CN102276579B

CN102276579B - 一种寡聚噻吩及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN102276579B
Application number: CN 201110160346
Authority: CN
Inventors: 王树; 刘礼兵; 杨琼; 杨高买
Original assignee: Institute of Chemistry CAS
Current assignee: Institute of Chemistry CAS
Priority date: 2011-06-15
Filing date: 2011-06-15
Publication date: 2013-04-10
Anticipated expiration: 2031-06-15
Also published as: CN102276579A

Abstract

本发明公开了一种寡聚噻吩及其制备方法与应用。本发明所提供的寡聚噻吩的结构式如式(III)所示，其中，m＝3；n为1-6中的整数。该寡聚噻吩应用于下述五方面：1)在制备癌细胞增殖抑制剂中的应用；2)在制备癌细胞凋亡诱导剂中的应用；3)在制备预防和/或治疗癌症药物中的应用；4)在制备线粒体靶向药物中的应用；5)作为线粒体染料在细胞成像中的应用。本发明寡聚噻吩由于保留了共轭聚合物的骨架，其荧光性质可以用来进行细胞成像。通过试验发现，式III所示寡聚噻吩是线粒体的专一染料。此外，本发明式III所示寡聚噻吩还可与苯丁酸氮芥复合，形成纳米颗粒。结果表明该复合物具有广谱抗癌性，提高了抗肿瘤活性。

Description

一种寡聚噻吩及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种寡聚噻吩及其制备方法与应用。

背景技术

癌症已经成为危害人类健康的主要杀手之一。在肿瘤的治疗过程中，耐药性是造成死亡的一个主要因素。随着治疗手段的越来越先进，获得性耐药也变得越来越普遍。由于耐药性的发生，许多非常有效的抗癌药，如顺铂、苯丁酸氮芥、紫杉醇等的治疗效果大大降低。因此寻找新的具有广谱抗肿瘤活性的先导化合物，发现新的化合物骨架具有重要意义。

共轭聚合物(CPs)由于主链电子离域显示出独特的物理/化学性质，在过去的三十多年里已经成为最引人注目的先进材料之一。寡聚噻吩由于保留了共轭聚合物的骨架，其荧光性质可以用来进行细胞成像。到目前为止，尚未见有关寡聚噻吩具有多功能抗癌活性的报道。

线粒体被称为细胞的发电机，然而由于其内膜结构的特殊性，几乎不允许任何分子透过。这一性质同样不允许药物分子通过，因此开发针对于线粒体的药物对克服耐药性具有重要意义。

苯丁酸氮芥(chlorambucil)是一种广泛用于治疗慢性淋巴细胞白血病的药物。基于耐药性的原因，寻找新的治疗策略以期克服对苯丁酸氮芥的耐药性是具有挑战性的。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗癌、细胞成像功能的寡聚噻吩及其制备方法。

本发明所提供的寡聚噻吩的结构式如式(III)所示：

其中，m＝3；n为1-6中的整数；R₁选自下述基团中的任意一种：-COOH、-NH₂、-NHCH₃、-N(CH₃)₂、-N⁺(CH₃)₃、-N⁺(CH₃)₃Br^-、-NH(CH₂CH₃)、-N⁺(CH₂CH₃)₃、-O^-N⁺(CH₂CH₃)₂、-COOCH₃、-COOCH₂CH₃、-SO₃H、-SO₂CH₃、-CH₂COOH、-CH₂COOCH₃、-NO₂，-PO₃、-CHO、-OH、-N₃、-OCHO、-CN、

本发明还保护制备式III所示寡聚噻吩的两个中间体即式I所示的单噻吩和式II所示的三聚噻吩

其中，式I和式II中的n为1-6中的整数；R₁选自下述基团中的任意一种：-COOH、-NH₂、-NHCH₃、-N(CH₃)₂、-N⁺(CH₃)₃、-N⁺(CH₃)₃Br^-、-NH(CH₂CH₃)、-N⁺(CH₂CH₃)₃、-O^-N⁺(CH₂CH₃)₂、-COOCH₃、-COOCH₂CH₃、-SO₃H -SO₃CH₃、-CH₂COOH、-CH₂COOCH₃、-NO₂，-PO₃、-CHO、-OH、-N₃、-OCHO、-CN、-Cl、-I、-Br、

式II中的m＝1。

制备权利式III所示寡聚噻吩的方法，包括下述步骤：

1)将2-(3-噻吩基)乙醇与式IV所示卤代烷烃在氢化钠作用下反应，得到式I所示的化合物，

式IV中的n为1-6中的整数，X为Cl、Br或I，R₁与式I中R₁相同；

2)使式I所示的化合物与N-溴代丁二酰亚胺反应，得到式V所示的化合物；

3)使式V所示的化合物与式VI所示单硼酸酯在钯(0)催化作用下反应，得到式II所示的寡聚噻吩；

式V、式VI中的R＝(CH₂)_n R₁，n为1-6的整数，R₁与式I中R₁相同；

4)使式II所示的化合物与N-溴代丁二酰亚胺反应，得到式VII所示的化合物；

5)使式VII所示的化合物与式VI所示单硼酸酯在钯(0)催化作用下反应，得到式III所示寡聚噻吩。

其中，步骤3)和步骤5)中的钯(0)为四(三苯基膦)钯。

本发明的另一个目的是提供式III所示聚合物的应用。

本发明的所提供的式III所示聚合物的应用包括下述五个方面：

1)式III所示聚合物在制备癌细胞增殖抑制剂中的应用；

2)式III所示聚合物在制备癌细胞凋亡诱导剂中的应用；

3)式III所示聚合物在制备预防和/或治疗癌症药物中的应用；

4)式III所示聚合物在制备线粒体靶向药物中的应用；

5)作为线粒体染料在细胞成像中的应用。

其中，所述癌细胞选自下述至少一种：肾癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞和结肠癌细胞；所述肾癌细胞优选人肾癌细胞A498，所述肺癌细胞优选人肺癌细胞A549，所述肝癌细胞优选人肝癌细胞HepG2，所述乳腺癌细胞优选人乳腺癌细胞MCF-7，所述结肠癌细胞优选人结肠癌细胞HCT116；

所述癌症选自下述至少一种：肾癌、肺癌、肝癌、乳腺癌和结肠癌。

本发明的再一个目的是提供一种具有广谱抗癌性的复合物。

本发明所提供的复合物由式III所示寡聚噻吩和苯丁酸氮芥盐复合而成。

所述复合物中，式III所示寡聚噻吩与苯丁酸氮芥盐的摩尔比为1∶(1-5)。所述复合物的形态为纳米颗粒，其粒径为10-100nm。

该复合物的制备方法，包括下述步骤：将式III所示寡聚噻吩溶解在水中，并向其中逐滴加入苯丁酸氮芥盐的水溶液；对混合物搅拌48-96小时，即得到所述复合物。

本发明中所提供的复合物可用于制备癌细胞增殖抑制剂或用于制备预防和/或治疗癌症药物中的应用。

本发明提供了一种新型的靶向线粒体的具有多功能抗癌活性的寡聚噻吩。该寡聚噻吩由于保留了共轭聚合物的骨架，其荧光性质可以用来进行细胞成像。通过试验发现，式III所示寡聚噻吩是线粒体的专一染料。此外，本发明式III所示寡聚噻吩还可与苯丁酸氮芥通过静电作用形成具有纳米结构的复合物。结果表明该复合物具有广谱抗癌性，提高了抗肿瘤活性。

附图说明

图1为本发明合成寡聚噻吩的化学反应流程图。

图2为本发明合成寡聚噻吩与苯丁酸氮芥盐的复合物的反应流程图。

图3为本发明合成的寡聚噻吩与苯丁酸氮芥盐的复合物的扫描电镜照片。

图4为细胞A498、HepG2在单噻吩及寡聚噻吩作用下的细胞存活率；其中，1T代表单噻吩3，3T代表寡聚噻吩7，5T代表寡聚噻吩9。

图5为细胞A498、MCF-7在寡聚噻吩与苯丁酸氮芥盐的复合物作用下的细胞存活率。

图6为寡聚噻吩9的细胞成像图。

图7为寡聚噻吩9诱导A498细胞凋亡的流式分析图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、制备单噻吩2、3

制备单噻吩2：663微升(6毫摩尔)2-(3-噻吩基)乙醇在氮气气氛下加入到氢化钠(含量70％，206mg，6毫摩尔)的干燥DMF溶液中。搅拌30分钟后，然后加入过量1，6-二溴己烷(4.6毫升，10毫摩尔)，室温搅拌过夜。加入水淬灭反应，二氯甲烷(3×100毫升)萃取三次，无水硫酸镁干燥，减压浓缩后，柱色谱(硅胶；石油醚∶乙酸乙酯＝40∶1，v/v)分离得产物0.54克，产率31％。单噻吩2结构确证数据如下：¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ1.61-1.45(m，4H)，1.72(p，2H，J＝6.78)，1.99(p，2H，J＝6.82)，3.04(t，2H，J＝6.98)，3.53(t，2H，6.86)，3.57(t，2H，J＝6.50)，3.76(t，2H，J＝7.01)，7.15-7.10(m，2H)，7.37(m，1H)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ25.43，28.01，29.57，30.83，32.79，33.82，70.77，71.03，121.04，125.14，128.53，139.46；HREI-MS Calcd.for C₁₂H₁₉BrOS m/z Acc.Mass290.0340，292.0320；Obs.Mass 290.0342，290.0316.

制备单噻吩3：在单噻吩2(291毫克，1毫摩尔)的四氢呋喃溶液中加入过量三甲胺的水溶液(3毫升)，室温搅拌24小时，减压蒸去三甲胺，得白色沉淀，即为单噻吩3。结构确证数据如下：¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.27(m，1H)，7.02-6.98(m，2H)，3.65-3.56(m，4H)，3.47(m，11H)，2.91(t，2H，6.78)，1.75(br，2H)，1.58(br，2H)，1.42(br，4H)；¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)δ23.02，25.76，25.81，29.25，30.61，53.27，66.64，70.37，70.79，120.96，125.10，128.48，139.34；ESI-MS m/z：270.2(M)；Anal.Calcd.for C₁₅H₂₈BrNOS：C51.42，H 8.06，N 4.00；Found C 51.11，H 7.95，N 4.12.

实施例2、制备寡聚噻吩6、7

制备单噻吩4(R＝(CH₂)₆Br)：在溶有1.00克单噻吩2的四氢呋喃和乙酸的混合溶液中(12毫升，1∶1，v/v)一次性加入1.22克N-溴代丁二酰亚胺，混合物室温搅拌1小时，然后倒入30毫升水中并用正戊烷(3×15毫升)萃取三次，无水硫酸镁干燥，减压浓缩后，柱色谱(硅胶；石油醚∶乙酸乙酯＝40∶1，v/v)分离得产物1.38克，产率90％。单噻吩4结构确证数据如下：¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝7.26(s，1H)，6.87(s，1H)，3.56(t，J＝6.5，2H)，3.42(dd，J＝11.6，5.7，4H)，2.79(t，J＝6.5，2H)，1.95-1.79(m，2H)，1.65-1.51(m，2H)，1.51-1.30(m，4H).¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ＝139.75，131.53，110.43，109.03，87.18，70.83，69.49，34.03，32.82，30.13，29.55，28.03，25.46.EI-MS m/z：448；Anal.Calcd.forC₁₂H₁₇Br₃OS:C32.10，H3.82；Found C32.05，H4.01。

制备单硼酸酯5(R＝(CH₂)₆Br)：在2.65克单噻吩2的DMF(108毫升)溶液中，滴入1.62克的N-溴代丁二酰亚胺的DMF溶液54毫升。混合物室温搅拌24小时，然后倒入30毫升水中并用正戊烷(3×15毫升)萃取三次，无水硫酸镁干燥，减压浓缩后，柱色谱(硅胶；石油醚∶乙酸乙酯＝40∶1，v/v)分离得单噻吩2的2位单溴代产物2.80克，产率90％。在-78℃含有1.00克的单溴代产物的20毫升四氢呋喃溶液中，通过注射器加入1.04毫升正丁基锂(2.72M的正己烷溶液)。混合物在-78℃继续搅拌2小时，然后加入0.7毫升2-异丙氧基-4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧硼戊烷，混合物继续在-78℃搅拌1小时，加热到室温，继续搅拌12小时，然后倒入30毫升水中并用正戊烷(3×15毫升)萃取三次，无水硫酸镁干燥，减压浓缩后，柱色谱(硅胶；石油醚∶乙酸乙酯＝40∶1，v/v)分离得产物0.57克，产率51％。单硼酸酯5结构确证数据如下：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.50(d，J＝3.8，1H)，7.07(d，J＝3.8，1H)，3.61(t，J＝6.9，2H)，3.43(dt，J＝13.5，6.2，4H)，3.18(t，J＝6.8，2H)，1.93-1.80(m，2H)，1.64-1.53(m，2H)，1.51-1.36(m，4H)，1.33(s，12H).13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝150.34，131.49，130.82，83.71，71.81，70.54，33.95，32.82，30.75，29.63，28.05，25.46，24.86.EI-MS m/z：416.Anal.Calcd.for C18H30BBrO3S:C 51.82，H7.25；Found C 51.85，H 7.13.

寡聚噻吩6(R＝(CH₂)₆Br)：在0.51毫摩尔单噻吩4，4.09毫摩尔碳酸钾，0.09毫摩尔的Pd(PPh₃)₄(四(三苯基膦)钯(0))的甲苯和水混合溶剂中(甲苯/水＝3/1，v/v)，一次性加入0.60毫摩尔的单硼酸酯5(R＝(CH₂)₆Br)的四氢呋喃溶液。混合物在氮气下搅拌20分钟后继续回流20小时。冷却到室温，加入15毫升水。混合物用二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，浓缩后柱色谱(硅胶；石油醚∶乙酸乙酯＝500∶35，v/v)纯化得产物。寡聚噻吩6的结构确证数据如下：¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝7.31(s，1H)，7.18(s，1H)，7.07(s，1H)，7.03(s，1H)，6.99(d，J＝2.9，1H)，3.65(s，2H)，3.55(s，4H)，3.44(s，2H)，3.39(s，10H)，3.06(s，2H)，2.83(s，2H)，2.77(s，2H)，1.84(s，6H)，1.55(s，6H)，1.43(s，6H)，1.36(s，6H).¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ＝139.27，139.04，135.89，135.71，131.74，130.34，129.62，129.15，129.09，128.02，125.87，123.90，70.86，70.80，70.72，33.94，32.79，29.59，29.44，28.04，25.45.MS(MALDI-TOF)：870.3(M)，790.3(M-Br).Anal.Calcd.forC₃₆H₅₃Br₃O₃S：C 49.72，H 6.14；Found C 49.76，H 6.23.

寡聚噻吩7(R’＝(CH₂)₆N⁺(CH₃)₃Br)：反应步骤参见单噻吩3的合成。在寡聚噻吩6的四氢呋喃溶液中加入过量三甲胺的水溶液，室温搅拌24小时，减压蒸去三甲胺，即得寡聚噻吩7。结构确证数据如下：¹H NMR(400MHz，MeOD)δ＝7.54(d，J＝3.9，1H)，7.40(d，J＝3.8，1H)，7.24(s，1H)，7.17(d，J＝3.9，1H)，7.12(d，J＝3.9，1H)，3.80-3.69(m，2H)，3.65(s，4H)，3.58-3.44(m，6H)，3.40(s，6H)，3.19(s，27H)，3.11(s，2H)，2.87(s，2H)，2.82(s，2H)，1.81(s，6H)，1.63(s，6H)，1.45(s，12H).¹³C NMR(100MHz，MeOD)δ＝139.64，139.20，136.08，135.73，131.22，130.29，129.48，128.97，128.63，128.03，125.93，124.03，70.41，70.35，70.30，70.25，66.45，59.26，52.28，48.52，48.31，48.09，47.88，47.67，47.45，47.24，47.03，29.38，29.11，25.76，25.54，25.48，22.58.ESI-MS m/z：269.1(M-3Br)，443.7(M-2Br).

实施例3、制备寡聚噻吩8、9

寡聚噻吩8(R＝(CH₂)₆Br)：在-20℃下，N-溴代丁二酰亚胺(NBS)(44毫克，0.247毫摩尔)溶解在10毫升DMF(N，N-二甲基甲酰胺)中，逐滴加入到寡聚噻吩6(107毫克，0.123毫摩尔)的5毫升DMF溶液中，整个过程在5分钟内加完。混合物继续搅拌2小时，加热到室温，过夜反应。将反应溶液加入到100毫升水中，正戊烷萃取三次，无水硫酸镁干燥，浓缩后柱色谱(硅胶；石油醚∶乙酸乙酯＝500∶35，v/v)纯化得产物二溴代寡聚噻吩6，110毫克，产率93％。二溴代寡聚噻吩6与实施例2中所示单硼酸酯5反应得产物寡聚噻吩8，具体反应步骤参见寡聚噻吩6的合成。寡聚噻吩8的结构确证数据如下：¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝7.26(s，2H)，7.19(d，J＝4.3，2H)，7.10(d，J＝3.9，2H)，7.05(s，1H)，7.00(d，J＝4.4，2H)，3.67(t，J＝7.0，6H)，3.59(t，J＝6.4，4H)，3.52-3.29(m，20H)，3.07(s，6H)，2.83(t，J＝6.2，4H)，1.84(dd，J＝12.9，6.3，10H)，1.58(d，J＝6.2，10H)，1.40(dd，J＝10.5，6.2，20H).¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ＝139.64，136.28，136.25，136.03，135.95，135.81，134.18，131.76，131.67，130.48，129.51，129.40，129.15，128.21，128.09，124.16，71.07，71.00，70.86，70.83，70.68，34.06，32.91，30.08，29.95，29.75，29.71，28.18，27.18，25.62，25.56，MS(MALDI-TOF)：1448.4(M)，1366.4(M-Br).Anal.Calcd.for C₆₀H₈₇Br₅O₃S:C 49.76，H 6.06；Found C 49.67，H 6.06.

寡聚噻吩9(R’＝(CH₂)₆N⁺(CH₃)₃Br)：反应步骤参见单噻吩3的合成。在寡聚噻吩8的四氢呋喃溶液中加入过量三甲胺的水溶液，室温搅拌24小时，减压蒸去三甲胺，即得寡聚噻吩9。结构确证数据如下：¹H NMR(400MHz，MeOD)δ＝7.46(s，2H)，7.34(s，1H)，7.31(s，1H)，7.27(s，1H)，7.16(d，J＝2.5，2H)，3.79(s，6H)，3.71(s，4H)，3.62-3.49(m，10H)，3.42(s，10H)，3.20-3.23(m，45H)，3.14(s，6H)，2.91(s，4H)，1.83(s，10H)，1.68(s，10H)，1.48(d，J＝5.2，20H).¹³C NMR(100MHz，MeOD)δ＝140.12，136.92，136.39，136.31，136.16，135.43，134.09，131.08，130.97，130.49，130.46，129.35，129.01，128.58，128.16，128.11，124.27，70.48，70.40，70.31，70.26，70.13，66.42，58.84，52.35，29.60，29.52，29.48，29.22，29.18，25.79，25.60，25.50，22.66，22.63.ESI-MS m/z：268.9(M-5Br)，356.3(M-4Br)，501.2(M-3Br).

实施例4、制备寡聚噻吩9与苯丁酸氮芥的复合物(纳米颗粒)

将实施例3制备的寡聚噻吩9(2.41毫克，1.38微摩尔)溶解在5毫升水溶液中，逐滴加入5毫升苯丁酸氮芥钠盐(0.450毫克，1.38微摩尔)的水溶液。混合物剧烈搅拌48小时，冷冻干燥，得到复合物1(寡聚物∶苯丁酸氮芥＝1∶1，mol/mol)。

通过改变苯丁酸氮芥钠盐的加入量(0.9毫克，2.76微摩尔；1.35毫克，4.14微摩尔；1.78毫克，5.52微摩尔；2.25毫克，6.90微摩尔)以相似方法合成复合物2(寡聚物∶苯丁酸氮芥钠盐＝1∶2，mol/mol)、复合物3(寡聚物∶苯丁酸氮芥钠盐＝1∶3，mol/mol)、复合物4(寡聚物∶苯丁酸氮芥钠盐＝1∶4，mol/mol)、复合物5(寡聚物∶苯丁酸氮芥钠盐＝1∶5，mol/mol)。其扫描电镜照片如图3所示。

实施例5、体外抗癌活性试验

利用上述合成的寡聚噻吩及其复合物采用MTT法进行体外抗肿瘤活性测定。试验中所用的人肺癌细胞A549细胞株、人肝癌细胞HepG2、人肾癌细胞A498、人乳腺癌细胞MCF-7、人结肠癌细胞HCT116以及正常人胚肺二倍体细胞HPF均购于中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。

具体步骤如下：人肺癌细胞A549细胞株，胰酶消化悬浮后，用含10％血清的DMEM细胞培养液，调整细胞浓度至4-7×10⁴个/mL，加入到96孔细胞培养板，100μL/孔，设平行对照孔，放入5％CO₂培养箱中，37℃培养24h使细胞贴壁。分别加入不同浓度的寡聚噻吩，实施例4制备的药物复合物，设置调零孔、对照孔，继续培养48h。取出细胞，倒掉培养液，加入1mg/mL MTT的PBS(pH 7.4)溶液，100μL/孔，37℃继续培养4h。4h后倒掉液体，加入DMSO150μL/孔，微量震荡器震荡5min，使其中的兰色颗粒formazan充分溶解。将培养板放入酶标仪，520nm测定OD值。按以下公式计算存活率：存活率(％)＝给药组细胞平均吸光度值/对照组细胞平均吸光度值×100％。最后用SPSS(Ver.13.0)软件对实验数据进行处理，计算细胞活性。

进行3次重复试验，数据和结果均为平均值。以体外培养的人肺癌细胞A549和肝癌细胞HepG2，人肾癌细胞A498，人乳腺癌细胞MCF-7，人结肠癌细胞HCT116，以及正常人胚肺二倍体细胞HPF为模型，MTT实验步骤同上。

结果如下：

1)各种细胞与寡聚噻吩9分别作用48小时，寡聚噻吩9对细胞的IC₅₀结果见表1。

表1

	A498	HCT116	HepG2	A549	HPF	MCF-7
							IC₅₀(μM)	6.96	12.03	12.74	8.81	16.74	18.07

由表1可知，寡聚噻吩9在体外对人肾癌细胞株A498具有较强的选择性抑制作用。

2)各种细胞与复合物1，2，3，4或5分别作用48小时，复合物1，2，3，4，5以及寡聚噻吩9、苯丁酸氮芥对细胞的IC₅₀结果见表2。

表2

IC₅₀(μM)	A498	A549	MCF-7	HepG2	HPF	HCT116
							复合物1	2.60	5.86	2.68	NA^a	7.05	5.66
复合物2	2.54	5.28	2.29	NA^a	7.01	5.95
							复合物3	2.61	4.94	2.27	NA^a	7.02	5.11
复合物4	2.11	3.37	1.97	NA^a	6.90	4.91
							复合物5	2.45	4.57	2.43	NA^a	7.79	6.04
寡聚噻吩9	6.96	8.81	18.07	12.74	16.74	12.03
							苯丁酸氮芥	NA^a	NA^a	NA^a	NA^a	NA^a	NA^a

^aN ot Available

实施例6、细胞成像实验

利用上述合成的寡聚噻吩进行细胞成像，采用Confocal激光扫描显微镜(FV1000-IX81，Olympus，Japan)表征。

具体步骤为：人肾癌细胞A498用含10％血清的DMEM细胞培养液在有玻璃底的培养皿中培育24小时，当细胞数达到接近60时，加入10微摩尔的寡聚噻吩9继续培养12小时，同时设置对照皿。移去培养液分别加入37℃预热的线粒体荧光染料(M7512，Invitrogen)100纳摩尔，染色15分钟。染色结束后小心移去培养液，用PBS洗涤3次，加入质量浓度4％多聚甲醛的PBS溶液，固定15分钟。固定完成后用PBS洗涤三次，然后用Confocal激光扫描显微镜(FV1000-IX81，Olympus，Japan)观察，见图6。对寡聚噻吩使用405nm激光，线粒体染料使用559nm激光。结果表明寡聚噻吩9可以实现对细胞的成像，和线粒体染料比较发现这种寡聚噻吩可以选择性靶向线粒体。因此在低浓度下，本发明的寡聚噻吩是一种新的线粒体染料。

实施例7、细胞凋亡分析

细胞凋亡可以用Annexin V-FITC和PI双染色测定，流式细胞仪(FACSCalibur，Becton，Dickinson and Company，USA)用来进行细胞凋亡定量。磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35～36KD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记，以标记的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidine iodide，PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

具体步骤：A498细胞在35×35mm细胞培养皿中培养24小时，用1×PBS洗涤一次，然后加入1毫升DMEM培养液。分别加入不同浓度的寡聚噻吩9，以正常培养的细胞作为对照，继续培养24小时。将正常培养和诱导凋亡的贴壁培养的A498细胞先用0.25％的胰酶消化，离心后，用PBS洗2次，加入100微升Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V(20微克/毫升)10微升，室温避光30分钟，再加入PI(50微克/毫升)5微升，避光反应5分钟后，加入400微升Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测(一般不超过1h)，同时设置阴性对照。

实验过程中使用488nm激光，分别用Channel FL-1 and FL-2收集来自FITC和PI的信号。收集细胞总数为3×10⁴个。结果见图7。表明寡聚噻吩9可以显著的诱导细胞凋亡。

Claims

1.式Ⅲ所示的寡聚噻吩：

（式Ⅲ）

其中，m=3；n为1-6中的整数；R₁选自下述基团中的任意一种：-N⁺(CH₃)₃Br^-、-N(CH₃)₂、-NH(CH₂CH₃)、-NHCH₃和-NH₂。

2.制备权利要求1中式Ⅲ所示寡聚噻吩的方法，包括下述步骤：

1）将2-(3-噻吩基)乙醇与式Ⅳ所示卤代烷烃在氢化钠作用下反应，得到式I所示的化合物，

(式Ⅳ) (式I)

式Ⅳ中，n为1-6中的整数，X为Cl、Br或I，R₁选自下述基团中的任意一种：-N⁺(CH₃)₃Br^-、-N(CH₃)₂、-NH(CH₂CH₃)、-NHCH₃和-NH₂；

式I中，n与R₁与式Ⅳ中相同；

2）使式I所示的化合物与N-溴代丁二酰亚胺反应，得到式Ⅴ所示的化合物；式Ⅴ中，R=(CH₂)_n R₁，n及R₁与式Ⅳ中相同；

3）使式Ⅴ所示的化合物与式Ⅵ所示单硼酸酯在钯（0）催化作用下反应，得到式Ⅱ所示的寡聚噻吩；式Ⅵ中，R=(CH₂)_n R₁，n及R₁与式Ⅳ中相同；式Ⅱ中，m=1，n及R₁与式Ⅳ中相同；

（式Ⅴ）（式Ⅵ）

（式Ⅱ）

4）使式Ⅱ所示的化合物与N-溴代丁二酰亚胺反应，得到式Ⅶ所示的化合物；式Ⅶ中，R=(CH₂)_n R₁，n及R₁与式Ⅳ中相同；

(式Ⅶ)

5）使式Ⅶ所示的化合物与式Ⅵ所示单硼酸酯在钯（0）催化作用下反应，得到式Ⅲ所示寡聚噻吩。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤3）和步骤5）中的钯（0）为四（三苯基膦）钯。

4.一种复合物，由权利要求1中式Ⅲ所示寡聚噻吩和苯丁酸氮芥盐复合而成，式Ⅲ所示寡聚噻吩与苯丁酸氮芥盐的摩尔比为1：（1-5）。

5.根据权利要求4所述的复合物，其特征在于：所述复合物中，所述苯丁酸氮芥盐优选苯丁酸氮芥钠盐。

6.制备权利要求4或5所述复合物的方法，包括下述步骤：将式Ⅲ所示寡聚噻吩溶解在水中，并向其中加入苯丁酸氮芥盐的水溶液；混合物搅拌48-96小时，即得到所述复合物。

7.权利要求1中式Ⅲ所示的寡聚噻吩在下述1）—3）任意一种中的应用：

1）制备预防和/或治疗癌症药物；所述癌症选自下述至少一种：肾癌、肺癌、肝癌、乳腺癌和结肠癌；

2）制备线粒体靶向药物；

3）作为线粒体染料在细胞成像中的应用；所述应用为非疾病治疗方法。

8.权利要求1中式Ⅲ所示的寡聚噻吩在下述1）或2）中的应用：

1）制备癌细胞增殖抑制剂；

2）制备癌细胞凋亡诱导剂；

所述癌细胞选自下述至少一种：肾癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞和结肠癌细胞。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述肾癌细胞为人肾癌细胞A498，所述肺癌细胞为人肺癌细胞A549，所述肝癌细胞为人肝癌细胞HepG2，所述乳腺癌细胞为人乳腺癌细胞MCF-7，所述结肠癌细胞为人结肠癌细胞HCT116。

10.权利要求4或5所述复合物在制备预防和/或治疗癌症药物中的应用；所述癌症选自下述至少一种：肾癌、肺癌、肝癌、乳腺癌和结肠癌。

11.权利要求4或5所述复合物在制备癌细胞增殖抑制剂中的应用；所述癌细胞选自下述至少一种：肾癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞和结肠癌细胞。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述肾癌细胞为人肾癌细胞A498，所述肺癌细胞为人肺癌细胞A549，所述肝癌细胞为人肝癌细胞HepG2，所述乳腺癌细胞为人乳腺癌细胞MCF-7，所述结肠癌细胞为人结肠癌细胞HCT116。