CN100360182C - 抗原特异性免疫耐受的诱导 - Google Patents

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Abstract

通过施用耐受原与免疫抑制方案相组合诱导哺乳动物宿主中的抗原特异性免疫耐受。该方法任选包括在前适应期，在适应期中，在无耐受原的情况下施用T细胞免疫抑制剂。在致耐受方案后，将免疫抑制剂从宿主撤离，宿主仍能保持对存在于耐受原上的免疫原性表位的特异性免疫耐受。最好，所述耐受原要具有高摄取特性，以使其在体内低浓度时可以被多种致耐受细胞摄取。

Description

抗原特异性免疫耐受的诱导
发明领域
本发明涉及用于诱导哺乳动物免疫耐受的方法和组合物。该方法包括按耐受方案联合施用高-摄取耐受原与免疫抑制剂。
发明背景
免疫耐受与许多种临床重要用途密切相关。抗原特异性耐受是治疗和预防自体免疫疾病和移植排斥的主要目标，这些病症目前主要通过非特异性免疫抑制来控制。但是这种治疗方式会导致感染率升高、癌症和药物相关疾病。免疫耐受诱导的其它用途包括变态反应和哮喘，骨髓置换和基于蛋白质的治疗。
分子生物学的一个首要的实际用途是已经能够生产出大量稀有的生物药物，其中的大部分具有治疗活性。但是，现已发现：在施用这些药物的过程中，患者会出现免疫应答，产生出能够结合和干扰治疗活性的抗体以及引发急性或慢性免疫应答。该问题是蛋白质治疗药物的最大问题，因为蛋白质是复合抗原，多数情况下，患者对于这些抗原是初次接触(naive)。
在缺陷病证的至少一些患者中已经发现这种类型的免疫应答，例如，血友病A(Aledort(1994)Am.J.Hemat.47：208-217)，糖尿病(Gossain etal.(1985)Ann.Allergy 55：116-118)，腺嘌呤去氨酶缺陷(Chaffee et al.(1993)J.Clin.Inv.89：1643-1651)，高雪氏病(Gaucher disease)(Richards et al.(1993)Blood 82：1402-1409)，和庞氏症(Pompe disease)(Amalfitano(2001)Genet Med3：132-138)。在血友病A，抗体会抑制因子VIII的功能，需要用活化的凝血酶原浓缩复合物进行替代治疗。腺嘌呤去氨酶缺陷时，抗经PEG修饰的腺苷脱氨酶的抗体会加速酶的清除和降低酶的效率。在高雪氏病中，IgG1抗体的诱导与因输注过程中补体活化的过敏样反应相关。在庞氏症中，用重组的α-葡糖苷酶替代治疗导致所治疗三位患者中的两位诱导产生了抗体，因而消减了治疗效果。
类似的免疫应答也已发现于通过基因治疗的蛋白质治疗物的递送过程中。例如，与载体连接的病毒蛋白是免疫应答的目标，该免疫应答能引发炎症，表达缩短以及对重复施用载体的抵制(Wilson and Kay(1995)NatureMed.1：887-889)。对治疗蛋白的抗体应答还发现于基因治疗试验中，并且是阻止长期表达的全身免疫应答的一部分(Shull et al.(1996)Blood88：377-379)。全身性免疫抑制、阻滞和从体液到细胞应答的免疫偏离已被用来解决这一问题，但是并不能确保对抗原的持久耐受。
耐受可以定义为是对正常免疫系统中特异抗原的免疫应答的缺失。这种对自体成分的特异性免疫耐受的状态包括中枢和外周机制。中枢耐受(阴性选择)是未成熟T细胞还留在胸腺中时接受强的细胞内信号导致自体细胞克隆消除的结果。外周耐受发生在免疫系统对存在于外周环境中的抗原变得不反应时。与胸腺不同，外周环境中的T细胞是功能成熟的。外周耐受已被认为是各种机制的结果，包括抗原特异性抑制细胞或其它方式的活性耐受的发生、克隆缺失以及不应答。自体反应活性细胞可以通过在其识别了耐受抗原后诱导凋亡而从物理方式上去除，可以不去除但是让其变得不应答，或者可以用调控功能的细胞因子或细胞从功能上抑制。尽管近年来对体内抗原暴露的发生有了许多了解，但是对其所造成的后果还很难预测，还需要在基础水平上对耐受机制作进一步阐明。
现已发展了大量方法诱导动物模型中的抗原特异性耐受，例如带有自体免疫病症的动物模型，如多发性硬化症(或实验性变态反应性脑脊髓炎，EAE)或糖尿病，以及防止异基因组织移植的排斥。在小鼠和大鼠模型上开发的主要方法包括施用高用量的可溶性抗原，口服抗原或胸腺内注射。这些方法的效率取决于下列操作的不同程度：克隆缺失，克隆不应答，抗原特异性T细胞的活性抑制以及从细胞到体液免疫应答的偏离所达到的程度。
尽管很久以来就已知道施用大量可溶性抗原会导致对随后的免疫攻击不应答，但是EAE的研究也已显现了该方法中的困难。高用量的需求以及耐受与免疫偏离的不一致使得大多数基因治疗情况下单独施用可溶性抗原变得不切实际。
现已查明：向小鼠口服施用极大量的抗原会诱导对蛋白抗原的耐受。但是，需要超常规的用量，而且结果也很复杂。一定的用量导致不应答，而其它用量则会引发一种抗原-特异性旁路抑制的反应形式，特征为抗原-特异性的TH2型应答。此外，口服抗原会致敏免疫系统，引发更严重的疾病。
胸腺内注射抗原或细胞已被广泛用作诱导中枢免疫耐受的技术。该过程中注射和提呈于胸腺中的抗原能使得CD4+、CD8+T细胞凋亡或不应答，该过程需要10天时间。与口服和可溶性抗原耐受一样，耐受效果是用量依赖性的：低用量的抗原具有致敏作用或只提供部分保护，而较大用量的抗原具有致耐受的作用。胸腺中的抗原提呈范围也是很重要的。当抗原是被宿主抗原提呈细胞(APC)提呈时，耐受诱导的效率最高。耐受一旦发生，则需要动物体内抗原的持续提呈来维持耐受，另外成熟T细胞的消减也是需要的。
一种诱导耐受的方法是以下述发现为基础的：最佳的T细胞活化需要抗原特异性信号和非-抗原特异性信号。在抗原提呈过程中，发生了大量重要的双向识别相互作用，向T细胞和抗原提呈细胞都发送了信号。最好理解的共刺激信号是通过T细胞表面分子CD28提供的。CD28有两种配体，同源分子CD80(B7-1)和CD86(B7-2)；它们二者都表达于活化的APC和其它一些细胞类型。已受到密切关注的另一途径在T细胞共刺激中发挥重要作用，该途径是通过CD40及其配体CD154介导的。CD154表达于活化的T细胞，主要为CD4+T细胞。
在过去几年中，许多实验室已发现：封闭T细胞共刺激信号能提高长期异体移植物的存活率，诱导移植耐受。这些研究中的大部分使用了CTLA4Ig或具有封闭活性的抗CD154单克隆抗体，CTLA4Ig，是一种CTLA-4与人Ig的融合蛋白，能够竞争性地结合CD80和CD86。共刺激封闭已经在进行了下列移植的小鼠和大鼠模型中取得了部分成功：心、肝、胰岛、肾、肺和骨髓移植。尽管单独使用单一药物如CTLA4Ig或抗-CD154抗体能提高长期移植物的存活率，但是这些药物自身不能实现不受限制的移植物存活；慢性排斥导致的晚期异体移植物丢失是必然的结果。最常见的是，供体特异性淋巴细胞的转输或CTLA4Ig与抗-CD154抗体的联用是长期存活所需要的，无论有无耐受。另外，非人灵长类的结果不如啮齿类模型那么好。
在已经使用了CTLA4Ig和/或抗-CD40抗体诱导耐受的小鼠模型中，已经表明合并施用环孢菌素能阻止耐受的诱导。剥夺了共刺激信号的T细胞中，耐受的诱导是一个涉及TCR信号传导事件的主动过程(active process)，所述事件对于环孢菌素来说是敏感的。因此，在存在环孢菌素时，耐受不能通过这种方式实现。因此，这些参考文献教导：在耐受诱导方案中，不可使用环孢菌素。
在将移植后两天施用的CTLA4Ig与供体特异性淋巴细胞联合使用诱导小鼠心脏异体移植物耐受的方法中，在移植时封闭CTLA-4能阻止耐受的诱导，导致早期排斥。因此，早期的CTLA-4信号对于一些T细胞耐受抑制策略来说是允许的；没有这些信号将很难关闭免疫应答。类似地，在自体免疫病小鼠模型中，封闭CTLA-4加剧疾病的进程和严重程度。由于CTLA4Ig等药物能阻止CD80和CD86与CD28和CTLA-4这二者的结合，所以这些药物在具有阻断阳性信号(通过CD28)的同时，还具有阻断阴性信号(通过CTLA-4)的副作用。
在所有这些方法中，诱导的耐受要么是不能令人信赖的，要么是还未在人体取得成功或者不能应用于治疗和临床。所以，临床上需要能防止针对抗原的免疫应答的方法。本发明就是旨在解决该问题。
发明概述
本发明提供了在哺乳动物宿主诱导抗原特异性免疫耐受的方法。将基本含有提呈于目的抗原的所有免疫原性表位的耐受原与T细胞免疫抑制剂联合。在一段时间内以足以提供深度免疫抑制的量施用给哺乳动物宿主。该方案还可以进一步包括施用抗-增殖药物。在本发明的一个技术方案中，在该耐受方案之前安排一段适应期，在适应期中，在无耐受原的情况下单独施用T细胞免疫抑制剂。在致耐受方案后，将免疫抑制剂从宿主撤离，宿主能保持对耐受原上存在的免疫原性表位的特异性免疫耐受。还可以选择在致耐受方案完成之后施用维持量的耐受原。
耐受原可以是任一抗原，尤其为可溶性蛋白抗原，例如治疗蛋白，移植抗原混合物等，可以与目的抗原相同，或者可以是耐受原特性增强的抗原修饰形式。例如，增加了由非-专职抗原提呈细胞的摄取量。优选地，所述耐受原含有高摄取基元(high uptake moiety)，可以被广泛存在的高-亲和受体有效摄取，例如6-磷酸甘露糖受体等。广泛存在且亲和力等同的其它受体也是合适的。可以将无合适高摄取能力的抗原修饰使其含有可提供该功能的基元，从而使得其能被各种类型致耐受细胞摄取。
在本发明的一个实施方案中，所述宿主对于目的抗原来说是免疫学意义上的初次接触，即没有针对该抗原的预先存在的或记忆的免疫应答。在本发明另一实施方案中，所述宿主已经暴露于所述抗原。在后一种情况下，有必要将负责预先存在的免疫应答的免疫系统的细胞清除。
本发明进一步涉及使用含有抗原和高摄取基元的耐受原，用于制备药物，该药物与T细胞免疫抑制剂联合以预防性诱导针对耐受原的抗原成分的免疫耐受。
在本发明的具体方面，值得注意的是免疫抑制剂的用量要足以基本抑制T细胞。可以对药物用量进行调整以使在不同受试者和不同条件下的T细胞抑制达到同等程度。在T细胞对抗原刺激不做出应答性增殖的水平对T细胞抑制水平进行监测。监测T细胞增殖的方法已被本领域技术人员所知，可以与本发明结合使用。
在优选实施方案中，抗原/耐受原的用量为0.001mg/kg-5mg/kg/周。较优选地，耐受原的用量范围为0.01mg-1mg/kg，以及更优选地为0.03mg/kg/周-0.1mg/kg/周。优选实施方案中，抗原/耐受原的用量为0.056mg/kg体重/周。
在那些免疫抑制剂为CsA的优选实施方案中，给予CsA以达到＞400ng/ml的血浆浓度，尽管300ng/ml或更高也可以使用。优选的用量范围为1mg/kg-30mg/kg，最优选的人用量范围为5-15mg/kg/天。每天用量可以分次施用，将该完整用量分为2、3、4或更多部分，在一天当中按一定时间间隔施用。替代地，所述用量可以单一剂量施用
本发明的药物还可以进一步含有核苷酸类似物。在那些类似物为硫唑嘌呤的实施方案中，该药物的用量为1mg/kg/天-10mg/kg/天，每天一次或隔天施用。
附图简述
附图1：耐受方案的图表。耐受方案的一般例子需要CsA+Aza治疗(CsA的用量为25mg/kg/天)，同时伴随如图所示的耐受原的注入。额外的治疗例如胸腺内注射和单克隆抗体，作为并不起作用，或与耐受性的诱导无关的例子。这些无作用的方案为本发明那些犬的最佳抗原耐受反应提供了对照的例子。
对于一般的耐受方案，如图下部时间线所示，犬从第0天至第18天，每天接受CsA(25mg/kg/天)，加上每隔一天Aza的治疗。每周的艾杜糖苷酸酶注射开始于时间线上箭头所示的第18天。犬接受每周耐受原注射，用量为0.056mg/kg/周。那之后以两周的间隔，CsA+Aza的用量减半，最后两周的用量为四分之一的初始剂量。在总共施用60天后中止药物CsA+Aza施用，继续每周的耐受原注射。
对于非耐受诱导方案，犬接受胸腺内注射或单克隆抗体，和25mg/kg用量的CsA和5mg/kg的Aza，两者轮流(也就是说每隔一天施用每种药物)。如果有时间表的话，在第4天犬接受胸腺内注射。在图表的上部为IT+药物，犬接受0-4天的CsA+Aza施用，然后接受胸腺内注射(IT Inj.或ITI)。如果需要单克隆抗体则在IT注射前施用。所采用的准确用量依赖于试验。隔天施用的CsA和Aza用量在第18天减半，是犬接受注射的第一天。犬开始每周接受0.56mg/kg用量的酶。接下来的两周，犬隔天接受二分之一初始用量的CsA和Aza。接着两周药物用量减为初始剂量的四分之一，接着为初始剂量的八分之一。两周最初用量的八分之一后，中止施用药物，犬继续接受每周的酶注射。
附图2：在注射重组人艾杜糖苷酸酶(rhIDU)过程中每天施用CsA和隔天施用Aza诱导耐受。在图中，所示的是6只耐受性(黑符号)和11只非耐受性(空的符号)犬对于艾杜糖苷酸酶的抗体滴度OD单位/μl未稀释血清，通过ELISA测定，横坐标是注射酶的周数。在艾杜糖苷酸酶注射前的18天，犬接受如实施例1描述的耐受方案。在开始注入艾杜糖苷酸酶的第一周，对犬每周静脉输注rh-Idu 0.056mg/kg/周的艾杜糖苷酸酶。低的抗体滴度(艾杜糖苷酸酶ELISA＜20)随着持续的艾杜糖苷酸酶的刺激在接受合适的耐受方案的犬中表现出耐受，滴度超过50，达到500表明产生了主动免疫应答。CsA+Aza药物方案在酶攻击的第7周停止，超过这一点的低抗体应答表明耐受并不依赖于持续的免疫抑制。
附图3：在艾杜糖苷酸酶缺陷的MPS I感染犬中成功地诱导耐受和对随后的治疗酶的高水平的耐受。三只MPS I犬接受耐受方案，一只MPS I犬作为对照，不采用耐受方案。在三只耐受的MPS I犬(空白的符号)和1只非耐受MPS I犬(黑的符号)中对艾杜糖苷酸酶的抗体滴度表示为OD单位/μl未稀释血清，由ELISA测定；对应于酶刺激的周数。耐受犬接受如实施例2中所述的耐受性药物方案；非耐受犬作为对照没有接受药物治疗。伴随持续的抗原攻击产生低的抗体滴度(＜20 OD)表明耐受。耐受性药物方案在酶攻击的第7周停止，超过那点的低抗体滴度显示诱导的耐受。4只犬在1-12个周内都接受0.056mg/kg/周的静脉注射的艾杜糖苷酸酶。随后，犬在3周内接受逐步增加用量的艾杜糖苷酸酶，直到治疗用量，即在酶注射的第15周，用量为0.500mg/kg/周。对于增强的艾杜糖苷酸酶抗原用量的反应，在15周耐受犬中的抗体水平保持＜20 OD单位，相比同期对照的RU抗体水平＞500 OD单位。在第16周，非耐受犬RU在注射过程中产生严重的临床过敏反应，因而停止治疗。耐受犬在注射过程中没有显示过敏反应。
附图4：rhGAA，第2种溶酶体酶的抗原特异性耐受的成功诱导，用于治疗Pompe疾病。一只耐受性(SC，空白符号)和一只非耐受性(ST，黑的符号)犬对人重组α葡萄糖苷酶(rhGAA)的抗体滴度表示为ELISA测定的OD单位/μl未稀释血清，对应于酶攻击的周数。耐受犬接受如实施例3中所述的耐受性药物方案。第1周，犬接受每周静脉注射的0.056mg/kg/周rhGAA。环孢菌素和硫唑嘌呤(CsA(每天一次)+Aza)继续。用量每2周减半，直到在酶攻击的第7周停止药物施用。非耐受犬没有施用药物治疗。耐受性药物方案在酶注射的第7周停止，超过那点的低抗体水平表明诱导的耐受，其在不存在持续的免疫抑制时仍保留。2只犬在1-12个周内都接受0.056mg/kg/周的静脉注射的rhGAA。耐受犬中的抗体水平在最高点保持在＜5 OD单位，相比同期非耐受性的最高点的对照抗体水平＞150 OD单位。结果证实耐受方案也适用于另外一种有治疗意义的高摄取的免疫原性酶。
附图5：图示了来源于6只非耐受犬与一只耐受犬JH的数据的对比情况。非耐受犬的ELISA滴度超过50，有些时候都超过200 OD U/μl/血清。相反，JH的抗体滴度在18周的艾杜糖苷酸酶注射过程中都低于20 OD U/μl/血清。JH的显著差别在于血液中的环孢菌素的水平超过500ng/ml，而其他犬的血液水平都低于400ng/ml，和经常小于200ng/ml。
附图6：抗原特异性耐受是持久的。图中所示的是耐受犬(JO，RO)和非耐受犬(RU)对应于时间的抗体滴度。在第一部分，所示耐受过程和耐受后的滴度。RU具有高的滴度，而其他犬的滴度都比较低。间隔分别为5周、4.5月、6月或2.5年，再用艾杜糖苷酸酶攻击犬。耐受犬(PE，RO)甚至在间隔5周到6个月的耐受原注射后无免疫应答。非耐受犬RU，在4.5个月间隔后仅2个剂量的酶刺激后其对抗原的反应就增加＞20倍。最初的耐受犬JH在2.5年的间隔后表现部分的反应。数据表明诱导的耐受状态是持久的。
附图7：耐受方案防止除了IgG的其他Ig亚类的诱导。图7A和7B所示的是非耐受犬在每周注射艾杜糖苷酸酶12周之前和之后的ELISA滴度。图7C和7D所示的是耐受对照犬在艾杜糖苷酸酶每周注射12周之前和之后的ELISA滴度。
附图8：耐受方案也可以用于诱导相对的耐受或用于减少事先存在免疫应答的犬的Ig滴度。让试验犬(Nitro)经过自抗原暴露起6个月的时间间隔。该阶段过后再用抗原刺激，在施用CsA+Aza方案的过程中IgG滴度最初上升超过典型的回忆应答中的100，然后迅速减少低于20。使用联合耐受方案通过耐受原的再诱导可以减少免疫应答。
附图9：验证艾杜糖苷酸酶的高摄取部分(甘露糖-6-磷酸基团)对于艾杜糖苷酸酶的免疫耐受是必需的。为了说明M6P高摄取部分有助于诱导对抗原的耐受，重组艾杜糖苷酸酶在连接在球上的磷酸酶中培育后去磷酸化。去磷酸化的艾杜糖苷酸酶用于给犬的耐受方案(CsA+Aza)。研究表明用去磷酸化的艾杜糖苷酸酶处理的犬没有被诱导对艾杜糖苷酸酶的耐受，因此表明高亲和力摄取(甘露糖-6-磷酸部分)对于耐受是必需的。
实施方案详述
在一段足以致宿主耐受的时间内，将耐受原施用与免疫抑制方案结合，以在哺乳动物宿主中诱导抗原特异性免疫耐受。免疫抑制是通过施用T细胞免疫抑制剂实现的。所述方法还可以进一步包括施用抗-增殖药物。本发明的方法任选地包括一段在给药耐受原前的适应期，在适应期中，在无耐受原的情况下施用T细胞免疫抑制剂。在致耐受方案后，将免疫抑制剂从宿主撤离，宿主能保持对存在于耐受原上的免疫原性表位的特异性免疫耐受。最好是在致耐受方案完成之后施用维持量的耐受原。
在本发明的一个实施方案中，所述宿主对于目的抗原来说是免疫学意义上的初次接触，即没有针对该抗原的预先存在的或记忆性的免疫应答。在本发明的另一实施方案中，宿主曾经暴露于抗原。在后一种情况，有必要将负责预先-存在的免疫应答的免疫系统中的细胞清除。本发明者已经表明本发明的耐受方案可用于诱导相关耐受或减少先前存在抗特定抗原免疫应答的犬体内免疫球蛋白的滴度。
所述方法可以用于耐受的抢先(proactive)建立，这种情况下向初次接触的宿主施用蛋白或其它免疫原性药物。例如，施用治疗性抗体、生长因子、酶和其它在宿主中未曾出现过的多肽，会激发显著的免疫应答，这样会消减治疗效果。通过耐受的抢先建立，所述治疗的长期效力得到加强。本发明的方法还发现在移植前建立耐受以及治疗自体免疫方面的用途。
在范例性研究中，本发明表明能够减少或预防临床针对重组人α-L-艾杜糖醛酸酶(rhIDU)的显著抗原-特异性免疫应答的方法用于治疗犬粘多糖贮积症I(MPSI)。该方法将最初30-60天使用T细胞免疫抑制剂如环孢菌素A(CsA)和抗增殖药物如硫唑嘌呤(Aza)的方案，与每周静脉内输注低剂量rhIDU相结合。通过免疫抑制剂药物环孢菌素A(CsA)和硫唑嘌呤(Aza)的60天使用方案，结合每周静脉内输注低剂量rhIDU，在很大程度上减少或防止了犬每周输注rhIDU引发的典型的强IgG应答。更具体地，使用该方案，在输注12周rhIDU(6周没有CsA+Aza)后，8只犬的抗体滴度减少了20倍，而且在继续输注rhIDU达6个月以及完全治疗用量的rhIDU情况下，低滴度没有升高(相对于8个对照犬的149 OD单位/μl，8个正常和MPS I犬ELISA测得的平均抗体滴度7.2 OD单位/μl)。犬耐受达6个月较高治疗用量艾杜糖醛酸酶而滴度没有升高(平均7.5 OD单位/μl血清，n＝6)，而免疫应答犬的抗体滴度继续升高2-3倍(平均369 OD单位/μl血清，n＝2)。取自免疫应答犬的抗血清抑制了艾杜糖醛酸酶的体外细胞摄取量95％以上，而取自非应答犬的抗血清则不能。这些数据表明单一方法能够防止或减少对溶酶体酶替代治疗的临床上显著的免疫应答，以及减弱对其他临床重要抗原的免疫应答。
研究表明：决定致耐受方案成功与否的一个关键因素是高的CsA血清谷底(trough)水平，优选＞400ng/ml。此外，致耐受抗原研究表明：高-亲和力的甘露糖-6-磷酸化(M6P)的酶(rhIDU，(-葡糖苷酶)可以作为耐受原，而非-磷酸化的蛋白质卵清白蛋白则不能。由于去磷酸化的rhIDU不能诱导耐受状态，所以高亲和力M6P制备物是必不可少的。提出了一种模型，在该模型中，在所有T细胞活化都被CsA+Aza抑制的情况下，诱导产生了耐受，而未成熟及非专职抗原提呈细胞(APC)则通过诱导犬耐受状态的M6P受体及非活化的抗原-应答性的T细胞或活化的调节性T细胞有效地装配抗原。探索这些发现用的方法和组合物将在本申请下文做详细讨论。
定义
在描述本发明的方法之前，应当能够理解本发明不局限于所述的具体方法，其当然可以有所改变。还应当理解的是本申请使用的命名，只是为了描述具体实施方案，而无意对本发明作出限制，因为本发明的范围只通过所附权利要求来限制。
在提供了数值范围的情况下，应当理解每一中间值，至下限单位的十分之一(to the tenth of the unit of the lower limit)，除非另有清楚说明，都在该范围的上下限值之间，该指定范围内的任何指定值或中间值都包括在本发明范围之内。在该指定范围专门排除了任一限值的条件下，这些较小范围的上下限可以各自独立地包括在该较小范围内。
除非另有说明，本申请使用的所有科技术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。与本申请所述方法和材料类似或相同的方法和材料尽管也可用于实施或测试本发明，但是现在还是要对优选的方法和材料进行描述。本申请提及的所有出版物在此引入作为参考，以公开和描述与所引述出版物有关的方法和/或材料。
必须指出的是本申请所附权利要求中使用的单数形式“a“an”和“the”包括复数情况，除非上下文另有说明。
本申请讨论的出版物只是为了提供其在本申请申请日之前所公开的内容。这并不说明本发明中任何内容因为使用了在前发明，而不能先于所述出版物。另外，提供的出版日期可能不同于实际的公开日，这一点需要单独证实。
抗原本发明使用的抗原一词是指能够在哺乳动物宿主中引发免疫应答的分子；具体为体液免疫应答，即特征为产生抗原特异性抗体。目的抗原是治疗性药物，例如多肽及其片段；自体抗原，如自体多肽；移植抗原等。作为对抗原的应答，产生出多种类别、亚类及同种型抗体。
抗原中结合抗体的部分称为表位，抗原具体为复合抗原如多肽，通常含有多个表位。当抗原是蛋白质时，线性表位的长度为5-20个氨基酸。抗体还能识别由抗原上的非连续残基形成的空间决定簇，因此，一个表位需要被提呈抗原的一个较大片段，例如蛋白结构域或基本全长蛋白序列。因此，可以理解的是，一个长度为几个氨基酸的治疗性蛋白可以含有多个不同的表位。
被认为是特异性抗体的结合亲和力水平部分取决于抗体的类别。例如，IgM类抗原特异性抗体的亲和力要比例如IgG类低。本申请中要想将抗体的相互作用称为“特异性的”，那么其对于目的表位的亲和力为至少约10-7M，通常约10-8M～10-9M，以及可以高达10-11M或更高。本领域技术人员应当理解的是：“特异性”是指这样的高亲和力结合，而目的不在于指所述抗体与其他分子间不能以同等程度结合或者与宿主未出现表位间的一些轻微交叉反应。
抗原特异性免疫耐受在本发明中，耐受是指其它基本正常免疫系统中出现的对特异性抗原的免疫应答不复存在。耐受不同于一般意义上的免疫抑制，在免疫抑制情况下，所有或所有种类的免疫应答如B细胞介导的免疫应答都减弱了。
治疗性抗原特异性免疫耐受为宿主提供了一种特定的状态，在该状态下，目的治疗分子如治疗性蛋白，可以按正常有效量多次施用。当所述抗原特异性耐受不存在时，连续施用正常量的治疗药物就会使得由于抗体对治疗药物的干扰而效力下降，因而有效量所需的药物量将增加。当按照本发明方法成功实现了抗原特异性免疫耐受时，连续实施后达到治疗药物有效量所需的药物量的增加不超过约5倍，通常不超过约2.5倍，以及也可能不会增加至初始量以上。
代之以或结合了上述效力优势，免疫耐受状态使得治疗性蛋白或其它药物施用的安全性增加。当耐受不存在时，对药物的免疫应答会引发过敏反应或过敏样反应或以特异性抗体产生为基础的免疫复合反应。在按本发明方法实现的耐受状态下可以观察到免疫应答的减弱或消失，而这种免疫应答的减弱或消失将会因抗体介异副反应的减少而降低和限制所述药物施用安全性降低的幅度。
在目的抗原是自体抗原的情况下，抗原特异性免疫耐受的诱导足以减轻患者自体免疫疾病的症状，例如患者在常用免疫抑制剂如皮质类固醇不存在或用量减少条件下仍能充分改善从而保持正常的活性。
在目的抗原是一种或多种移植抗原时，抗原特异性免疫耐受的诱导可以使移植的器官在常用免疫抑制剂不存在或用量减少条件下仍能在受体宿主体内存活并发挥作用。
测定抗原特异性免疫耐受的另一种方法是观察在连续施用治疗性药物后宿主动物血清内是否出现抗原特异性抗体。在非耐受宿主体内，抗原，例如治疗药物，自体抗原，移植抗原等的特异性抗体的滴度，将会随连续施用或暴露而呈数量级地增加。例如，从本申请可以看出：连续施用治疗性蛋白约8周后，特异性抗体的滴渡能升高约50倍以上，通常为100倍以上，随着时间的进展会升高至1000倍或更高。而在耐受宿主体内，特异性抗体滴度的升高不超过相应非耐受宿主体内升高幅度的约10％，并且可以不超过升高幅度的约5％。例如，在约8周至数月的期间，可以观察到特异性抗体滴渡的升高幅度不超过50倍。针对特定抗原观察到的升高的特定水平的差异取决于药物的特性、宿主对药物的提前暴露、药物的施用模式、应答水平的测定方法等。用于测定患者血清是否存在特异性抗体的方法，例如ELISA已为本领域熟知，在此不需详细描述。
耐受的另一方面是存在着其他情况下基本正常的免疫系统。本发明的方法不涉及一般意义上的免疫抑制，在致耐受方案后，对除目的抗原之外的抗原的免疫应答基本正常，与未经外理的对照相比通常减少不超过约5倍，与未经处理的对照相比更通常减少不超过约2倍，以及与正常应答没有区别。
能从本发明方法受益的哺乳动物包括犬、猫、马、牛、绵羊等，以及灵长类，尤其是人。动物模型，具体为小的哺乳动物，如鼠类、兔类等可以用于实验研究。目的动物模型包括施用治疗性蛋白的模型、自体免疫模型、移植物排斥模型等。
含有高摄取基元的耐受原耐受原是在致耐受方案中施用给宿主的目的抗原的形式，含有抗原中基本上全部的表位，这些表位可以单一药物或药物混合物的方式提供。一些情况下，耐受原和抗原是等同的，但是在修饰、配制等情况下它们也可以是不同的。耐受原可以可溶形式，即基本不含凝集物的形式以及无细胞的形式施用，而目的抗原却不能是可溶性的。耐受原还可以含有载体以增强与免疫系统的相互作用；可以含有源自目的抗原的多个片段；可以偶联基团增加免疫原性；可以是含有目的多肽基元的融合蛋白等等。
耐受原可以含有或被共价偶联于高摄取基元。高摄取基元是可以被非专职抗原提呈细胞上的受体广泛识别并内化的多肽。优选地，选择那些广泛表达于提呈抗原时处于耐受状态的外周及中枢细胞的受体，它并非专一表达于巨噬细胞，树突状细胞或其他专职抗原提呈细胞。当提呈抗原时处于耐受状态的细胞包括，例如，肝窦内皮细胞、皮质/髓质胸腺上皮细胞，以及类似的细胞类型。
特别优选的是针对配体的K摄取为至少约10-6M的受体，通常至少约10-7M，更通常至少约10-8M，优选至少约10-9M，K摄取是指细胞发生半数最大摄取时的配体浓度。目的受体包括运铁蛋白受体，黑素运铁蛋白(melanotransferrin)受体，甘露糖-6-磷酸受体，生长激素受体等。相关(cognate)配体包括：胰岛素样生长因子II(IGF2)，运铁蛋白、生长激素、胰岛素及其具有结合功能的片段，具体为不同细胞类型上具有特异性高亲和力受体的多肽。单链抗体以及来自随机噬菌体展示系统的具结合功能的药物。如果它们具有对受体的足够亲和力就可以使用。为了测定配体和受体结合的K摄取，可以使用本领域已知的方法，例如参见Kakkis et al.(1994)Protein ExprPurif 5(3)：225-32中用于测定α-L-艾杜糖醛酸酶的K摄取的试验。该公开的方法可以很容易地被调整适于测定任一种配体与受体间的结合。这类试验也可以用于验证含有外来高摄取基元的耐受原的摄取量。
当所述抗原是被这类受体摄取的多肽时，抗原和耐受原是等同的。当目的抗原是不被非专职抗原提呈细胞广泛摄取的多肽时，所述耐受原可以是抗原的修饰形式，例如，可以是抗原与高摄取基元(配体)的偶联物，如甘露糖-6-磷酸，运铁蛋白等。
替代地，所述耐受原可以是抗原多肽的修饰形式，含有氨基酸变化，例如，取代、缺失、添加等，这些变化为所述多肽提供了赋予其高摄取特性的序列。例如，可以添加或改变糖基化基元以提供适当的翻译后修饰，例如用于添加甘露糖-6-磷酸的基元(参见Cantor等(1992)J Biol Chem267(32)：23349-56)。在本发明的一个技术方案中，所述耐受原是一种融合蛋白，其中包括(a)目的抗原的全部或部分以及(b)带有高摄取基元的蛋白质的片段，其中所述片段足以赋予高摄取特性。例如，可以将含有翻译后糖基化所需基元以及添加了甘露糖-6-磷酸的a-L-艾杜糖醛酸酶片段与目的抗原融合在一起。
将化学基团偶联到多肽的方法已为本领域熟知。发现可用于连接的化学基团包括氨基甲酸；酰胺(氨+羧酸)；酯(醇+羧酸)，硫醚(卤代烷+硫氢基；马来酰亚胺+硫氢基)，Schiff碱(胺+醛)，脲(胺+异氰酸酯)，硫脲(胺+异硫氰酸酯)，磺酰胺(胺+磺酰氯)，二硫化物；腙，脂，等等，已为本领域所知。如果为了在物质转运后所述键在胞液中易于降解，优选酯键和二硫键。例证性实例包括：叠氮苯甲酰肼、N-[4-(p-叠氮水杨酸基氨基)丁基]-3′-[2′-二硫代吡啶基]丙酰胺)，辛二酸二(磺基琥珀酰亚胺)(bis-sulfosuccinimidyl suberate)，二甲基己二酰亚胺(dimethyladipimidate)，酒石酸二琥珀酰亚胺(disuccinimidyltartrate)，N-γ-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯(N-γ-maleimidobutyryloxysuccinimide ester)，N-羟基磺基琥珀酰亚胺-4-叠氮安息香酸酯，N-琥珀酰亚胺基[4-叠氮苯基]-1，3′-二硫代丙酸酯，N-琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯，戊二醛，NHS-PEG-MAL；琥珀酰亚胺基4-[N-甲基马来酰亚胺]环己胺-1-羧酸酯；3-(二硫代吡啶)丙酸N-羟基琥珀亚胺酯(SPDP)；N，N′-(1，3-亚苯基)二马来酰亚胺；N，N′-乙烯基-二-(碘乙酰胺)；或4-(N-甲基马来酰亚胺)-环已胺-1-羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)；间-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)，和琥珀酰亚胺4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)，MBS的延伸链类似物。这些交联物的琥珀酰亚胺基与伯胺反应，巯基-活性的马来酰亚胺与半胱氨酸残基的巯基形成共价键。
抑制剂
T细胞免疫抑制剂T细胞免疫抑制剂是能抑制T细胞活性的化合物，具体为T辅助细胞，通常不包括对其他细胞，例如B细胞、单核细胞、骨髓造血原祖细胞等的一般意义上的抑制。测定T细胞免疫抑制的方法已为本领域熟知，包括体外试验，例如在抗原存在下T辅助细胞释放IL-2的情况，在抗原或ConA等刺激物存在下3H胸腺嘧啶掺入DNA的情况，在异基因(allogeneic)刺激细胞存在下51Cr的释放情况，等等。体内试验可以以测量T细胞的增殖、细胞因子的释放、活性被抑制时对移植物的耐受等为基础。
特别适合于这些目的的一组化合物是亲免蛋白(immunophilin)，也称钙调神经磷酸酶抑制剂，能够抑制T辅助细胞。亲免蛋白是一种Ca2+/钙调蛋白-依赖性的S/T蛋白磷酸酶2B，现已报道在钙信号传导途径中发挥重要作用。这种酶是61kDa钙调蛋白-结合催化亚单位(亲免蛋白A)和小的(19kDa)调控亚单位(亲免蛋白B)的异源二聚体。所述免疫抑制剂，环孢菌素A、雷帕霉素、FK506等能抑制钙调神经磷酸酶，钙调神经磷酸酶是NF-AT(活化T细胞的核因子)核内吞所必需的。用于耐受目的的T细胞免疫抑制剂的用量可以高于正常情况下一般意义免疫抑制所需用量，下文将作详细讨论。
亲免蛋白可以常规实践的方式施用。参见，例如，Goodman和Gilman所著的“The Pharmacological Basis of Therapeutics”，7th Ed，1985，p.1299。例如，CSA可以用12.5％乙醇配制的100mg/ml口服溶液提供，以用33％乙醇配制的50mg/ml且含有650mg聚氧乙烯化的(polyoxyethlated)蓖麻油的溶液静脉内施用。当静脉内施用时，可以将50mg CSA稀释到20-100mg常用盐水或含5％葡萄糖水溶液的稀释液提供，在几小时的时段内缓慢输注。静脉内用量通常为口服用量的1/3。最优选，CSA口服施用，以胶囊或片剂的形式。所述制剂可以通过任一合适制药方法制备，其中包括将活性化合物与合适载体(其中含有一种或多种辅助成分)结合在一起的步骤。通常，所述制剂可以通过下述操作制备：将活性化合物与液相或精细粉碎的固相载体或二者均一且彻底地混合，然后如果需要，将得到的混合物成型。CSA的制备公开于美国专利US4,117,118。可用于实施本发明的CSA可以按商品名SANDIMMUNEO从Sandoz Pharmaceuticals Corporation购得。FK506又称他克莫司(tacrolimus)，可以按商品名PROGRAFS从FujisawaHealthcare购得。雷帕霉素又称西罗莫司，可以按商品名RAPAMUNE从Wyeth-Ayerst Pharmaceuticals Inc.购得。
抗增殖药物用于本发明方法的抗增殖药物是能降低细胞增殖的药物活性化合物。由于免疫系统的细胞通常为活跃分化着的，所以很一般的抗-增殖药物往往都具有免疫抑制作用。许多这类抗增殖药物已为本领域已知，例如被用于化疗。
目的抗增殖药物包括抗代谢药物，例如核苷酸类似物，如硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、阿糖胞苷等；其他类似物，如甲氨蝶呤、霉酚酸、或6-(1，3-二氢-4-羟基-6-甲氧基-7-甲基-3-氧-5-异苯并呋喃基)-4-甲基-4-己酸，等。尽管并非优选，烷化剂如环磷酰胺、苯丁酸氮芥等也可用作免疫抑制的抗增殖药物，例如当存在针对目的抗原的在先免疫应答的情况下。
在本发明的一个实施方案中，抗增殖药物是硫唑嘌呤(AZA)或6-巯基嘌呤(6-MP)。本申请中使用的″6-巯基嘌呤药物″或″6-MP药物″是指能够被代谢成具有疗效的活性6-巯基嘌呤代谢物的任一药物。范例性的本申请所述6-巯基嘌呤药物包括6-巯基嘌呤(6-MP)和硫唑嘌呤(AZA)。其他6-MP药物包括，例如，6-甲基巯基嘌呤核苷和6-TG。6-TG是一种对具有高TPMT活性的患者特别有用的6-MP药物。显示高TPMT活性的患者更容易将6-MP药物如6-MP和AZA转化为6-MMP。本申请中的″6-硫鸟嘌呤″或″6-TG″是指6-硫鸟嘌呤或其类似物，包括具有同样碱基结构的分子，例如，6-硫鸟嘌呤核糖核苷，单-、二-及三-磷酸6-硫鸟嘌呤核糖核苷，6-硫鸟嘌呤脱氧核糖核苷以及单-、二-及三-磷酸6-硫鸟嘌呤脱氧核糖核苷。″6-TG″一词还包括6-硫鸟嘌呤的衍生物，包括6-TG的化学修饰物，只要6-TG碱基的结构还存在。本申请中的″6-甲基-巯基嘌呤″或″6-MMP″是指6-甲基-巯基嘌呤或其类似物，包括具有同样碱基结构的类似物，例如，6-甲基-巯基嘌呤核糖核苷，单-、二-及三-磷酸6-甲基-巯基嘌呤核糖核苷，6-甲基-巯基嘌呤脱氧核糖核苷，以及单-、二-及三-磷酸6-甲基-巯基嘌呤脱氧核糖核苷。″6-MMP″′一词还包括6-甲基-巯基嘌呤的衍生物，包括6-MMP的化学修饰物，只要6-MMP碱基的结构还存在。
6-MP药物可以油或水载体的悬液、溶液或乳液递送，可以含有配制试剂，如悬浮、固定和/或分散试剂。合适的含水载体包括生理盐水、磷酸盐缓冲盐水以及非胃肠道递送的其他载体，这些通常称为″静脉内溶液″。替代地，在使用之前所述活性成分可以为粉末，通过无菌分离无菌固体或者从溶液冻干获得，在使用之前用合适的载体，例如无菌无热源的水配制。
本发明的方法
哺乳动物体内的抗原特异性免疫耐受通过同时施用耐受原和T细胞免疫抑制剂诱导，也可以进一步与施用抗增殖药物联合，如上所述，这些试剂可以单独或一起配制，通常为单独配制。当所述药物在常用治疗方案过程中同时或不同时间共同导入宿主时，称为同时施用。后一种情况下，所述化合物的施用在时间上要足以靠近从而实现所期望的效果。通常，如果一种药物大约在另一药物体内半衰期内施用，那么这两种药物就被称为同时施用。任一活性药物都应该以足以结合的水平出现从而达到治疗效果。
耐受方案任选包括一段在前适应期，在适应期中，在无耐受原的情况下单独施用抑制剂约1-3周。在施用耐受原之前适应期的时间要足以抑制宿主T细胞应答。适应期时间的长短因宿主、抑制剂等的不同而不同。适应期长短可根据经验确定，或者从公开的渠道获得。
致耐受方案需要T细胞免疫抑制剂的施用的时间要足以诱导免疫耐受。通常，所述T细胞免疫剂给宿主施用至少约3周，通常至少约5周，可以至少约8周或更长。所述抗增殖药物在这段时间内还要按适于所述药物的方案施用，通常至少每隔一天一次，每天一次一次，每天一次两次或更多。当所述致耐受方案可以继续施用更长时间时，通常期望将用抑制剂治疗患者的时间减至最短。
本发明的一个重要方面是致耐受方案的起始阶段要保持高剂量的T细胞免疫抑制剂。在药物动力学中，观察到施用后血流中药物浓度达到“峰值”，然后等血液水平降至最低点或“谷底”后再施用下一用量。在本发明的方法中，重要的是在这段时间内要将T细胞免疫抑制剂保持在治疗水平，以使所述“谷底”水平不降至非抑制水平。这可以通过定时测量血流中药物浓度确定给定施用方法的谷底值而根据经验确定。给定药物浓度的免疫抑制水平可以根据经验确定，如此前讨论的，或者从公开的数值获得。所述药物浓度要足以防止T细胞介导免疫应答的体内启动或维持。
提高谷底水平保持药物的抑制水平可以通过施用较高用量的药物或者通过更频繁地施用常规用量来实现。例如，就向人施用环孢菌素A而言，期望谷底血液水平不低于约200ng/ml，通常不低于约300ng/ml，以及可以为约500ng/ml或更高。已知诱导犬耐受的谷底水平为约400ng/ml，但是其它物种的合适水平要将宿主对所施用免疫抑制剂的敏感性考虑在内。具体而言，人对环孢菌素的作用比犬更敏感。由于通常相对于犬而言人的代谢速率减慢，所以人的用量范围可以低于犬的用量范围。为了实现同等的血浆水平或者相同程度的生理效果，根据代谢速率的差异，人的用量可以为犬用量的约1/2(约10mg/kg/天-约15mg/kg/天)。所需水平可以相当于肾或其它移植中所用的水平(约8+/-3mg/kg/天)，这种情况下实现的谷底水平为约3 50+/-150ng/ml，内科医师手册(Physicians Desk Reference)，ed.56，医学经济公司(by Medical Economics Co.)出版，Montvale，NJ，p2381)。
例如，T细胞免疫抑制剂的起始用量可以为免疫抑制常规用量的至少约125％，常规用量的至少约150％，或者常规用量的200％或更高。其它实施方案中，所述用量可以是更频繁地施用常规用量，例如由每天一次增至每天两次，等。口服他克莫司的常规用量为0.2mg/kg/天。西罗莫司的常规用量为2mg/kg/天。本领域技术人员可以理解的是所述常规用量因具体药物，施用方法即口服、静脉内等，以及宿主的不同而变化。
在高用量期的末尾，T细胞免疫抑制剂的用量逐渐降低直至致耐受方案结束，它才停止施用。任一常规方法都可以使用，例如每周或每两周用量减半。
高用量维持的时间要足以使耐受原被致耐受细胞摄取，加工，提呈在细胞表面，以及就T细胞而言与所述致耐受细胞相互作用，通常至少约2周，更通常为至少约3周，可以为4周或更长。用量水平和时间间隔通过下述操作足以确定：测定方案中6-8周宿主血清或血浆用ELISA等方法测量抗体滴度。当免疫抑制剂逐渐减少接近终点时，非耐受宿主会出现免疫应答。必需使用高用量的时间段包括所述的适应期，所以如果有两周的适应期时，那么所述高用量可以在耐受方案启动后不久逐渐减少。
当所述方案中包括抗增殖药物时，按常规用量施用，而T细胞免疫抑制剂施用通常至少约2周，更通常为至少约3周，以及可以为4周或更长。例如，硫唑嘌呤的常规用量为约1-5mg/kg/天，此时起始施用的上限为约3-5mg/kg/天，建立方案后给定的下限范围为约1-3mg/kg/天。所述抗增殖药物也可以隔周一次施用。如上所述对于T细胞免疫抑制剂而言，需要起始用量的时间段可以包括适应期，因而如果适应期为两周，那么所述高用量可以在耐受方案启动后不久逐渐减少。通常优选在整个致耐受方案过程中通过任一常规方法逐渐减少用量。
在致耐受时段内，所述耐受原施用至少2次，通常至少约4次，以及可以施用6次或更多次。如果是1次，那么所述耐受原在适应期内不施用。不同于抑制剂，耐受原的施用频率较低，例如约4天后，约7天后，约10天后等。每周施用是方便的。
通常，耐受原用量低于相应抗原的治疗量，范围可以从相等于抗原治疗量到治疗量的约5％，治疗量的约10％，治疗量的约50％，等。当所述耐受原是多肽时，施用量为至少约0.005mg/kg/周，通常至少约0.01mg/kg/周，通常至少约0.05mg/kg/周，以及通常不高于约1mg/kg/周。但是，应该理解，具体用量取决于施用途径、药物活性等。
耐受原的用量逐渐增加达到常规治疗用量，约3周后开始，通常约4周后，可以为约6或8周后。当耐受原与抗原不相同时，患者可以在致耐受方案后转向抗原，这种转变可以包括一段时间施用二者的混合物。
耐受原可以通过任一常规途径施用，通常为静脉内，以可溶形式。更具体地，可以将耐受原与合适的药物学可接受载体或溶剂组合配制，可以配制成固相制剂、半-固相、液相或汽相形式，例如片剂、胶囊、粉末、颗粒、药膏、溶液、栓剂、注射液、吸入剂、凝胶、微球体以及气溶胶。同样，化合物的施用可以通过不同方式实现，包括口服、口腔用、直肠用、非肠道用、腹膜内、皮内、经皮、鞘内等施用。
就药用剂型而言，耐受原可以药物学可接受盐的形式施用。它们可以与其它药物活性化合物适当结合使用。下列方法及赋形剂只是例举而决不构成限制。耐受原可以通过下述操作配制成注射用制剂：将其溶解、悬浮或乳化入含水或无水溶剂，例如植物油或其它类似的油、合成脂肪酸甘油酯、高脂肪酸酯或聚乙二醇；以及如果需要，使用常规添加剂如增溶剂、等张剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂以及防腐剂。
本申请使用的“单位用量形式”是指适合作为人及动物受试者单位用量的物理分散单位，每一单位中含有与药物学可接受稀释液、载体或介质结合的预先确定量的本发明化合物，所述预先确定的量是从足以产生期望效果的量计算得出的。本发明所述单位用量形式的规格取决于所施用的化合物和要达到的效果，以及与每一化合物在宿主体内的药效学。
所述药学上可接受的赋形剂，如介质、佐剂、载体或稀释液，公众很容易获得。另外，药学上可接受的辅助物质，如pH调节及缓冲试剂，张力调节剂，稳定剂、增湿剂等，公众也很容易获得。
适于本发明非法的抗原包括大量治疗活性物质，具体为具有免疫活性的多肽、生长因子、激素、凝血因子、代谢作用的酶等。目的治疗性蛋白的实例包括凝血因子，如因子VIII；α-糖苷酶；艾杜糖醛酸酶；治疗性抗体如herceptin；脱氧核糖核酸酶；人生长因子；胰岛素；等。
当目的抗原是自体抗原或者所述宿主此前曾暴露于治疗物的情况下，需要将患者体内存在的成熟免疫细胞部分或全部清除。所述方法已为本领域所知，例如可以使用强免疫抑制剂，例如环磷酰胺、抗-胸腺细胞球蛋白、全身辐射(TBI)等。
致耐受用的目的自体抗原包括下列自体抗原。耐受原可以包含一种自体抗原或自体抗原的混合物。对于多发性硬化症，蛋白脂蛋白(PLP)；碱性髓鞘蛋白(MBP)；神经髓鞘少突胶质细胞蛋白(MOG)；环核苷酸磷酸二酯酶(CNPase)；神经髓鞘-相关糖蛋白(MAG)，以及神经髓鞘-相关少突胶质细胞碱性蛋白(MBOP)；α-B-晶体蛋白(一种热休克蛋白)；OSP(少突胶质细胞特异性蛋白)；瓜氨酸修饰的MBP(MBP的C8同工型，其中的6个精氨酸已经是脱亚氨基形成瓜氨酸)，等。
风湿性关节炎的自体抗原包括II型胶原蛋白；hnRNP；A2/RA33；Sa；纤聚蛋白(filaggrin)；角蛋白；瓜氨酸；软骨蛋白包括gp39；I，III，IV，V，IX，XI型胶原蛋白；HSP-65/60；IgM(类风湿因子)；RNA聚合酶；hnRNP-B1；hnRNP-D；心磷脂；醛缩酶A；瓜氨酸-修饰的纤聚蛋白以及纤维蛋白。
人胰岛素依赖性糖尿病中的自体抗原包括酪氨酸磷酸酶IA-2；IA-2β；谷氨酸脱羧酶(GAD)65kDa和67kDa两种形式；羧基肽酶H；胰岛素；胰岛素原；热休克蛋白(HSP)；胶质瘤38；胰岛细胞抗原69KDa(ICA69)；p52；两种神经节苷脂抗原(GT3和GM2-1)；以及胰岛细胞葡萄糖转运蛋白(GLUT2)。
重症肌无力中的自体抗原包括乙酰胆碱受体中的表位。寻常型天疱疮中作为靶标的自体抗原包括桥粒芯糖蛋白-3(desmoglein-3)。舍格林(sjogren′s)综合征抗原包括SSA(Ro)；SSB(La)；和胞衬蛋白。寻常型天疱疮中主要的自体抗原包括桥粒芯糖蛋白-3。
组织抑制物的免疫排斥，包括肺、心、肝、肾、胰腺以及其他器官和组织，是通过移植物受体抗移植器官免疫应答介导的。异基因移植器官含有氨基酸序列不同于移植物受体氨基酸序列的蛋白质。由于移植器官的氨基酸序列不同于移植物受体，所以它们常常引发受体抗移植器官的免疫应答。移植器官排斥是组织移植中的主要并发症和限制，能够导致受体中移植器官的衰竭。排斥导致的慢性炎症往往导致移植器官功能不良。
目的移植物受体的耐受原可以包括一种或多种主要组织相容性抗原，例如HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-DR，HLA-DQ，HLA-DP等，以及可以包括所述抗原的混合物，其中所述抗原包括那些受体和供体间不匹配的抗原。当它们是细胞表面蛋白时，施用形式可以是可溶形式，即在跨膜区截短的形式。
尽管不是必需，但是为了在免疫抑制剂停用后增强耐受，可以提供维持量的耐受原，其中所述维持量按下列用量提供：相当于0.056mg/kg/周或更低的用量，或该量的1/10或更低，频率低于每月一次或每几个月一次，或频率更低，或者用量和频率同时都如上调整。在耐受原不同于抗原的情况下，所述耐受原可用于维持期，如果需要维持期的话。
本发明方法中使用的药剂可以试剂盒提供，其中所述试剂盒可进一步包括使用说明书。所述试剂盒包括耐受原，通常采用适于宿主施用的用量和形式。所述试剂盒可以进一步含有适于施用的形式的T细胞免疫抑制剂，以及可进一步包括用于监测药剂血液水平和/或用于测定T细胞活性抑制的检测试剂。抗-增殖药物也可以适于施用的形式包括在所述试剂盒内。
为了制备出耐受原性组合物，试剂盒还可以抗原具体为多肽抗原与高摄取基元的偶联物形式提供。例如，甘露糖-6-磷酸基团等基元，可以如上所述，偶联于适于连接糖和多肽的连接物的形式提供。所述高摄取基元也可以非偶联形式提供，与合适连接物，以及使用说明组合在一起提供。
实施例
以下实施例旨在为本领域技术人员提供全面的公开和描述怎样制备和使用本发明，因此，实施例部分无意于限制发明人所认定的本发明范围，也无意于表示以下实验是所实施的全部或仅有的实验。尽管在确保所使用数据(例如，量、温度等)的准确性方面已作出了努力，但还应该考虑到一些实验不免存在误差和偏差。除非另有说明，本文中所指的部分是根据重量确定的，分子量是平均分子重量，温度是摄氏度，压力是指大气压或接近大气压。
实施例1
在正常和MPS I犬中诱导对人α-L-艾杜糖苷酸酶的耐受
粘多糖病I是遗传性疾病，是由于α-L-艾杜糖苷酸酶基因的突变导致艾杜糖苷酸酶缺陷引起的。这种缺陷导致进行性的多系统溶酶体储积症，包括面貌变粗，大舌头，大肝脏和脾，呼吸困难，心脏问题，关节僵直和骨病。这种病通常在患者十多岁或二十多岁时夺去生命。
缺陷的艾杜糖苷酸酶是溶酶体水解酶，它剪切类肝素和硫酸皮肤素的末端艾杜糖苷酸酶残基。这种酶可以通过重组细胞制备，以翻译后连接的糖类甘露糖-6-磷酸作为标记，其对于细胞的摄取是很重要的。酶替代疗法作为一种治疗方法，其中重组形式的酶通过静脉内施用分布到组织中，细胞通过甘露糖-6-磷酸受体摄取。这种疗法已经在犬体上进行了研究，最近已应用于人体(Kakkis et al.(2001)NEJM 344：182)。
向正常和MPS I犬施用重组的人α-L-艾杜糖苷酸酶，会引发对该酶的强免疫应答(Shull et al.(1994)P.N.A.S.91：12937-12941；Kakkis etal.(1996)Biochem Mol.Med.58：156-167)，这种免疫应答与人MPS I患者中观察到的类似。这些应答干扰了酶治疗的效果。为了研究诱导耐受的方法，在为阻止主动免疫应答实现诱导耐受而设计的各种条件下向正常犬施用异源人α-L-艾杜糖苷酸酶蛋白。研究表明：合适剂量的环孢菌素A和硫唑嘌呤，随后每周一次重组人α-L-艾杜糖苷酸酶并逐渐撤除免疫抑制药物，能够诱导在每周一次持续至少6个月给药情况下对酶的耐受。环孢菌素A用量的频率降低，有或无附加胸腺内注射或抗T细胞单克隆抗体，对耐受性的诱导没有影响。单独使用合适用量的CsA不能诱导耐受。
致耐受方案采用CsA+Aza治疗(CsA的用量为25mg/kg/天)，伴随耐受原输注，如图1所示。所述附加处理，例如胸腺内注射和单克隆抗体，是作为不能诱导或不能增强诱导耐受的实例给出的。将这些无效方案纳入实施例部分的目的是为了与那些最佳致耐受后的犬对本发明耐受原的应答进行比较。
对于采用胸腺内注射或单克隆抗体但不使用25mg/kg/天用量CsA的非耐受诱导方案而言，第4天是犬接受胸腺内注射的日子。在(图1)下面使用IT+药物的方案图中，第0-4天，犬接受CsA+Aza，然后接受胸腺内注射(ITInj.或ITI)。如果需要单克隆抗体，则在IT注射前一天给予。所采用的准确剂量依据试验而定。在非耐受试验中，犬隔天接受25mg/kg CsA，中间轮换以Aza。在耐受性试验中，犬每天接受CsA，隔天(alternative day)接受Aza。在任一种情况下，施用剂量按所述顺序减半。对于接受致耐受方案的犬，上面的方案图描述的是治疗过程。犬PA只接受CsA，4天后开始输注并逐渐递减，随后执行上面的那套耐受诱导方案。
材料和方法
动物：正常和MPS I犬来源于UCLA港的MPS I犬。该犬是小猎犬(beagle)和Plott猎犬(hound)的杂交，平均重量为12-20kg。这些试验用的犬都小于两岁，但至少4个月龄。
犬BI，BE，BC，BO，JA，JO，ME，MA，MO，和PA是来自MPS I犬群的正常或携带犬(carrier canines)，因此未感染MPS I，接受一系列但不诱导耐受的不同方案。当CsA+Aza是方案的一部分时，它们隔天接受CsA。BI接受磷酸盐缓冲液胸腺内注射(ITD；BE和BC接受艾杜糖苷酸酶ITI；BO接受CsA(qod)+Aza+ITI；JA，JO，ME，MA，和MO接受CsA+Aza，ITI和可删除成熟T细胞的各种单克隆抗体。PA每天接受CsA剂量，但与耐受犬不同，她不接受Aza。
犬RH，RI和RO来自MPS I犬群的正常或携带犬(carrier canines)，接受能诱导耐受的最小量CsA+Aza方案，对于RH和RI而言，它们也接受胸腺内注射。每天给予CsA。
犬RU是MPS I感染犬，接受非致耐受方案，用作对照。犬PE，SA，和NI是MPS I感染犬，接受CsA+Aza的耐受诱导方案。
单克隆抗体：系列单克隆抗体获自Peter Moore(UC Davis VeterinarySchool)，特异性针对犬T细胞受体(抗-TCR)，犬CD3抗原(抗-CD3；IgG2b)和Thy-1的犬等价物(抗-Thy1；IgG1)。抗-TCR抗体通过低血清培养基中培养杂交瘤产生，通过蛋白A层析纯化。抗-CD3和抗-Thy1抗体制备通过杂交瘤CA17.6B3和CA1.4G8在小鼠的腹水中产生，蛋白A纯化，在约定的实验室(Strategic Biosolutions)中完成。使用时，单克隆抗体在ITI之前给予2或3剂量。
免疫抑制药物：环孢菌素A(Neoral或Sandimmune)和硫唑嘌呤(Imuran)来源于当地的制药公司。两种药物按试验所述用量和频率口服施用。所述试验两种方案如下所述。
诱导耐受的每天CsA剂量的免疫抑制药物方案：
CsA Neoral25mg/kg/天分两次口服
Aza Imuran5mg/kg隔日一次口服
0-32天给予全剂量的CsA+Aza，33-46天为1/2剂量，47-60天为1/4剂量，然后终止。
监测动物的副反应
监测CsA高峰和谷底水平，调节剂量维持循环中谷底水平为400-500ng/ml。
不能诱导耐受的隔天接受CsA剂量的免疫抑制药物方案：
CsA Neoral25mg/kg/隔天分两次口服
Aza Imuran5mg/kg隔天，交替以CsA
0-18天给予全剂量的CsA+Aza，19-32天为1/2剂量，33-46天为1/4剂量，47-60天为1/8剂量，然后终止。
监测动物的副反应
监测CsA高峰和谷底水平，调节剂量维持循环中谷底水平为100-200ng/ml。
胸腺内注射：在全身麻醉过程中，在左边第3肋间隙切开3英寸的切口。切口通过肌肉层到达胸腔。采用肋骨分离器，可直接观察到胸腺是位于肺下方的带血管的弧形器官。用注射器和25G针管将酶溶液注射入胸腺。插入针头时要按照″zig-zag″方式以免在退出针头时酶泄露。通过伊文思蓝染色肉眼可检查到胸腺的任何酶溶液泄露。缝合手术部位，通过在胸腔内插入福利(Foley)导管使用真空抽吸恢复呼吸功能。在所有切口使用抗生素，手术后使用短时间的抗生素和必要的控制疼痛药物。
注射溶液，总共1.5ml：1mg/kg的12.1mg/mL艾杜糖苷酸酶(3×106U/mL)。用含有40％PEG+2mg/mL伊文思蓝的酸性PBS调至1.5mL(终溶液约6％PEG，0.3mg/mL伊文思蓝)。
酶输注.制备的重组艾杜糖苷酸酶为高度纯化的形式，显示出高摄取潜力，在酶浓度约为1nmol时Hurler成纤维细胞达到半数最大摄取量(K摄取)，摄取浮动范围(specification)小于3.3nmol。就耐受原输注而言，按14,000U/kg/周的量，将α-L-艾杜糖苷酸酶以50ml含1mg/mL犬白蛋白和10mMNaPO4盐输注液，在2小时时段内通过静脉内方式施用(第1小时3,000U/kg/小时；第2小时11,000U/kg/hr)。监测动物的过敏反应。250,000U相当于1mg蛋白。
结果
试验计划的基本思路如图1所示。用免疫抑制药物预处理全部的犬，接着按时间进行IT注射，开始2周后，进行一系列的每周一次的艾杜糖苷酸酶攻击。犬要么接受非耐受性诱导方案，隔天一次CsA(见上面方案)同时伴有或不伴有其他的处理(胸腺内注射，单克隆抗体)；要么接受耐受性诱导方案，每天一次CsA伴有或不伴有其他处理。其中1只犬，PA接受每天一次CsA剂量但不接受Aza。
在第0天，犬使用免疫抑制药物，一直到18天才接受首次酶攻击。如果按照时间表，在ITI之前犬接受通过静脉内输注的单克隆抗体(2-5mg)。在第4天，按照时间表犬接受胸腺内注射艾杜糖苷酸酶剂量为1mg/kg。两周后，犬接受每周一次的艾杜糖苷酸酶注射，具体为每周一次静脉内输注14,000U/kg(0.056mg/kg/wk)的人重组艾杜糖苷酸酶。CsA和Aza的剂量如材料和方法一节中所述每两周减半。
在酶攻击6-8周后，接受CsA(每天一次)+Aza最佳处理同时伴有或不伴有IT注射(图2中的空心符号)的犬，对艾杜糖苷酸酶耐受，但是接受其他方案的犬表现出通过ELISA测定的强免疫应答(图2中的实心符号)。艾杜糖苷酸酶耐受犬RO继续接受每周一次的酶攻击共6个月，仍未诱导出针对艾杜糖苷酸酶的显著ELISA滴度。
非耐受性和耐受犬对于艾杜糖苷酸酶的抗体滴度如表1所示。只有完成了至少12周的犬才被收入表中；非耐受性的犬BE，BI，BC和BO在7周终止时，其滴度已达21-74OD/μl血清。非耐受犬从基础水平0.8到平均诱导水平144.6 ELISA OD单位/μl血清，具有181倍的诱导结果。耐受犬的滴度提高了13倍，从基础的0.4到用艾杜糖苷酸酶处理后的5.2。非耐受犬对于艾杜糖苷酸酶抗体的诱导比耐受犬高28倍。其中一只NI犬是耐受性组中最高的滴度为13.8。该犬在多数时候会吐出CsA，其可能是由于不完全的耐受诱导，进一步支持了CsA剂量的重要性。接受优选的每天一次剂量CsA但并不接受Aza的PA不耐受。尽管耐受正常犬中的两只RH和RI犬，也接受胸腺内注射，但该注射对于犬RO所表现的耐受不是必需的。
表1.
耐受性和非耐受犬的免疫应答
    艾杜糖苷酸酶的抗体滴度(OD单位/μl未稀释的血清)
  犬   处理   处理前   平均值   处理后   平均值
非耐受性(每隔一天的CsA加其他的治疗)   JAJOMEMAMOPARU   (CsA+Aza+ITI+TCR mAb)(CsA+Aza+ITI+TCR mAb)(CsA+Aza+ITI+TCR mAb)(CsA+Aza+ITI+CD3/Thy1/TCR mAb)(CsA+Aza+ITI+CD3/Thy1/TCR mAb)(CsA)未使用药物，MPS I感染的对照     02.60.61.500.31.2 0.8     230.7101.260.2120.8388.964.456.7 144.6
  RHRIROPESANI   (CSA(每天)+Aza+ITI)(CSA(每天)+Aza+ITI)(CSA(每天)+Aza)(CSA(每天)+Aza+MPS I感染的)(CSA(每天)+Aza+MPS I感染的)(CSA(每天)+Aza+MPS I感染的)     0.30.30.20.60.40.8 0.4     8.70.50.70.86.813.8 5.2
表1中，所示的6只耐受性的犬和7只非耐受犬的艾杜糖苷酸酶的抗体滴度用ELISA测定的OD单位/uL未稀释血清表示。向接受药物或如实施例1所述其他处理的犬施用艾杜糖苷酸酶。所有犬通过静脉输注接受0.056mg/kg/周重组人艾杜糖苷酸酶。处理前的ELISA值代表首次艾杜糖苷酸酶攻击前的血清抗体水平。处理后的值代表12周酶攻击后的血清抗体水平，或最后一个时间点的数值(ME，MA，MO在第11周；PA在第9周)。耐受犬处理后抗体滴度的平均值(5.2OD/μl)是非耐受犬滴度平均值(144.6OD/μl)的1/25。
尽管在6周末撤除了全部免疫抑制药物，但是耐受犬对于艾杜糖苷酸酶的应答大幅度降低。耐受犬的低滴度持续几个月，对RO和SA进行每周一次输注共持续6个月(图2)的研究。试图诱导对另外一种抗原-通过甘露糖末端N连接寡糖的卵清蛋白的耐受，没有成功。该数据显示较高的摄取和广泛提呈的甘露糖-6-磷酸受体是必需的，或者甘露糖受体介导的摄取不足以使得耐受原能够成功诱导耐受。
在犬中已经成功实现了对治疗性蛋白的耐受。用最佳方案的CsA和Aza处理的犬，表现出对于持续至少4-6个月的每周一次输注的艾杜糖苷酸酶免疫应答的明显减弱。耐受不取决于其他试剂或操作例如单克隆抗体或胸腺内注射。在无免疫抑制药物存在时，耐受状态保持至少6个月。
耐受犬和其他犬的关键差别在于每天使用CsA。但是，单独使用CsA不足以使犬产生耐受，如犬PA每天单独接受CsA没有产生耐受。单独使用免疫抑制药物不能诱导犬的耐受，在免疫抑制药物的保护下使用抗原输注是耐受方法的关键部分。可能是当被活化的T细胞被药物抑制时，酶作为致耐受抗原被提呈。
试图改进方案的其他部分以提高诱导耐受的机会，但是没有效果。设计胸腺内注射的目的是为了定位提呈已知具有耐受原性的抗原，但这也是无效的，如果说有一些效果的话，那便是导致较早的免疫应答。显然该模型中这样的外周呈递和耐受更为有效。
针对T细胞标记的单克隆抗体对耐受也没有起到作用。使用这些抗体的意图是消除循环中多达90％的成熟T细胞，如试验所示，但是它们的使用并没有增加耐受，也不是耐受所需要的。
尽管宿主犬可能是个关键的因素，但是事实上，具有内源性艾杜糖苷酸酶的正常犬对人艾杜糖苷酸酶的耐受与无内源性艾杜糖苷酸酶的MPS I感染犬都可以诱导对人艾杜糖苷酸酶的耐受。
实施例2
在感染MPS I犬中诱导对治疗性艾杜糖苷酸酶的耐
受和在高治疗剂量输注过程中维持耐受
诱导耐受必须防止对可用于临床的治疗性蛋白的临床显著的免疫应答。用艾杜糖苷酸酶取代治疗的MPS I犬对于能延迟清除或改变酶稳定性的高滴度抗体的反应是，阻止酶的摄取和限制酶治疗的有效性。同样的现象在其他动物模型中已有报道。
为了研究MPS I犬初次接触是否能产生对艾杜糖苷酸酶的耐受，是否能随后接受每周一次为基础的高用量治疗水平的酶，将一组4只MPS I感染犬致耐受(3只犬)或作为对照(1只犬)。12个星期后，耐受犬接受渐增的每周一次用量的艾杜糖苷酸酶和最后接受至少6周治疗用量的酶，没有显著免疫应答。与此前观察到的结果一样，非耐受性对照犬抗酶抗体的滴度迅速升高，由于过敏反应，输注在第16周停止。
材料和方法
动物：MPS I犬来源于UCLA港的MPS I犬。该犬是小猎犬和Plott猎犬的杂交，平均重量为12-20kg。这些试验用的犬都小于两岁，但至少4个月龄。
免疫抑制药物  环孢菌素A(Neoral或Sandimmune)和硫唑嘌呤(Imuran)来源于当地的制药公司。两种药物按试验所述用量和频率口服施用。所试验两种方案如下所述。
诱导耐受的每天一次CsA剂量的免疫抑制药物方案：该方案同实施例1所示。
酶输注：制备的重组艾杜糖苷酸酶为高度纯化的形式，显示出高摄取潜力，在酶浓度约为1nmol时Hurler成纤维细胞达到半数最大摄取量(K摄取)，摄取浮动范围(specification)小于3.3nmol。就耐受原输注而言，按14,000U/kg/周或更高的量，将α-L-艾杜糖苷酸酶以50ml含1mg/mL犬白蛋白和10mM NaPO4 pH5.8盐注射液，在2小时时段内通过静脉内方式施用(第1小时3,000U/kg/小时；第2小时11,000U/kg/hr)。监测动物的过敏反应。
结果
在3只MPS I感染犬中诱导耐受，而在对照的MPS I犬中不诱导耐受。3只MPS I感染犬采用的致耐受方案包括18天CsA+Aza后开始每周一次的酶输注。1条MPS I感染犬作为对照，不接受致耐受方案。4只犬在1-12周内都接受0.056mg/kg/周的静脉输注的艾杜糖苷酸酶。3只耐受MPSI犬中(图3中空心符号)和1只非耐受MPSI犬中(图3中实心符号)针对艾杜糖苷酸酶的抗体滴度通过ELISA测定。用持续抗原攻击产生的低抗体水平(＜20OD)表明产生了耐受。致耐受药物方案(CsA+Aza)在酶攻击的第7周时停止，低于该点的低抗体水平是诱导产生耐受的标志。
耐受MPS I犬对全剂量的酶治疗具有耐受性：4条MPS I犬在3周内接受逐步增加剂量的艾杜糖苷酸酶，直到治疗剂量，即在酶注射的第15周，剂量为0.500mg/kg/周。这与MPS I犬之前治疗试验使用的剂量相同，且用于人MPS I酶治疗(Kakkis etal 2001，同上文)。对照RU在第15周时对不断递增的抗原用量应答的抗体水平为＞500 OD单位，与之相比，在第15周时耐受犬中的抗体水平仍然保持＜20 OD单位。事先用该用量酶(0.5mg/kg/周)处理过的两条MPS I犬在14周酶治疗后的滴度为1800和2000。
在第16周，非耐受犬RU在输注过程中出现严重的临床过敏反应，因而停止治疗。耐受犬在输注过程中没有显示过敏反应。
抗原艾杜糖苷酸酶完全缺陷的MPS I犬，犬或人，能够可复制地对人艾杜糖苷酸酶蛋白产生耐受。这些耐受犬也可以接受全治疗剂量的酶，而不产生显著免疫应答。这个结果表明诱导的耐受是强烈的，可以在犬接受高水平抗原时产生保护作用，其中包括在施用治疗性蛋白过程中可预见的水平。
实施例3
对α葡萄糖苷酶的耐受的诱导
对艾杜糖苷酸酶输注耐受的诱导已经在采用了下述方案的正常和MPSI犬中得到验证：即每天一次CsA+Aza后接每周一次的耐受原输注，与此同时逐渐递减免疫抑制药物。为了验证对另外一种具有高亲和力摄取特征的酶也能诱导耐受，制备重组人α葡萄糖苷酶，用上述耐受方案进行研究。在两只正常犬上进行试验，其中一只采用致耐受方案，另一只用作对照。开始每周一次输注葡萄糖苷酶，输注3周后，对照犬显示逐渐升高的免疫滴度。到第5周，对照犬的滴度增高100倍，而治疗犬则无明显滴度。数据表明致耐受方案对于其他抗原也一样有效。
材料和方法
动物：MPS I犬来源于UCLA港的MPS I犬。该犬是小猎犬和Plott猎犬的杂交，平均重量为12-20kg。这些试验用的犬都小于两岁，但至少4个月龄。
免疫抑制药物：环孢菌素A(Neoral或Sandimmune)和硫唑嘌呤(Imuran)来源于当地的制药公司。两种药物按试验所述用量和频率口服施用。所试验两种方案如下所述。
诱导耐受的每天一次CsA剂量的免疫抑制药物方案：
CsA Neoral25mg/kg/天分两次口服
Aza Imuran5mg/kg隔日一次口服
所有药物在首次酶输注后每隔两周用量减半一次
监测动物的副反应
监测CsA高峰和谷底水平，调节剂量维持循环中谷底水平为400-500ng/ml。
酶输注：制备的重组α葡萄糖苷酶为高度纯化的形式，显示出高摄取潜力，在酶浓度约为1nmol时Hurler成纤维细胞达到半数最大摄取量(K摄取)，摄取浮动范围(specification)小于3.3nmol。就耐受原输注而言，按0.056mg/kg/周的量进行，将重组α葡萄糖苷酶溶解在50ml含10mM NaPO4pH5.8的盐溶液中，在2小时时段内通过静脉内方式施用(第1小时施用总量的21％；第2小时施用剩余的酶)。监测动物的过敏反应。
结果
对照犬ST接受无任何药物的处理，直接开始接受每周一次静脉输注的α葡萄糖苷酶。到第3周时检测到明显滴度，到第4周滴度增加到超过100OD单位/μl血清。随后滴度的范围在约100-200单位/μl血清之间。相反，犬SC接受CsA+Aza方案，在12周的输注过程中有最小量的免疫应答。其中包括不施用任何药物的第7-12周情况同样如此。
伴有每周一次输注致耐受抗原的CsA+Aza方案能够诱导对其他抗原的耐受。结果表明该方案和致耐受抗原的方案可广泛用于诱导深度免疫耐受。具体而言，现已报道对α葡萄糖苷酶的免疫应答抑制或限制了酶取代方案在Pompe患者中的使用。该结果表明致耐受方案可用于防止对这种治疗蛋白的免疫应答。
实施例4
耐受的诱导取决于于CsA剂量
产生耐受方案的早期研究集中在联合使用胸腺内注射、免疫抑制药物和消耗成熟T细胞的单克隆抗体。据认为将耐受抗原表达(胸腺内注射)，抑制成熟抗原特异性T细胞应答(CsA和Aza)以及将能应答抗原的成熟T细胞消除这三者全部结合，是阻断活化免疫应答和使免疫系统认可抗原接触所必需的。在该研究的发展过程中，犬JH尽管只接受了ITI和CsA+Aza但是已获得耐受。对这只犬进一步分析表明其对CsA的代谢导致CsA血清水平的大幅度提高。这个发现是一个关键性的结果，使得能够对只用免疫抑制药物和耐受原诱导耐受进行进一步的试验。
材料和方法
动物：正常和MPS I犬来源于UCLA港的MPS I犬。该犬是小猎犬和Plott猎犬的杂交，平均重量为12-20kg。这些试验用的犬都小于两岁，但至少4个月龄。
单克隆抗体：系列单克隆抗体获自Peter Moore(UC Davis VeterinarySchool)，特异性针对犬T细胞受体(抗-TCR)，犬CD3抗原(抗-CD3；IgG2b)和Thy-1的犬等价物(抗-Thy1；IgG1)。抗-TCR抗体通过低血清培养基中培养杂交瘤产生，通过蛋白A层析纯化。抗-CD3和抗-Thy1抗体制备通过杂交瘤CA17.6B3和CA1.4G8在小鼠的腹水中产生，蛋白A纯化，在约定的实验室(Strategic Biosolutions)中完成。使用时，单克隆抗体就在ITI之前给予2或3剂量。
免疫抑制药物：环孢菌素(Neoral或Sandimmune)和硫唑嘌呤(Imuran)来源于当地的制药公司。两种药物按试验所述用量和频率口服施用。对使用Neoral或Sandimmune是不是诱导产生耐受的一个因素进行了评估，但未发现其是致耐受的因素。
不能诱导耐受性的每隔一天的CsA剂量的免疫抑制药物方案：
CsA Neoral25mg/kg/每隔一天分两次口服
Aza Imuran5mg/kg每隔一天，与CsA交替
0-18天给予全剂量的CsA+Aza，19-32天为1/2剂量，33-46天为1/4剂量，47-60天为1/8剂量，然后终止。
监测动物的副反应
监测CsA高峰和谷底水平，调节剂量维持循环中谷底水平为100-200ng/ml。
胸腺内注射：在全身麻醉过程中，在左边第3肋间隙切开3英寸的切口。切口通过肌肉层到达胸腔。采用肋骨分离器，可直接观察到胸腺是位于肺下方的带血管的弧形器官。用注射器和25G针管将酶溶液注射入胸腺。插入针头时要按照″zig-zag″方式以免在退出针头时酶泄露。通过伊文思蓝染色肉眼可检查到胸腺的任何酶溶液泄露。缝合手术部位，通过在胸腔内插入福利导管使用真空抽恢复呼吸功能。在所有切口使用抗生素，手术后使用短时间的抗生素和必要的控制疼痛药物。
注射溶液：总共1.5ml：1mg/kg的12.1mg/mL艾杜糖苷酸酶(3×106U/mL)。用含有40％PEG+2mg/mL伊文思蓝的酸性PBS调至1.5mL(终溶液约6％PEG，0.3mg/mL伊文思蓝)。
酶注射：按14,000U/kg/周的量，将α-L-艾杜糖苷酸酶以50ml含1mg/mL犬白蛋白和10mM NaPO4盐注射液，在2小时时段内通过静脉内方式施用(第1小时3,000U/kg/小时；第2小时11,000U/kg/hr)。监测动物的过敏反应。
结果
早期的耐受性试验包括每隔一天的CsA剂量。这些早期试验是为了确定ITI、免疫抑制药物和/或消耗T细胞的单克隆抗体是不是诱导耐受所必需的。图5显示的是用ITI和药物对一些早期犬进行研究的结果。
BI是只通过ITI接受PBS的对照犬，BE和BC通过ITI接受艾杜糖苷酸酶处理的两只犬。这3只犬在第7周其滴度都超过20，没有产生耐受。BO除了ITI外每隔一天接受CsA+Aza，它到第7周时也未产生耐受，滴度为42。JA和JO进行同样的方案，但是在ITI之前输注抗TCR单克隆抗体，以确定T细胞的消除是否能够诱导产生耐受。这两只犬都产生了免疫应答，在第12周时滴度分别达到148和135。值得注意的是对照犬JH没有出现免疫应答，尽管它也接受了此前未在BO起效的CsA+Aza和ITI方案。所述耐受包括对艾杜糖苷酸酶的一段时间的适度滴度，在一周时达到峰值15.1，然后在18周时减少到7.1。
常规CsA水平的评估显示了解释这一结果的方式。大部分每隔一天接受CsA的犬的谷底水平为60-190ng/ml，尽管一只犬(JO)达到342(表2)。这些犬都没有产生耐受。JH的水平为570，超过其他犬至少200ng/ml。该犬接受的是根据圈养和药物施用纪录正确的方案，而水平仍旧高得多。
使用CsA+Aza和ITI方案，JH产生了对艾杜糖苷酸酶的耐受。值得注意的是，其血清内CsA的水平很高，这表明CsA的水平可能是个关键的因素。接下来的试验，进一步研究CsA的剂量，验证了每天一次CsA剂量可以保持谷底值超过400ng/ml，和每隔一天一次的Aza剂量，就足以诱导耐受。
表2
在对艾杜糖苷酸酶非耐受和耐受犬中比较CsA谷底血液水平
  犬 治疗 谷底CsA水平(ng/ml) 平均值
非耐受性(隔日一次CsA外加其他治疗)   BOJAMEMAMO (CsA+Aza+ITI)(CsA+Aza+ITI+TCR mAb)(CsA+Aza+ITI+TCR mAb)(CsA+Aza+ITI+CD3/Thy1/TCRmAb)(CsA+Aza+ITI+CD3/Thy1/TCRmAb)     1906360120110 148
耐受性(隔日一次CsA外加其他治疗)   JH (CsA+Aza+ITI)     570
耐受性(致耐受药物方案：每天一次CsA外加Aza)   RHRIROPESANI (CsA(每天一次)+Aza+ITI)(CsA(每天一次)+Aza+ITI)(CsA(每天一次)+Aza)(CsA(每天一次)+Aza，MPS I感染)(CsA(每天一次)+Aza，MPS I感染)(CsA(每天一次)+Aza，MPS I感染)     520450680440520660 545
非耐受性(每天一次CsA无Aza)   PA (CsA(每天一次))     490
表2中，在艾杜糖苷酸酶非耐受和耐受犬中比较CsA谷底血液水平以ng/ml血显示。环孢菌素水平是在至少连续4周给予环孢菌素剂量后测定。PA只接受每天一次的环孢菌素治疗，4天后接受最初的艾杜糖苷酸酶攻击，对艾杜糖苷酸酶没有耐受性。所有其他的犬接受免疫抑制药物，18天后开始接受首次的艾杜糖苷酸酶攻击(ITI之前的4天)。所有的犬静脉接受0.056mg/kg/周的人重组艾杜糖苷酸酶。对艾杜糖苷酸酶成功的耐受与环孢菌素谷底水平为400-700ng/mL相关。环孢菌素谷底水平小于400ng/mL的犬对艾杜糖苷酸酶没有耐受性。(CsA＝环孢菌素A；Aza＝硫唑嘌呤；ITI＝艾杜糖苷酸酶胸腺内注射；mAb＝单克隆抗体)。
表2所示的来源于其他耐受犬的其他数据验证了CsA剂量在致耐受方案中的作用。在表上部分非耐受犬接受隔日一次25mg/kg的CsA，6只犬用药物治疗同时伴有或不伴有其他治疗手段，其谷底CsA水平为60-190ng/ml，只有一种情况JO为342ng/ml。这些水平是在所述方案过程中已经施用了至少4个剂量的药物后测得的。非耐受犬的CsA平均值为148ng/ml。在第3部分，耐受犬的CsA谷底水平为440-680，平均值为545ng/ml，比非耐受犬高出3倍多。JH的水平在表的第2栏为570ng/ml，尽管其只接受隔日一次的剂量，但其水平已足够高且已产生了耐受。相反，在表格第4部分的PA虽然有足够的CsA水平490，但是没有另外接受Aza，没有产生耐受。这些数据表明足量的CsA在致耐受方案发挥着重要作用。
实施例5
诱导在无慢性耐受原刺激条件下仍能长久持续的耐受
如果耐受状态持久，那么用耐受原诱导耐受是特别有用的，甚至在不施用耐受原的情况下。为了验证耐受状态的稳定性，让耐受和非耐受犬在不同时间间隔后接受艾杜糖苷酸酶输注的攻击。数据表明：在至少6个月中，耐受性动物仍旧保留对艾杜糖苷酸酶输注的耐受，即使没有了持续的耐受原或抗原的接触。
方法和材料
对提到的每一只犬都进行上述实施例中描述的耐受性诱导(使用同样的初始操作)。JO是接受隔日一次CsA剂量的耐受犬，与其他犬不一样。该犬在起初没有完全耐受但没有抗体应答。在其他实施例所描述的试验中，其他犬是产生完全耐受。艾杜糖苷酸酶是如上所述那样具有高摄取特性的艾杜糖苷酸酶。犬每周一次接受0.58mg/kg静脉内施用的酶，共3-6个剂量。
结果和讨论
在图6中，耐受和非耐受犬的滴度显示有一段空缺，这正是无耐受原或治疗性输注的那段时间。少至5周和多至6个月的耐受原停歇都没有改变耐受犬的应答水平。在4.5个月的停歇后非耐受犬RU再接受2个剂量的酶，诱导产生出＞20倍的抗体滴度。犬JH在3周的再诱导后表现一些程度的应答，应答水平超过大多数耐受犬，但并没有达到致敏的非耐受犬RU的应答，其仍然表现为耐受，并不产生明显的免疫应答。JH在最初攻击时也有比较显著的应答，但是其水平不及用最佳致耐受方案处理后的犬的耐受程度。其最初的滴度模式也是一个平台，然后随着持续的输注而下降，随后研究这个情况。
这些数据表明用本发明的方法和组合物诱导的耐受性是持久的，可用于临床。
实施例6
在人中诱导耐受
材料和方法
患者：挑选患粘多糖病I的患者进行治疗。患者在起始时刻和第6、12、26和52周时进行下列评估：详细的临床检查，腹部和脑部核磁共振成像，超声波心动描记，运动范围测量，多导睡眠监测，临床实验室评估，测定白细胞α-L-艾杜糖苷酸酶活性，和尿中糖胺聚糖的分泌。
免疫抑制药物：环孢菌素(Neoral或Sandimmune)和硫唑嘌呤(Imuran)均从商业途径获得。两种药物的剂量和频率如下所述：CsA Neoral25mg/kg/每天，分两次口服；Aza Imuran5mg/kg隔日一次口服两周的适应时间。在附加的两周内耐受原存在下给予所述剂量的该药物。在首次耐受原输注后每2周所有药物的用量均减半。检测患者的副反应，和检测CsA的高峰及谷底水平。
耐受原：用生物反应器和常规柱层析在中国仓鼠卵巢细胞中制备重组α-L-艾杜糖苷酸酶，分析其安全性和纯度。α-L-艾杜糖苷酸酶活性的测定采用Shull等，(同上)一文中的方法，或用结果表示为SI单位的测定方法(Kakkis et al.，2001，同上)。当使用后者的测定方法时，125,000U α-L-艾杜糖苷酸酶/千克的剂量相当于100SI单位/千克。尿中糖胺聚糖分泌的测定采用Bjomsson方法并做出改进。对α-L-艾杜糖苷酸酶的抗体的酶联免疫吸附测定采用Shull等方法的变化形式，以及Western印迹，按常规方法进行。
按每周一次静脉内输注(用含有0.1％人血清白蛋白的常规盐水稀释)14,000U(0.056mg/kg)的剂量施用耐受原。首次剂量是在两周的适应期完成后施用，随后每周一次。患者事先服用苯海拉明(0.5-1.25mg/kg体重)。
诱导耐受后，通常是适应期开始后的6-8周，剂量增至每周一次，125，000U(0.058mg)/千克；速率为第一个小时内3000U/千克，后两个小时中每小时的速率为61,000U/千克。
实施例7
免疫致耐受方案阻止除IgG以外的其他免疫球蛋白的诱导产生
致耐受方案能阻止犬中IgG的诱导产生，表现为对艾杜糖苷酸酶总IgG应答与非耐受犬中观察到的IgG应答相比减弱。本实施例提供的另外证据表明除了能阻止IgG的诱导产生外，致耐受方案还能阻止其他亚型免疫球蛋白的诱导产生。对耐受犬(犬PE和SA)或未接受致耐受方案的对照犬(犬RU和UM)的免疫血清进行分析，测定其中是否出现抗艾杜糖苷酸酶的IgG，IgA和IgE抗体。
这些测定试验的数据如附图7A-7D所示。数据显示耐受犬中的其他亚型的滴度没有显著增加(＞3倍)，而非耐受犬出现显著的IgA或IgE应答，一些情况下达到了约10倍。尽管IgA和IgE的滴度与IgG相比不算高，但是这些滴度在非耐受犬中是显著的和呈阳性的。数据显示致耐受方案还能阻止其他Ig亚型的诱导产生，这与其对体液应答的较广泛的影响相一致。
实施例8
在预先存在免疫应答的动物中诱导耐受
本发明的另一个方面，本发明人证实可以将已有的免疫应答减弱或消除。本实施例对来源于试用犬(canine Nitro)的数据进行讨论。试用犬最初是耐受性的，但近6个月的不接触抗原后，再次接触抗原引起深度免疫回忆应答，其滴度达到400+。在不接触抗原几周后，犬接受致耐受方案，每周一次输注低剂量(0.056mg)的艾杜糖苷酸酶。在施用CsA+Aza方案的过程中滴度起初上升，超过通常的免疫回忆应答值100，然后迅速降低至20以下(见图8)。所述方案减弱了这种应答，与此前0.5mg/kg/周输注量时＞400的水平相比，此时对酶免疫应答相对减弱。数据表明：即使动物已经具有对耐受原组合物中抗原的免疫应答，仍然可能再诱导产生对耐受原的耐受。
实施例9
抗原上高亲和力摄取残基的存在使得抗原作为耐受原更有效
在上面的实施例1中已经讨论了高亲和力基元对耐受原的影响，表明使用甘露糖-6-磷酸等基元能有效增强抗原的致耐受能力。对耐受原组合物的这一方面进一步研究，研究结果报道于本实施例和图9。艾杜糖苷酸酶通常含有甘露糖-6-磷酸，这种高摄取基元促进靶细胞通过甘露糖-6-磷酸受体摄取艾杜糖苷酸酶。
在本实施例中，通过用连接在微珠的酸性磷酸酶孵育，将重组艾杜糖苷酸酶去磷酸化。在Hurler成纤维细胞中缺乏有效的摄取和K摄取的值太低以致于无法测量说明酶去磷酸化成功。在致耐受方案中使用去磷酸化的艾杜糖苷酸酶，其方式类似于上述实施例中使用艾杜糖苷酸酶的耐受试验。数据如图9所示。研究表明用去磷酸化的艾杜糖苷酸酶诱导耐受的犬不能耐受，再次表明高摄取亲和力是产生耐受所必需的。
实施例10
诱导对凝血因子VIII耐受的方法
治疗血友病A依赖于向血友病患者递送有效量的凝血因子(Factor)VIII的能力。但是，对凝血因子VIII治疗的抗体或抑制剂是血友病A患者的重要问题。已经产生对凝血因子VIII的抗体抑制剂的血友病患者可能会经历流血无法控制，使得凝血因子VIII治疗无效。实施例1-9描述了，通过施用作为耐受原的α-L-艾杜糖苷酸酶或α葡萄糖苷酶与在一段长度足以使宿主产生对耐受原耐受的时间段的免疫抑制方案相结合诱导抗原特异性免疫应答的方法和组合物。本实施例目的是诱导对凝血因子VIII的耐受。本实施例提供用于预防和逆转凝血因子VIII抑制剂形成的方法。
耐受原性凝血因子VIII的制备：通过将耐受原凝血因子VIII蛋白偶联至与高摄取蛋白上制备出耐受原性凝血因子VIII。最简单的方法就是将凝血因子VIII蛋白与溶酶体酶艾杜糖苷酸酶偶联，该酶在其N-连接糖基上含有高亲和力摄取标志物(high affinity uptake marker)。用杂合双效交联剂(例如SBDB)偶联蛋白。合适的交联比率是1∶1，纯化交联后的蛋白。
血友病患者的耐受性：患者接受环孢菌素A，剂量为12.5mg/kg/天，分开施用以使得血液水平高于400ng/ml。患者还隔日一次接受硫唑嘌呤，剂量为2-5mg/kg，适于人类患者。施用18天的药物后，患者每周一次接受0.6mg/kg耐受原输注。32天后，CsA和Aza的剂量减半，46天后减为1/4。在60天CsA+Aza终止，而每周一次的输注仍然继续。对免疫应答的监测显示：如果有免疫应答那么也是适度的，低于无耐受时应答的20％。患者接受正常的凝血因子VIII输注，终止耐受原的给予。如果需要的话，继续施用耐受原以维持间隔期内的耐受状态。
实施例11
糖尿患者中对β细胞抗原的耐受
针对β细胞抗原例如谷氨酸脱羧酶(GAD)的抗体和细胞免疫应答导致胰腺β细胞的破坏，引发糖尿病。诱导对这些抗原的耐受可以为防止高危或具有I型糖尿病症状的患者糖尿病恶化或发生的重要方法。GAD是一种重要的抗原，但是其他的抗原如IA2和胰岛素也作了如此研究。
耐受原性GAD的制备：可以通过与高摄取肽基元的融合，制备出具有耐受原性的GAD。将人GAD基因与高摄取肽例如IGF2的基因连接在阅读框内，IGF2已知能够与甘露糖-6-磷酸受体结合。这种融合使得两种蛋白都能形成正确的结构，正确的抗原性和形式。
1型糖尿患者的耐受性：优选使用处在发病早期仍还保留一部分β细胞功能的新发生糖尿病的患者。患者接受环孢菌素A，剂量为12.5mg/kg/天，一天二次分开施用以使得血液中的水平高于400ng/ml。患者还隔日一次接受硫唑嘌呤，剂量为2-5mg/kg，适于人类患者。施用18天的药物后，患者每周一次接受0.06mg/kg耐受原输注。32天后，CsA和Aza的剂量减半，46天后减为1/4。在60天CsA+Aza终止，而每周一次的输注仍然继续。然后耐受原的剂量可以增加到0.6mg/kg/周。对免疫应答的监测显示：如果有免疫应答那么也是适度的，低于无耐受时应答的20％。患者具有正常的葡萄糖耐受时，终止耐受原的给予。如果需要的话，继续施用耐受原以维持间隔期内的耐受状态，由患者的临床状态所决定。

Claims (70)

1.一种致耐受组合物，包含天然含有或偶联于高摄取基元的多肽抗原；以及一种药物学上可接受的赋形剂。
2.一种试剂盒，其中包括：一种致耐受组合物和使用说明书，该致耐受组合物含有一种多肽抗原和一种药物学上可接受的赋形剂，所述多肽抗原天然含有或偶联于高摄取基元。
3.权利要求2中的试剂盒，其还包括T细胞免疫免疫抑制剂。
4.权利要求3中的试剂盒，其还包括抗增殖药物。
5.权利要求2中的试剂盒，其中所述多肽抗原偶联于高摄取基元。
6.一种耐受原在制备药物中的用途，该药物用于和有效量的T细胞免疫抑制剂组合治疗，以诱导对该耐受原中抗原成分的免疫耐受，所述耐受原含有抗原和高摄取基元，其中，所述抗原天然含有所述高摄取基元或偶联于所述高摄取基元。
7.权利要求6中的用途，其中所述组合治疗还包括抗增殖药物。
8.权利要求6中的用途，其中所述T细胞免疫抑制剂是亲免蛋白。
9.权利要求8中的用途，其中所述亲免蛋白为环孢菌素A。
10.权利要求9中的用途，其中所述环孢菌素A的用量为约0.5mg-10mg。
11.权利要求7中的用途，其中所述抗增殖药物是核苷酸类似物。
12.权利要求11中的用途，其中所述核苷酸类似物为6-巯基嘌呤药物。
13.权利要求12中的用途，其中所述6-巯基嘌呤药物为硫唑嘌呤。
14.权利要求7中的用途，其中所述抗增殖药物是抗代谢药物。
15.权利要求14中的用途，其中所述抗代谢药物是参与核苷酸代谢的二氢叶酸还原酶或其他酶的抑制物。
16.权利要求14中的用途，其中所述的核苷酸代谢酶是二氢叶酸还原酶，所述抑制剂是甲氨蝶呤或其类似物。
17.权利要求13中的用途，其中配制在组合物中的硫唑嘌呤的量为约0.5mg-10mg。
18.权利要求6中的用途，其中所述耐受原是针对广泛表达于所述哺乳动物宿主的高摄取受体的多肽。
19.权利要求6中的用途，其中所述耐受原包括甘露糖-6-磷酸。
20.权利要求6中的用途，其中所述耐受原是与目的抗原偶联的甘露糖-6-磷酸。
21.权利要求6中的用途，其中所述耐受原是治疗性多肽。
22.权利要求21中的用途，其中所述治疗性多肽选自抗体、凝血因子、酶或生长因子。
23.权利要求21中的用途，其中所述治疗性多肽是凝血因子VIII。
24.权利要求23中的用途，其中所述凝血因子VIII偶联于高摄取基元。
25.权利要求24中的用途，其中所述高摄取基元是艾杜糖苷酸酶，其含有在其N-连接糖上的高亲和力摄取标志物。
26.权利要求6中的用途，其中所述耐受原是β-细胞抗原。
27.权利要求26中的用途，其中所述β-细胞抗原选自谷氨酸脱羧酶(GAD)、IA2或胰岛素。
28.权利要求27中的用途，其中所述β-细胞抗原是GAD。
29.权利要求28中的用途，其中所述GAD偶联于高摄取基元。
30.权利要求29中的用途，其中所述高摄取基元是能结合选自下列的受体的肽：运铁蛋白受体，黑素运铁蛋白受体，甘露糖-6-磷酸受体。
31.权利要求29中的用途，其中所述高摄取基元是能结合甘露糖-6-磷酸受体的肽。
32.权利要求29中的用途，其中所述肽是胰岛素-样生长因子(IGF)。
33.权利要求6中的用途，其中所述耐受原是自体抗原。
34.权利要求33中的用途，其中所述耐受原包括多种自体抗原。
35.权利要求6中的用途，其中所述耐受原包括移植抗原。
36.权利要求35中的用途，其中所述耐受原包括多种移植抗原。
37.一种试剂盒，其中包括权利要求6-36任一项中所述的药物。
38.T细胞免疫抑制剂在制备药物中的用途，该药物用于和耐受原组合治疗，以预防性诱导对该耐受原中抗原成分的免疫耐受，所述耐受原含有抗原和高摄取基元，其中，所述抗原天然含有所述高摄取基元或偶联于所述高摄取基元。
39.权利要求38的用途，其中所述T细胞免疫抑制剂是环孢菌素A、他克莫司或雷帕霉素。
40.权利要求38的用途，其中所述T细胞免疫抑制剂是环孢菌素A。
41.权利要求38-40任一项的用途，其中所述组合治疗还包括用抗增殖剂的治疗。
42.权利要求4 1的用途，其中所述抗增殖剂选自：硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、6-硫鸟嘌呤、或其类似物、6-甲基-巯基嘌呤或其类似物、6-甲基-巯基嘌呤核糖核苷、阿糖胞苷、甲氨蝶呤、霉酚酸、6-(1，3-二氢-4-羟基-6-甲氧基-7-甲基-3-氧-5-异苯并呋喃基)-4-甲基-4-己酸、环磷酰胺和苯丁酸氮芥。
43.权利要求42的用途，其中所述抗增殖剂是硫唑嘌呤。
44.权利要求41-43任一项的用途，其中在所述组合治疗中，所述T细胞免疫抑制剂的起始施用量将宿主血液中所述药物谷底水平保持在发挥抑制作用的水平。
45.权利要求41-43任一项的用途，其中在所述组合治疗中，所述环孢菌素A的起始施用量使得谷底水平为至少约200ng/ml。
46.权利要求41-43任一项的用途，其中在所述组合治疗中，所述环孢菌素A的起始施用量使得谷底水平为至少约300ng/ml。
47.权利要求41-43任一项的用途，其中在所述组合治疗中，所述环孢菌素A的起始施用量使得谷底水平为至少约400ng/ml。
48.权利要求41-43任一项的用途，其中在诱导免疫耐受期间，在至少6周的时段内用T细胞免疫抑制剂结合抗增殖药物维持所述宿主。
49.权利要求41-43任一项的用途，其中在所述组合治疗中，所述硫唑嘌呤以1-5mg/ml/天的用量维持至少约两周。
50.权利要求41-43任一项的用途，其中在诱导免疫耐受期间，在至少约6周的致耐受方案期间施用至少6次有效量的所述耐受原。
51.权利要求50的用途，其中所述的耐受原的有效量低于常规治疗量的50％。
52.权利要求50的用途，其中所述的耐受原的有效量低于常规治疗量的10％。
53.权利要求38-52任一项的用途，其进一步包括监测所述哺乳动物宿主对所述抗原的回忆应答，以及当抗所述抗原的免疫球蛋白滴度上升时通过重复所述组合治疗再诱导对所述抗原的耐受。
54.有效量的抗增殖剂在制备药物中的用途，该药物用于和耐受原组合治疗，以预防性诱导对该耐受原中抗原成分的免疫耐受，所述耐受原含有抗原和高摄取基元，其中，所述抗原天然含有所述高摄取基元或偶联于所述高摄取基元。
55.权利要求54的用途，其中所述抗增殖剂选自：硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、6-硫鸟嘌呤、或其类似物、6-甲基-巯基嘌呤或其类似物、6-甲基-巯基嘌呤核糖核苷、阿糖胞苷、甲氨蝶呤、霉酚酸、6-(1，3-二氢-4-羟基-6-甲氧基-7-甲基-3-氧-5-异苯并呋喃基)-4-甲基-4-己酸、环磷酰胺和苯丁酸氮芥。
56.权利要求54的用途，其中所述抗增殖剂是硫唑嘌呤。
57.权利要求54-56任一项的用途，其中所述组合治疗还包括用T细胞免疫抑制剂的治疗。
58.权利要求57的用途，其中所述T细胞免疫抑制剂是环孢菌素A、他克莫司或雷帕霉素。
59.权利要求58的用途，其中所述T细胞免疫抑制剂是环孢菌素A。
60.权利要求57-59任一项的用途，其中在所述组合治疗中，所述T细胞免疫抑制剂的起始施用量将宿主血液中所述药物谷底水平保持在发挥抑制作用的水平。
61.权利要求57-59任一项的用途，其中在所述组合治疗中，所述环孢菌素A的起始施用量使得谷底水平为至少约200ng/ml。
62.权利要求57-59任一项的用途，其中在所述组合治疗中，所述环孢菌素A的起始施用量使得谷底水平为至少约300ng/ml。
63.权利要求57-59任一项的用途，其中在所述组合治疗中，所述环孢菌素A的起始施用量使得谷底水平为至少约400ng/ml。
64.权利要求57-59任一项的用途，其中在诱导免疫耐受期间，在至少6周的时段内用T细胞免疫抑制剂结合抗增殖药物维持所述宿主。
65.权利要求57-59任一项的用途，其中在所述组合治疗中，所述硫唑嘌呤以1-5mg/ml/天的用量维持至少约两周。
66.权利要求57-59任一项的用途，其中在诱导免疫耐受期间，在至少约6周的致耐受方案期间施用至少6次有效量的所述耐受原。
67.权利要求66的用途，其中所述的耐受原的有效量低于常规治疗量的50％。
68.权利要求66的用途，其中所述的耐受原的有效量低于常规治疗量的10％。
69.权利要求54-68任一项的用途，其进一步包括监测所述哺乳动物宿主对所述抗原的回忆应答，以及当抗所述抗原的免疫球蛋白滴度上升时通过重复所述组合治疗再诱导对所述抗原的耐受。
70.权利要求2的试剂盒，其中所述多肽抗原天然含有高摄取基元。
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