CN100364536C - 甲基异硫脲阳离子作为连接基的脱氧核糖核酸双嵌入剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类以甲基异硫脲阳离子作为连接基的萘酰亚胺类脱氧核糖核酸(DNA)双嵌入剂，其制备方法以及其作为肿瘤抑制剂的生物学应用。此类DNA双嵌入剂以甲基异硫脲阳离子作为连接基，连接两个萘酰亚胺结构单元。其制备方法是：以原料萘酐，与烷基二胺H₂N-L-NH₂反应，得到的中间产物再与二硫化碳反应得到另一个中间产物，其再与硫酸二甲酯(或碘甲烷)反应，得到DNA双嵌入剂。此类DNA双嵌入剂能引起环形和线形质粒DNA的降解，具有明显的切割DNA的能力；能导致人结肠癌细胞(HT-29)的凋亡，具有抗肿瘤活性。

Description

甲基异硫脲阳离子作为连接基的脱氧核糖核酸双嵌入剂

技术领域：

本发明涉及一类以甲基异硫脲阳离子作为连接基的萘酰亚胺类脱氧核糖核酸双嵌入剂，其制备方法以及其作为肿瘤抑制剂的生物学应用。

背景技术：

近年来，新型抗癌药物的研发一直是医药化学的热点。由于肿瘤细胞与正常细胞的脱氧核糖核酸(以下简称DNA)存在显著的差异性，将DNA作为抗肿瘤药物的靶点是一种理想的选择。DNA嵌入剂能够嵌入到DNA碱基对中间，导致DNA拓扑结构的变化，进而影响拓扑异构酶对DNA的识别与作用。根据文献(Cur.Pharm.Design，2001，7，1745)报道，不同类别的DNA嵌入剂，如蒽环类、吖啶类、萘酰亚胺类、放线菌素类等，都被用作抗肿瘤研究；以它们作为先导，合成了大量衍生物，已经从中筛选出了一些具有显著的肿瘤治疗作用的药物分子，嵌入剂也因此成为抗肿瘤药物的一个重要类别。此外，文献(Cacer Res.，1995，55，1176)报道，如果采用适当的基团将两个具有DNA嵌入作用的结构单元连接起来形成的分子可作为DNA双嵌入剂；与相应的单嵌入剂相比，DNA双嵌入剂往往表现更高的抗肿瘤活性；而连接基团，尽管本身并不能嵌入到DNA中，但可能通过静电作用、氢键作用等与DNA的沟槽区域产生亲合力，从而显著地影响双嵌入剂的DNA嵌入方式和嵌入效率；因此通过连接基的设计和修饰，可能实现对双嵌入剂化合物的抗肿瘤活性和选择性的控制和调节。目前，尽管已经报道了许多DNA双嵌入剂，但多数是在嵌入母体结构上作修饰，而连接基的选择则比较单一，通常是采用柔性的含氮原子的烷氨基链。本发明所涉及的甲基异硫脲阳离子作为DNA双嵌入剂的连接基的分子设计思想，目前为止，未见任何报道。

发明内容：

本发明的目的在于采用甲基异硫脲阳离子作为连接基，利用其具有与DNA磷酸键较强亲合力的特点，获得具有良好抗肿瘤活性的萘酰亚胺类DNA双嵌入剂。

本发明涉及的一类以甲基异硫脲阳离子作为连接基的萘酰亚胺类DNA双嵌入剂分子具有如下的结构通式：

其中：L是C₂-C₆直链烷烃，X^-是I^-，或1/2 SO₄ ^2-。

本发明中，考虑到甲基异硫脲阳离子具有独特的正电荷和氢键供体性质，而DNA的磷酸骨架结构具有负电荷和氢键受体性质，二者之间具有强亲合力，使甲基异硫脲阳离子结构单元与DNA发生稳固的沟槽结合；本发明采用的萘酰亚胺作为嵌入结构单元，其本身是具备良好的DNA嵌入作用；本发明中，甲基异硫脲阳离子作为连接基对称性地连接两个萘酰亚胺形成的DNA双嵌入剂利用以上两种作用的协同效应；通过改变L链的长短，可改变甲基异硫脲阳离子与萘酰亚胺的空间间隔，对二者的协同作用进行调控；本发明涉及的DNA双嵌入剂经过生物学实验，证实具有显著的DNA损伤能力，和诱导肿瘤细胞凋亡的活性。

本发明所涉及的甲基异硫脲阳离子作为连接基的萘酰亚胺类DNA双嵌入剂可采用以下反应过程制备：

原料萘酐(A)和1～3倍摩尔量的烷基二胺(H₂N-L-NH₂)在溶剂水、乙醇、甲醇、乙睛、三氯甲烷、乙二醇单甲醚、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中，60～120℃温度条件下，搅拌反应0.5～5小时后，冷却，析出固体，过滤得到中间产物B。化合物B悬浮在上述一种溶剂中，与0.5倍摩尔量的二硫化碳，60～120℃温度条件下搅拌反应0.5～5小时，冷却，析出固体，过滤得到中间产物C。化合物C悬浮在上述一种溶剂中，与等摩尔量的硫酸二甲酯或10～20倍摩尔量的碘甲烷，40～120℃温度条件下搅拌反应2～5小时，冷却析出固体，过滤得到产物D(使用硫酸二甲酯得到硫酸盐，使用碘甲烷反应得到的产物则得到碘化盐，)，即本发明所涉及的DNA双嵌入剂化合物。

本发明所涉及的烷基异硫脲阳离子作为连接基的萘酰亚胺类DNA双嵌入剂的生物活性通过DNA切割实验和肿瘤细胞诱导实验测试，证实其具有良好的DNA切割能力和抗肿瘤活性。

附图说明：

图1是DNA凝胶电泳谱带图；

图2是流式细胞仪测定的细胞凋亡指数图，其中横坐标是DNA含量，纵坐标是细胞数量。

具体实施方式

实施例1

10克萘酐和6.1克乙二胺，加入到60毫升乙睛中，搅拌、加热，保持60℃保持3小时，然后冷却至常温，析出固体，过滤、干燥得到10.3克中间产物B1，产率85％；5克化合物B1悬浮在100毫升乙二醇单甲醚中，加入0.8克的二硫化碳，搅拌、加热到120℃，保温2.5小时，冷却，析出固体，过滤得到5.1克中间产物C1，收率94％。1克化合物C1在悬浮在30毫升三氯甲烷中，加入0.24克硫酸二甲酯，搅拌，加热60℃，保持2小时，冷却析出固体，过滤得到0.8克产物，DNA双嵌入剂D1，收率71％。

D1熔点：190-191℃；¹H NMR：δδ9.40(br s 2H)，，8.46-8.44(d，J＝8.4Hz，8H)，7.87-7.83(t，J＝7.6Hz，4H)，4.31(br s，4H)，3.78-3.72(m，6H)，2.45(s，3H)；ESI-MS：m/e 537(C₃₀H₂₅N₄O₄S⁺).

实施例2

10克萘酐和7.5克乙二胺，加入到60毫升乙睛中，搅拌、加热，保持60℃保持3小时，然后冷却至常温，析出固体，过滤、干燥得到9.8克中间产物B2，产率76％；5克化合物B1悬浮在100毫升乙二醇单甲醚中，加入0.74克的二硫化碳，搅拌、加热到120℃，保温2.5小时，冷却，析出固体，过滤得到5.2克中间产物C2，收率96％。1克化合物C2悬浮在30毫升三氯甲烷中，加入0.23克硫酸二甲酯，搅拌，加热60℃，保持2小时，冷却析出固体，过滤得到0.82克产物，DNA双嵌入剂D2，收率77％。

D2熔点：147-148℃；¹H NMR：δ 9.08(br s 1H)，8.68(br s，1H)，8.42-8.36(m，8H)，7.84-7.79(t，J＝7.6Hz，4H)，4.02-4.00(m，4H)，3.51(s，4H)，2.74(br s，3H)，2.10(br s，2H)，1.93(br s，2H)；ESI-MS：m/e 565(C₃₂H₂₉N₄O₄S⁺).

实施例3

10克萘酐和11.8克己二胺，加入到60毫升乙睛中，搅拌、加热，保持60℃保持3小时，然后冷却至常温，析出固体，过滤、干燥得到10.0克中间产物B1，产率66％；5克化合物B3悬浮在100毫升乙二醇单甲醚中，加入0.64克的二硫化碳，搅拌、加热到120℃，保温2.5小时，冷却，析出固体，过滤得到5.2克中间产物C3，收率98％。1克化合物C3悬浮在30毫升三氯甲烷中，加入0.19克硫酸二甲酯，搅拌，加热60℃，保持2小时，冷却析出固体，过滤得到0.84克产物，DNA双嵌入剂D3，收率76％。

D3熔点：115-116℃；¹H NMR：δ9.11(br s 1H)，8.71(br s，1H)，8.42-8.36(m，8H)，7.84-7.79(t，J＝7.6Hz，4H)，4.03-4.00(t，J＝7.2Hz，4H)，3.36(s，3H)，2.64(br s，2H)，2.10(br s，2H)，1.63-1.60(m，8H)，1.37(br s，8H)；ESI-MS：m/e 649(C₃₈H₄₁N₄O₄S⁺).

实施例4

1克化合物C3悬浮在30毫升三氯甲烷中，加入0.19克硫酸二甲酯，搅拌，加热40℃，保持4小时，冷却析出固体，过滤得到0.78克产物，DNA双嵌入剂D3I，收率73％。

D4熔点：190-191℃；¹H NMR：δδ9.40(br s 2H)，，8.46-8.44(d，J＝8.4Hz，8H)，7.87-7.83(t，J＝7.6Hz，4H)，4.31(br s，4H)，3.78-3.72(m，6H)，2.45(s，3H)；ESI-MS：m/e 537(C₃₀H₂₅N₄O₄S⁺).

实施例5

分别取无菌水18μL，加入质粒DNA(200ng/μL)1μL和双嵌入剂D1(100μM)1μL(终浓度5μM)；无菌水17μL，加入质粒DNA(200ng/μL)1μL和双嵌入剂D1(100μM)2μL(终浓度10μM)；无菌水15μL，加入质粒DNA(200ng/μL)1μL和双嵌入剂D1(100μM)4μL(终浓度20μM)使反应总体积为20μL。混匀置于37℃水浴中24小时后进行1％琼脂糖凝胶电泳。如图1所示，电泳显色结果表明，双嵌入剂D1在低浓度(5～20μM)下就能够导致环形和线形质粒DNA的降解，具有明显的切割DNA的能力。

实施例6

细胞培养严格进行无菌操作，人结肠癌细胞(HT-29)采用含10％小牛血清、100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素的DMEM/F-12培养基，置于37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养。细胞传代，取处于对数生长期的HT-29细胞加入PBS洗液洗涤两次，加入1.25g/L胰蛋白酶消化，弃去胰蛋白酶细胞分瓶，加入新鲜培养基。

取处于对数生长期的HT-29细胞传代培养24小时，加入双嵌入剂D1浓度为20μmol/L，对照组加入等量的培养基，培养24小时。收集细胞用PBS洗液洗涤三次，1体积细胞悬液加9体积70％乙醇于-20℃固定细胞24小时，离心，PBS液洗涤除尽乙醇，离心后悬于PI染液中室温染色30分钟，流式细胞仪测定，以凋亡指数(APO)表示细胞凋亡情况(APO＝凋亡细胞数/所测细胞数×100％)。

如图2所示，流式细胞仪测定结果表明，低浓度(20μmol/L)的双嵌入剂D1，能显著地诱导人结肠癌细胞(HT-29)的凋亡。

Claims (2)

1.一类甲基异硫脲阳离子作为连接基的脱氧核糖核酸双嵌入剂，其特征是：甲基异硫脲阳离子作为连接基，连接两个萘酰亚胺结构单元，形成DNA双嵌入剂，结构通式：

其中：L是C₂-C₆直链烷烃，X^-是I^-，或1/2 SO₄ ^2-。

2.根据权利要求1所述的甲基异硫脲阳离子作为连接基的脱氧核糖核酸双嵌入剂的制备方法，其特征是：以原料萘酐，与1～3倍摩尔量的烷基二胺H₂N-L-NH₂在溶剂水、乙醇、甲醇、乙腈、三氯甲烷、乙二醇单甲醚、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中，60～120℃，搅拌反应0.5～5小时，冷却，析出固体，过滤得到中间体氨基烷基萘酰亚胺；将氨基烷基萘酰亚胺悬浮在上述一种溶剂中，与0.5倍摩尔量二硫化碳，在60～120℃下搅拌反应0.5～5小时，冷却，析出固体，过滤得到另一个中间体尿素基双烷基双萘酰亚胺；将尿素基双烷基双萘酰亚胺悬浮在上述一种溶剂中，与等摩尔量硫酸二甲酯或10～20倍摩尔量的碘甲烷，在40～120℃下搅拌反应2～5小时，冷却析出固体，过滤得到产物DNA双嵌入剂。

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