CN100374455C - 核酸的处理 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了处理核酸、特别是被甲基化的核酸的方法。在一个实施方案中，所述方法包括下列步骤：(a)为核酸样品提供变性的环境；(b)将核酸样品与亚硫酸氢盐试剂反应并将反应保温以形成被处理的核酸样品，使核酸样品中甲基化的核苷酸保持不变，而未甲基化的核苷酸被转变为另一种形式；(c)将被处理的核酸样品稀释以便使盐浓度减少到基本上不干扰核酸沉淀步骤的水平；(d)将稀释的被处理的核酸沉淀，以便从被处理的核酸中基本上除去任何不想要的试剂或稀释剂；以及(e)对沉淀的被处理的核酸进行脱磺酸基，以便除去被处理的核酸中存在的磺酸基，从而获得基本上不含磺酸基的核酸样品。

Description

核酸的处理
技术领域
本发明涉及使用亚硫酸氢盐对核酸，特别是甲基化的核酸进行处理的修饰方法。
发明背景
作为自动化测序技术发展的结果，已经进行了许多工作以确定在许多动物基因组、包括人类基因组的全序列测定中获得的DNA的编码区。但是，多年来，已经认识到大部分的基因组DNA是非编码的，这些DNA曾经被当作“垃圾”DNA。对DNA非编码区的分析现在被认为对基因表达和功能的研究来说是重要的。核酸，特别是基因组DNA中的甲基化状态或方式被认为在动物的基因表达和控制中具有功能性或调控性作用。
已经证实在单链DNA中，亚硫酸氢钠优先将胞嘧啶脱氨基成为尿嘧啶，与此相比将5-甲基胞嘧啶脱氨基成为胸腺嘧啶的速度则非常慢(Shapiro，R.，DiFate，V.，和Welcher，M.，(1974)J.Am.Chem.Soc.96：906-912)。这项观察成为Frommer等1992年开发的亚硫酸氢盐基因组测序方案的基础(Frommer M，McDonald LE，Millar DS，Collis CM，Watt F，Grigg GW，Molloy PL和Paul CL.PNAS 89：1827-1831(1992)，在此引为参考)。简单来说，现在使用的该方法包括下面的基本步骤：DNA的碱变性；使用亚硫酸氢钠进行脱氨基作用；通过脱盐接着用氢氧化钠处理进行脱磺酸基；中和并脱盐。
亚硫酸氢盐修饰方法以及现有的对它的修改所具有的一个主要的缺点是已经显示出该方法导致84-96％的原始输入的DNA发生降解(Grunau等，Nucleic Acids Research 29(13)e65；(2001))。与该方法相关的这种巨大的损失意味着实际上很难成功地分析少量细胞的甲基化状态，或成功地分析DNA已经处于部分降解状态的古代档案样本。此外，由于现有方法内在的降解作用，不可能以已经被公共的人类基因组计划(International Human Genome Sequencing Consortium，2001，Nature，409，860-921)或私人的CELERA测序计划(J Craig Venter等，2001，Science，291，1304-1351)所成功使用的相同的方式对生物体的完整基因组进行测序和装配，以确定整个基因组范围内的甲基化状态，因为DNA已经变得片段，以致由于在序列中存在巨量的“间隙”使其不能以任何有意义的方式被克隆、测序和组装。
现在使用的亚硫酸氢盐方法的另一个缺点是一般来说，只有小片段的DNA可以被扩增。经验表明，一般小于大约500碱基对(bp)可以被成功地处理和扩增。现有的技术不能应用于新的分子生物学方法，例如长距离聚合酶链反应(PCR)，这种技术使得扩增大段的未处理的基因组DNA成为可能，一般多达约50kb。目前，甚至还不可能分析完整的基因的甲基化状态，因为在哺乳动物基因组中大量的基因长度超过50kb。
甚至为了查看相对小的基因(＜4kb)的甲基化状态，也不得不使用PCR反应艰难地通过目的基因区域(D.S Millar，K.K Ow，C.L.Paul，P.J.Russell，P.L.Molloy，S.J.Clark，1999，Oncogene，18(6)：1313-24；Millar DS，Paul CL，Molloy PL，Clark SJ.(2000).J Biol Chem；275(32)：24893-9)。目前使用的亚硫酸氢盐DNA处理的方法也是繁琐和耗时的。标准方法一般需要转换多个试管、柱纯化、透析、将DNA包埋在琼脂糖珠中或在反应中加入添加剂以试图减少例如基因组DNA的某些区域未转化这样的问题。因此，需要一种更可靠的方法，它基本上不导致DNA降解，并克服或至少减轻了与现有DNA处理相关的多种问题。
发明公开的内容
本发明涉及一种有效的、适用于许多不同分子生物学技术、并能够获得极大的核酸保留率的改进的亚硫酸氢盐处理核酸的方法，在此被称为人类遗传标记(Human Genetic Signature)(HGS)亚硫酸氢盐方法或本发明的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了处理核酸的方法。该方法可以包括下列步骤：将核酸样品变性；将核酸样品与亚硫酸氢盐试剂保温，从而用磺酸基修饰甲基化的核苷酸；将修饰的核酸样品稀释；使修饰的核酸样品沉淀；以及将修饰的核酸样品反应以除去磺酸基。核酸的变性可以通过例如碱处理来进行。
在另一个实施方案中，本发明提供了处理核酸的方法，包括：
(a)为核酸样品提供变性的环境；
(b)将核酸样品与亚硫酸氢盐试剂反应并将反应保温以形成被处理的核酸样品，使核酸样品中任何甲基化的核苷酸保持不变，而未甲基化的核苷酸被转变为另一种形式；
(c)将被处理的核酸样品稀释以便使盐浓度减少到基本上不干扰核酸沉淀步骤的水平；
(d)将稀释的被处理的核酸沉淀，以便从容器中基本上除去任何不想要的试剂或稀释剂；以及
(e)对沉淀的被处理的核酸进行脱磺酸基，以便除去被处理的核酸中存在的磺酸基，从而获得基本上不含磺酸基的核酸样品，同时又不诱导大量的链断裂。
该方法典型地可以保留大约50％以上样品中的初始核酸，一般能保留大约75％以上，甚至保留大约95％以上。本发明的方法可以被实施而不引起核酸样品任何实质上的降解或损失。与此相反，目前使用或在现有技术中描述的亚硫酸氢盐方法典型地导致核酸样品多达大约96％的损失，以至于只有大约4％的核酸实际上可用于分析。
该方法还可以包括：
(f)进一步加工或分析被处理的核酸样品。
样品可以包含DNA或RNA或DNA和RNA二者的组合。
与现有技术中的方法不同，不需要将被处理的核酸与亚硫酸氢盐试剂完全分开或分离。也不需要使用例如现有技术方法中所需要的层析分离方法。本发明的稀释步骤有助于使样品的损失最小化。
本发明还涉及含有用于实施本发明的方法的试剂和说明书的试剂盒。
在整个本说明书中，除非上下文有另外的需要，单词“包含”或其变形“包括”或“含有”，将被理解成包含了被陈述的要素、整数或步骤，或一组要素、整数或步骤，但是不排除任何其它的要素、整数或步骤，或一组要素、整数或步骤。
对包含在本说明书中的任何文件、法案、材料、装置、文章等的讨论仅仅是出于为本发明提供背景的目的，并非承认由于在本申请的每个权利要求的优先权日期已经在澳大利亚存在了，任何或所有这些主题就构成了现有技术基础的组成部分或属于本发明相关领域中的常识。
为了使本发明可以被更清楚地理解，将参考下面的附图和实施例对优选实施方案进行描述。
附图简述
图1显示了HGS亚硫酸氢盐方法和传统的亚硫酸氢盐方法(Clark等，(1994)Nucleic Acids Res.22：2990-2997)之间从不同的组织样品得到的亚硫酸氢盐处理的DNA回收率的比较。孔#1是从2个LNCaP细胞提取并用亚硫酸氢盐处理的DNA；孔#2是从20个LNCaP细胞提取并用亚硫酸氢盐处理的DNA；孔#3是从200个LNCaP细胞提取并用亚硫酸氢盐处理的DNA；孔#4是从2000个LNCaP细胞提取并用亚硫酸氢盐处理的DNA；孔#5是从20000个LNCaP细胞提取并用亚硫酸氢盐处理的DNA。HGS方法显示在左边(标明为1-5的道分别对应于上面的说明)；传统的亚硫酸氢盐方法显示在右边(标明为1-5的道分别对应于上面的说明)。
图2显示了用HGS亚硫酸氢盐处理从前列腺癌细胞学Du145提取的RNA所获得的结果与使用常规的亚硫酸氢盐方法处理获得的结果的比较。道1是未处理的对照RNA，道2是用亚硫酸氢盐在4℃处理过夜的RNA，道3是用亚硫酸氢盐在室温处理过夜的RNA，道4是用亚硫酸氢盐在55℃处理过夜的RNA。道5是用亚硫酸氢盐在室温处理过夜的RNA平行样#2，道6是用亚硫酸氢盐在室温处理过夜的RNA平行样#3。道7是使用常规方法(Clark等1994)用亚硫酸氢盐在室温处理过夜的RNA。M是分子量标记物。
图3显示了在不同的温度下保温时RNA稳定性的时间过程实验。从结果可以看出在保温的第一个30分钟发生了少量的降解，然后却达到了几乎稳定的状态，随后损失很小，即使是在55℃保温16小时以后。
图4显示了对亚硫酸氢盐转化的RNA和野生型RNA所进行的反转录酶PCR。可以看到，在亚硫酸氢盐处理的RNA中有强烈的PCR扩增信号，其大小与野生型RNA中的带相同。道1是使用亚硫酸氢盐引物扩增亚硫酸氢盐处理的人β-肌动蛋白RNA的外显子3和4的RT-PCR扩增。道2是使用亚硫酸氢盐引物扩增亚硫酸氢盐处理的人β-肌动蛋白RNA的外显子3的RT-PCR扩增。道3是使用野生型引物扩增人β-肌动蛋白RNA的外显子3和4的RT-PCR扩增。道4是使用野生型引物扩增人β-肌动蛋白RNA的外显子3的RT-PCR扩增。M是分子量标记物。NB表示当亚硫酸氢盐处理的扩增引物用于野生型RNA时没有观察到PCR扩增，此外当野生型引物用于亚硫酸氢盐处理的RNA时没有观察到PCR信号。
图5确认了对图4中产生的PCR产物是来自亚硫酸氢盐处理的基因组RNA。箭头指示了人β-肌动蛋白转录本中外显子3和4之间的剪接位点。
实施本发明的方式
下面对处理核酸的实施方案进行非限制性的详细描述。
本发明提供了处理和分析核酸的方法。该方法的优点在于它们提供了简单高效的修饰核酸的方法，并且可用于例如检测基因组DNA或RNA的甲基化形式或甲基化的变化。相对于目前已知的方法，本发明的方法提供了简化的步骤，能获得较高的产量和较高分子量的核酸分子，因此允许分析较少量的核酸，并易于应用于大量的样品。
本发明提供了处理核酸的方法，包括：
(a)将核酸样品变性；
(b)将核酸样品与亚硫酸氢盐试剂反应并将反应保温，以便形成被处理的核酸样品，其中核酸样品中任何甲基化的核苷酸保持不变，而未甲基化的核苷酸被转变为另一种形式；
(c)将被处理的核酸样品稀释以便使盐浓度减少到基本上不干扰核酸沉淀步骤的水平；
(d)将稀释的被处理的核酸沉淀，以便从被处理的核酸样品中基本上除去任何不想要的试剂或稀释剂；以及
(e)对沉淀的被处理的核酸进行脱磺酸基，以便除去被处理的核酸中存在的磺酸基，从而获得基本上不含磺酸基的核酸样品。
可以通过例如给DNA样品提供碱性环境来进行核酸样品的变性。该方法在分析DNA核酸样品中特别有用。RNA样品的变性可以通过将RNA加热以解开二级结构来进行。加热一般高达约95℃，优选在约50℃到70℃之间。但是应该认识到，温度的选择优选使RNA变性以除去二级结构，但不破坏或扰乱RNA分子。
脱磺酸基步骤一般在受控制的条件下进行以除去被处理的核酸中存在的磺酸基。该方法的优点在于它们可以被实施，而核酸样品例如DNA链不被打破或剪切到严重的程度。这样的方法对于RNA样品来说特别具有优势，因为象常规亚硫酸氢盐方法中所描述的加入碱的步骤将导致总RNA的降解。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了处理核酸的方法。该方法可以包括下列步骤：将核酸样品变性；将核酸样品与亚硫酸氢盐试剂保温，从而用磺酸基团修饰甲基化的核苷酸；将修饰的核酸样品稀释；将修饰的核酸样品沉淀；以及对修饰的核酸样品进行反应以除去磺酸基团。核酸的变性可以通过例如用碱处理、加热、或添加其它能够导致单链核酸形成的化学或蛋白试剂来进行。
该方法典型地导致样品中起始核酸被保留多于大约50％，一般多于大约75％，可以多于大约95％。本发明的发明人已经发现该方法可以被实施而不引起核酸样品任何实质性的降解或损失。与此相反，目前使用或在现有技术中描述的亚硫酸氢盐方法典型地导致核酸样品多达大约96％的损失。
该方法还可以包括：
(f)加工或分析被处理的核酸样品。
样品可以包含DNA或RNA或DNA和RNA二者的组合。
样品可以从组织、细胞制备，或可以是任何生物样品例如血液，尿液，粪便，精液，脑脊液，从来源例如脑、结肠、泌尿生殖器、肺脏、肾脏、造血组织、乳腺、胸腺、睾丸、卵巢、子宫获得的洗出液、细胞或组织，来自胚胎或外胚层的组织，环境样品，植物，微生物包括细菌、细胞内寄生病毒、真菌、原生生物、类病毒等。描述得最详尽的适合使用本发明处理的细胞类型被概述在B.Alberts等，1989，《The Molecular Biology of the cell<细胞的分子生物学>》第二版，Garland出版公司，纽约和伦敦，995-997页中。
对来自人、动物、植物、细菌和病毒的样品的DNA或RNA中5-甲基胞嘧啶残基的分析意味着覆盖所有的生命周期阶段，在所有的细胞、组织和器官中从受精直到死后48小时，以及可能来自组织学来源例如显微镜载玻片的样品，包埋在块中的样品，体液或提取自合成的或天然的表面或液体的样品。
分析意味着包括了健康个体(按照WHO定义的健康)的细胞、组织和器官之间天然发生的变化，以及来自患病个体的细胞、组织和器官。这种意义上的患病包括所有在《Harrison’s Principles of InternalMedicine》(第12版，Jean D Wilson等主编，McGrraw Hill Inc.)以及后续版本中描述或提到的人类的疾病、痛苦、失调和不正常的症状；以及在OMIM(在线人类孟德尔式遗传(Online Mendelian Inheritance inMan)，www.ncbi.gov)中所描述的所有疾病、痛苦、失调和不正常的症状，但是着重于死亡的主导原因，即恶性肿瘤(癌症)、缺血性心脏病、脑血管病、慢性障碍性肺病、肺炎和流感、动脉病(包括动脉粥样硬化和主动脉瘤)、糖尿病和中枢神经系统疾病，以及社交衰弱症状例如与神经精神状况相关的焦虑、紧张，以及肥胖症和所有由异常的染色体数量或染色体重排(包括常染色体和性染色体的异倍性、重复、缺陷、移位和插入)所引起的症状，以及线粒体基因组的类似畸变。
正常或患病的个体可以来自(i)不同种族和进化谱系的种群；(ii)菌株和地理上分离株；(iii)亚种；(iv)孪生子或同样或不同性别的较高级别的多胞子；(v)通过正常的接合方法、人工授精、胚胎干细胞方法克隆、或通过核转移(来自体细胞系或生殖细胞系的核)、或通过线粒体或其它细胞器的输入或修饰而产生的个体；(vi)从转基因敲除、敲入、拆卸方法得到的个体(体内、离体或基因活性被暂时或永久改变的任何方法，基因活性的改变通过例如RNAi、核酶、转座子活化、药物或小分子方法、肽核酸(PNA)、插入核酸(INA)、阿卓糖醇核酸(ANA)、己糖醇核酸(HNA)、锁核酸(LNA)、环己基核酸(CNA)等，或基于核酸的接合，包括但不限于Trojan肽)，或处于正常怀孕或宫外孕任何阶段的个体。
分析也包括来自与人类疾病的细胞外和细胞内方式相关的原核和真核生物和病毒(或其组合)的DNA或RNA中的5-甲基胞嘧啶残基，目的在于在正常变化和疾病系统中确定和治疗性地改变下列情况的变化的参数和潜在的机制：
(I)遗传疾病；
(II)由环境诱导因素引起的非遗传的或后成的疾病，不管它们是生物起源、还是非生物起源的、(这种意义上的环境也包括生物体本身内部的环境、在怀孕的所有阶段中的环境、或在生育或不育治疗条件下的环境)；
(III)遗传或非遗传疾病的诱因，包括由“朊病毒”类型的因子、暴露于压力变化和失重、或辐射效应所带来的影响；
(IV)在所有的细胞类型、组织、器官系统和生物网络的衰老过程中，包括与衰老相关的压抑、疼痛、神经精神和神经变性症状和绝经前后的症状(包括在两种性别中生育力的降低)中的5-甲基胞嘧啶的变化；
(V)在癌症中5-甲基胞嘧啶的变化(包括在具有由DNA扩增、缺失、重排、移位和插入事件引起的异常核型的细胞中的变化)，以及它们在不同的细胞周期现象(包括细胞周期对昼夜节律、光周期、睡眠、记忆和时差综合症的影响)中的变化或改变；
(VI)在最广阔的意义上定义的代谢网络中5-甲基胞嘧啶的变化，从受精卵开始，经过胚胎形成、胚胎发育、出生、青春期、成年期和老年期(包括由低氧、缺氧、任何类型的辐射(离子化的或非离子化的、或来自化学治疗疗法、高度暴露于附近天然来源的辐射例如岩石、或来自军事或政府资助的活动的放射性尘埃的辐射)、紧张或由线粒体、核或细胞器基因组之间不平衡所引起的代谢效应)；
(VII)在分子、细胞、组织、器官和整个生物体水平上由于对蛋白、多肽、肽、以及DNA、RNA、PNA、INA、ANA、HNA、LNA、CNA等、或肽适配子(aptamers)(包括任何带有翻译后添加物、翻译后水解产物、翻译后修饰(例如内含肽(inteins)和外显肽(exeins)、泛醌化和降解产物的肽适配子)，含有稀有天然氨基酸的蛋白、多肽和肽，以及单独的稀有氨基酸例如参与学习、脑生长和细胞死亡的D-丝氨酸，药物、生物药物、化学实体(化学实体和生物药物的定义见G.Ashton，2001，Nature Biotechnology 19，307-3111)、代谢物、新的盐类、药物前体、现有化合物的酯、疫苗、抗原、聚酮化合物、非核糖体肽、维生素和来自任何天然来源的分子(例如植物来源的环杷明(cyclopamine))做出反应而引起的5-甲基胞嘧啶的变化；
(VIII)在分子、细胞、组织、器官和整个生物体水平上由于对DNA和RNA病毒做出反应而引起的5-甲基胞嘧啶的变化，这些病毒无论是单链或双链的、外部来源或内部激活的，例如内源转座子或反转座子(SINES和LINES)；
(IX)在分子、细胞、组织、器官和整个生物体水平上由于对RNA转录本的反转录拷贝做出反应而引起的5-甲基胞嘧啶的变化，这些转录本无论是基因或非基因来源的(或者含有内含子或者不含)；
(X)在分子、细胞、组织、器官和整个生物体水平上由于对下列物质做出反应而引起的5-甲基胞嘧啶的变化：(a)DNA、RNA、PNA、INA、ANA、HNA、LNA、CNA等(或任何DNA、RNA、PNA、INA、ANA、HNA、LNA、CNA、适配子的所有组合)；包括在所有的体液，包括血液、脑脊液以及怀孕以前、期间和以后的母体体液中循环的DNA、RNA、PNA、INA、ANA、HNA、LNA、CNA等分子；
(b)结合的生物分子的组合，这些分子是肽和核酸的嵌合体，或天然的分子例如胆固醇基团、激素和核酸的嵌合体；以及
(XI)由于对干细胞做出反应而引起的5-甲基胞嘧啶的变化(可以是体内、离体，也可以是与新的环境或天然的和合成的基质(或其组合)相关的)，干细胞是人和动物来源的，受到了前面(i)到(x)中描述的任何微扰。
可以使用任何适当的方法获得核酸材料。例子包括但不限于可购买到的DNA/RNA试剂盒或试剂、工作站、含有蛋白酶试剂的标准细胞裂解缓冲液以及本领域的专业技术人员熟知的有机提取步骤。
本方法可以在反应容器中进行。反应容器可以是任何适当的容器，例如试管、平板、毛细管、孔、离心管、微量离心管、载玻片、盖玻片或任何适当的表面。本方法一般在一个反应容器中进行以便减少核酸样品降解或损失的可能性。
一般来说，通过加入碱例如NaOH或通过对含有核酸的样品加热来为样品提供变性环境。提供碱性的环境可以将双链的DNA分子变性，成为分子容易与亚硫酸氢盐试剂进行反应的状态。但是应该认识到，任何其它的变性方法例如热处理或其它适合的碱或变性试剂也可以加入或使用，例如KOH以及任何其它的碱，只要变性试剂的使用不显著抑制后面的步骤就可以。这对于RNA的分析可能是重要的，因为碱导致RNA分子的降解，因此另一种方法例如热变性是合乎需要的。
一般来说，亚硫酸氢盐试剂是偏亚硫酸氢钠。使用亚硫酸氢盐试剂引起胞嘧啶碱基磺化形成胞嘧啶磺酸盐，然后胞嘧啶磺酸盐通过水解脱氨基成为尿嘧啶磺酸盐。但是应该认识到，任何其它合适的亚硫酸氢盐试剂也可以使用，例如亚硫酸盐或乙酸离子(参见Shapiro，R.，DiFate，V.，和Welcher，M.，(1974)J.Am.Chem.Soc.96：906-912)。
与磺化试剂保温可以在pH低于7以及有助于尿嘧啶磺酸基形成的温度下进行。优选低于大约7的pH来进行磺化反应，该反应将胞嘧啶碱基转化为胞嘧啶磺酸盐，然后再转化为尿嘧啶磺酸盐。但是，如果需要，本发明的方法中的磺化反应可以在pH高于7下进行。
磺化反应可以在存在能够增强亚硫酸氢盐反应的添加剂的情况下进行。合适添加剂的例子包括但不限于对苯二酚、尿素、甲氧胺。在这些试剂中，对苯二酚是还原试剂。尿素和甲氧胺试剂的加入可以改进亚硫酸氢盐反应的效率。应该意识到其它的添加剂或试剂也可以提供用来辅助亚硫酸氢盐反应。
磺化反应导致核酸样品中甲基化的胞嘧啶保持不变，而未甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶。
工作良好的反应条件如下。将要被处理的变性DNA或其它核酸补足到20μl的体积。然后加入208μl新鲜配制的2M偏亚硫酸氢钠(BDHAnalaR#10356.4D)，pH为5.0(pH通过加入10M的氢氧化钠(BDHAnalaR#10252.4X)来调整)的溶液，以及12μl 10mM的对苯二酚溶液(BDH AnalaR#103122E)。加入的对苯二酚的浓度可以是大约10到500mM范围内的任何浓度，由实验所确定。然后将溶液混合，并用208μl矿物油(Sigma分子生物学级M-5904)覆盖。接着将样品留在适当的温度下过夜，例如室温或其它适当的温度，以便有充分的时间完全进行亚硫酸氢盐转化。本领域的专业技术人员将会理解，上述的体积、浓度以及保温时间和温度仅仅是示例性的，它们可以被改变，只要反应条件适合于核酸的磺化。此外也将会理解，本发明方法的步骤的次序可以被改变，只要磺化和脱磺酸基的步骤可以充分地实施。
稀释步骤的实施是为了使抑制后面反应的盐类不与磺化的核酸共沉淀。盐浓度被稀释到低于大约1M。一般来说，稀释步骤的实施使用水或缓冲液，以便将盐浓度减少到低于大约0.5M。例如，盐浓度一般被稀释到低于大约1mM到大约1M，具体来说，如果需要，可以稀释到低于大约0.5M，低于大约0.4M，低于大约0.3M，低于大约0.2M，低于大约0.1M，低于大约50mM，低于大约20mM，低于大约10mM，或甚至低于大约1mM。本领域的专业技术人员可以容易地确定适合的稀释度，以减小盐与核酸的沉淀，以便后面的步骤可以在使核酸样品进一步的清理或操作最少化的情况下实施。稀释一般在水中进行，但是也可以在任何适当的缓冲液中进行，例如Tris/EDTA或其它生物缓冲液，只要缓冲液不显著地沉淀或引起盐与核酸显著地沉淀以至于抑制后面的反应。
与现有的技术方法不同，不需要将被处理的核酸与亚硫酸氢盐试剂完全分开或分离。也不需要使用例如现有技术方法中所需要的层析分离方法。本发明的稀释步骤有助于使样品的损失最小化。
一般来说，沉淀是使用沉淀剂例如醇类来进行的。用于沉淀核酸的示例性的醇类可以从异丙醇、乙醇或任何其它适合的醇类中选择。
脱磺酸基步骤可以通过将沉淀的被处理的核酸的pH调整到高达大约12.5来进行。暴露于碱性环境往往促进链在核酸中被以前暴露到酸性pH所诱导的脱嘌呤位点断裂。因此，如果要避免链断裂，碱性pH处理应该最小化。该步骤可以使用适当的缓冲液或碱性试剂在大约pH10.5有效地进行。适当的缓冲液或碱性试剂的例子包括pH7.0-12.5的缓冲液。本领域的专业技术人员将会认识到，适当的缓冲液或碱性试剂可以从广范围的可以获得的已知缓冲液和碱性试剂中选择。
脱磺酸基步骤的温度范围是室温到大约96℃，时间可以从2分钟到96小时或以上的范围内根据所用的条件而改变。本领域的专业人员可以容易地确定实施脱磺酸基反应的适合时间和温度。低于室温的温度也可以使用，只要将保温时间增加使脱磺酸基充分。因此，保温步骤可以在大约10℃、大约20℃、大约22℃、大约25℃、大约30℃、大约35℃、大约37℃、大约40℃、大约45℃、大约50℃、大约55℃、大约60℃、大约65℃、大约70℃、大约75℃、大约80℃、大约85℃、大约90℃、大约95℃、大约96℃下进行。实施脱磺酸基反应的特别有用的温度是大约55℃。这些以及其它的保温和/或反应步骤可以同样地在上述的各种温度下实施，只要反应步骤充分地进行。
本发明提供了对甲基化核酸进行有效表征的方法。该方法允许对核酸样品实施有效的磺化和脱磺酸基步骤。但是，应该理解磺化和脱磺酸基步骤都不需要实施到反应完成，只要实施到足以如本文公开的随后对甲基化核酸的表征。本领域的专业人员可以容易地确定这些步骤是否应该实施到接近完成，或者未完成的反应是否足以进行所需的分析。例如，当使用小量的细胞或小量的核酸样品时，一般需要进行更完全的反应。当要表征较大量的核酸样品时，可以进行较不完全的反应，而仍然能够提供足够的反应产物用于后面核酸样品的甲基化状态分析。
正如本文所公开的，本发明提供了方便地处理核酸的方法。正如本文所公开的，该方法可以用于分析核酸种群的甲基化状态，作为对细胞、组织或生物体的状态的度量。本发明的方法与以前使用的处理核酸的方法相比提供了几个优点。一个优点是本发明的方法允许省略了传统上在磺化反应后用于核酸样品脱盐的层析步骤(Clark等，1994Nucleic Acids Res.22：2990-2997)。层析步骤导致磺化的核酸样品的损失，这在用小量的起始材料进行工作时可能是特别严重的问题。
本发明的另一个优点是脱盐步骤以高效的方式通过稀释盐浓度和沉淀核酸来进行。稀释步骤将盐浓度减少到一定量以下，使得当核酸被沉淀时，该盐浓度不会干扰后面的步骤例如脱磺酸基步骤。沉淀步骤是高效的，还任选包含增加核酸沉淀效率的载体。本发明的方法使核酸样品的损失最小并增加了核酸样品的回收率。因此，本发明的方法还提供了其它的优点，允许使用甚至更少量的起始材料并且对甲基化进行有效的表征。本发明提供的方法，通过用简单的稀释和沉淀方法代替烦琐和低效的层析分离方法在从核酸中除去任何不想要的试剂或稀释剂的步骤中，对Clark等，1994 Nucleic Acids Res.22：2990-2997的方法进行了改进。
此外，微碱性pH的缓冲溶液的使用可以减少目的核酸变得基本上被片段化的可能性。将缓冲溶液的pH增加到远高于pH12.5以上，已经被证实导致了非常显著的高分子量核酸的片段化。因此，当希望最小化这样的片段化时，一般使用低于大约pH11的碱性pH。
本发明的另一个优点是对于每个样品来说反应可以在单一的管或容器中进行，因此最小化了样品的损失，并允许进行大量样品的处理。与以前的方法相比，本发明的方法的另一个优点是核酸一旦被磺化，就可以重新悬浮在具有碱性pH的缓冲液中进行脱磺酸基步骤，而不需要象在Clark等1994所描述的方法中那样加入强碱，然后除去盐类。
另一个优点是本发明的方法允许在处理前用限制性内切酶任选消化。为了进行成功的处理和扩增，传统的亚硫酸氢盐处理方法一般包含了用限制性内切酶消化的起始步骤，因此不适用于长距离PCR反应。但是本发明的方法在磺化反应前不需要用限制性内切酶预先消化，这既省略了操作步骤，同时又保留了对较长片段进行PCR的选择。
本发明的方法可以用于表征细胞、组织或生物体甲基化状态。本发明的方法也可以与基因组测序方法结合使用，例如Frommer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1827-1831(1992)所描述的那些方法，在此引为参考。
本发明还提供了确定样品的甲基化状态的方法。对样品来说，该方法的实施可以使用本发明的处理核酸的方法，即HGS方法。确定样品的甲基化状态的方法可以用测试样品和对照样品平行地进行，以便样品的甲基化状态可以相对于参比样品进行比较和确定。例如，可以对样品进行比较，以确定普遍来说或在特定位点上甲基化是增加还是减少了。这种确定可以用于诊断和/或确定本文讨论的疾病的预后。本方法还可以包含例如在诊断应用中报告样品的甲基化状态。
本发明的方法特别适合于使用在试剂盒中。这样的试剂盒一般来说包含了实施本发明所需的试剂和说明书。通过提供适当的试剂盒，有可能允许终端用户进行关于甲基化核酸的工作，并获得可重复的一致的结果。
可以理解，本发明方法的成分可以以试剂盒的形式提供。试剂盒可以含有适当的化学试剂、反应管和说明书以实施本发明的方法。
实施例
方法和试剂
化学药品如下获得：琼脂糖来自BioRad(Hercules CA；被证实为分子生物学级，#161-3101)；冰乙酸来自BDH(Kylsyth，Australia；AnalaR 100015N)；乙二胺四乙酸(EDTA)来自BDH(AnalaR10093.5V)；乙醇来自Aldrich(St.Louis MO；200 proof E702-3)；异丙醇来自Sigma(St.Louis MO；99％+Sigma I-9516)；矿物油来自Sigma(M-5904)；3M的乙酸钠溶液来自Sigma(S-7899)；氯化钠来自Sigma(ACS试剂S9888)；以及氢氧化钠来自BDH(AnalaR#10252.4X)。
酶/试剂如下获得：EcoRI来自Roche(Indianapolis IN；#87930626，10单位/μl)；HindIII来自Biolabs(Beverly MA；#R01045，10单位/μl)；PCR master混合物来自Promega(Madison WI；#M7505)；以及DNA分子量标准来自Sigma(直接上样的PCR低分子量标准100-1000bp，Sigma D-3687和100-10Kb，Sigma D-7058)。
溶液如下：(1)10mM Tris/0.1M EDTA，pH7.0-12.5；(2)3M NaOH(6克溶于50ml水中，BDH AnalaR#10252.4X)；(3)2M偏亚硫酸氢盐(7.6克溶于20ml水中，加入416μl 10N NaOH(BDH AnalaR#10356.4D))；(4)10mM对苯二酚(0.055克溶于50ml水中；BDH AnalaR#103122E)；(5)50X TAE凝胶电泳缓冲液(242克Tris碱，57.1ml冰乙酸，37.2克EDTA，加水到1升)；以及(6)5X琼脂糖凝胶载样缓冲液(1ml 1％的溴酚蓝(Sigma B6131)，1ml二甲苯蓝(Sigma X-4126)，3.2ml甘油(Sigma G6279)，8μl 0.5M EDTA pH8.0，200μl 50XTAE缓冲液，加水到10ml)。
组织和细胞学
组织和细胞学如下获得：HeLa(宫颈癌细胞学，ATCC CCL-2)；LNCaP(前列腺癌细胞学，ATCC#CRL-10995)；HepG2(肝癌细胞学；ATCC#HB-8065)；以及MCF-7(乳腺癌细胞学，ATCC#HTB-22)从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。
为了制备用于LNCaP细胞生长的T培养基，如下的试剂除了特别指明外，从Gibco/BRL或Invitrogen获得：DMEM干粉10X小袋(10x1L；#31600-034)；F-12K Kaighn氏修改的营养混合物(500ml；#21127-022)；L-谷氨酰胺，200mM(100ml；#25030-081)；青/链霉素5000U/ml，5000μg/ml(100ml#15070-063，痕量热源)；胎牛血清(500ml；#15-010-0500V Sigma)；胰岛素(牛胰)(100mg；#1882)；转铁蛋白(人)(10mg；#T5391)；α-生物素(500mg；#B4639)；腺嘌呤(5g；#A3159)；T3(#T6397或#T5516)。
T培养基(500ml)如下配制：DMEM储存溶液通过每升加入3.7克碳酸氢钠并将pH调整到7.2-7.4之间而制备。在400ml DMEM储存溶液中加入下列试剂：100ml F-12K、250μl胰岛素(10mg/ml)、1.0mlT3(500x；三碘甲腺原氨酸；6.825ng/ml)、1.0ml转铁蛋白(500x；2.5mg/ml)、1.0ml生物素(500x；0.122mg/ml)、4.0ml腺嘌呤(125x；3.125mg/ml)、5.5ml青/链霉素(100x；5000μg/ml)、以及5.5ml谷氨酰胺(100x；200mM)。过滤除菌后，加入50ml胎牛血清，使浓度达到10％。
表1列出了在下面的实验中使用的细胞学及生长条件。
  名称   细胞类型   生长条件
BL13 膀胱癌   RPM1+10％HIFCS1∶3分用，每周2次
DU145 前列腺癌(未甲基化)   RPM1+10％HIFCS+2mM谷氨酰胺1∶6分用，每周2次
HeLa 宫颈腺癌   起始的快速生长使用RPM1+10％HIFCS，然后的较慢生长使用DMEM+10％HIFCS1∶10分用，每周2次
HepG2 肝脏腺癌   DMEM(高葡萄糖4.5g/l)+10％HIFCS+2mM谷氨酰胺1∶4分用，每周2次
LNCAP 前列腺癌(甲基化的)   DMEM(低葡萄糖)+10％HIFCS+2mM谷氨酰胺+多种其它营养物，参见LNCaP生长方法
MCF7 乳腺癌   RPM1+10％HIFCS1∶6分用，每周2次
从全血中纯化T细胞和CD34+细胞
样品从悉尼皇家北岸医院(Royal North Shore Hospital)一个经历了白细胞除去术的病人获得。样品的获得预先得到了伦理委员会的批准。使用Ficoll Paque plus(Amersham Biosciences#17-1440-03；Piscataway NJ)按照制造商的说明将白细胞浓缩。T细胞和CD34+细胞分别使用CELLection CD2 Dynabeads(Dynal#116.03；Lake SuccessNY)和Dynal CD34始祖细胞选择系统(Dynal#113.01)按照制造商的说明从白细胞中分离。
使用了下列设备：PCR仪是ThermalHybaid PX2(Sydney，Australia)，凝胶记录系统是Kodak UVltec EDAS 290(Rochester NY)，微量离心机是Eppendorf 5415-D(Brinkman Instruments；WestburyNY)。
DNA扩增
PCR扩增在含有2μl亚硫酸氢盐处理的基因组DNA的25μl反应混合物中进行，使用Promega PCR master混合物，每种引物6ng/μl。用于从亚硫酸氢盐处理的DNA扩增GSTP1的链特异性的嵌套引物是GST-9(967-993)TTTGTTGTTTGTTTATTTTTTAGGTTT(SEQ ID NO：1)(F)，GST-10(1307-1332)AACCTAATACTACCAATTAACCCCAT(SEQ ID NO：2)(R)，GST-11(999-1027)GGGATTTGGGAAAGAGGGAAAGGTTTTTT(SEQ ID NO：3)(F)，GST-12(1281-1306)ACTAAAAACTCTAAAAACCCCATCCC(SEQ IDNO：4)(R)。引物的位置按照GSTP1序列(GenBank登记号M24485；Morrow等，Gene 75：3-11(1989))标明。
RNA纯化
Du145细胞在T75组织培养瓶中在上述的条件下生长至90％汇合。将培养基丢弃，加入3ml Trizol(Invitrogen Cat#15596-026)，样品如下处理：
I、样品完全混合，室温放置5分钟使核蛋白复合物解离。
II、然后将样品在4℃下12000Xg离心10分钟以除去高分子量DNA和其它污染物。
III、将上清液转移到干净的管中，加入100μl 100％的氯仿，用手将样品剧烈混合15秒，然后在室温保温2-3分钟。
IV、然后将样品在4℃下12000Xg离心10分钟使相分离。
V、将上层水相转移到干净的管中，确保吸管头不接触到界面，加入1μl 20mg/ml的糖原，将样品震荡混合。
VI、加入等体积(0.25ml)的100％，震荡管子，然后在室温放置10分钟。
VII、然后将样品在4℃下12000Xg离心10分钟使RNA沉淀。
VIII、取出上清液，用0.75ml 80％的乙醇清洗沉淀以除去cDNA合成反应的抑制剂，简单震荡，然后在4℃下7500Xg离心5分钟使RNA沉淀。
IX、重复步骤VIII一次。
X、然后将沉淀在微量离心机中离心10秒，除去残留的乙醇，将沉淀立即重新悬浮在25μl无RNase的水中。注意如果沉淀干透将很难重新悬浮RNA，260/280比率将低于1.6。
XI、然后记录OD 260/280/310。
XII、然后将纯化的RNA储存在-70℃，备用。
cDNA合成
cDNA合成使用superscript III(Invitrogen Cat#18080-044)和100ng随机heamers(Invitrogen Cat#48910-011)按照制造商说明书的推荐进行。
RNA扩增
PCR扩增在含有2μl亚硫酸氢盐处理的反转录的基因组RNA的25μl反应混合物中进行，使用Promega PCR master混合物，每种引物6ng/μl。用于从亚硫酸氢盐处理的RNA扩增肌动蛋白的链特异性的引物是ActinBS-3A(2076-2097)TTAATATTTTAGTTATGTATGTTGT(SEQID NO：5)；ActinBS-4(2720-2744)CTTCATTATACTAAATACCAAA(SEQ ID NO：6)。
用于野生型肌动蛋白RNA的对照引物也被包括，以确保扩增的RNA是源自亚硫酸氢盐转化的RNA而不是源自野生型RNA。合成了下面的野生型引物：肌动蛋白野生型3A(2076-2097)TCAACACCCCAGCCATGTACGTTGC(SEQ ID NO：7)，肌动蛋白野生型4(2720-2744)GATCTTCATTGTGCTGGGTGCC(SEQ IDNO：8)。引物的位置按照人类β-肌动蛋白基因序列(登记号M10277)标明。
核酸分离
在1％TAE中制备1％或2％的琼脂糖凝胶，每50ml琼脂糖中含有1滴溴化乙锭(CLP#5450)。目的(基因组的或PCR衍生的)DNA或RNA样品与五分之一体积5X的琼脂糖载样缓冲液混合，在X1TAE中使用水下水平电泳槽在125mA电泳。
DNA的传统亚硫酸氢盐处理
(Clark等，(1994)Nucleic Acids Res.22：2990-2997，在此引为参考)(现有技术方法导致极低的DNA产量)
基因组DNA(2μg)在20μl终体积中用EcoRI消化至少60分钟。在消化液中加入2.2μl 3M NaOH(50ml水中含6克NaOH，新鲜配制)，37℃保温15分钟。然后加入208μl 2M偏亚硫酸氢盐(7.6克偏亚硫酸氢盐溶于20ml水中，加入416μl 10M NaOH到pH5.0)，再加入12μl10mM对苯二酚(0.55克对苯二酚得到100mM，稀释10倍)。反应混合物用200μl矿物油覆盖，在50-55℃保温过夜。在保温结束时，除去矿物油，加入1μg酵母tRNA(Sigma R-8508)。
使用Wizard DNA清理系统(Promega#7280)按照制造商的说明书进行DNA脱盐。简单来说，在样品中加入1ml树脂，震荡样品。将样品通过2.5ml注射器缓慢压到柱子中。柱子用2ml 80％的异丙醇清洗，然后在微量离心机中14000rpm离心20秒。在柱子中加入50μl水，，将样品在室温放置1分钟。将柱子中的物质放入干净的1.5ml离心管，在微量离心机中14000rpm离心20秒。DNA被回收在洗脱液中，准备用于脱磺酸基反应。
为了从尿嘧啶中除去磺酸基，在洗脱的DNA中加入5.5μl 3MNaOH，将混合物在37℃保温15分钟。加入33.5μl NH4OAC(pH7.0)中和碱。加入330μl 100％的乙醇，反应混合物在-20℃保温60分钟。样品在14000rpm离心15分钟，将乙醇丢弃。将沉淀空气干燥，重新悬浮在10μl T/E(pH8.0)中。
核酸的HGS亚硫酸氢盐处理
下面给出了一个示例性的方案以证实本发明的亚硫酸氢盐处理方法的有效性。该方案导致成功地保留了几乎所有被处理的核酸。本发明的这种方法在此也被称为HGS亚硫酸氢盐方法。应该认识到样品或试剂的体积或量可以改变。
DNA变性
向如果需要预先用合适的限制酶消化的2μg DNA中，加入2μl(1/10体积)3M NaOH(50ml水中含6克NaOH，新鲜配制)到终体积为20μl。这个步骤将双链DNA分子变性成单链的形式，因为亚硫酸氢盐试剂优选与单链分子反应。混合物在37℃保温15分钟。可以在高于室温的温度保温以提高变性的效率。
RNA变性
2μg RNA重新悬浮在总体积20μl中，其中含有1μl RNase抑制剂(RNaseOUT Invitrogen Cat#10777-019 40U/μl)。然后将溶液在50℃加热2分钟，接着在冰上骤冷(可选)。该步骤将RNA分子变性成基本上不含二级结构的形式，因为亚硫酸氢盐试剂优选与单链分子反应。
DNA的亚硫酸氢盐处理
保温后，连续加入208μl 2M偏亚硫酸氢钠(7.6克偏亚硫酸氢钠溶于20ml水中，加入416ml 10N NaOH；BDH AnalaR#10356.4D；新鲜配制)和12μl 10mM对苯二酚(0.055克对苯二酚到50ml水中，BDH AnalaR#103122E；新鲜配制)。对苯二酚是还原试剂，帮助减少试剂的氧化。其它的还原试剂也可以使用，例如二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙醇、醌(甲代二氢醌)，或其它适当的还原试剂。样品用200μl矿物油覆盖。矿物油覆盖是为了防止试剂的蒸发和氧化，但不是必需的。然后将样品在55℃保温过夜。此外，样品可以在热循环仪中进行如下的循环：如下保温约4小时或过夜：第一步，在PCR仪中55℃循环2小时；第二步，95℃2分钟。第一步可以在任何温度下进行，从大约37℃到大约90℃，时间长度可以从5分钟到8小时之间变化。第二步可以在任何温度下进行，从大约70℃到大约99℃，时间长度可以从1秒到60分钟或更长之间变化。
在用偏亚硫酸氢钠处理后，将油除去，如果DNA浓度低的话加入1μg tRNA(20mg/ml)或2μl糖原。这些添加剂是可选的，可以用来增加与靶DNA共沉淀所获得的DNA的产量，特别是当DNA以低浓度出现时。当核酸量低于0.5μg时，一般希望使用添加剂作为载体以更有效地沉淀核酸。
异丙醇清理处理如下进行：在样品中加入800μl水，混合，然后加入1ml异丙醇。水或缓冲液将反应容器中的亚硫酸氢盐的浓度减少到盐不随着目的靶核酸沉淀的水平。稀释度一般为大约4倍或1000倍，只要盐浓度被稀释到低于本文公开的希望的范围。
样品再次混合，在4℃放置最少5分钟。样品在微量离心机中离心10-15分钟，沉淀用80％乙醇清洗2次，每次涡旋振荡。清洗处理除去了任何随着核酸沉淀下来的残留的盐。
将沉淀干燥，然后重新悬浮在适当体积例如50μl的T/E中(10mMTris/0.1mM EDTA)pH7.0-12.5。pH10.5的缓冲液被发现特别有效。样品在37-95℃保温1分钟到96小时，视悬浮核酸的需要而定。
上述的方法之前可以用一个或多个限制性内切酶消化。如下所述对同样的DNA样品进行了两个独立的限制性内切酶消化。消化选择的酶依赖于被扩增的序列。例如，用EcoRI在20μl体积中于37℃将2μg基因组DNA消化1小时。这个步骤用于将基因组DNA消化为较小的片段，它们比基因组DNA更易于亚硫酸氢盐转化。也可以使用超声或物理力将DNA剪切成较小的片段。超声的强度和超声的时间长度根据所希望的DNA片段的大小来选择。进行另一个消化反应，例如用HindIII如前所述消化2μg基因组DNA。对于预处理消化来说，可以选择这些酶或其它适合的限制性酶。被消化的DNA如前所述用偏亚硫酸氢盐进行处理。
RNA的亚硫酸氢盐处理
保温后，加入208μl 2M偏亚硫酸氢钠(7.6克偏亚硫酸氢钠溶于20ml水中，加入416ml 10N NaOH；BDH AnalaR#10356.4D；新鲜配制)。样品用200μl矿物油覆盖。矿物油覆盖是为了防止试剂的蒸发和氧化，但不是必需的。然后将样品在37-55℃保温3小时到过夜。此外，样品可以在热循环仪中进行如下的循环：如下保温4小时或过夜：第一步，在PCR仪中55℃循环2小时；第二步，70℃30秒。第一步可以在任何温度下进行，从大约37℃到大约90℃，时间长度可以从5分钟到8小时之间变化。第二步可以在任何温度下进行，从大约60℃到大约99℃，时间长度可以从1秒到60分钟或更长之间变化。
在用偏亚硫酸氢钠处理后，将油除去，如果RNA浓度低的话加入1μl糖原。该添加剂是可选的，可以用来增加与靶RNA共沉淀所获得的RNA的产量，特别是当RNA以低浓度出现时。当核酸量低于0.5μg时，一般希望使用添加剂作为载体以更有效地沉淀核酸。
异丙醇清理处理如下进行：在样品中加入800μl水，混合，然后加入1ml界丙醇。水或缓冲液将反应容器中的亚硫酸氢盐的浓度减少到盐不随着目的靶核酸沉淀的水平。稀释度一般为大约4倍或1000倍，只要盐浓度被稀释到低于本文公开的希望的范围。
样品再次混合，在室温放置15分钟。样品在微量离心机中离心10-15分钟，沉淀用80％乙醇清洗2次，在清洗之间进行涡旋振荡。清洗处理除去了任何随着核酸沉淀下来的残留的盐。
将沉淀干燥，然后重新悬浮在适当体积例如50μl的T/E中(10mMTris/0.1mM EDTA)pH7.0-12.5。pH10.5的缓冲液被发现特别有效。样品在37-95℃保温1分钟到96小时，视悬浮核酸的需要而定。
也可以使用超声或物理力将RNA剪切成较小的片段。超声的强度和超声的时间长度根据所希望的RNA片段的大小来选择。
结果
LNCaP细胞的DNA分析和PCR扩增的灵敏度
LNCaP细胞培养物在标准条件下生长到90％汇合。细胞用胰蛋白酶处理，清洗，然后使用血细胞计数器计数。然后将细胞稀释到含有表2中所示的大概细胞数量。然后使用MasterPure DNA纯化试剂盒(Epicentre#MCD85201；Madison WI)按照制造商说明书的描述将细胞裂解，使用上述的两种磺化方法对DNA进行修饰。
在精确地测定了细胞数量之后，培养物被分成2份放入1.5mleppendorf离心管中，在25μl T/E pH8.0中各含有100、1000、10000和100000个细胞。然后对细胞进行细胞裂解，使用MasterPure DNA纯化试剂盒(Epicentre#MCD85201)按照制造商说明书的描述进行。
将DNA重新悬浮在10μl T/E pH8.0中。然后用1单位EcoRI(Roche#87930626 10单位/μl)按照制造商说明书在终体积20μl中于37℃消化DNA1小时。
一组平行样用传统的亚硫酸氢盐方法(Clark等1994)处理DNA，另一组用HGS亚硫酸氢盐方法处理DNA。处理后将DNA重新悬浮在5μl T/E pH8.0中。
对1μl，即1/5最终重新悬浮样品体积的被处理的DNA进行PCR扩增，方法如下。PCR扩增在25μl反应混合物中进行，含有1μl亚硫酸氢盐处理的基因组DNA，使用Promega master混合物，每种引物6ng/μl。用于从亚硫酸氢盐处理的DNA扩增GSTP1的链特异性嵌套引物是GST-9(967-993)TTTGTTGTTTGTTTATTTTTTAGGTTT(SEQID NO ：1)(F)和GST-10(1307-1332)AACCTAATACTACCAATTAACCCCAT(SEQ ID NO：2)(R)，使用第一轮扩增条件。
1μl第一轮扩增产物被转移到含有下列引物的第二轮扩增反应混合物中：GST-11(999-1027)GGGATTTGGGAAAGAGGGAAAGGTTTTTT(SEQ ID NO：3)(F)和GST-12(1281-1306)ACTAAAAACTCTAAAAACCCCATCCC(SEQID NO：4)(R)。引物的位置按照GSTP1序列(GenBank登记号M24485)标明。PCR产物样品在ThermoHybaid PX2热循环仪中扩增，使用Clark等描述的条件。
在1％TAE中制备2％的琼脂糖凝胶，每50ml琼脂糖中含有1滴溴化乙锭(CLP#5450)。5μl PCR产物与1μl  5X的琼脂糖载样缓冲液混合，在X1 TAE中使用水下水平电泳槽在125mA电泳。分子量标准是低分子量的100-1000bp类型。凝胶在UV照射下观察，使用KodakUVIdoc EDAS 290系统。
表2显示了本发明的方法和Clark等的传统方法之间PCR扩增灵敏度的比较。
表2、使用HGS方法和传统的亚硫酸氢盐扩增步骤(Clark等，1994)对GSTP1基因进行PCR扩增的灵敏度比较
方法   PCR扩增的灵敏度
  20000   2000   200   20
  HGS   是   是   是   是
  传统   是   是   否   否
pH对亚硫酸氢盐处理的基因组DNA的降解的影响
用2单位EcoRI(Roche#87930626 10单位/μl)按照制造商的说明将2μg LNCaP DNA在终体积20μl中于37℃消化1小时。共进行8个单独的反应。
对每个消化产物进行DNA的HGS亚硫酸氢盐处理。处理后，每个单独的处理得到的DNA被重新悬浮在20μl T/E中，pH为7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5和12.5。
然后使用下面的方法将DNA保温。
处理方法1：HGS亚硫酸氢盐处理的基因组DNA被重新悬浮在pH10.5的缓冲溶液中，在37℃放置30分钟，然后进行PCR扩增。
处理方法2：HGS亚硫酸氢盐处理的基因组DNA被重新悬浮在pH10.5的缓冲溶液中，在37℃放置120分钟，然后进行PCR扩增。
处理方法3：HGS亚硫酸氢盐处理的基因组DNA被重新悬浮在pH10.5的缓冲溶液中，在55℃放置30分钟，然后进行PCR扩增。
在1％TAE中制备1％的琼脂糖凝胶，每50ml琼脂糖中含有1滴溴化乙锭(CLP#5450)。10μl基因组DNA样品与1/5体积(2μl)5X的琼脂糖载样缓冲液混合，在X1TAE中使用水下水平电泳槽在125mA电泳。分子量标准是100-10000bp范围的。凝胶在UV照射下观察并照相，使用Kodak UVIdoc EDAS 290系统。
样品的PCR分析
对1μl亚硫酸氢盐处理的DNA重悬浮样品如下描述进行PCR扩增。
PCR扩增在25μl反应混合物中进行，含有1μl亚硫酸氢盐处理的基因组DNA，使用Promega master混合物，每种引物6ng/μl。用于从亚硫酸氢盐处理的DNA扩增GSTP1的链特异性嵌套引物是GST-9(967-993)TTTGTTGTTTGTTTATTTTTTAGGTTT(SEQ ID NO：1)(F)和GST-10(1307-1332)AACCTAATACTACCAATTAACCCCAT(SEQ ID NO：2)(R)，使用第一轮扩增条件。
1μl第一轮扩增产物被转移到含有下列引物的第二轮扩增反应混合物中：GST-11(999-1027)GGGATTTGGGAAAGAGGGAAAGGTTTTTT(SEQ ID NO：3)(F)和GST-12(1281-1306)ACTAAAAACTCTAAAAACCCCATCCC(SEQID NO：4)(R)。引物的位置按照GSTP1序列(GenBank登记号M24485)标明。PCR产物样品在ThermoHybaid PX2热循环仪中扩增，使用Clark等1994中描述的条件。
在1％TAE中制备2％的琼脂糖凝胶，每50ml琼脂糖中含有1滴溴化乙锭(CLP#5450)。5μl PCR产物与1μl  5X的琼脂糖载样缓冲液混合，在X1TAE中使用水下水平电泳槽在125mA电泳。分子量标准是低分子量的100-1000bp类型。凝胶在UV照射下观察，使用KodakUVIdoc EDAS 290系统。
结果概述在表3中。表3结果的第一点证实当亚硫酸氢盐处理的基因组DNA溶液的pH低时，通过标准的PCR方法不能检测到明显的扩增信号。这可能是由于亚硫酸氢盐处理的基因组DNA脱磺酸基反应不完全。
表3的结果表明在pH和温度之间针对亚硫酸氢盐处理的基因组DNA的脱磺酸基反应的速度存在动态平衡。如果亚硫酸氢盐处理的基因组DNA保留在低pH的溶液中，那么脱磺酸基反应的速度非常慢，但是可以通过提高溶液的温度而加快。例如，有可能使亚硫酸氢盐处理的基因组DNA在pH7.0下于72℃加热并保留48小时，从而达到完全的脱磺酸基作用。同样地，在pH10.5下于72℃反应可以在5分钟内完成。因此，从室温到大约95℃的温度范围对本发明是适合的。pH范围从7.0到12.5以及保温时间从大约1分钟到大约96小时将是适合的。应该认识到各种可能的pH、时间和温度的组合将是适合的。
此外，如果样品用常规的方法处理，当亚硫酸氢盐处理的基因组DNA通过分子量排阻层析柱进行溶液脱盐时将有DNA的大量损失。非常可能将有至少50％亚硫酸氢盐处理的基因组DNA损失，如果不是更多的话，因为在现有工艺中使用的常规柱不是为了单链DNA材料设计的，有较大的损失。使用不含柱纯化步骤的HGS方法，损失将是很小的。
表3、pH对使用HGS方法进行亚硫酸氢盐处理的基因组DNA的降解的影响
  缓冲的DNA溶液的pH
  7.0   8.0   8.5   9.0   9.5   10.0   10.5   12.5
  高分子量DNA的降解   否   否   否   否   否   否   否   是
  缓冲的DNA溶液的pH
  PCR产物的产生   7.0   8.0   8.5   9.0   9.5   10.0   10.5   12.5
  处理方法1获得的PCR产物   否   否   否   否   否   否   否   是
  处理方法2获得的PCR产物   ND   ND   ND   ND   ND   微弱   是   ND
  处理方法3获得的PCR产物   ND   ND   ND   ND   ND   ND   是   ND
处理方法1：HGS亚硫酸氢盐处理的基因组DNA被重新悬浮在pH10.5的缓冲溶液中，在37℃放置30分钟，然后进行PCR扩增。
处理方法2：HGS亚硫酸氢盐处理的基因组DNA被重新悬浮在pH10.5的缓冲溶液中，在37℃放置120分钟，然后进行PCR扩增。
处理方法3：HGS亚硫酸氢盐处理的基因组DNA被重新悬浮在pH10.5的缓冲溶液中，在55℃放置30分钟，然后进行PCR扩增。
各种不同细胞学和组织的亚硫酸氢盐处理
1μg来自下列细胞学和组织样品的DNA用2单位EcoRI(Roche#87930626 10单位/μl)按照制造商的说明在终体积20μl中于37℃消化1小时，一式二份：LNCaP前列腺癌细胞学DNA、MCF-7乳腺癌细胞学DNA、BL-13膀胱癌细胞学DNA、HepG2肝癌细胞学DNA、HeLa宫颈癌细胞学DNA、从病人#1纯化的T细胞以及从病人#1纯化的CD34+细胞。
一组消化样品进行DNA的HGS亚硫酸氢盐处理。处理后，从每个单独样品获得的DNA被重新悬浮在20μl T/E pH10.5中，在55℃保温2小时。对另一组消化样品进行DNA的传统亚硫酸氢盐处理，在DNA被修饰后重新悬浮在20μl T/E pH8.0中。
样品的PCR分析
对1μl传统和HGS亚硫酸氢盐处理的DNA都进行PCR扩增。对于每个样品分析了6个单独的基因组位点，以确定HGS和传统的亚硫酸氢盐修饰方法所描绘的基因组覆盖范围。
PCR扩增在25μl反应混合物中进行，含有1μl亚硫酸氢盐处理的基因组DNA，使用Promega master混合物，每种第一轮基因特异性引物引物6ng/μl。1μl第一轮扩增产物被转移到第二轮扩增反应混合物中，其中含有第二轮基因特异性引物。PCR产物在ThermoHybaid PX2热循环仪中扩增，使用Clark等1994中描述的条件。
在1％TAE中制备2％的琼脂糖凝胶，每50ml琼脂糖中含有1滴溴化乙锭(CLP#5450)。5μl PCR产物样品与1μl 5X的琼脂糖载样缓冲液混合，在X1 TAE中使用水下水平电泳槽在125mA电泳。分子量标准是低分子量的100-1000bp类型。凝胶在UV照射下观察，使用Kodak UVIdoc EDAS 290系统。
用HGS亚硫酸氢盐方法处理的基因组DNA使用常规的PCR技术和设计来检测GSTP1基因的引物进行扩增。现有技术方法与本发明的方法之间比较的结果显示在表4中。
表4中的组织样品如下：
a)LNCaP前列腺癌细胞学DNA
b)MCF-7乳腺癌细胞学DNA
c)HepG2肝癌细胞学DNA
d)HeLa宫颈癌细胞学DNA
e)从病人#1纯化的T细胞
f)从病人#1纯化的CD34+细胞
图1显示了HGS亚硫酸氢盐方法和传统的亚硫酸氢盐方法(Clark等1994)之间从不同的组织样品得到的亚硫酸氢盐处理的DNA回收率的比较。孔#1是从2个LNCaP细胞提取并用亚硫酸氢盐处理的DNA；孔#2是从20个LNCaP细胞提取并用亚硫酸氢盐处理的DNA；孔#3是从200个LNCaP细胞提取并用亚硫酸氢盐处理的DNA；孔#4是从2000个LNCaP细胞提取并用亚硫酸氢盐处理的DNA；孔#5是从20000个LNCaP细胞提取并用亚硫酸氢盐处理的DNA。
从图1中可以看到，使用本发明的方法得到的DNA回收率远远高于现有技术方法的回收率。
表4、HGS方法与传统亚硫酸氢盐方法扩增步骤(Clark等1994)的全基因组扩增效率的比较
  HGS方法扩增的基因1-6   传统亚硫酸氢盐方法扩增的基因1-6
  组织   1   2   3   4   5   6   1   2   3   4   5   6
a   是   是   是   是   是   是   否   否   否   否   否   否
  b   是   是   是   是   是   是   否   是   是   否   否   否
c   是   是   是   是   是   是   是   是   是   是   否   是
  d   是   是   是   是   是   是   否   是   是   否   否   否
e   是   是   是   是   是   是   是   是   否   否   是   是
  f   是   是   是   是   是   是   是   是   否   否   否   否
RNA结果
图2显示了用HGS亚硫酸氢盐处理从前列腺癌细胞学Du145提取的RNA所获得的结果与使用常规的亚硫酸氢盐方法处理获得的结果的比较。
可以看到，在所有用HGS方法于4℃、室温和55℃处理的样品中都观察到了高分子量RNA。23S、18S和5S核糖体RNA带清晰可见，也可以看见与对照相比，几乎没有RNA的降解。相反，用常规方法处理的RNA已经被完全降解了。
图3显示了在不同的温度下保温时RNA稳定性的时间过程实验。从结果可以看出在保温的第一个30分钟发生了小量的降解，然后却达到了几乎稳定的状态，随后损失很少，即使是在55℃保温16小时以后。
图4显示了对亚硫酸氢盐转化的RNA和野生型RNA所进行的反转录酶PCR。可以看到，在亚硫酸氢盐处理的RNA中看到了强烈的PCR扩增信号，其大小与野生型RNA中的带相同。
当亚硫酸氢盐处理的RNA作为模板使用野生型引物进行RT-PCR或野生型RNA作为模板使用亚硫酸氢盐转化的引物进行RT-PCR时没有观察到带。这表明亚硫酸氢盐反应以接近100％的效率将野生型RNA转化为被转化的RNA。
图5证明了对图4中产生的PCR产物是来自亚硫酸氢盐处理的基因组RNA。箭头指示了人β-肌动蛋白转录本中外显子3和4之间的剪接位点。
本领域的专业技术人员将会认识到，对于本发明在特定实施方案中显示的方法可以进行大量的变动和/或修改，而不偏离被广泛描述的本发明的精神或范围。因此，本实施方案将在所有的方面被认为是说明性的而非限制性的。
序列表
<110>人类遗传标记控股有限公司(Human Genetic Signatures)
<120>核酸的处理(Treatment of methylated nucleic acid)
<130>SCT054695-47
<150>US 10/428310
<151>2003-02-05
<160>8
<170>Patentln version 3.1
<210>1
<211>27
<212>DNA
<213>human
<400>1
tttgttgttt gtttattttt taggttt                                          27
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>Human
<400>2
aacctaatac taccaattaa ccccat                                           26
<210>3
<211>29
<212>DNA
<213>Human
<400>3
gggatttggg aaagagggaa aggtttttt                                        29
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>Human
<400>4
actaaaaact ctaaaaaccc catccc                                           26
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>Human
<400>5
ttaatatttt agttatgtat gttgt                                            25
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>human
<400>6
cttcattata ctaaatacca aa                                               22
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>human
<400>7
tcaacacccc agccatgtac gttgc                                            25
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>human
<400>8
gatcttcatt gtgctgggtg cc                                               22

Claims (24)

1.处理核酸的方法，包括：
(a)为核酸样品提供变性环境；
(b)将核酸样品与亚硫酸氢盐试剂反应并将反应保温以形成被处理的核酸样品，使核酸样品中甲基化的核苷酸保持不变，而未甲基化的核苷酸被转变为另一种形式；
(c)将被处理的核酸样品稀释以便使盐浓度减少到基本上不干扰核酸沉淀步骤的水平；
(d)将稀释的被处理的核酸沉淀，以便从被处理的核酸样品中基本上除去任何不想要的试剂或稀释剂；以及
(e)对沉淀的被处理的核酸进行脱磺酸基，以便除去被处理的核酸中存在的磺酸基，从而获得基本上不含磺酸基的核酸样品。
2.权利要求1的方法，其中样品中超过50％的起始核酸被保留了。
3.权利要求2的方法，其中样品中超过75％的起始核酸被保留了。
4.权利要求3的方法，其中样品中超过95％的起始核酸被保留了。
5.权利要求1-4任何一个的方法，还包括：
(f)加工和分析被处理的核酸样品。
6.权利要求1的方法，其中的样品含有DNA，样品含有RNA，或样品含有DNA和RNA的组合。
7.权利要求1的方法，其中的样品从组织、器官、细胞、微生物、或其他生物材料中制备。
8.权利要求1的方法，在反应容器中进行。
9.权利要求8的方法，其中的反应容器从试管、平板、毛细管、孔、离心管、微量离心管、载玻片和盖玻片中选择。
10.权利要求1的方法，其中的亚硫酸氢盐试剂是偏亚硫酸氢钠。
11.权利要求1的方法，其中通过加入碱为样品提供变性环境。
12.权利要求11的方法，其中的碱是NaOH、KOH或其他任何提供羟基基团的化合物或试剂。
13.权利要求1的方法，其中通过加热为样品提供变性环境。
14.权利要求13的方法，其中加热高达95℃。
15.权利要求14的方法，其中加热是从50℃到70℃。
16.权利要求1的方法，其中的提供步骤(a)是在存在能够增强亚硫酸氢盐反应的添加剂的情况下进行的。
17.权利要求16的方法，其中的添加剂从对苯二酚、尿素、甲氧胺和其混合物中选择。
18.权利要求1的方法，其中的反应步骤(b)导致核酸样品中甲基化的胞嘧啶保持不变，而未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。
19.权利要求1的方法，其中的稀释步骤(c)用水来进行，以使盐浓度减少到低于0.5M。
20.权利要求1的方法，其中的沉淀使用醇类沉淀剂来进行。
21.权利要求20的方法，其中的醇类沉淀试剂从异丙醇、乙醇、丁醇、甲醇及其混合物中选择。
22.权利要求21的方法，其中的醇类是异丙醇。
23.权利要求1的方法，其中脱磺酸基步骤(d)是通过用缓冲液或碱性试剂将沉淀的被处理核酸调整到高达pH12.5来进行的。
24.权利要求23的方法，其中的pH被调整到10.5。
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