CN100362972C - 人工毛乳头替代结构及其制作方法 - Google Patents

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Abstract

一种人工毛乳头替代结构，包括毛乳头细胞，在毛乳头细胞外面包裹有海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠三层结构膜的中空微囊，微囊的直径为200～650μm，微囊的壁厚为2～12μm。该人工毛乳头替代结构的功能与毛乳头十分相似，具有诱导毛囊再生及维持毛发生长的功能，而且该结构可以在体外由人工制作得到，其制作材料来源广泛，数量不受限制，使临床上模仿毛乳头的生物学特性治疗各种毛发缺失性疾病成为现实上的可能，具有广阔应用前景。

Description

人工毛乳头替代结构及其制作方法
技术领域
本发明属于一种人体或动物组织的替代结构及其制作方法，具体涉及一种人工制作的毛乳头替代结构及其制作方法。
背景技术
人体或动物的毛乳头位于毛囊的底部，包括毛乳头细胞2及基底膜3(见图1)。研究和实验证实，毛乳头对于诱导毛囊再生及维持毛发生长，均起到重要的核心作用，其中一个重要机制是毛乳头在此过程中不断分泌并向毛囊传送有关信号因子。但是如果单独将毛乳头细胞移植到皮肤后，其诱导毛囊再生及维持毛发生长的作用却很不稳定，这个原因十分复杂，其中比较重要的因素是，毛乳头的基底膜能为包裹其中的毛乳头细胞提供立体的生长空间，让毛乳头细胞呈现集聚性生长，而集聚性生长的特性与其功能密切相关。如果单纯将毛乳头细胞进行自体或异体的移植，毛乳头细胞就没有上述生长条件，因而很难起到与毛乳头同样的作用。由于毛乳头细胞诱导毛囊再生及维持毛发生长的作用不稳定，因而还不能实际应用到临床上治疗各种毛发缺失性疾病。
毛乳头可以在培养皿中进行体外培养，但是，毛乳头体外培养的结果只是使毛乳头细胞的数量扩增，而不是使毛乳头的数量扩增，即不能由一倍数量的毛乳头在体外直接培养得到更多数量的毛乳头。换言之，现有技术中，人们为了获取具有诱导毛囊再生功能的毛乳头，其唯一途径只能是直接从自体或异体的皮肤分离出来，但异体或异种毛乳头的移植应用易产生排斥免疫反应，而可供移植的自体人头皮毛乳头来源十分有限。因此，虽然人们已经深刻了解毛乳头具有诱导毛囊再生及维持毛发生长的特性，但由于毛乳头的来源受到极大限制，现在人们也同样未能将毛乳头的特性广泛应用在临床上治疗各种毛发缺失性疾病，毛发缺失性疾病的治疗仍然是世界性难题。
在另一方面，海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠三层结构膜形成的中空微囊(通称“APA微囊”)已经在细胞移植的领域广泛应用，该三层结构膜为半透膜，只允许分子量小于10万左右的小分子物质自由进出，因而APA微囊结构一方面能让营养物质、细胞因子、生长因子及有关信号因子自由通过，另一方面又能有效隔绝IgG抗体等大分子物质对囊内细胞的攻击，APA微囊的免疫隔离性能已经得到公认。但是，迄今为止，人们对于APA微囊性能和作用的认识和利用，只是注意到了其免疫隔离性能，而尚未发现APA微囊具有其它性能和作用，国内外尚未发现有关于APA微囊用于人工毛乳头替代结构的报道。
发明内容
本发明的目的是要提供一种人工毛乳头替代结构，它具有诱导毛囊再生及维持毛发生长的功能，而且该结构可以在体外由人工制作得到，其制作材料来源广泛，数量不受限制。本发明的目的还在于提供这种人工毛乳头替代结构的制作方法。
为实现以上目的，本发明的人工毛乳头替代结构包括毛乳头细胞，其特征在于：在毛乳头细胞外面包裹有海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠三层结构膜形成的中空微囊，微囊的直径为200～650μm，微囊的壁厚为2～12μm。
较好的是，上述人工毛乳头替代结构中微囊的直径为300～500μm，微囊的壁厚为4～8μm。这样，微囊的形态与人头皮毛乳头基底膜的形态基本相似。
更好的是，微囊中的毛乳头细胞为人头皮毛乳头细胞。
上述微囊中的毛乳头细胞也可以为有毛动物毛乳头细胞。
上述人工毛乳头替代结构的制作方法依次包括以下主要步骤：①、将毛乳头细胞悬于浓度为15～25 g/L的海藻酸钠溶液，形成悬浮液，使每毫升悬浮液中含1.5～9×105个毛乳头细胞；②、利用高压电场微囊发生器使步骤①获得的悬浮液形成直径为200～650μm的微滴状态，然后滴入浓度为9～14g/L的CaCl2溶液中，获得实心微球状沉淀物；③、将步骤②获得的实心微球状沉淀物加入到浓度为0.5～1.5g/L的多聚赖氨酸溶液中，作用8～20分钟，获得实心微球状沉淀物；④、将步骤③获得的实心微球状沉淀物加入到浓度为1.5～2.5g/L的海藻酸钠溶液中，作用3～10分钟，获得实心微球状沉淀物；⑤、将步骤④获得的实心微球状沉淀物加入到浓度为0.03～0.07mol/L的枸橼酸钠溶液中，作用5～20分钟，获得中空结构的微球状沉淀物；⑥、将步骤⑤获得的中空结构微球状沉淀物用生理盐水清洗，即可获得人工毛乳头替代结构。获得的人工毛乳头替代结构可转入含胎牛血清的DMEM液中培养，保存。
较好的是，在上述步骤①之中，使悬浮液中毛乳头细胞的浓度为每毫升4～6×105个。
更好的是，上述制作方法中，在上述步骤①之前，先将毛乳头置于器皿中培养，将毛乳头中迁出的毛乳头细胞传代培养后，取得数量成倍扩增的毛乳头细胞，然后再进行上述步骤①。
上述制作方法中，采用的毛乳头细胞可以为人头皮毛乳头细胞。
上述制作方法中，采用的毛乳头细胞也可以为有毛动物毛乳头细胞。在上述每个人工毛乳头替代结构中，毛乳头细胞的数量可为10～100个，最好为15～40个。
本发明具有以下优点和效果：
1.本发明中的海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠三层结构膜(APA微囊)的形状、直径与生物体毛乳头的基底膜大致相仿，都是空心的类圆球形结构，两者壁厚差别不大，壁上都有均匀的蜂窝状孔隙结构，而且孔隙大小相仿，都为半透膜性质，两者在结构、形态方面非常相似。
2、本发明中的APA微囊不但具有传统APA微囊的两大常见功能(即能让小分子物质自由通过和隔绝大分子物质攻击)，而且还具有生物体毛乳头的基底膜的功能，即可以为包裹其中的毛乳头细胞提供足够的立体生长空间，使毛乳头细胞得以以聚集性的方式生长，并有利于让毛乳头细胞贴着APA微囊壁生长，迎合毛乳头细胞生理特点的需求。因此，将本发明的人工毛乳头替代结构移植到人体或动物身上，同样能比较稳定地起到诱导毛囊再生及维持毛发生长的作用。
3、本发明的人工毛乳头替代结构既可进行自体移植(即采用自体传代扩增培养出来的毛乳头细胞制作得到的毛乳头替代结构进行的移植)，也可进行同种异体移植，还可进行异种移植，具有广阔应用前景。当进行自体移植时，本发明中APA微囊的主要作用并非公知的免疫隔离性能，而是起到替代基底膜的功能作用，APA微囊的这种性能是前所未知的，因此充分体现出本发明的创造性。当进行同种异体移植或异种移植时，本发明中APA微囊的主要作用有两方面，其一是起到替代基底膜的功能作用，其二是在一定程度上起到公知的免疫隔离作用，由于这种情况下APA微囊能实现一物两用，且其中一个作用是前所未知的，更充分地体现出本发明的创造性。
4、本发明的人工毛乳头替代结构起到与毛乳头相同的作用，并可以在生物体外构建，使毛乳头来源不足的问题迎刃而解，它既可利用自体的毛乳头细胞先行传代扩增培养后制作，又可利用同种异体的毛乳头细胞或异种的毛乳头细胞制作，特别是可以采用动物毛乳头细胞制作人头皮毛乳头的替代结构，因此其原料来源、产量不受限制，使临床上模仿毛乳头的生物学特性治疗各种毛发缺失性疾病成为现实上的可能，具有广阔应用前景。
本发明的人工毛乳头替代结构在形态结构观察和移植方面的实验效果显著。
利用本发明的方法制作得到人工毛乳头替代结构，并与新鲜分离的人头皮毛乳头进行大体形态、超微结构的显微镜下观察、对比，结果如下：新鲜分离的人头皮毛乳头的基底膜为圆球形，直径300～450μm，基底膜非常光滑，厚约5～6μm，呈均匀的蜂窝状结构。而实验得到的人工毛乳头替代结构同样呈圆球形，直径300～500μm，大小均匀，表面光滑，囊膜壁厚约4～8μm，呈均匀的蜂窝状结构，而且其中的毛乳头细胞与新鲜分离毛乳头中的细胞无明显差异，可见人毛乳头替代结构与新鲜分离的毛乳头在结构形态方面非常相似。
将本发明方法制作得到的1毫升人头皮毛乳头替代结构(约含1000多个)，用注射器针头注射于裸小鼠背部皮下，观察其诱导局部毛囊结构形成的情况，结果如下：移植后第4周，在背部皮下组织中，可见大量发育完整的毛囊结构形成，HE染色显示，毛囊由数层上皮细胞呈同心圆排列而成，中心为嗜伊红染色的角化物质，同时，在裸小鼠背部皮肤可见毛发长出。而在远离移植区域的裸鼠皮肤中，仅偶见萎缩的毛囊结构。可见人工毛乳头替代结构的APA微囊能够发挥与毛乳头中基底膜相同的作用，人工毛乳头替代结构同样具有诱导毛囊再生及维持毛发生长的功能。
将本发明方法制作得到的1毫升人头皮毛乳头替代结构(约含1000多个)，用注射器针头注射于人头皮脱发部位，观察其诱导局部毛囊结构形成的情况，结果如下：移植后第4周，在人头皮脱发部位可见大量发育完整的毛囊结构形成，移植后第6周，可见移植处头皮长出毛发。因此，人工人头皮毛乳头替代结构具有诱导毛囊再生及维持毛发生长的功能，可以有效治疗脱发。
附图说明
图1是人体或动物毛乳头的结构示意图。
图2是本发明人工人头皮毛乳头替代结构的结构示意图。
具体实施方式
实施例一
见图2，该实施例的人工毛乳头替代结构包括中空微囊1，该中空微囊为海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠三层半透膜结构，微囊的直径为300μm，微囊的壁厚为4μm，微囊中开始包裹有15个人头皮毛乳头细胞2，当然，以后细胞的数量可逐渐生长、增多。
实施例二
该实施例的人工毛乳头替代结构包括海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠三层结构膜的中空微囊，微囊的直径为500μm，微囊的壁厚为8μm，微囊中包裹有40个人头皮毛乳头细胞，其结构与实施例一基本相同。
实施例三
该实施例的人工毛乳头替代结构包括海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠三层结构膜的中空微囊，微囊的直径为400μm，微囊的壁厚为6μm，微囊中包裹有25个人头皮毛乳头细胞，其结构与实施例一基本相同。
实施例四
该实施例的人工毛乳头替代结构包括海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠三层结构膜的中空微囊，微囊的直径为500μm，微囊的壁厚为6μm，微囊中包裹有45个绵羊的毛乳头细胞，其结构与实施例一基本相同。
实施例五
该实施例的人工毛乳头替代结构包括海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠三层结构膜的中空微囊，微囊的直径为220μm，微囊的壁厚为2μm，微囊中包裹有80个小白鼠的毛乳头细胞，其结构与实施例一基本相同。
实施例六
该实施例的人工毛乳头替代结构包括海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠三层结构膜的中空微囊，微囊的直径为650μm，微囊的壁厚为11μm，微囊中包裹有40个红鹿的毛乳头细胞，其结构与实施例一基本相同。
实施例七
人工毛乳头替代结构的制作方法，依次包括以下主要步骤：①、先将人头皮毛乳头置于器皿中培养，将毛乳头中迁出的毛乳头细胞传代而取得数量成倍扩增的毛乳头细胞，将毛乳头细胞悬于浓度为20g/L的海藻酸钠溶液中，形成每毫升含有5×105个毛乳头细胞的悬浮液；②、利用高压电场微囊发生器使步骤①获得的悬浮液形成直径为450μm的微滴状态，然后滴入浓度为11g/L的CaCl2溶液中，待完全沉淀后，去除上清液，获得实心微球状沉淀物，生理盐水清洗3次；③、将步骤②获得的实心微球状沉淀物加入到浓度为1g/L的多聚赖氨酸溶液中，作用10分钟，获得实心微球状沉淀物，生理盐水清洗3次；④、将步骤③获得的实心微球状沉淀物加入到浓度为2g/L的海藻酸钠溶液中，作用4分钟，获得实心微球状沉淀物，生理盐水清洗3次，每次3分钟；⑤、将步骤④获得的实心微球状沉淀物加入到浓度为0.05mol/L的枸橼酸钠溶液中，作用6分钟，获得中空结构的微球状物；⑥、将步骤⑤获得的中空结构的微球状物用生理盐水清洗3次，即可获得人工毛乳头替代结构，然后将该人工毛乳头替代结构转入到含10％胎牛血清的DMEM液中培养，保存。
上述步骤①中的“悬于”，是指将毛乳头细胞均匀分散到海藻酸钠溶液中。
实施例八
人工毛乳头替代结构的制作方法，依次包括以下主要步骤：①、先将人头皮毛乳头置于器皿中培养，使毛乳头中迁出的毛乳头细胞融合后传代而取得数量扩增的毛乳头细胞，然后将毛乳头细胞悬于浓度为15g/L的海藻酸钠溶液中，形成每毫升含有1.5×105个毛乳头细胞的悬浮液；②、利用高压电场微囊发生器使步骤①获得的悬浮液形成直径为400μm的微滴状态，然后滴入浓度为9g/L的CaCl2溶液中，待完全沉淀后，去除上清液，获得实心微球状沉淀物，生理盐水清洗3次；③、将步骤②获得的实心微球状沉淀物加入到浓度为0.5g/L的多聚赖氨酸溶液中，作用20分钟，获得实心微球状沉淀物，生理盐水清洗3次；④、将步骤③获得的实心微球状沉淀物加入到浓度为1.5g/L的海藻酸钠溶液中，作用10分钟，获得实心微球状沉淀物，生理盐水清洗3次；⑤、将步骤④获得的实心微球状沉淀物加入到浓度为0.03mol/L的枸橼酸钠溶液中，作用20分钟，获得中空结构的微球状物；⑥、将步骤⑤获得的中空结构的微球状物用生理盐水清洗3次，每次3分钟，即可获得人工毛乳头替代结构，然后将该人工毛乳头替代结构转入含10％胎牛血清的DMEM液中培养，保存。
实施例九
人工毛乳头替代结构的制作方法，依次包括以下主要步骤：①、将人头皮毛乳头细胞与浓度为25 g/L的海藻酸钠溶液混合，形成每毫升含有9×105个毛乳头细胞的悬浮液；②、利用高压电场微囊发生器使步骤①获得的悬浮液形成直径为500μm的微滴状态，然后滴入浓度为14g/L的CaCl2溶液中，待完全沉淀后，去除上清液，获得实心微球状沉淀物，生理盐水清洗3次；③、将步骤②获得的实心微球状沉淀物加入到浓度为2.5g/L的多聚赖氨酸溶液中，作用8分钟，获得实心微球状沉淀物，生理盐水清洗3次；④、将步骤③获得的实心微球状沉淀物加入到浓度为2.5g/L的海藻酸钠溶液中，作用3分钟，获得实心微球状沉淀物，生理盐水清洗3次；⑤、将步骤④获得的实心微球状沉淀物加入到浓度为0.07mol/L的枸橼酸钠溶液中，作用5分钟，获得中空结构的微球状物；⑥、将步骤⑤获得的中空结构的微球状物用生理盐水清洗3次，即可获得人工毛乳头替代结构，然后将该人工毛乳头替代结构转入含10％胎牛血清的DMEM液中培养，保存。
实施例十
该方法的步骤①、将绵羊毛乳头细胞与浓度为20g/L的海藻酸钠溶液混合，形成每毫升含有5×105个绵羊毛乳头细胞的悬浮液；该方法的步骤②～⑥与实施例七相同。
实施例十一
该方法的步骤①、将小白鼠毛乳头细胞与浓度为20g/L的海藻酸钠溶液混合，形成每毫升含有4×105个小白鼠毛乳头细胞的悬浮液；②、利用高压电场微囊发生器使步骤①获得的悬浮液形成直径为200μm的微滴状态，然后滴入浓度为11g/L的CaCl2溶液中，待完全沉淀后，去除上清液，获得微球状沉淀物，生理盐水清洗3次；以下步骤③～⑥与实施例八相同。
实施例十二
该方法的步骤①、将红鹿(red deer)毛乳头细胞与浓度为20 g/L的海藻酸钠溶液混合，形成每毫升含有6×105个红鹿毛乳头细胞的悬浮液；②、利用高压电场微囊发生器使步骤①获得的悬浮液形成直径为650μm的微滴状态，然后滴入浓度为11g/L的CaCl2溶液中，待完全沉淀后，去除上清液，获得实心微球状沉淀物，生理盐水清洗3次；以下步骤③～⑥与实施例九相同。
上述实施例中，高压电场微囊发生器可采用上海理工大学生产的产品，其调节控制微滴直径大小的方法属于公知技术。

Claims (9)

1.一种人工毛乳头替代结构，包括毛乳头细胞，其特征在于：在毛乳头细胞外面包裹有海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠三层结构膜的中空微囊，微囊的直径为200～650μm，微囊的壁厚为2～12μm。
2.根据权利要求1的人工毛乳头替代结构，其特征在于：微囊的直径为300～500μm，微囊的壁厚为4～8μm。
3.根据权利要求1或2的人工毛乳头替代结构，其特征在于：微囊中的毛乳头细胞为人头皮毛乳头细胞。
4.根据权利要求1或2的人工毛乳头替代结构，其特征在于：微囊中的毛乳头细胞为有毛动物毛乳头细胞。
5.一种人工毛乳头替代结构的制作方法，其特征在于依次包括以下主要步骤：①、将毛乳头细胞悬于浓度为15～25g/L的海藻酸钠溶液，形成悬浮液，使每毫升悬浮液中含1.5～9×105个毛乳头细胞；②、利用高压电场微囊发生器使步骤①获得的悬浮液形成直径为200～650μm的微滴状态，然后滴入浓度为9～14g/L的CaCl2溶液中，获得实心微球状沉淀物；③、将步骤②获得的实心微球状沉淀物加入到浓度为0.5～1.5g/L的多聚赖氨酸溶液中，作用8～20分钟，获得实心微球状沉淀物；④、将步骤③获得的实心微球状沉淀物加入到浓度为1.5～2.5g/L的海藻酸钠溶液中，作用3～10分钟，获得实心微球状沉淀物；⑤、将步骤④获得的实心微球状沉淀物加入到浓度为0.03～0.07mol/L的枸橼酸钠溶液中，作用5～20分钟，获得中空结构的微球状沉淀物；⑥、将步骤⑤获得的中空结构微球状沉淀物用生理盐水清洗，即可获得人工毛乳头替代结构。
6.根据权利要求5的制作方法，其特征在于：在上述步骤①之中，使每毫升悬浮液中含4～6×105个毛乳头细胞。
7.根据权利要求5或6的制作方法，其特征在于：在上述步骤①之前，先将毛乳头置于器皿中培养，将毛乳头中迁出的毛乳头细胞传代培养后取得数量扩增的毛乳头细胞，然后再进行上述步骤①。
8.根据权利要求5或6的制作方法，其特征在于：上述制作方法中，采用的毛乳头细胞为人头皮毛乳头细胞。
9.根据权利要求5或6的制作方法，其特征在于：上述制作方法中，采用的毛乳头细胞为有毛动物毛乳头细胞。
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