CN108276454A

CN108276454A - 一种具有荧光特性含n^n两齿螯合配体的半三明治铱配合物及其制备方法、应用

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Publication number: CN108276454A
Application number: CN201810053253.3A
Authority: CN
Inventors: 刘哲; 马文丽; 郭丽华; 田珍珍; 李娟娟; 张均铭
Original assignee: Qufu Normal University
Current assignee: Qufu Normal University
Priority date: 2018-01-19
Filing date: 2018-01-19
Publication date: 2018-07-13
Anticipated expiration: 2038-01-19
Also published as: CN108276454B

Abstract

本发明具体涉及一种具有荧光特性含N^N两齿螯合配体的半三明治铱配合物，属于化学制药领域。该铱配合物的分子结构式为：。本发明通过创造性的采用罗丹明B修饰铱配合物，能够赋予整个配合物以高抗癌活性，线粒体靶向性，对癌细胞可具有选择性，作用过程可视性和实时检测性的理想目的，对药物靶向性的研究具有重大意义。本发明以N^N作为两齿螯合的阴离子配体，合成出一种新型的具有较高抗癌活性且具有荧光特性的离子型性铱配合物，该配合物在抗癌及细胞成像中效果好，活性高。

Description

一种具有荧光特性含N^N两齿螯合配体的半三明治铱配合物及其制备方法、应用

技术领域

本发明涉及金属配合物，具体涉及一种具有荧光特性含N^N两齿螯合配体的半三明治铱配合物，属于化学制药领域。

背景技术

癌症是严重危害人类健康的主要疾病之一，攻克癌症一直是世界瞩目的研究课题。众多金属配合物具有抗肿瘤活性及诱导肿瘤细胞凋亡作用，因此，抗癌药物的种类、结构、性质、作用机制及其应用现状的调研是抗癌药物诱导肿瘤细胞凋亡的研究内容。因此，寻找具有不同作用机理的新型金属抗癌药物，以改良或补充现有铂类药物的性能是当前的研究热点。此外，随着人们对细胞研究的日益深入，核磁共振成像 (MRI)、正电子发射型断层成像 (PET)、单光子发射型断层成像 (SPECT) 以及激光共聚焦荧光显微镜技术等生物医学光学成像技术也得到不断发展，适合的生物成像试剂的开发是当前的一个研究热点。目前，应用于细胞成像领域的商用荧光染料大部分是一些有机小分子，如 PI、DAPI、EB、Hoechst 等。然而，这些有机小分子存在一些缺点：水溶性较差，在水环境 ( 如培养基中) 容易产生沉淀或者与细胞作用后即刻析出，影响染色效果；具有比较高的细胞毒性，染料与细胞作用后，导致细胞的死亡，影响对细胞正常状态的观测；光稳定性低，因受空气中或介质中活性剂基团 ( 单线态氧等 ) 的作用，染料在激发波长照射后，荧光不断减弱，光漂泊现象严重，不利于成像稳定；激发和发射光谱的交叉严重 (stoke shif 小 )，一般在几十个纳米左右，不利于区分内源荧光和降低染料本身的自淬灭。

过渡金属铱配合物，由于其具有良好的物理化学性质，且具备一定的抗癌活性。 N^N、C^C两齿配体的五甲基环戊二烯基IrIII有机金属离子型配合物，抗衡阴离子为六氟磷酸根，此类离子型配合物相对于C^N配体的中性铱配合物，具有更好的溶解性，这有利于作为抗癌药物时的给药。N^N配体作为一个反位效应显著的对称配体多用于合成金属配合物与催化剂，并应用于新金属配合物的合成与催化有机反应和聚合。然而，由于半三明治铱配合物本身并没有荧光特性，所以对半三明治铱配合物抗癌作用的认识还不够深入，还存在着具体作用靶点不明，抗癌机理不明确，以及在正常细胞和癌细胞间选择性差等问题。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种具有荧光特性含N^N两齿螯合配体的铱配合物。

本发明还提供了上述具有荧光特性含N^N两齿螯合配体的铱配合物的制备方法。

本发明还提供了一种上述铱配合物的应用。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种具有荧光特性含N^N两齿螯合配体的半三明治铱配合物，该铱配合物的分子结构式为：

(I)

式（I）中，所述R₁为氢、芳基、烷基、环烷基、卤素或卤代烷基、卤代环烷基、卤代芳基，R₂~R₈为H或烷基；X为Cl^-、PF₆ ^-、BF₄ ^-、BPh₄ ^-、SbF₆ ^-、、。

进一步的，所述R₁为氢原子、苯基或联苯基，R₂~R₈为氢原子，X为PF₆ ^-。

本发明制备的铱配合物的优化的化学结构式如下：

本发明还提供了一种半三明治铱配合物的制备方法，所述方法反应式如下：

本发明所提供的优化的配合物1和配合物2时，具体包括以下步骤：

（1）称取0.5g IrCl₃·nH₂O，加入微波消解仪内罐中，然后加入0.75mL1,2,3,4,5-五甲基环戊二烯，20mL甲醇，超声，通氮气，盖好罐盖，用微波消解仪反应，得到的产物过滤，除去未反应完的IrCl₃·nH₂O，液体旋干，得到的固体连同内罐中的晶体一起用二氯甲烷溶解，加乙醚，用扩散法培养单晶，得到橘黄色铱二聚体（式(1)A中R₁=甲基）产物；

（2）称取0.5g IrCl₃·nH₂O，加入微波消解仪内罐中，然后加入1.3g 1-联苯基，2,3,4,5-四甲基环戊二烯，20mL甲醇，超声，通氮气，盖好罐盖，用微波消解仪反应，得到的产物过滤，除去未反应完的IrCl₃·nH₂O，液体旋干，得到的固体连同内罐中的晶体一起用二氯甲烷溶解，加乙醚，用扩散法培养单晶，得到橘黄色铱二聚体（式（1）A中R₁=联苯基）产物；

（3）配体L的合成：取0.098g罗丹明B酰肼与0.05g5-醛基-邻菲啰啉于100ml圆底烧瓶中，加入30ml二氯甲烷为溶剂，加入1mL甲酸，在45℃下加热回流24h，溶液由玫红色变为红色，旋干液体为红色油状物，加入1-10mL甲醇，置于冰箱中，取出，有米白色固体产生，抽滤，滤饼用甲醇清洗，真空干燥，取滤饼，得米白色粉末产物；

（4）配合物1的合成：取0.0533gL，0.05g铱二聚体（A中R₁=甲基）于100ml圆底烧瓶中，加入20mL溶剂，于70℃加热回流24h，然后旋干溶液，用40℃的甲醇溶解，后加入0.15g六氟磷酸铵，沉淀完全析出后，将溶液和沉淀分开处理；用二氯甲烷将沉淀溶解，硅藻土过滤，旋干液体，用二氯甲烷溶解，加入乙醚重结晶，溶液与沉淀的处理方法一样，产物为橙色固体；

（5）配合物2的合成：取0.0571gL，0.05g铱二聚体（A中R₁=联苯基）于100ml圆底烧瓶中，加入20mL溶剂，于70℃加热回流24h，然后旋干溶液，用40℃的甲醇溶解，后加入0.15g六氟磷酸铵，沉淀完全析出后，将溶液和沉淀分开处理；用二氯甲烷将沉淀溶解，硅藻土过滤，旋干液体，二氯甲烷溶解，加入乙醚重结晶，溶液与沉淀的处理方法一样，产物为橙红色固体。

进一步的，步骤（4）和（5）中，所述溶剂是由甲醇和二氯甲烷按照体积比1：1混合而成。

本发明还提供了一种上述半三明治铱配合物在抗癌及细胞成像药物中的应用。

本发明合成了具有荧光特性的罗丹明B修饰的半三明治铱抗癌配合物，利用罗丹明B良好的荧光特性，使配合物在具有高的抗癌活性的同时，可达到在细胞内成像，其发光性质可以帮助我们实时跟踪药物在细胞内的转运分布，实时监测药物与生物靶分子的相互作用。罗丹明B是一种激光染料，生物染色，是一种荧光染料，其本身具有优良的光物理性质和光稳定性，如摩尔吸光系数大，荧光量子产率高，对PH不敏感等特点，已被广泛应用于荧光标准物，荧光探针以及生物学研究的荧光标记等。

本发明的有益效果为：

（1）本发明通过创造性的采用罗丹明B修饰铱配合物，能够赋予整个配合物以高抗癌活性，线粒体靶向性，对癌细胞可具有选择性，作用过程可视性和实时检测性的理想目的，对药物靶向性的研究具有重大意义。

（2）本发明以N^N作为两齿螯合的阴离子配体，合成出一种新型的具有较高抗癌活性且具有荧光特性的离子型性铱配合物，该配合物在抗癌及细胞成像中效果好，活性高。

附图说明

图1为本发明实施例4制备的配合物1的核磁氢谱。

图2为本发明实施例5制备的配合物2的核磁氢谱。

图3为本发明实施例4制备的配合物1的质谱。

图4为本发明实施例5制备的配合物2的质谱。

图5为本发明浓度为50μM的配合物1,2在365nm紫外灯下存在荧光的图片。

图6为本发明浓度为10μM的配合物1在546nm下激发与发射荧光光谱图。

图7为本发明浓度为10μM的配合物1在592nm下激发与发射荧光光谱图。

图8为本发明浓度为10μM的配合物1在488nm下激发与发射荧光光谱图。

图9为本发明浓度为10μM的配合物1在589nm下激发与发射荧光光谱图。

图10为本发明浓度为10μM的配合物2在550nm下激发与发射荧光光谱图。

图11为本发明浓度为10μM的配合物2在599nm下激发与发射荧光光谱图。

图12为本发明浓度为10μM的配合物2在488nm下激发与发射荧光光谱图。

图13为本发明浓度为10μM的配合物2在600nm下激发与发射荧光光谱图。

图14为本发明浓度为10μM配合物1在488nm激发下在A549细胞内存在荧光的激光共聚焦图片。

图15为本发明浓度为10μM配合物2在488nm激发下在A549细胞内存在荧光的激光共聚焦图片。

具体实施方式

本发明由下述一些代表性化合物的实施例得到进一步阐述，但这些说明并不限制本发明。

本发明所使用的化合物均可通过现有技术中的制备方法进行合成或直接购买。

实施例1

称取0.5g IrCl₃·nH₂O 4份，分别加入4个微波消解仪内罐中，各罐分别加入0.75mL1,2,3,4,5-五甲基环戊二烯，20mL甲醇，超声，通氮气，盖好罐盖，组装主罐与标准罐，设置微波消解仪参数，用微波消解仪反应，得到的产物过滤，除去未反应完的IrCl₃·nH₂O，液体旋干，得到的固体连同内罐中的晶体一起用二氯甲烷溶解，加乙醚，用扩散法培养单晶，得到橘黄色铱二聚体（式(1)A中R₁=甲基）产物，产率51.4%。

实施例2

称取0.5g IrCl₃·nH₂O 4份，分别加入4个微波消解仪内罐中，各罐分别加入1.3g 1-联苯基，2,3,4,5-四甲基环戊二烯，20mL甲醇，超声，通氮气，盖好罐盖，组装主罐与标准罐，设置微波消解仪参数，用微波消解仪反应，得到的产物过滤，除去未反应完的IrCl₃·nH₂O，液体旋干，得到的固体连同内罐中的晶体一起用二氯甲烷溶解，加乙醚，用扩散法培养单晶，得到橘黄色铱二聚体（式（1）A中R₁=联苯基）产物，产率20.6%。

实施例3

配体L的合成：取0.098g罗丹明B酰肼与0.05g5-醛基-邻菲啰啉于100ml圆底烧瓶中，加入30ml二氯甲烷为溶剂，加入一滴甲酸，在45℃下加热回流24h，溶液由玫红色变为红色，TLC检测反应进程，有新物质产生，旋干液体为红色油状物，加入少量的甲醇，置于冰箱中一段时间后，取出，有米白色固体产生，抽滤，滤饼用甲醇洗几遍，滤液为玫红色，真空干燥，取滤饼，得米白色粉末产物。产率53.6%。

实施例4

配合物1的合成：取0.075gL，0.05g铱二聚体（A中R₁=甲基）于100ml圆底烧瓶中，在甲醇:二氯甲烷=1:1为溶剂的条件下，于70℃加热回流24h，溶液变为血红色，一段时间后，有红色残渣出现，旋干溶液，用热的甲醇溶解，后加入0.15g六氟磷酸铵加速沉淀析出，沉淀为橙红色，沉淀完全析出后，将溶液和沉淀分开处理。用二氯甲烷将沉淀溶解，硅藻土过滤，旋干液体，用尽可能少的二氯甲烷溶解，加入乙醚重结晶，溶液与沉淀的处理方法一样，产物为橙红色固体，产率为25.1％。

氢谱图如图1所示：核磁表征为：¹H NMR (500 MHz, CDCl₃)： δ 9.55 (s, 1H),9.34 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 9.17 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 9.12 (d, J = 5.1 Hz, 1H),8.49 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.11 – 8.02 (m, 4H), 7.59 (dt, J = 22.6, 7.2 Hz,2H), 7.24 (s, 1H), 6.54 (t, J = 8.2 Hz, 4H), 6.27 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.32(tt, J = 14.8, 7.4 Hz, 8H), 1.74 (s, 15H), 1.13 (d, J = 7.0 Hz, 12H)。质谱图如图3所示。

实施例5

配合物2的合成：取0.075gL₂，0.069g铱二聚体（A中R₁=联苯基）于100ml圆底烧瓶中，在甲醇:二氯甲烷=1:1为溶剂的条件下，于70℃加热回流24h，溶液变为血红色，一段时间后，有红色残渣出现，旋干溶液，用热的甲醇溶解，后加入0.15g六氟磷酸铵加速沉淀析出，沉淀为橙红色，沉淀完全析出后，将溶液和沉淀分开处理。用二氯甲烷将沉淀溶解，硅藻土过滤，旋干液体，用尽可能少的二氯甲烷溶解，加入乙醚重结晶，溶液与沉淀的处理方法一样，产物为橙红色固体，产率为56.0％。

氢谱图如图2所示，核磁表征为：¹H NMR (500 MHz, CDCl₃)： δ 9.79 (s, 1H),9.19 – 9.12 (m, 1H), 9.07 (dd, J = 10.3, 4.7 Hz, 1H), 8.91 (d, J = 7.8 Hz,1H), 8.84 – 8.70 (m, 1H), 8.52 (s, 1H), 8.13 (dd, J = 8.2, 5.2 Hz, 1H), 7.99(d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.91 (dd, J = 8.6, 5.3 Hz, 1H), 7.75 (ddd, J = 20.6,17.1, 8.5 Hz, 5H), 7.67 – 7.56 (m, 3H), 7.52 (dd, J = 17.6, 10.2 Hz, 2H),7.42 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.23 (t, J = 10.6 Hz, 1H), 6.53 – 6.32 (m, 6H),3.38 (dd, J = 14.0, 7.0 Hz, 4H), 3.27 (dd, J = 15.2, 8.2 Hz, 4H), 1.90 – 1.69(m, 12H), 1.13 – 0.99 (m, 12H).。质谱图如图4所示。

对比例1

配合物1和配合物2较[(η5 -C5Me5)Ir(phen)Cl] PF6和[(η5 -C5Me4C6H4C6H5)Ir(phen)Cl]PF6 结构相比，抗癌活性更高、且具有细胞成像效果。

效果实施例

（一）具抗癌活性的配合物1~2对肿瘤细胞株的增殖抑制活性实验：

(1)待测化合物的配制：

将固体配合物1~2分别溶解在DMSO中，配成一定浓度的储备液，用细胞培养液进一步稀释储备液直到达到工作浓度，培养24h；

(2) 细胞生长抑制实验(MTT法)：

1) 取5000个子宫颈癌细胞(Hela)，配制成细胞悬液，接种于96孔培养板中；

2) 用无药培养基预培养细胞，5％CO2，310K孵育24小时，加入配制好的待测化合物，培养24 h；

3) 每孔加入15μL 5 mg/mL的MTT溶液，继续培养4小时，形成紫色结晶物质甲瓒；

4) 终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入100μL的DMSO充分溶解甲瓒沉淀，振荡器混匀后，酶标仪用波长为 570nm测定各孔的光密度值；

5) 每个实验重复三次，IC₅₀=平均值± SEM

配合物1、2及顺铂对子宫颈癌细胞(Hela)生长的抑制率见表1。

表1

通过表1可以看出，配合物IC₅₀值>100μM，不表现抗癌活性，配合物1、2表现出抗癌活性，配合物1的抗癌活性优于顺铂，配合物1的抗癌活性是顺铂的2.5倍。此外，随着取代基的改变，抗癌活性也发生变化，这说明取代基的修饰对抗癌活性会产生一定的影响。

（二）配合物1~2具有荧光性质的测试实验：

(1) 配制浓度为50μM的配合物一和配合物二，在365nm紫外灯下照射，从图5可看出，两者皆呈现橙黄色荧光。

(2)荧光分光光度计

配制 10μM配合物1,2的溶液：

配合物1在546nm下激发，荧光曲线图如图6所示，从图中可看出，峰值最高处为546nm激发状态下的592nm处，再以592nm做发射值，做荧光曲线图，如图7所示，从图中可看出，峰值最高处为564nm，与激发为546nm基本一致，故可证明配合物1具有荧光性质。再以488nm为激发值，由图8可看出，在589nm处存在发射值，再以589nm做发射值，由图9可看出，在519nm处存在激发值，与激发值488nm基本一致，故证明，配合物1在488nm激发下具有荧光。

配合物2在550nm下激发，荧光曲线图如图10所示，从图中可看出，599nm处有发射峰，再以599nm做发射值，做荧光曲线图，如图11所示，从图中可看出，峰值最高处为565nm，与激发为550nm基本一致，故可证明配合物2具有荧光性质。再以488nm为激发值，由图12可看出，在600nm处存在发射值，再以600nm做发射值，由图13可看出，在522nm处存在激发值，与激发值488nm基本一致，故证明，配合物2在488nm激发下具有荧光。

（3）激光共聚焦细胞内荧光呈像测试：

配制浓度为10μM的配合物1和配合物2于一定数量的A549细胞中，孵化1h后，用 488nm光作为激发光源，收集 493 ～ 630nm 范围内的荧光。如图14和图15所示，配合物1和配合物2均可在细胞内荧光呈像。

综上所述，本发明中的罗丹明修饰的半三明治铱配合物，由MTT 法分析1μM 配合物对Hela 细胞的细胞毒性研究，表明配合物具备较高抗癌活性，通过对配合物做的荧光曲线图及配合物孵化后进入A549细胞后的激光共聚焦实验表明，该类配合物具有优良的荧光特性，是良好的活细胞成像试剂，表明该罗丹明修饰的半三明治铱配合物在研究其具体的抗癌机理及细胞内荧光成像，生物标记等方面具有巨大的应用潜力。

Claims

1.一种具有荧光特性含N^N两齿螯合配体的半三明治铱配合物，其特征在于，该铱配合物的分子结构式为：

(I)

2.根据权利要求1所述的半三明治铱配合物，其特征在于，所述R₁为氢原子、苯基或联苯基，R₂~R₈为氢原子，X为PF₆ ^-。

3.根据权利要求1或2所述的半三明治铱配合物，其特征在于，所述铱配合物的化学结构式如下：

。

4.一种如权利要求1-3任一项所述的半三明治铱配合物的制备方法，其特征在于，所述方法反应式如下：

。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）和（5）中，所述溶剂是由甲醇和二氯甲烷按照体积比1：1混合而成。

7.一种如权利要求1-3任一项所述的半三明治铱配合物在抗癌及细胞成像药物中的应用。