保护基团，可举出乙酰基、单卤代乙酰基、二卤代乙酰基、乙酰丙酰基、苯甲酰基、三甲基乙酰基等所有酰基类保护基团。作为3位的羟基的保护基团，除了可举出乙酰基、苯甲酰基、三甲基乙酰基等酰基类保护基团外，还可举出苄基、对甲氧基苄基、烯丙基等醚类保护基团。

上述各种保护基团中，2位的氨基或者羟基的保护基团多数在通常的糖基化反应中大多显示强邻基参与，对α-选择性糖基化反应会造成很大障碍，但是如上文所述，在本发明涉及的α-选择性糖基化反应中，则没有这样的担心。

(α-选择性糖基化反应方法的反应条件等)

在进行本发明的α-选择性糖基化反应方法时，对反应条件、反应体系中的供体和受体的浓度、反应催化剂的利用等没有特殊限制，可根据需要适当设计。

但是，反应条件优选使用二氯甲烷等非极性溶剂，在反应温度-30℃～0℃的范围内进行。此外，反应体系中的供体和受体浓度优选设置为0.1M左右。反应体系中供体和受体的浓度比基本上按化学计量决定，更优选相对于受体，使用1.5当量摩尔左右的供体。

(糖结构体)

本发明中使用的糖结构体，是满足至少在4位和6位上具有羟基，且4位上的羟基为直立键，5位上的基因为平伏键这一结构条件的6碳糖或6碳糖以上的糖结构体。糖结构体可作为单糖使用，也可作为二糖或二糖以上的低聚糖或糖链的还原末端使用。

糖结构体的种类只要符合上述条件即可，没有特殊限制，但可代表性地列举以下(a)～(d)中任一个。这些均是包含将任意的取代基导入到任意位置的衍生物，例如D/L-半乳糖中的N-乙酰基半乳糖胺等取代基衍生物的概念。

(a)D-半乳糖或者L-半乳糖；

(b)D-古洛糖或者L-古洛糖；

(c)2-脱氧-D-半乳糖或者2-脱氧-L-半乳糖；

(d)以上述(1)～(3)中的任一个为基本结构的7碳糖。

此外，由“第3发明的作用·效果”栏中记载的理由可知，这些糖结构体中，优选在D型中为6元环的C1立体构象(⁴C₁吡喃糖苷结构)，在L型中为6元环的1C立体构象(¹C₄吡喃糖苷结构)。但是不否定不符合该条件的糖结构体也能使用的可能性。

(甲硅烷基缩醛结构的保护基团的形成)

在糖结构体的4位和6位羟基上形成的环状保护基团，只要是甲硅烷基缩醛结构即可，没有特殊限定，但是可特别列举二烷基亚甲硅基，尤其优选使用二-(叔丁基)-亚甲硅基(DTBS基)。此外，还可以优选列举二-异丙基-亚甲硅基、二-异丁基-亚甲硅基、二-正丁基-亚甲硅基、二-正丙基-亚甲硅基等。

(受体化合物)

本发明中所用的受体化合物，基本上只要是具有醇性羟基或硫羟基的有机化合物即可。作为受体化合物的优选例子，可举出具有醇性羟基或硫羟基的氨基酸、例如丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸等。本发明为有机合成法的一种，因此勿庸置疑L-氨基酸、D-氨基酸均可利用。

此外，含有上述任一种氨基酸作为构成残基的肽链(寡肽或者多肽)，也可作为受体化合物的优选例子给出。也可优选列举单糖、或者二糖或二糖以上的低聚糖或糖链。

进一步地，除上述外，通常的有机醇化合物或者硫醇化合物，例如甲醇、乙醇、乙硫醇等也可作为受体化合物使用。

实施例

以下对本发明的实施例进行说明。本发明的技术范围不限于这些实施例。

[实施例1：受体化合物的合成]

首先，对于由多聚乙酰神经氨酸得到的下述化学式1所示的唾液酸二聚体，将其中的羧基甲酯化，得到如下述化学式2所示的唾液酸二聚体。此时，使非还原末端侧的羧基与还原末端侧的8位的羟基形成内酯。进一步地，通过将该化学式2所示的唾液酸二聚体中的端基异构位(anomeric position)的乙酰基转换为苯硫基(SPh)，得到下述化学式3所示的二唾液酸供体。此外，在化学式1～化学式3中，“Ac”表示乙酰基，“SPh”表示苯硫基。

[化学式1]

[化学式2]

[化学式3]

接着，另外准备如下述化学式4所示，用保护基团修饰了的半乳糖。在化学式4中，“Bn”表示苄基，“SE”表示2-(三甲基甲硅烷基)乙基。

[化学式4]

接着，将化学式3所示的二唾液酸供体和化学式4所示的半乳糖，在由反应条件研究被认为是优选的预定的反应条件下进行缩合。从这样生成的α，β的立体异构体混合物中，通过使用了一定组成的洗脱液的硅胶色谱法，将下述化学式5所示的α异构体分离出来。将该化学式5所示的化合物制成用于本发明的α-选择性糖基化反应方法的受体化合物。

化学式5所示的α异构体为2-(三甲基甲硅烷基)乙基[甲基5-乙酰氨基-8-O-(5-乙酰氨基-4，7，8，9-四-O-乙酰基-3，5-二脱氧-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-ノヌロピラノシロノ(nonulopyranosilono)-1’，9-内酯)-4，7-二-O-乙酰基-3，5-二脱氧-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-ノヌロピラノシロネ-ト(nonulopyranosilonate)]-(2→3)2，6-二-O-苄基-β-D-吡喃半乳糖苷。

[化学式5]

[实施例2：糖结构体的合成]

首先，通过预定的合成工艺，制备分别用Sph基保护了1位的羟基、用Troc基保护了2位的氨基的下述化学式6所示的半乳糖胺三元醇衍生物。该半乳糖胺三元醇衍生物具有“⁴C₁”吡喃糖苷结构。

接着，使用在二-叔丁基硅烷上带有三氟甲磺酸的DTBS(OTf)₂作为离去基团，在给定的反应条件下，将DTBS导入到化学式6所示化合物的4、6位上，得到在4、6位上具有甲硅烷基缩醛结构的保护基团的下述化学式7所示的化合物。

进一步地，在吡啶溶剂中使TrocC1作用于化学式7所示的化合物，得到在3位上导入了Troc基的下述化学式8所示的化合物。将该化学式8的化合物制备成用于本发明的α-选择性糖基化反应方法的糖结构体(半乳糖胺供体)。

化学式8所示的化合物为苯基2-脱氧-4，6-O-二-叔丁基亚甲硅基-1-硫代-3-O-(2，2，2-三氯乙氧基羰基)-2-(2，2，2，-三氯乙氧基羰基氨基)-β-D-吡喃半乳糖苷。

[化学式6]

[化学式7]

[化学式8]

[实施例3：糖基化反应]

如图3所示，根据如下所述的过程，由化学式8所示的糖结构体和化学式5所示的受体化合物，得到下述化学式9所示的糖苷。

化学式9所示的糖苷为2-(三甲基甲硅烷基)乙基[甲基5-乙酰氨基-8-O-(5-乙酰氨基-4，7，8，9-四-O-乙酰基-3，5-二脱氧-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-ノヌロピラノシロノ-1’，9-内酯)-4，7-二-O-乙酰基-3，5-二脱氧-D-甘油基-α-D-半乳糖-2-ノヌロピラノシロネ-ト-(2→3)]-[2-脱氧]-4，6-O-二-叔丁基亚甲硅基-3-O-(2，2，2-三氯乙氧基羰基)-2-(2，2，2-三氯乙氧基羰基氨基)-α-D-半乳糖吡喃基]-2，6-二-O-苄基-β-D-吡喃半乳糖苷。

[化学式9]

即，首先将化学式8所示的糖结构体(118mg，0.155mmol)和化学式5所示的受体化合物(100mg，77.4μmol)溶解到5.0ml的二氯甲烷中，加入MS4

(200mg)，室温下搅拌1小时。然后，冷却到0℃，加入70mg即0.310mmol的N-碘代琥珀酰亚胺(NIS)和2.7μl即31.0μmol的三氟甲磺酸(TfOH)，搅拌。

接着，边利用薄层色谱(TLC)确认反应进程，在反应期间分别再加入一次化学式8所示的糖结构体(118mg)、NIS(70mg)、TfOH(2.7μl)。然后，搅拌32小时。

通过TLC(AcOEt/MeOH＝15/1)确认反应结束后，使用硅藻土(Celite)过滤出生成的固体物，用氯仿洗涤。接着，合并滤液和洗涤液并用氯仿稀释，依次用sat.Na₂CO₃、sat.Na₂S₂O₃、盐水洗涤有机层，用Na₂SO₄干燥·浓缩后，将得到的糖浆供给柱色谱，从其洗脱溶剂中，得到化学式9所示的糖苷(113mg，75％)。

[对实施例1～实施例3的考察]

上述实施例1～实施例3，最初的目的是以合成二唾液酸半乳糖单元为目的而进行的实验的一部分。而且，作为本申请的发明人的预测，也是认为由将化学式8的糖结构体的2位氨基改为一般认为会发生邻基参与的Troc基这一点考虑，应该能够得到化学式8的糖结构体和化学式5的受体化合物构成的β-糖苷。

但是，用¹H-NMR对得到的化学式9的糖苷进行解析，意外地发现竟然是α-糖苷，不能确认其是预料中的β-糖苷产物。此外，如下述表1所示，虽然是与上述实施例3相同的内容，但是对反应温度、供体、受体的使用浓度以及反应时间稍加改变而进行了合成实验(上述实施例3本对应于表1中的Entry No.1)，发现在所有的合成实验例(Entry No.)中，仅α-糖苷以表1的收率获得，不能确认预料是β-糖苷的产物。

【表1】

此外，表1的收率一栏之所以将(“Yield”)的百分比数值用括号括起来，是因为在¹H-NMR中，会存在一般认为是rotamer的不纯信号。这里对于这种现象的原因不作详细叙述，但可以知道是受到DTBS基的影响而引起的。

在实施例1～实施例3那样的合成反应体系中，如果能够实现高度选择性的α-糖基化反应的话，那么就能够提供例如以极为简单且有利的新合成方法进行O结合型糖链的化学合成等这一在现有技术中一直在寻求的有力的改良合成方法。因此，为了确认在实施例1～实施例3中使得α-选择性糖基化反应成为可能的要素到底是在哪一点，接着进行了以下的实施例4～实施例6以及比较例1。

[实施例4：受体化合物的改变(1)]

将对糖基化反应的空间位阻小的2金刚烷醇-(ァダマンタノ-ル)(如下述化学式10所示)用于受体化合物，像下面这样，尝试将糖结构体供体导入到其羟基中。

[化学式10]

即，将上述化学式8所示的糖结构体(50mg，65.6μmol)和作为受体化合物的化学式10所示的2-金刚烷醇(30mg，0.197mmol)溶解到2.6ml的二氯甲烷中，加入MS4

(80mg)，室温下搅拌1小时。然后，冷却到0℃，加入NIS(30mg，0.131mmol)和TfOH(1.2μl，13.1μmol)，搅拌1小时。

通过TLC(AcOEt/己烷＝1/3)确认反应结束后，使用硅藻土过滤出生成的固体物，用氯仿洗涤。接着，合并滤液和洗涤液并用氯仿稀释，依次用sat.Na₂CO₃、sat.Na₂S₂O₃、盐水洗涤有机层，用Na₂SO₄干燥·减压浓缩后，将得到的糖浆供给柱色谱。

然后，从柱色谱的洗脱溶剂(AcOEt/己烷＝1/20)中得到缩合反应所涉及的糖苷。通过对该糖苷进行结构解析(利用¹H-NMR，下同)，发现β-糖苷可见8％左右，以85％的收率得到了α-糖苷。

[实施例5：受体化合物的改变(2)]

将本发明在糖中的应用纳入视野范围，将作为一元醇的葡萄糖(下述化学式11所示)用于受体化合物，像下面这样，尝试将糖结构体供体导入到其6位的羟基中。

[化学式11]

即，将上述化学式8所示的糖结构体(50mg，65.6μmol)和作为受体化合物的化学式11所示的化合物(正己基-2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷；38mg，98.4μmol)溶解到2ml的二氯甲烷中，加入MS4

(100mg)后，室温下搅拌1小时。然后，冷却到0℃，加入NIS(30mg，0.131mmol)和TfOH(1.2μl，13.1μmol)，搅拌5小时。

通过TLC(AcOEt/己烷＝1/2)确认反应结束后，使用硅藻土过滤出生成的固体物，用氯仿洗涤。接着，合并滤液和洗涤液并用氯仿稀释，依次用sat.Na₂CO₃、sat.Na₂S₂O₃、盐水洗涤有机层，用Na₂SO₄干燥·减压浓缩后，将得到的糖浆供给柱色谱。

然后，从柱色谱的洗脱溶剂(AcOEt/己烷＝1/4)中得到缩合反应涉及的糖苷。通过对该糖苷进行结构解析，令人意外地发现以90％的高收率得到了α-糖苷。在TLC上也能看到可能是β-糖苷的斑点，但是没有达到分离·鉴定的程度。

[实施例6：糖结构体的3位的保护基团的改变]

接着，为了验证糖结构体中的3位的保护基团的影响，将上述化学式8的糖结构体中的3位的保护基团Troc改为与其同属于酰类的乙酰基，得到如下化学式12所示的化合物，将其用作糖结构体供体，像下面这样，尝试将糖结构体供体导入到与实施例5相同的化学式11的葡萄糖受体的6位羟基中。

[化学式12]

即，将化学式12的糖结构体(50mg，79.5μmol)和作为受体化合物的化学式11的化合物(47mg，0.119mmol)溶解到2ml的二氯甲烷中，加入MS4

(100mg)后，室温下搅拌1小时。然后，冷却到0℃，加入NIS(36mg，0.159mmol)和TfOH(1.4μl，15.9μmol)，搅拌30分钟。

通过TLC(AcOEt/己烷＝1/2)确认反应结束后，使用硅藻土过滤出生成的固形物，用氯仿洗涤。接着，合并滤液和洗涤液并用氯仿稀释，依次用sat.Na₂CO₃、sat.Na₂S₂O₃、盐水洗涤有机层，用Na₂SO₄干燥·减压浓缩后，将得到的糖浆供给柱色谱。

然后，从柱色谱的洗脱溶剂(AcOEt/己烷＝1/4)中得到化学式13所示的化合物。其收量为69mg，收率实际上达到96％这一大致定量的数值。这一结果是令人意外的。

[化学式13]

[比较例1：未被DTBS基保护的糖结构体的使用]

这里，作为在糖结构体的4位和6位的羟基上不具有甲硅烷基缩醛结构的保护基团的糖结构体供体，使用下述化学式14所示的化合物[3，4，6-三-O-乙酰基-2-脱氧-1-硫羟-2-(2，2，2-三氯乙氧基羰基氨基)-β-D-吡喃半乳糖苷]，像下面这样，尝试与上述化学式5所示的受体化合物的糖基化反应。

[化学式14]

即，将化学式14的糖结构体(1.10g，1.93mmol)和作为受体化合物的化学式5的化合物(1.00g，0.774mmol)溶解到77ml的二氯甲烷中，加入MS4

(2g)后，室温下搅拌1小时。然后，冷却到0℃，加入NIS(868mg，3.86mmol)和TfOH(34μl，0.386mmol)，搅拌1小时。

通过TLC(AcOEt/MeOH＝15/1)确认反应结束后，使用硅藻土过滤出生成的固形物，用氯仿洗涤。接着，合并滤液和洗涤液并用氯仿稀释，依次用sat.Na₂CO₃、sat.Na₂S₂O₃、盐水洗涤有机层，用Na₂SO₄干燥·浓缩后，将得到的糖浆供给柱色谱。

然后，从柱色谱的洗脱溶剂(AcOEt)中，以收量994mg、收率73％得到下述化学式15所示的糖苷。对该糖苷进行结构分析发现，其为β-糖苷。

[化学式15]

[对实施例4～实施例6以及比较例1的考察]

结合实施例3的结果对实施例4和实施例5的结果进行考虑的话，发现受体化合物的种类或者化学结构并不是决定能否进行α-选择性糖基化反应的要素。因此，作为本发明涉及的α-选择性糖基化反应中可用的受体化合物，只要具有醇性羟基或硫羟基这一作为通常的糖基化反应中的受体化合物的条件即可。

接着，由实施例6的结果可知，糖结构体中的3位的保护基团的种类也不是决定能否进行α-选择性糖基化反应的要素。

另一方面，在上述的各实施例中生成的糖苷的全部或者大致全部为α-糖苷，而像比较例1那样，仅在使用在4位和6位羟基上不具有甲硅烷基缩醛结构的保护基团的糖结构体供体的情况下，生成的糖苷全部是β-糖苷。因此，决定能否进行本发明涉及的α-选择性糖基化反应的要素是：“在糖结构体供体的4位和6位羟基上环状地形成了甲硅烷基缩醛结构的保护基团”。

[实施例7：氨基糖供体中2位保护基团的邻基参与(1)]

其次，希望将2位上具有氨基的半乳糖胺或葡萄糖胺α-选择性地导入到受体化合物中时，如上文所述，在现有技术中，2位氨基的保护基团引起的邻基参与一直是一个大的障碍。因此，为了验证在将化学式8所示的糖结构体中2位的氨基的保护基团Troc改为与其相比邻基参与明显强的保护基团的情况下，能否确保α-选择性糖基化反应，进行了下面的实施例7。

即，将化学式8的化合物中2位的Troc基改为Bz基(此外，实际上3位的Troc基也同样改变)，得到下述化学式16的化合物，将其用作糖结构体供体，像下面这样，尝试将糖结构体导入到与实施例5同样的化学式11的葡萄糖受体的6位羟基中。

[化学式16]

首先，将化学式16的糖结构体(50mg，80.5μmol)和作为受体化合物的化学式11的化合物(47mg，0.121mmol)溶解到2ml的二氯甲烷中，加入MS4

(100mg)后，室温下搅拌1小时。然后，冷却到0℃，加入NIS(36mg，0.161mmol)和TfOH(1.4μl，16.1μmol)，搅拌20小时。

然后，从柱色谱的洗脱溶剂(AcOEt/己烷＝1/5)中得到下述化学式17所示的α-糖苷化合物(经结构解析确认)。其收量为51mg，收率为71％。未分离出β-糖苷，生成了其他的若干副产物。

[化学式17]

[实施例8：氨基糖供体中2位保护基团的邻基参与(2)]

基于与实施例7同样的理由，将化学式8的化合物中2位的Troc基改为与其相比邻基参与明显更强的Phth基(此外，实际上3位的Troc基也改为乙酰基)，得到下述化学式18的化合物，将其用作糖结构体供体，像下面这样，尝试将糖结构体导入到与实施例5同样的化学式11的葡萄糖受体的6位羟基中。

[化学式18]

将化学式18的糖结构体(100mg，0.171mmol)和作为受体化合物的化学式11的化合物(100mg，0.256mmol)溶解到4.3ml的二氯甲烷中，加入MS4

(200mg)后，室温下搅拌1小时。然后，冷却到0℃，加入NIS(77mg，0.342mmol)和TfOH(3μl，34.2μmol)，搅拌30分钟。

然后，从柱色谱的洗脱溶剂(AcOEt/己烷＝2/5)中得到下述化学式19所示的α-糖苷化合物(经结构解析确认)。其收量为141mg，收率为95％。

[化学式19]

[对实施例7和实施例8的考察]

由实施例7和实施例8的结果可知，本发明涉及的α-选择性糖基化反应方法，能够不受到现有技术中成问题的邻基参与的强弱的影响而进行，因此可以确认其是广泛应用性好的方法。

[实施例9：α-半乳糖胺-丝氨酸的合成]

如上所述，半乳糖型的糖结构体供体中的α-选择性糖基化反应中利用价值最高的情况是O结合型糖链的化学合成。因此，从构成O结合型糖链中糖链与肽的结合部位的α-半乳糖胺-L-丝氨酸或α-半乳糖胺-L-苏氨酸中，选择后者的情况，像下面这样，尝试α-选择性糖基化反应方法。

首先，考虑到以后的糖链延长，在半乳糖胺供体中，使用3位中导入了Troc基的化学式8的糖结构体。丝氨酸，考虑到以后的肽链延长，准备了化学式20和化学式21那样导入了保护基团的2种糖结构体。如下述实施例9-1和实施例9-2所述，能够看到由于氨基酸的保护基团的差异而引起的一些收率上的差异，但所有情况下均显示出令人意想不到的高α-选择性。

[化学式20]

[化学式21]

(实施例9-1)

将化学式8的糖结构体(122mg，0.160mmol)和作为受体化合物的化学式20的化合物(N-苄氧基羰基-L-丝氨酸-五氟苯基酯；50mg，0.123mmol)溶解到2.8ml的二氯甲烷中，加入MS4

(170mg)后，室温下搅拌1小时。然后，冷却到0℃，加入NIS(72mg，0.320mmol)和TfOH(2.8μl，32.0μmol)，搅拌30分钟。

然后，从柱色谱的洗脱溶剂(AcOEt/己烷＝1/3)中得到预期的作为α-糖苷的α-半乳糖胺-丝氨酸(经结构解析确认)。其收量为117mg，收率为90％。

(实施例9-2)

将化学式8的糖结构体(100mg，0.131mmol)和作为受体化合物的化学式21的化合物(N-9-芴基甲氧基羰基-L-丝氨酸-五氟苯基酯；50mg，0.101mmol)溶解到2.3ml的二氯甲烷中，加入MS4

(150mg)后，室温下搅拌1小时。然后，冷却到0℃，加入NIS(59mg，0.262mmol)和TfOH(2.3μl，26.2μmol)，搅拌30分钟。

通过TLC(AcOEt/己烷＝1/2)确认反应结束后，使用硅藻土过滤出生成的固体物，用氯仿洗涤。接着，合并滤液和洗涤液并用氯仿稀释，依次用sat.Na₂CO₃、sat.Na₂S₂O₃、盐水洗涤有机层，用Na₂SO₄干燥·依次用后，将得到的糖浆供给柱色谱。

然后，从柱色谱的洗脱溶剂(AcOEt/己烷＝1/3)中得到预期的作为α-糖苷的α-半乳糖胺-丝氨酸(经结构解析确认)。其收量为91mg，收率为78％。

(实施例10：糖结构体的1位保护基团的改变)

接着，使用将上述化学式8的糖结构体中1位羟基的保护基团(sph基)分别改为a：SCH₃基、b：F基、c：OC(NH)CCl₃基后的糖结构体，在这些物质和2-金刚烷醇之间实施α-选择性糖基化反应方法。

(实施例10-1)

在氩气流下将糖结构体a(150mg，0.214mmol)和2-金刚烷醇(21.7mg，0.143mmol)溶解到3.5ml的二氯甲烷中，加入MS4(170mg)后，室温下搅拌1小时。然后，冷却到0℃，加入NIS(96.4mg，0.428mmol)和TfOH(3.8μl，42.8μmol)，搅拌30分钟。

通过TLC(AcOEt/己烷＝1/3)确认反应结束后，使用硅藻土过滤出生成的固体物，用氯仿洗涤。接着，合并滤液和洗涤液并用氯仿稀释，依次用sat.Na₂CO₃、sat.Na₂S₂O₃、盐水洗涤有机层，用Na₂SO₄干燥·减压浓缩后，将得到的糖浆供给硅胶柱色谱。对洗脱溶剂(AcOEt/己烷＝1/30)中得到的糖苷进行结构解析发现，虽然可看到11％(13mg)左右的β-糖苷，但以85％(106g)的收率得到了α-糖苷。

(实施例10-2)

在氩气流下将糖结构体b(150mg，0.223mmol)和2-金刚烷醇(22.6mg，0.148mmol)溶解到3.7ml的二氯甲烷中，加入MS4

(170mg)后，室温下搅拌1小时。然后，冷却到0℃，避光条件下加入SnCl₂(42.3mg，0.223mmol)、AgClO₄(55.5mg，0.267mmol)，搅拌16小时。

通过TLC(AcOEt/己烷＝1/4)确认反应结束后，使用硅藻土过滤出生成的固体物，用氯仿洗涤。接着，合并滤液和洗涤液并用氯仿稀释，依次用sat.Na₂HCO₃、盐水的顺序洗涤有机层，用Na₂SO₄干燥·减压浓缩后，将得到的糖浆供给硅胶柱色谱。对洗脱溶剂(AcOEt/己烷＝1/30)中得到的糖苷进行结构解析发现，虽然可看到10％左右(12mg)的β-糖苷，但以78％(93mg)的收率得到了α-糖苷。

(实施例10-3)

在氩气流下将糖结构体c(150mg，0.184mmol)和2-金刚烷醇(18.7mg，0.123mmol)溶解到3.1ml的二氯甲烷中，加入AW-300(170mg)后，室温下搅拌1小时。然后，冷却到0℃，加入TMSOf(0.670μl，3.68μmol)，搅拌30分钟。

通过TLC(AcOEt/己烷＝1/3)确认反应结束后，使用硅藻土过滤出生成的固体物，用氯仿洗涤。接着，合并滤液和洗涤液并用氯仿稀释，依次用sat.Na₂HCO₃、盐水洗涤有机层，用Na₂SO₄干燥·依次用后，将得到的糖浆供给硅胶柱色谱。对洗脱溶剂(AcOEt/己烷＝1/30)中得到的糖苷进行结构解析发现，虽然可看到9％左右(9mg)的β-糖苷，但以87％(86mg)的收率得到了α-糖苷。

产业实用性

如上所述，根据本发明，糖结构体中的高度选择性α-糖基化反应，能够通过简单且方便的方法实现。

Claims

1.α-选择性糖基化反应方法，该方法是在作为供体的糖结构体和受体化合物的醇性羟基或硫羟基之间进行糖基化反应的方法，其中

(1)作为上述糖结构体，使用满足如下结构条件的糖结构体，即，该糖结构体为单糖或二糖或二糖以上的低聚糖或糖链的还原末端的6碳糖或6碳糖以上的糖结构体，至少在4位和6位上具有羟基，且4位的羟基为直立键，5位的基团为平伏键，且该糖结构体在2位上具有通过邻基参与而干扰α-选择性糖基化反应的取代基，

(2)在该糖结构体的4位和6位的羟基上，环状地形成甲硅烷基缩醛结构的保护基团，在此基础上，

(4)得到在α/β比中以80％或80％以上的比率含有α-糖苷的糖结构体糖苷。

2.权利要求1所述的α-选择性糖基化反应方法，其中上述糖结构体为下述(a)～(d)中的任一个：

(a)D-半乳糖或者L-半乳糖；

(b)D-古洛糖或者L-古洛糖；

(c)2-脱氧-D-半乳糖或者2-脱氧-L-半乳糖；

(d)以上述(a)～(c)中的任一个为基本结构的7碳糖。

3.权利要求1或2所述的α-选择性糖基化反应方法，其中上述糖结构体在D型中为C1立体构象，即“⁴C₁”吡喃糖苷结构；在L型中为1C立体构象，即“¹C₄”吡喃糖苷结构。

4.权利要求1或2所述的α-选择性糖基化反应方法，其中上述甲硅烷基缩醛结构的保护基团为二烷基亚甲硅基。

5.权利要求4所述的α-选择性糖基化反应方法，其中上述二烷基亚甲硅基为二-(叔丁基)-亚甲硅基。

6.权利要求1或2所述的α-选择性糖基化反应方法，其中形成上述甲硅烷基缩醛结构的保护基团时，预先对糖结构体中4位和6位羟基之外的所有反应性官能团进行保护基团修饰。

7.权利要求6所述的α-选择性糖基化反应方法，其中上述保护基团修饰中，氨基酸的保护基团为2，2，2-三氯乙氧基羰基。

8.权利要求1所述的α-选择性糖基化反应方法，其中上述2位的取代基为与2，2，2-三氯乙氧基羰基或乙酰基结合的氨基。

9.权利要求1或2所述的α-选择性糖基化反应方法，其中作为上述受体化合物，使用具有醇性羟基或者硫羟基的氨基酸、含有这些氨基酸中的任一种作为构成残基的肽链、单糖或者二糖或二糖以上的低聚糖或糖链。