CN104017894B - 一种dna转录方向和转录模板的系统检测方法及其应用 - Google Patents

一种dna转录方向和转录模板的系统检测方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104017894B
CN104017894B CN201410282616.2A CN201410282616A CN104017894B CN 104017894 B CN104017894 B CN 104017894B CN 201410282616 A CN201410282616 A CN 201410282616A CN 104017894 B CN104017894 B CN 104017894B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
primer
cdna
strand
transcription
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201410282616.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104017894A (zh
Inventor
张丽
张细权
聂庆华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Agricultural University
Original Assignee
South China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Agricultural University filed Critical South China Agricultural University
Priority to CN201410282616.2A priority Critical patent/CN104017894B/zh
Publication of CN104017894A publication Critical patent/CN104017894A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104017894B publication Critical patent/CN104017894B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种DNA转录方向和转录模板的系统检测方法及其应用。该方法主要是利用S1核酸酶能够特异性降解单链DNA的性质检测目的基因的转录方向；以待检基因链特异RT-PCR产物cDNA为模板，利用设计的基因上游引物F或下游引物R进行PCR，根据PCR产物电泳结果判断待检基因的转录模板是DNA的正链还是负链。该方法可用于分析DNA向mRNA转录过程中是单向转录还是双向转录；对于单向转录的DNA片段，能够进一步确定DNA转录的模板链是DNA的正链还是负链。另外，本方法可在12h左右完成检测，具有操作简单、速度快、成本低的显著特点，开发成检测试剂盒，可在科学研究、新基因功能研究中广泛推广应用。

Description

一种DNA转录方向和转录模板的系统检测方法及其应用
技术领域
本发明属于分子生物技术领域。更具体地，涉及一种DNA转录方向和转录模板的系统检测方法及其应用。
背景技术
在分子生物学领域，基因转录是以DNA的一条链为模板，在RNA聚合酶的作用下合成RNA的过程。DNA双链中以哪一条链为模板进行转录依不同的基因或DNA片段而不同。而近些年研究发现有些基因的DNA区域两条链均可以转录。以DNA单独的一条链为模板进行转录即为单向转录，转录得到的cDNA为单链；而存在DNA区域两条链均可以转录的基因转录方式，我们称之为双向转录，转录得到的cDNA为双链。在高通量测序的时代，已经发现大量基因或DNA片段存在反义链转录本，并且很多基因是双向转录。
真核基因的转录调控对基因的表达乃至机体的发育有着举足轻重的作用，因此建立一种系统检测基因转录方向和模板的通用方法有助于推动已知基因转录调控功能的挖掘；对于新基因，能够分析其转录方向和转录模板链。截至目前，关于基因单、双向转录情况的研究仅见Fadia（2007）对比分析了不同商品化的试剂盒在不同条件下反转录的特异性，仅此1篇报道。
目前，检测基因转录方向的方法主要有northernblot、高通量测序等，但是，northernblot步骤繁琐，整个实验流程需要2天时间才能完成，并且如果以检测基因转录方向及模板为目的的话，就杂交所用的单链探针的合成、标记这一项成本就非常高。高通量测序也可以检测基因转录方向，但是，高通量测序是组学的研究方法，研究对象是整个转录组或基因组，成本很高，并且至少1个月的时间才能完成。如此费时、成本高的高通量测序非常不适合于研究单个基因或少数几个基因转录方向和模板。因此，寻找一种操作简单、速度快、成本低的检测DNA转录模板和转录方向的方法，对于基因分子功能科学研究、新基因功能研究，具有很大的实用价值和意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有检测基因转录方向及模板技术的缺陷和不足，提供一种操作简单、速度快、成本低的DNA转录方向和转录模板的系统检测方法。
本发明的目的是提供一种DNA转录方向和转录模板的系统检测方法。
本发明另一目的是提供上述DNA转录方向和转录模板的系统检测方法的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种DNA转录方向和转录模板的系统检测方法，步骤如下：
S1.提取待检基因总RNA；
S2.将步骤S1的RNA反转录为cDNA；
S3.设计待检基因的引物F和引物R，确定适宜的退火温度和反应体系；所述引物F和引物R分别为待检基因DNA双链两端的一段序列，可用于PCR扩增出待检基因序列。
S4.利用S1核酸酶酶切步骤S2的cDNA，以酶切产物为模板，利用步骤S3设计的引物F和引物R进行PCR，PCR产物进行电泳，根据电泳结果判断待检基因转录产物cDNA是单链还是双链；所述S1核酸酶是一种高度单链特异的核酸内切酶，可市购，如TaKaRa出品的S1核酸酶。
S5.如果待检基因转录产物cDNA是单链，检测其转录模板是正链或负链的方法如下：
S51.去除步骤S1的RNA中的DNA后，以步骤S3设计的引物F或引物R进行链特异RT-PCR（链特异反转录聚合酶链反应），得到反转录产物cDNA；
S52.以链特异RT-PCR产物cDNA为模板，利用步骤S3设计的引物F或引物R，按照各自适宜的退火温度进行PCR扩增；
S53.步骤S52的PCR产物进行电泳，根据电泳结果判断待检基因的转录模板是DNA的正链还是负链。
其中，步骤S4所述根据电泳结果判断待检基因转录产物cDNA是单链还是双链的依据是：如果电泳结果显示无待检基因产物，则表明待检基因转录后的cDNA为单链，即待检基因为单向转录；如果电泳结果显示有待检基因产物，则表明待检基因转录后的cDNA为双链，即待检基因为双向转录。
步骤S53所述根据电泳结果判断待检基因的转录模板是DNA的正链还是负链的依据是：如果电泳结果显示只有引物F反转录的cDNA具有PCR产物，而引物R无扩增产物，表明待检基因的转录模板是DNA的负链；如果电泳结果显示只有引物R反转录的cDNA具有PCR产物，而引物F无扩增产物，表明待检基因的转录模板是DNA的正链。
本发明还提供上述DNA转录方向和转录模板的系统检测方法的应用。利用所述DNA转录方向和转录模板的系统检测方法制备的试剂盒也应在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了基因β-actin转录方向和转录模板的系统检测方法，步骤如下：
S1.提取待检基因总RNA；
S2.将步骤S1的RNA反转录为cDNA；
S3.设计β-actin基因的引物β-actinF1和β-actinR1，确定适宜的退火温度和反应体系；
S4.利用S1核酸酶酶切步骤S2的cDNA，以酶切产物为模板，利用步骤S3设计的引物β-actinF1和β-actinR1进行PCR，PCR产物进行电泳，根据电泳结果判断β-actin基因转录产物cDNA是单链还是双链；
S5.如果β-actin基因转录产物cDNA是单链，检测其转录模板是正链或负链的方法如下：
S51.去除步骤S1的RNA中的DNA后，以步骤S3设计的引物β-actinF1或β-actinR1进行链特异RT-PCR（链特异反转录聚合酶链反应），得到反转录产物cDNA；
S52.以链特异RT-PCR产物cDNA为模板，利用步骤S3设计的引物β-actinF1或β-actinR1，按照各自适宜的退火温度进行PCR扩增；
S53.步骤S52的PCR产物进行电泳，根据电泳结果判断β-actin基因的转录模板是DNA的正链还是负链；
其中，所述引物β-actinF1的序列如SEQIDNO.1所示，β-actinR1的序列如SEQIDNO.2所示。
其中，步骤S4所述根据电泳结果判断β-actin基因转录产物cDNA是单链还是双链的依据是：如果电泳结果显示无β-actin基因产物，则表明β-actin基因转录后的cDNA为单链，即β-actin基因为单向转录；如果电泳结果显示有β-actin基因产物，则表明β-actin基因转录后的cDNA为双链，即β-actin基因为双向转录。
步骤S53所述根据电泳结果判断β-actin基因的转录模板是DNA的正链还是负链的依据是：如果电泳结果显示只有引物β-actinF1反转录的cDNA具有PCR产物，而引物β-actinR1无扩增产物，表明β-actin基因的转录模板是DNA的负链；如果电泳结果显示只有引物β-actinR1反转录的cDNA具有PCR产物，而引物β-actinF1无扩增产物，表明β-actin基因的转录模板是DNA的正链。
本发明还提供了基因Tsix转录方向和转录模板的系统检测方法，步骤如下：
S1.提取待检基因总RNA；
S2.将步骤S1的RNA反转录为cDNA；
S3.设计Tsix基因的引物TsixF2和TsixR2，确定适宜的退火温度和反应体系；
S4.利用S1核酸酶酶切步骤S2的cDNA，以酶切产物为模板，利用步骤S3设计的引物TsixF2和TsixR2进行PCR，PCR产物进行电泳，根据电泳结果判断Tsix基因转录产物cDNA是单链还是双链；
S5.如果Tsix基因转录产物cDNA是单链，检测其转录模板是正链或负链的方法如下：
S51.去除步骤S1的RNA中的DNA后，以步骤S3设计的引物TsixF2或TsixR2进行链特异RT-PCR（链特异反转录聚合酶链反应），得到反转录产物cDNA；
S52.以链特异RT-PCR产物cDNA为模板，利用步骤S3设计的引物TsixF2或TsixR2，按照各自适宜的退火温度进行PCR扩增；
S53.步骤S52的PCR产物进行电泳，根据电泳结果判断Tsix基因的转录模板是DNA的正链还是负链；
其中，所述引物TsixF2的序列如SEQIDNO.3所示；TsixR2的序列如SEQIDNO.4所示。
步骤S4所述根据电泳结果判断Tsix基因转录产物cDNA是单链还是双链的依据是：如果电泳结果显示无Tsix基因产物，则表明Tsix基因转录后的cDNA为单链，即Tsix基因为单向转录；如果电泳结果显示有Tsix基因产物，则表明Tsix基因转录后的cDNA为双链，即Tsix基因为双向转录。
步骤S53所述根据电泳结果判断Tsix基因的转录模板是DNA的正链还是负链的依据是：如果电泳结果显示只有引物TsixF2反转录的cDNA具有PCR产物，而引物TsixR2无扩增产物，表明Tsix基因的转录模板是DNA的负链；如果电泳结果显示只有引物TsixR2反转录的cDNA具有PCR产物，而引物TsixF2无扩增产物，表明Tsix基因的转录模板是DNA的正链。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种DNA转录方向和转录模板的系统检测方法，该方法可用于分析DNA向mRNA转录过程中，确定DNA是单向转录还是双向转录（即转录的cDNA是单链还是双链），对于单向转录的DNA片段，能够进一步确定DNA转录所用的模板链是DNA正链还是负链。
另外，本方法具有操作简单、速度快、成本低的显著特点，本领域熟练技术人员可在12h左右完成检测，所用材料和试剂均为本领域常用，容易获得、价格低廉。开发成检测试剂盒可进一步简化操作步骤、缩短操作时间，推广使用，在科学研究、新基因功能研究中具有广泛推广应用的价值。
附图说明
图1为公鼠组织提取的总RNA电泳结果。
图2为母鼠组织提取的总RNA电泳结果。
图3为基因β-actin引物梯度PCR产物电泳结果。
图4为基因Tsix引物梯度PCR产物电泳结果。
图5为经S1核酸酶酶切后的cDNA进行β-actin基因的PCR结果。
图6为经S1核酸酶酶切后的cDNA进行Tsix基因的PCR结果。
图7为基因β-actin链特异RT-PCR产物。
图8为基因Tsix链特异RT-PCR产物。
图9为NCBI中注释的小鼠β-actin（Actb）转录方向。
图10为NCBI中注释的小鼠Tsix转录方向。
图11经S1核酸酶酶切后的cDNA进行GHR基因的PCR结果。
图12基因GHR链特异RT-PCR产物。
图13为NCBI中注释的鸡GHR与LRP1的转录方向。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1小鼠β-actin和Tsix基因转录方向分析
1、试验材料和实验方法
（1）试验动物
昆明白小鼠，雌鼠7-8周龄，雄鼠3-6月龄，饲养条件：光照6:00AM-8：00PM，温度20~25℃，自由采食。
（2）主要器械及仪器
剪刀、镊子、脱脂棉，使用前用RNA酶抑制剂处理；枪头、离心管、PCR管均用DECP水处理过，DECP浓度为0.1%。制冰机、-20℃冰箱、-80℃冰箱、台式离心机、高速冷冻离心机、电泳仪、电子分析天平、PCR仪。
（3）实验试剂
Mix(Transgene)、markerD2000(Genestar)、反转录试剂盒(Promega)、RNA酶抑制剂(Thermo)、S1核酸酶（TaKaRa），Trizol(TaKaRa)、DNaseⅠ(Thermo)。
50×TAE缓冲液：Tris242g，Na2EDTA.2H2O37.2g于1L烧杯中，向烧杯中加入约800mL去离子水，充分搅拌均匀；加入57.lmL冰乙酸，充分溶解；加水至1L。
1%琼脂糖凝胶：1g琼脂糖溶于100mL50×TAE缓冲液，微波炉加热2~3分钟溶化后加入5μLEB。
0.5MEDAT：EDAT186.1g溶于800mL双蒸水中，用NaOH调pH值至8.0，定容至1000mL，高压灭菌。
10×凝胶加样缓冲液：30mMEDTA，0.05%溴酚蓝、50%(w/v)蔗糖水溶液，4℃保存。
2、引物设计
利用软件VectorNTI和primerpremier5，设计目的基因β-actin的引物β-actinF1（序列如SEQIDNO.1所示）和β-actinR1（序列如SEQIDNO.2所示）；基因Tsix的引物TsixF2（序列如SEQIDNO.3所示）和TsixR2（序列如SEQIDNO.4所示），引物信息如表1所示：
表1Tsix和β-actin引物信息
3、组织总RNA提取和cDNA合成
（1）提取组织中的总RNA
S1.颈椎脱臼法处死雌性和雄性小鼠各三只，雌性小鼠取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴、肌肉、子宫和卵巢；雄性小鼠取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴、肌肉和睾丸；-80℃冰箱冷冻保存；
S2.分别取适量的各动物组织于1.5mLRNasefree管（即无RNA酶的试管）中，剪碎后加入1mLTrizol溶液，匀浆，使组织充分裂解，室温静置5min；
S3.取lmLTrizol试剂加入200μL氯仿，加入试管剧烈震荡混匀30s，室温静置5min；
S4.在4℃，12000rpm离心15min，移上清于新的1.5mlRNasefree管中；
S5.加入与上清等体积（约500μL）的异丙醇，混匀后室温静置10min；
S6.在4℃，12000rpm离心10min，弃上清，加入75%乙醇(v/v)清洗，（适度震荡），沉淀；
S7.在4℃，12000rpm离心5min，弃上清留沉淀，室温干燥5min；
S8.干燥的沉淀溶解于适量（30~50μL）DEPC处理过的水中，得到RNA溶液，-80℃冰箱保存。
提取的公、母鼠部分组织RNA用1%(w/v)凝胶电泳检测，结果分别如附图1和附图2所示。
（2）反转录得到cDNA
反转录体系如下：
第一步：去除总RNA中含有的DNA，反应体系如表2所示。
表2
反应条件：37℃30min，然后加入1μLEDTA溶液去除DNaseⅠ的活性，65℃10min，进行下一步操作。
第二步：反转录
上一步反应后溶液中加入表3所示试剂体系继续试验：
表3
反应条件：室温10min，42℃15min，95℃5min，12℃5min。得到cDNA，-20℃或-80℃保存备用。
4、温度梯度PCR
使用上面提取的各种组织的总RNA反转录得到的cDNA，分别使用beta-actin、Tsix的引物来扩增beta-actin和Tsix的片段以确定其扩增条件。
（1）将所得反转录产物cDNA各取1μL混合均匀，取8μL，用设计出的引物β-actinF1和β-actinR1或TsixF2和TsixR2做温度梯度PCR，确定引物合适的退火温度。PCR反应体系如表4所示：
表4
温度梯度PCR反应条件：
95℃，5min→（94℃，30sec→55~65℃，30sec→72℃，30sec）40cycles→72℃，5min→16℃，1h。
（2）梯度PCR结果
PCR产物的1.5%(w/v)凝胶电泳检测结果分别如附图3和附图4所示。由图可知，基因β-actin引物的合适退火温度为56℃，PCR反应体系不变，基因β-actin的PCR反应条件如下：
95℃，5min→（94℃，30sec→56℃，30sec→72℃，30sec）40cycles→72℃，5min→16℃，1h。
基因Tsix引物的合适退火温度为57℃，PCR反应体系不变，基因Tsix的PCR反应条件如下：
95℃，5min→（94℃，30sec→57℃，30sec→72℃，30sec）40cycles→72℃，5min→16℃，1h。
5、S1核酸酶酶切实验
（1）S1核酸酶是一种高度单链特异的核酸内切酶，本实验用其特异性降解单链DNA的性质检测目的基因的转录方向。
各取1μL上述反转录产物混合cDNA，利用S1核酸酶进行酶切，酶切反应体系如表5所示。
表5
23℃反应30min，得到酶切产物。
（2）以酶切后的cDNA（即酶切产物）为模板，分别利用上述基因β-actin和Tsix的引物做PCR，并与稀释20倍的反转录后cDNA的PCR产物电泳结果进行对比，电泳结果分别如附图5和附图6所示。
由图可知，经S1核酸酶酶切后，进行PCR结果显示，基因β-actin和Tsix均无目的基因产物。结合S1核酸酶特异性切割单链的性质，可以说明这两个基因转录后的cDNA均为单链，初步表明基因β-actin、Tsix均为单链转录。
6、基因链特异RT-PCR
（1）以该项试验检测基因的转录方向。
反转录体系如下（同前）：
第一步：去除总RNA中含有的DNA，反应体系如表6所示：
表6
反应条件：37℃30min，然后加入1μLEDTA溶液去除DNaseⅠ的活性，65℃10min，进行下一步操作。
第二步：反转录
以上一步反应后溶液为模板，分别利用基因的上游引物（F）或下游引物（F）进行链特异RT-PCR（链特异反转录聚合酶链反应），体系如表7所示：
表7
反应条件：51℃20min，95℃5min，12℃∞。
（2）以链特异RT-PCR后的cDNA为模板，分别利用上述β-actin和Tsix基因的F或R引物，按照各自适宜的退火温度进行PCR扩增，体系同前。
PCR产物用1.5%(w/v)琼脂糖凝胶进行电泳：电压160V，电流400mA，上样量为6μL。
电泳检测结果如图7和图8所示。由图可知，对于基因β-actin，只有F引物反转录的cDNA具有PCR产物，而R引物无扩增产物，表明基因β-actin的转录模板是DNA的负链。对于基因Tsix，只有R引物反转录的cDNA具有PCR产物，而F引物无扩增产物，表明基因Tsix的转录模板是DNA的正链。
7、本方法分析的DNA转录方向与NCBI的注释结果对比
登陆NCBI查询小鼠β-actin和Tsix基因的转录方向，发现上述基因转录方向的分析结果与NCBI注释结果全完一致，表明该方法的可靠性。在NCBI中注释的两个基因转录方向如附图9、附图10所示。
实施例2
提取鸡肝脏组织中的总RNA，反转录，方法同实施例1。利用软件VectorNTI和primerpremier5设计目的基因GHR的引物GHR（LRP1）-F3(序列如SEQIDNO.5所示）和GHR（LRP1）-R3（序列如SEQIDNO.6所示），并确定引物的适宜退火温度和反应条件。引物信息如表8所示：
表8鸡GHR引物信息
GHR基因PCR反应条件如下：
95℃，5min→（94℃，30sec→60℃，30sec→72℃，30sec）40cycles→72℃，5min→16℃，1h。
后续检测方法和操作同实施例1。
实验结果如图11~13所示。根据我们的实验结果，确定检测的DNA区段为双向转录，DNA的两条链均可以作为模板转录RNA。查阅NCBI的注释发现，该DNA区段包含了2个基因，为GHR和LRP1，两个基因共用了一段DNA序列，但是转录方向相反。因此我们的结果与NCBI的注释结果相同。
SEQUENCELISTING
<110>华南农业大学
<120>一种DNA转录方向和转录模板的系统检测方法及其应用
<130>
<160>6
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>引物β-actinF1
<400>1
tccggcatgtgcaaagc17
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>引物β-actinR1
<400>2
tcttctccatgtcgtcccagt21
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>引物TsixF2
<400>3
tagtcctctgcggcttcc18
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>引物TsixR2
<400>4
tgctgatcgtttggtgct18
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>引物GHR（LRP1）-F3
<400>5
gcgtgttcaggagcaaagct20
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>引物GHR（LRP1）-R3
<400>6
tgggacaggcatttccatactt22

Claims (2)

1.基因β-actin转录方向和转录模板的系统检测方法，其特征在于，步骤如下：
S1.提取待检基因总RNA；
S2.将步骤S1的RNA反转录为cDNA；
S3.设计β-actin基因的引物β-actinF1和β-actinR1；
S4.利用S1核酸酶酶切步骤S2的cDNA，以酶切产物为模板，利用步骤S3设计的引物β-actinF1和β-actinR1进行PCR，根据PCR产物的电泳结果判断β-actin基因转录产物cDNA是单链还是双链；
S5.如果β-actin基因转录产物cDNA是单链，检测其转录模板是正链或负链的方法如下：
S51.去除步骤S1的RNA中的DNA后，以步骤S3设计的引物β-actinF1和β-actinR1分别进行链特异RT-PCR，得到反转录产物cDNA；
S52.以产物cDNA为模板，利用步骤S3设计的引物β-actinF1和β-actinR1，分别进行PCR扩增；
S53.步骤S52的PCR产物进行电泳，根据电泳结果判断β-actin基因的转录模板是DNA的正链还是负链；
其中，所述引物β-actinF1的序列如SEQIDNO.1所示，β-actinR1的序列如SEQIDNO.2所示；
步骤S4所述根据PCR产物的电泳结果判断β-actin基因转录产物cDNA是单链还是双链的依据是：如果电泳结果显示无β-actin基因产物，则表明β-actin基因转录后的cDNA为单链，即β-actin基因为单向转录；如果电泳结果显示有β-actin基因产物，则表明β-actin基因转录后的cDNA为双链，即β-actin基因为双向转录；
步骤S53所述根据电泳结果判断β-actin基因的转录模板是DNA的正链还是负链的依据是：如果电泳结果显示只有引物β-actinF1反转录的cDNA具有PCR产物，而引物β-actinR1无扩增产物，表明β-actin基因的转录模板是DNA的负链；如果电泳结果显示只有引物β-actinR1反转录的cDNA具有PCR产物，而引物β-actinF1无扩增产物，表明β-actin基因的转录模板是DNA的正链。
2.基因Tsix转录方向和转录模板的系统检测方法，其特征在于，步骤如下：
S1.提取待检基因总RNA；
S2.将步骤S1的RNA反转录为cDNA；
S3.设计Tsix基因的引物TsixF2和TsixR2；
S4.利用S1核酸酶酶切步骤S2的cDNA，以酶切产物为模板，利用步骤S3设计的引物TsixF2和TsixR2进行PCR，根据PCR产物的电泳结果判断Tsix基因转录产物cDNA是单链还是双链；
S5.如果Tsix基因转录产物cDNA是单链，检测其转录模板是正链或负链的方法如下：
S51.去除步骤S1的RNA中的DNA后，以步骤S3设计的引物TsixF2和TsixR2分别进行链特异RT-PCR，得到反转录产物cDNA；
S52.以产物cDNA为模板，利用步骤S3设计的引物TsixF2和TsixR2，分别进行PCR扩增；
S53.步骤S52的PCR产物进行电泳，根据电泳结果判断Tsix基因的转录模板是DNA的正链还是负链；
其中，所述引物TsixF2的序列如SEQIDNO.3所示；TsixR2的序列如SEQIDNO.4所示；
步骤S4所述根据PCR产物的电泳结果判断Tsix基因转录产物cDNA是单链还是双链的依据是：如果电泳结果显示无Tsix基因产物，则表明Tsix基因转录后的cDNA为单链，即Tsix基因为单向转录；如果电泳结果显示有Tsix基因产物，则表明Tsix基因转录后的cDNA为双链，即Tsix基因为双向转录；
步骤S53所述根据电泳结果判断Tsix基因的转录模板是DNA的正链还是负链的依据是：如果电泳结果显示只有引物TsixF2反转录的cDNA具有PCR产物，而引物TsixR2无扩增产物，表明Tsix基因的转录模板是DNA的负链；如果电泳结果显示只有引物TsixR2反转录的cDNA具有PCR产物，而引物TsixF2无扩增产物，表明Tsix基因的转录模板是DNA的正链。
CN201410282616.2A 2014-06-23 2014-06-23 一种dna转录方向和转录模板的系统检测方法及其应用 Expired - Fee Related CN104017894B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410282616.2A CN104017894B (zh) 2014-06-23 2014-06-23 一种dna转录方向和转录模板的系统检测方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410282616.2A CN104017894B (zh) 2014-06-23 2014-06-23 一种dna转录方向和转录模板的系统检测方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104017894A CN104017894A (zh) 2014-09-03
CN104017894B true CN104017894B (zh) 2016-03-30

Family

ID=51434888

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410282616.2A Expired - Fee Related CN104017894B (zh) 2014-06-23 2014-06-23 一种dna转录方向和转录模板的系统检测方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104017894B (zh)

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Characterization of plastid psbT sense and antisense RNAs;Ouafa Zghidi-Abouzid,et al;《Nucleic Acids Research》;20110317;第39卷(第13期);5379-5387页 *
Potential pitfalls in the accuracy of analysis of natural sense-antisense RNA pairs by reverse transcription-PCR;Fadia Haddad,et al;《BMC Biotechnology》;20070504;第7卷;1-14页 *
Systematic identification of sense-antisense transcripts in mammalian cells;&Oslash;ystein R&oslash;sok，et al;《NATURE BIOTECHNOLOGY》;20031214;第22卷(第1期);104-108页 *
用S1核酸酶作图法测定蓖麻蚕18S rRNA基因的5’端位置;郑仲承等;《遗传学报》;19881231;第15卷(第1期);40-45页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104017894A (zh) 2014-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11633732B2 (en) CRISPR effector system based diagnostics
Xu et al. The origin of exosomal miR-1246 in human cancer cells
Su et al. Genome-wide analysis of DNA methylation in bovine placentas
CN100374455C (zh) 核酸的处理
CN102154505B (zh) 一种检测miRNA的方法及引物及其应用
JP2022115972A (ja) エキソソーム結合型核酸の配列決定および分析
Trzybulska et al. miRNA and other non-coding RNAs as promising diagnostic markers
Rowley et al. Analysis of long non-coding RNAs produced by a specialized RNA polymerase in Arabidopsis thaliana
Lian et al. Screening of significantly hypermethylated genes in breast cancer using microarray-based methylated-CpG island recovery assay and identification of their expression levels
US20140005058A1 (en) Methods and materials for the diagnosis of prostate cancers
CN104789667B (zh) 一种基于无偏识别与恒温扩增的小rna检测试剂盒及定量方法
US20240102115A1 (en) Crispr effector system based diagnostics for virus detection
JP2011505153A (ja) Ｒｎａのバイサルファイト処理
Dong et al. Integrated lncRNA and mRNA transcriptome analyses in the ovary of Cynoglossus semilaevis reveal genes and pathways potentially involved in reproduction
Moison et al. Commercial reverse transcriptase as source of false-positive strand-specific RNA detection in human cells
Naarmann-de Vries et al. Improved nanopore direct RNA sequencing of cardiac myocyte samples by selective mt-RNA depletion
CN103882043B (zh) 羊驼TGF-β1-3’UTR双荧光素酶报告基因载体及其构建和应用
CN101418343A (zh) miRNA在预测早期原发性肝癌病人术后复发的应用及其试剂盒
CN104017894B (zh) 一种dna转录方向和转录模板的系统检测方法及其应用
Ma et al. CRISPR-empowered electrochemical biosensor for target amplification-free and sensitive detection of miRNA
CN103789447B (zh) 一种5′端tRNA半分子检测方法
Gilbert et al. Real-time monitoring of aRNA production during T7 amplification to prevent the loss of sample representation during microarray hybridization sample preparation
JP2023531720A (ja) 核酸を解析するための方法および組成物
CN202671540U (zh) 鸡产蛋性状相关基因—bmp15基因snp分型试剂盒
CN102181435A (zh) 一种快速提取人参叶组织rna的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20160330