MXPA04009292A

MXPA04009292A - Induccion de tolerancia inmunologica antigeno especifica.

Info

Publication number: MXPA04009292A
Application number: MXPA04009292A
Authority: MX
Inventors: Tanaka Christopher
Original assignee: Biomarin Pharm Inc
Priority date: 2002-05-06
Filing date: 2003-05-05
Publication date: 2005-06-08
Also published as: ZA200409787B; US7485314B2; WO2003094840A3; UY27795A1; US20030211113A1; AU2003228829A1; WO2003094840A2; EP1507555A4; EP1507555A2; HK1081438A1; CA2492394A1; CN100360182C; IL165016A0; JP4933042B2; TW200400045A; BR0309809A; US7883707B2; IL165016A; ES2401681T3; TWI349556B

Abstract

Se induce tolerancia inmune a antigeno especifica en un huesped mamifero por la administracion de un tolerageno en combinacion con un regimen de inmunosupresion. Los metodos opcionalmente incluyen un periodo de acondicionamiento precedente, en donde los agentes inmunosupresores se administran en la ausencia del tolerageno. Despues del regimen de tolerizacion, el huesped se retira a partir de los agentes supresores, pero es capaz de mantener la tolerancia inmune especifica a los epitopes inmunogenicos presentes en el tolerageno. Optimamente, el tolerageno tendra propiedades de absorcion elevada que permiten la absorcion in vivo a concentraciones bajas en una amplia variada de tipos celulares tolerizantes.

Description

INDUCCIÓN DE TOLERANCIA INMUNOLOGICA ANTÍGENO ESPECÍFICA Campo de la Invención La presente solicitud se dirige a métodos y composiciones para inducir tolerancia inmune en un mamífero. Los métodos comprenden la administración de un tolerágeno de absorción elevada en combinación con agentes inmunosupresores en un régimen de tolerización .

Antecedentes de la Invención La tolerancia inmune es altamente relevante para un amplio rango de aplicaciones clínicamente importantes. La inducción de tolerancia a antígeno específica es un objetivo principal para el tratamiento de prevención de enfermedad autoinmune y rechazo de injerto, que se controlan actualmente por terapias inmunosupresoras , - no específicas que resultan en índices incrementados de infecciones, cánceres y patología relacionada con fármaco. Otras aplicaciones de inducción de tolerancia inmune incluyen alergias y asma, reemplazo de médula espinal y terapéuticos a base de proteínas. Una de las primeras aplicaciones prácticas de biología molecular ha sido la capacidad para producir grandes cantidad de agentes biológicos raros, muchos de los cuales tienen actividad terapéutica. Se ha encontrado, sin embargo, que durante la administración de estos agentes, un paciente puede acumular una respuesta inmune, conduciendo a la producción de anticuerpos que se unen e interfieren con la actividad terapéutica así como también provocan reacciones inmunológicas agudas o crónicas. Este problema es más significativo para terapéuticos que son proteínas debido a que las proteínas son antígenos complejos y en muchos casos, el paciente no ha sido afectado inmunológicamente por los ant ígenos . Este tipo de respuesta inmune se ha encontrado en al menos algunos pacientes con trastornos por deficiencia tales como hemofilia A (Aledort (1994) Am. J. Hemat . 47:208-217), diabetes mellitus (Gossain et al. (1985) Ann. Allegy 55:116-118), deficiencia de adenosina desaminasa (Chaffee et al. (1993) J". Clin. Inv. 89:1643-1651), enfermedad de Gaucher (Richards et al. (1993) Blood 82:1402-1409), y enfermedad de Pompe (Amalfitano (2001) Genet Med 3:132-138. En la hemofilia A, los anticuerpos pueden inhibir la función del factor VIII que requiere tratamiento alternativo con concentrados del complejo protombrina activado. En la deficiencia de adenosina desaminasa, los anticuerpos para adenosina desaminasa modificada con PEG mejoran la depuración de la enzima y disminuyen su eficacia. En la enfermedad de Gaucher, la inducción de anticuerpos IgGl se ha asociado con reacciones anafilactoides debidas a activación complementaria durante las infusiones. En la enfermedad de Pompe, la terapia de reemplazo con alfa-glucosidasa recombinante resultó en la inducción de anticuerpos en dos de los tres pacientes tratados, que resultaron en eficacia declinante de la terapia . Las respuestas inmunes similares se han encontrado en el suministro de terapéuticos de proteína por terapia genética. Por ejemplo, las proteínas virales asociadas con vectores son objetivos de respuesta inmune que pueden provocar inflamación, expresión acortada y administración de repetición evitada del vector (Wilson and Kay (1995) Nature Med. 1:887-889) . Las respuestas de anticuerpo a la proteína terapéutica se han observado también en experimentos de terapia genética y son parte de una respuesta inmune total que evita expresión a largo plazo (Shull et al. (1996) Blood 88:377-379) . La supresión inmune generalizada, bloqueada y desviación inmune a partir de las respuestas humorales a celulares se ha utilizado para dirigir este problema, pero no es probable asegurar tolerancia duradera al antígeno. La tolerancia puede definirse como la ausencia de una respuesta inmune a un antígeno específico en la determinación de un sistema inmune de otra manera normal. Este estado de tolerancia inmunológica específica a auto-componentes implica tanto mecanismos centrales como periféricos. La tolerancia central (selección negativa) es una consecuencia de células inmaduras T que reciben fuerte señalización intracelular mientras que aún residen en el timo, resultando en eliminación clonal de células auto-reactivas . La tolerancia periférica ocurre cuando el sistema inmune llega a ser reactivo a un antígeno presentado en la periferia, en donde en contraste con el timo, las células T se asume que son funcionalmente maduras. La tolerancia periférica se ha propuesta para ser el resultado de varios mecanismos, incluyendo el desarrollo de células supresoras antígeno específicas u otro medio de tolerancia activa, eliminación clonal, y anergia. Las células autoreactivas pueden eliminarse físicamente por la inducción de apoptosis después del reconocimiento de antígeno tolerizante, puede llegar a ser anérgico sin la eliminación, o puede inhibirse funcionalmente por citocinas o células regulatorias . Aunque se ha aprendido mucho en años recientes, es todavía difícil predecir el resultado de exposición antigénica in vivo, y se necesita el esclarecimiento adicional de mecanismos de tolerancia en el nivel básico. Numerosas estrategias se han desarrollado para inducir tolerancia a antígeno específica en modelos animales, por ejemplo con respecto a trastornos autoinmunes, tales como esclerosis múltiple (o encefalitis alérgica experimental, EAE) o diabetes, así como también para prevenir el rechazo de trasplantes de tejido alogeneico. Los métodos principales desarrollados en modelos de ratón y rata implican la administración de dosis elevadas de antígeno soluble, ingestión oral de antígenos o inyección intratímica. La eficacia de estos métodos depende de grados variables en eliminación clonal, anergia clonal, supresión activa por células T antígeno específicas y desviación inmune a partir de respuestas inmunes celulares a humorales. Aunque la administración de grandes cantidades de antígenos solubles se ha reconocido por mucho tiempo que no induce sensibilidades a pruebas inmunológicas subsecuentes, estudios de EAE también han resaltado las dificultades en este enfoque. Las dosis elevadas requeridas y la inconsistencia de tolerancia contra desviación inmune hacen a la administración de antígeno soluble sola impráctica para la mayoría de las situaciones de terapia genética. La administración de dosis muy grandes de antígeno oralmente para ratones también se ha demostrado que induce tolerancia a antígenos de proteína. Sin embargo, se requieren dosis extraordinarias, y los resultados son complejos. Ciertas dosis se encuentran que resultan en anergia, mientras otras dosis inducen una forma de supresión circunstante antígeno específico caracterizada por respuestas del tipo TH2 antígeno específicas. Además, el antígeno oral puede sensibilizar el sistema inmune y conducir a enfermedad más severa . La inyección intratímica de antígenos o células se ha explorado ampliamente como una técnica para inducir tolerancia inmune central. Los antígenos inyectados y presentados dentro del timo pueden provocar apoptosis o anergia de células T CD4+ , CR8+ en un proceso que puede tomar hasta 10 días. Igual que la tolerancia del antígeno oral y soluble, el efecto tolerizante es dependiente de dosis: dosis bajas de antígeno se sensibilizan o proporcionan únicamente protección parcial, mientras que dosis más grandes de antígeno se tolerizan. El contexto de la presentación antigénica dentro del timo es también importante. La tolerancia es inducida más eficientemente cuando los antígenos se presentan por células de presentación de antígeno huésped (APC) . Una vez tolerizadas, se necesita la presencia continuada de antígeno dentro del animal para el mantenimiento de tolerancia, y puede también requerirse la eliminación de células T maduras. Una estrategia para la inducción de tolerancia se basa en el descubrimiento que la activación de células T óptima requiere señales antígeno específicas y señales no antígeno específicas. Durante la presentación de antígenos, una variedad de interacciones semejantes bidireccionales importantes toma lugar, con señalización de tanto la célula T como la célula que presenta antígeno. La señal co-estimulante mejor entendida se proporciona a través de la molécula CD28 de superficie de la célula T. CD28 tiene dos ligandos, las moléculas homologas CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2) ; ambas se expresan en APC activado y algunos otros tipos celulares. Otra trayectoria que ha recibido atención significativa y es importante en la co-estimulación de células T es aquella mediada por CD40 y su ligando CD154. CD154 se expresa en las células T activadas, principalmente células T CD4+. En los últimos años, una variedad de laboratorios han mostrado que el bloqueo de las señales co-estimulantes de célula T puede mejorar los índices de supervivencia de aloinjerto a largo plazo e inducir tolerancia de transplante. La mayoría de estos estudios han utilizado cualquier CTLA4 Ig , una proteína de fusión de CTLA-4 e Ig humano que une competitivamente CD80 y CD86, o un anticuerpo monoclonal de bloqueo a CD154. El bloqueo co-estimulante ha sido parcialmente exitoso en modelos de ratón y rata de transplante cardiaco, hepático, isleta, renal, pulmón y médula espinal . Aunque un simple agente único tal como CTLA4Ig o anticuerpo anti-CD154 puede mejorar los índices de supervivencia de injerto a largo plazo, estos agentes por sí mismos es improbable que produzcan supervivencia de injerto indefinida; pérdida de aloinjerto tardía que resulta del rechazo crónico es la regla. Más comúnmente, se requiere cualquier transfusión de linfocitos específicos de donador o la combinación de CTLA4Ig y anti-CD154 para supervivencia a largo plazo, con o sin tolerancia. Además, los resultados en primates no humanos no son tan buenos como aquellos en modelos de roedor. En modelos de murino en donde CTLA4Ig y/o anticuerpo anti-CD40 se han utilizados para inducir tolerancia, se ha mostrado que la administración concomitante de ciclosporina evita inducción por tolerancia. Parece que la inducción de tolerancia en células T desprovistas de señales co-estimulantes es un proceso activo que implica J acontecimientos de señalización de TCR que son sensibles a ciclosporina. Por lo tanto en la presencia de ciclosporina, la tolerancia no puede lograrse por este medio. Estas referencias por lo tanto enseñan constantemente del uso de ciclosporina en regímenes de inducción de tolerancia. En un protocolo en donde la combinación de CTLA4Ig da 2 d después del transplante y los linfocitos específicos donadores se utiliza para inducir tolerancia de aloinjerto cardiaco en ratones, bloqueo de CTLA-4 al tiempo que el transplante evita la inducción de tolerancia y conduce a rechazo temprano. Por lo tanto, las señales de CTLA-4 tempranas pueden ser permisivas para algunas estrategias toleragénicas/inhibidoras de la célula T; sin estas señales, puede probar ser difícil desactivar la respuesta inmune. De manera similar, en modelos de murino de enfermedad autoinmune, el bloqueo de CLTA-4 agrava la duración y severidad de la enfermedad. Debido a que los agentes tales como CTLA Ig evitan CD80 y CD86 a partir de la unión a CD28 y CTLA-4, estos tienen tanto el potencial para bloquear las señales positivas (a través de CD28) como la capacidad indeseada para bloquear señales negativas (a través de CTLA-4) . En todos estos métodos, la tolerancia se induce ya sea poco confiablemente, no se ha logrado en seres humanos o no es terapéutica o clínicamente útil. Existe una necesidad clínica para métodos para evitar respuestas inmunes a antígenos. La presente invención dirige este problema.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Se proporcionan métodos para inducir tolerancia inmune a antígeno específica en un huésped mamífero. Un tolerágeno, que comprende sustancialmente todos los epítopes inmnunogénicos presentes en el antígeno de interés, se administra a un huésped mamífero durante un periodo de tiempo en combinación con un inmunosupresor de la célula T, en una dosis suficiente para proporcionar inmunosupresión profunda. El régimen puede además comprender administración de un agente anti-proliferativo. En una modalidad de la invención, este régimen de tolerización se precede por un periodo de acondicionamiento, en donde el inmunosupresor de célula T se administra en la ausencia del tolerágeno. Después del régimen de tolerización, el huésped se retira del agente inmunosupresor , pero es capaz de mantener tolerancia inmune específica a los epítopes inmunogénicos presentes en el tolerágeno. La dosis de mantenimiento del tolerágeno se administra opcionalmente después que el régimen de tolerizacion se completa. El tolerágeno puede ser cualquier antígeno, particularmente antígenos de proteína solubles, por ejemplo, proteínas terapéuticas, cócteles de antígenos de transplante, etc., y pueden ser idénticos al antígeno de interés, o puede ser una forma modificada del antígeno con propiedades toleragénicas mejoradas, por ejemplo, para incrementar la absorción por células de presentación de antígeno no profesional. Preferiblemente, el tolerágeno comprende una porción de absorción elevada, y se toma eficientemente por un receptor de alta afinidad ampliamente presente, por ejemplo, receptor del 6 -fosfato de mañosa, etc. Otros receptores que se presentan ampliamente y son iguales en afinidad son también adecuados. Un antígeno sin una capacidad de absorción elevada adecuada puede modificarse para contener una porción que proporciona esta función para permitir la absorción por tipos celulares de tolerizacion. En una modalidad de la invención, el huésped no es afectado inmunológicamente por el antígeno de interés, es decir, no existe respuesta inmune de memoria o pre-existente al antígeno. Para el último caso, puede ser necesario extirpar células del sistema inmune responsable de la respuesta inmune pre -existente . La invención contempla además el uso de un tolerágeno que comprende un antígeno y una porción de absorción elevada, para la fabricación de un medicamento para uso en terapia de combinación con un agente inmunosupresor de célula T en la inducción profiláctica de tolerancia inmune al componente antigénico del tolerágeno. En aspectos particulares de la presente invención, se debe observar que la dosis del agente inmunosupresor será suficiente para suprimir sustancialmente células T. Las variaciones en dosis de los fármacos pueden combinarse para alcanzar el mismo grado de supresión de la célula T en diferentes sujetos y bajo condiciones diferentes. El nivel de supresión de la célula T se supervisa como aquel nivel al cual las células T no proliferan en respuesta a la estimulación de antígenos. Los métodos para supervisar la proliferación de la célula T se conocen por aquellos expertos en la técnica, y pueden utilizarse junto con la presente invención. En las modalidades preferidas, el rango de dosis para el antígeno/tolerágeno puede estar entre 0.001 mg/kg a 5 mg/kg/semana . Más preferiblemente, el rango de dosis del tolerágeno está entre 0.01 mg a 1 mg/kg y más preferiblemente 0.03 mg/kg/semana a 0.1 mg/kg/semana . En las modalidades preferidas, la dosis para el antígeno/tolerágeno es 0.056 mg/kg de peso corporal una vez por semana. En aquellas modalidades preferidas en las cuales el agente inmunosupresor es CsA, el CsA se da para alcanzar una concentración de plasma de >400 ng/ml aunque 300 ng/ml o más puede utilizarse también. Un rango de dosis preferido puede estar entre 1 mg/kg a 30 mg/kg, más preferiblemente en humanos el rango de dosis puede estar entre 5 y 15 mg/kg/día. Tal dosis diaria puede administrarse dividiendo la dosis en dos, tres, cuatro o más fracciones de la dosis completa, que se administraría a intervalos espaciados durante el día. Alternativamente, la dosis puede administrarse como una sola dosis . Los medicamentos de la invención pueden comprender además un análogo nucleótido. En aquellas modalidades en donde el análogo es azatioprina, el rango de dosis de este agente puede ser 1 mg/kg/día a 10 mg/kg/día administrado diariamente o cada tercer día.

Breve Descripción de los Dibujos FIGURA 1. Se muestra un diagrama de régimen de tolerancia. El ejemplo común para el régimen de tolerancia requiere únicamente el tratamiento de CsA+Aza (con dosis de CsA a 24 mg/kg/día) junto con infusiones de tolerágeno en el horario mostrado. Los tratamientos adicionales indicados tal como inyección intratímica y anticuerpos monoclonales se muestran como ejemplos de tratamientos que no trabajaron o no contaron para inducción de tolerancia. Estos regímenes no efectivos se incluyen en los ejemplos para proporcionar contraste con la respuesta de aquellos caninos óptimamente tolerizados al antígeno por la invención. Para el régimen de tolerancia común, los caninos recibieron diariamente CsA (25 mg/kg/día) más cada tercer día Aza desde el día 0 hasta el día 18 como se muestra en la línea de tiempo en la parte inferior de la figura. Las infusiones de enzima iduronidasa se iniciaron el día 18 como se indica por las flechas ascendentes arriba de la línea de tiempo. Los caninos entonces recibieron semanalmente infusiones de tolerágeno a 0.056 mg/kg/semana . En intervalos de 2 semanas más adelante, la dosis de CsA+Aza se dividieron en dos, y finalmente se dividieron en cuadro a partir de la dosis inicial en el segmento de 2 semanas final. Los fármacos CsA+Aza se terminaron entonces después de un total de 60 días y las infusiones de tolerágeno continuaron en una base semanalmente . Para regímenes que no inducen tolerancia, los caninos recibieron inyección intratímica o anticuerpos monoclonales y dosis de 25 mg/kg de CsA y 5 mg/kg de Aza en días alternos (es decir, cada fármaco en cada tercer día) . En el día 4, los caninos recibieron inyección intratímica, si se programó. En el diagrama de protocolo superior para IT+fármacos, el canino recibió CsA+Aza durante 0-4 días, y luego recibió una inyección intratímica (IT Iny. O ITI). Si los anticuerpos monoclonales se indican, estos se dan en los días antes de la inyección IT. La dosis exacta realizada depende del experimento. La dosis de CsA y Aza administrada en los días alternos se dividió en dos en el día 18, el primer día en que el canino se implantó. Los caninos comenzaron a recibir 0.56 mg/kg de enzima en una base semanal. Durante las 2 semanas subsecuentes, los caninos recibieron CsA y Aza en la 1/2 de la dosis inicial en los días alternos. Después de esto, la dosis del fármaco se dividió en dos nuevamente a 1/4 de la inicial y después de unas 2 semanas adicionales, esta se dividió nuevamente a 1/8 de la dosis inicial. Después de 2 semanas, 1/8 de la dosis inicial, los fármacos se terminaron y el canino continuó recibiendo semanalmente infusiones de enzima. FIGURA 2. La inducción de tolerancia con CsA diariamente y cada tercer día Aza durante las infusiones de iduronidasa humana recombinante (rhIDU) . En la figura, el título del anticuerpo a iduronidasa de caninos 6 tolerantes (símbolos abiertos) y 11 no tolerancias (símbolos cerrados) se muestra como suero no diluido unidades OD/µ? como se mide por ELISA se planea contra la semana de infusión de enzimas. Comenzando 18 días antes de la infusión de la iduronidasa, los caninos recibieron un régimen de tolerancia como se describe en el ejemplo 1. Comenzando la semana 1, el canino se implantó con infusiones intravenosas semanalmente rh-Idu a 0.056 mg/kg/semana de iduronidasa. Los niveles de anticuerpo bajos (>20 para la iduronidasa ELISA) con prueba de iduronidasa continuo indica tolerancia en los perros que reciben el régimen de tolerancia óptimo y títulos que exceden 50 y hasta 500 indica una respuesta inmune activa. El régimen de fármaco CsA+Aza termina en la semana 7 de prueba de enzima y respuesta de anticuerpo bajo más allá de aquel punto que indica que la tolerancia no es dependiente de la supresión inmune continua. FIGURA 3. La inducción exitosa de tolerancia en perros MPS I iduronidasa deficientes y tolerancia a niveles terapéuticos elevados subsecuentes de enzima. Tres perros MPS I se tolerizaron utilizando el régimen de tolerancia y un perro MPS I sirvió como un control y no recibió el régimen de tolerancia. El título del anticuerpo a iduronidasa en los tres perros MPS I tolerantes (símbolos abiertos) y el perro MPS I 1 no tolerantes (símbolo cerrado) se muestra con suero no diluido unidades OD/µ? como se mide por ELISA planeado contra la semana de la prueba de enzima. Los caninos tolerantes recibieron el Régimen de Fármaco de Tolerancia como se describe en el ejemplo 2; el control no tolerante no recibió tratamiento de fármaco. Los niveles de anticuerpo bajos (<20 OD) con prueba de antígeno indican tolerancia. El régimen de fármaco de tolerización finaliza en la semana 7 de la prueba de enzima y los niveles de anticuerpo bajos más allá de ese punto es indicativo de tolerancia inducida. Los 4 caninos recibieron 0.056 mg/kg/semana de infusiones de iduronidasa intravenosa en las semanas 1-12.

Subsecuentemente, los perros recibieron un incremento paso a paso de dosis de iduronidasa durante 3 semanas a la dosis terapéutica de 0.500 mg/kg/semana en la semana 15 de la prueba de enzima. Los niveles de anticuerpo en caninos tolerantes permaneció <20 unidades OD en la semana 15 en comparación a los niveles de anticuerpo RU control de >500 unidades OD en la semana 15 en respuesta para incrementar la dosis de antígeno iduronidasa. En la semana 16, ningún canino RU no tolerante tuvo una seria reacción anafiláctica clínica durante la infusión y se terminó el tratamiento. Los caninos tolerantes no exhibieron anafilaxis durante las infusiones. FIGURA 4. La inducción exitosa de tolerancia a antígeno específica a rhGAA, una segunda enzima lisosomal que se desarrolla para tratar enfermedad de Pompe. El titulo del anticuerpo a rh-alfa-glucosidasa (rhGAA) para 1 canino tolerante (SC, símbolo abierto) y 1 canino no tolerante (ST, símbolo cerrado) se muestra como unidades OD/µ? de suero no diluido como se mide por ELISA contra la semana de prueba de enzima. El canino tolerante recibió el régimen de fármaco de tolerancia como se describe en el ejemplo 3. En la semana 1, el canino se toleriza con infusiones intravenosas semanales de rhGAA a 0.056 mg/kg/semana . La ciclosporina y azatioprina (CsA (diaria) +Aza) se continúa y luego la dosis se divide cada 2 semanas hasta que al canino se le retirar los fármacos en la semana 7 de prueba de enzima. El control no tolerante no recibió tratamiento de fármaco. El régimen de fármaco tolerizante finaliza en la semana 7 de la prueba de enzima y los niveles de anticuerpo bajos más allá de ese punto es indicativo de tolerancia inducida que se mantiene en la ausencia de supresión inmune continua. Los 2 caninos recibieron 0.056 mg/kg/semana de infusiones rhGAA intravenosas en las semanas 1-12. Los niveles de anticuerpo en el canino tolerante permanecieron <5 Unidades OD en el punto más elevado comparado a los niveles de anticuerpo control no tolerantes de >150 Unidades OD en el punto más elevado. El resultado confirma que el régimen de tolerancia puede tener éxito con otra enzima inmunogénica de absorción elevada con implicaciones terapéuticas. FIGURA 5. Los datos a partir de los 6 caninos no tolerantes se muestran comparados con un canino (JH) quien llega a ser tolerante. Los caninos no tolerantes tienen cantidades de sustancia ELISA que exceden 50 y en algunos casos exceden 200 OD ?/µ?/suero. En contraste, JH tuvo un título de anticuerpo de menos de 20 OD ?/µ?/suero a través de 18 semanas de infusiones de iduronidasa. JH se distinguió por los niveles de ciclosporina de más de 500 ng/ml en sangre, mientras que los otros caninos fueron menores de 400 ng/ml en sangre y con frecuencia menos de 200 ng/ml en sangre. FIGURA 6. La tolerancia a antígeno específica es duradera. La figura muestra el título del anticuerpo de caninos tolerizados (JO, RO) y no tolerizados (RU) con el tiempo. En el primer segmento, el título durante y después de la tolerización se muestra. RU tiene un título elevado, mientras que los otros caninos tienen un título bajo. Después de las aberturas en periodo de 5 semanas, 4.5 meses, 6 meses o 2.5 años, los caninos se volvieron a probar con iduronidasa. Los perros tolerantes (PE, RO) no mostraron respuesta inmune a la iduronidasa aún después de 5 semanas a 6 meses del hiato a partir de infusiones de tolerágeno. El canino RU no tolerante, mostró una respuesta a antígeno de >20 veces después de únicamente 2 dosis de pruebas de enzima después de un hiato de 4.5 meses. El canino JH tolerante original muestra una respuesta parcial después de 2.5 años de hiato. Los datos muestran un efecto duradero del estado tolerante inducido. FIGURA 7. El régimen de tolerancia evita la inducción de otros subtipos Ig, además de IgG. Las Figuras 7A y 7B muestran títulos de ELISA de perros control no tolerantes antes y después de 12 infusiones semanales con iduronidasa. Las Figuras 7C y 7D muestran titulación ELISA de perros control tolerantes antes y después de 12 infusiones semanales con iduronidasa. FIGURA 8. El régimen de tolerancia puede utilizarse para inducir tolerancia relativa o reducir titulación Ig con el régimen en caninos con respuesta inmune pre-existente . Se permitió nitro a hiato de 6 meses a partir de la exposición de antígeno. En la re-exposición a antígeno después de este periodo, la titulación de IgG inicialmente se elevó durante la administración del régimen de CsA+Aza a más de 100 en una respuesta anamnéstica y que cayó rápidamente por debajo de 20. La respuesta inmune se redujo por la reinducción de tolerancia utilizando el régimen de tolerización combinado. FIGURA 9. La confirmación que la porción de absorción elevada de iduronidasa (el grupo 6-fosfato de mañosa) se requiere para tolerancia inmune con iduronidasa. Para mostrar que una porción de absorción elevada M6P ayuda en la inducción de tolerancia al antígeno, la iduronidasa recombinante se desfosforiló por incubación con fosfatasa ácida unida a perlas. Se aplicó la iduronidasa desfosforilada con el régimen de tolerancia (CsA+Aza) a caninos. El estudio mostró que el canino tratado con desfosfo iduronidasa no se tolerizó a iduronidasa, por lo que se sugiere que la afinidad de absorción elevada (la porción de 6-fosfato de mañosa) es necesaria para tolerancia.

Descripción Detallada de las Modalidades Se induce tolerancia inmune a antígeno específica en un huésped mamífero por la administración de un tolerágeno en combinación con un régimen de inmunosupresión durante un periodo de tiempo suficiente para tolerizar el huésped. La inmunosupresión se logra por la administración de un agente i munosupresor de célula T. Los métodos pueden además comprender la administración de un agente anti -proli erativo . Los métodos incluyen opcionalmente un periodo de acondicionamiento precediendo la administración del tolerágeno, en donde el agente inmunosupresor se administra en la ausencia del tolerágeno. Después del régimen de tolerización, el huésped se retira de la inmunosupresión, pero es capaz de mantener tolerancia inmune específica a los epítopes inmunogénicos presentes en el tolerágeno. Las dosis de mantenimiento del tolerágeno pueden administrarse después que el régimen de tolerización se completa. En una modalidad de la invención, el huésped no se afectó inmunológicamente por el antígeno de interés, es decir, no existe una respuesta inmune de memoria o preexistente al antígeno. En otra modalidad de la invención el huésped se ha expuesto al antígeno. En el último caso, puede ser necesario extirpar las células del sistema inmune responsable por la respuesta inmune pre-existente . Los inventores han mostrado que el régimen de tolerancia de la presente invención puede ser utilizado para inducir tolerancia relativa o reducir la titulación de inmunoglóbulina en caninos con respuesta inmune pre -existente contra el antígeno dado. Los métodos son útiles en el establecimiento proactivo de tolerancia en donde una proteína u otro agente inmunogénico será administrado a un huésped no afectado. Por ejemplo, la administración de anticuerpos terapéuticos, de factores de crecimiento, enzimas y otros polipéptidos no presentes previamente en el huésped pueden dar lugar a una respuesta inmune significativa, que disminuye la efectividad del tratamiento. Por establecimiento proactivo de tolerancia, la efectividad a largo plazo de tal tratamiento se mejora. Los métodos de la invención también encuentran uso para establecer tolerancia antes del transplante; y en el tratamiento de enfermedades autoinmunes . En estudios ejemplares, los inventores demostraron que un método para reducir o evitar una respuesta inmune antígeno específica clínicamente significativa a a-L-iduronidasa humana recombinante (rhIDU) se utiliza para tratar mucopolisacaridosis canina I (MPS I). El método emplea un régimen de 30-60 días inicial de un agente inmunosupresor de célula T tal como ciclosporina A (CsA) y un agente antiproliferativo, tal como azatioprina (Aza) , combinado con infusiones intravenosas semanales de dosis bajas de rhIDU. La respuesta de IgG fuerte normal a infusiones semanales de rhIDU en caninos fue en gran medida reducida o evitada utilizando un régimen de 60 días de fármacos inmunosupresores , ciclosporina A (CsA) y azatioprina (Aza) , combinada con infusiones intravenosas semanales de dosis bajas de rhIDU. Más específicamente, utilizando el régimen, ocho caninos tuvieron una reducción de 20 veces en titulación de anticuerpo después de 12 infusiones semanales de rhIDU (6 semanas sin CsA+Aza) y las titulaciones bajas no se incrementaron con infusiones rhIDU adicionales hasta 6 meses y dosis de rhIDU terapéutica completa (los ocho caninos normales y MPS I tuvieron una titulación de anticuerpo promedio de 7.2 unidades OD/µ? de suero por ELISA en comparación a 149 unidades OD/µ? en ocho caninos control) . Los caninos toleraron dosis terapéuticas más elevadas de iduronidasa por hasta 6 meses sin un incremento en la titulación (promedio de 7.5 OD/µ? de suero, n=6) mientras que los caninos con respuesta inmune tuvieron además incrementos de 2-3 veces en titulación del anticuerpo (promedio de 369 OD/µ? suero, n=2) . El antisuero de los caninos con respuesta inmune inhibió la absorción celular de iduronidasa in vitro por >95% mientras que el antisuero de caninos sin respuesta no. Los datos sugieren que un simple protocolo puede evitar o reducir la respuesta inmune clínicamente significativa a terapia de reemplazo de enzima lisosomal, así como también reducir la respuesta inmune a otros antígenos clínicamente significativos . Los estudios demuestran que un factor clave que determina el éxito del régimen de tolerización fue un nivel de depresión de suero elevado de CsA o preferiblemente >400 ng/ml . Además, los estudios del antígeno tolerizante demostraron que las enzimas de mañosa 6-fosforilada (M6P) de alta afinidad (rhIDU, alfa-glucosidasa) pueden actuar como tolerágenos mientras que la ovalbúmina de proteína no fosforilada no podría. Los marcadores de M6P de afinidad elevada parecen esenciales ya que rhIDU desfosforilado no permitió la inducción del estado tolerante. Se propone un modelo en donde se induce la tolerancia bajo condiciones en donde toda la activación de la célula T se suprime por CsA+Aza, mientras las células que presentan antígeno no profesional e inmaduro (APC) son eficientemente cargadas con antígeno a través del receptor M6P e inactivan las células T sensibles a antígeno o activan células T regulatorias para inducir un estado tolerante en los caninos. Los métodos y composiciones para explotar estos descubrimientos se discuten en detalle adicional en la presente más adelante.

Definiciones Antes que se describan los presentes métodos, se entenderá que esta invención no se limita a métodos particulares descritos, como tales pueden, por supuesto, variar. Se entenderá también que la terminología utilizada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares únicamente, y no se pretende para limitar, ya que el alcance de la presente invención se limitará únicamente por las reivindicaciones anexas. En donde un rango de valores se proporciona, se entiende que cada valor de intervención, a la décima de la unidad del límite inferior a menos que el contexto claramente lo estipule de otra manera, entre el límite superior y el inferior de ese rango y cualquier otro estado o valor de intervención en ese rango establecido se abarca dentro de la invención. Los límites superiores e inferiores de estos rangos más pequeños pueden independientemente incluirse en los rangos más pequeños, sujetos a cualquier límite excluido específicamente en el rango establecido. A menos que se defina de otra manera, todos los térmicos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por alguien de experiencia ordinaria en la técnica a la cual esta invención pertenece. Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente pueden también utilizarse en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen ahora. Todas las publicaciones mencionadas en la presente se incorporan en la presente para referencia para describir y divulgar los métodos y/o materiales junto con los cuales las publicaciones se citan. Se debe observar que como se utiliza en la presente, y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un" , "una" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto lo estipule de otra manera claramente. Las publicaciones discutidas en la presente se proporcionan únicamente para su descripción antes de la fecha de catalogación de la presente solicitud. Nada en la presente es para interpretarse como una admisión que la presente invención no se titula para preceder tal publicación en virtud de la invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación actuales, que pueden necesitar ser independientemente confirmadas. Antígeno. Como se utiliza en la presente, el término antígeno se pretende para referirse a una molécula capaz de producir una respuesta inmune en un huésped mamífero, particularmente una respuesta inmune humoral, es decir, caracterizada por la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Los antígenos de interés son agentes terapéuticos, por ejemplo, polipéptidos y fragmentos de los mismos; autoantígenos , por ejemplo, auto-polipéptidos ; antígenos de transplante; y similares. En respuesta a los antígenos, los anticuerpos se producen en una variedad de clases, subclases e isotipos. La porción del antígeno unido por el anticuerpo se refiere como un epítope. Los antígenos, antígenos de complejo particular tales como polipéptidos , usualmente comprenden epítopes múltiples. Cuando el antígeno es una proteína, los epítopes lineales varían de aproximadamente 5 a 20 aminoácidos de longitud. Los anticuerpos pueden también reconocer las determinantes conformacionales formadas por residuos no contiguos o un antígeno, y un epítope puede por lo tanto requerir un fragmento grande del antígeno que va a presentarse para la unión, por ejemplo, un dominio de proteína, o subsecuentemente todo de una secuencia de la proteína. Se apreciará por lo tanto que una proteína terapéutica, que puede ser de varios cientos de aminoácidos de longitud, puede comprender un número de distintos epítope . El nivel de afinidad de la unión del anticuerpo que se considera que es "específico" se determinará en parte por la clase de anticuerpo, por ejemplo, anticuerpos específicos de antígeno de la clase IgM puede tener una afinidad más baja que los anticuerpos de, por ejemplo, las clases IgG. Como se utiliza en la presente, para considerar una interacción del anticuerpo que es "específico", la afinidad será al menos aproximadamente 10"7 M, de manera usual aproximadamente 10"8 M a 10"9 M, y puede ser de hasta 10"11 M o más elevado para el epítope de interés. Se entenderá por aquellos expertos en la técnica que el término "especificidad" se refiere a unión de afinidad elevada, y no se pretende para querer decir que el anticuerpo no puede unirse a otras moléculas también, o que alguna reactividad cruzada menor a un epítope puede no estar presente en el huésped. Tolerancia inmune a antígeno específica. Para los propósitos de la presente invención, la tolerancia es la ausencia de una respuesta inmune a un antígeno específico en el establecimiento de un sistema inmune de otra manera sustancialmente normal. La tolerancia es distinta a partir de la inmunosupresión generalizada, en donde todo o toda una clase tal como las respuestas inmunes mediadas de la célula B, de las respuestas inmunes se disminuyen. La tolerancia inmune a antígeno específica terapéutica proporciona un estado específico en un huésped, en donde una molécula terapéutica de interés, por ejemplo una proteína terapéutica, puede administrarse múltiples veces en la dosis efectiva normal. Cuando tal tolerancia a antígeno específica se ausenta, la administración sucesiva de una dosis normal del agente terapéutico conduce a eficacia disminuida, debido a la interferencia del anticuerpo con el agente terapéutico, y por lo tanto la cantidad del agente requerido para una dosis efectiva se incrementará. Cuando se logra la tolerancia inmune a antígeno específica de acuerdo a los métodos de la presente invención, la cantidad requerida para una dosis efectiva - de un agente terapéutico se incrementará por no más de aproximadamente cinco veces después de la administración sucesiva, usual ente por no más de aproximadamente 2.5 veces después de la administración sucesiva, y puede no incrementarse sobre la dosis inicial. Alternativamente o en combinación con el beneficio de eficacia descrito anteriormente, el estado de tolerancia inmune proporciona un incremento en la seguridad de la proteína terapéutica u otra administración de fármaco. Las respuestas inmunes a los fármacos pueden provocar anafilaxis o anaf ilactoide o reacciones del compuesto inmune basadas en la producción de anticuerpos específicos cuando la tolerancia está ausente. La disminución o ausencia de la respuesta inmune observada en la presencia de tolerancia de acuerdo a los métodos de la presente invención, disminuirá también y limitará la seguridad disminuida de administración de tales fármacos debido a un anticuerpo disminuido que media acontecimientos adversos. Cuando el antígeno de interés es un auto-antígeno, la inducción de tolerancia inmune a antígeno específica será suficiente para disminuir los síntomas de la enfermedad autoinmune en el paciente, por ejemplo, un paciente puede mejorarse suficientemente de manera que mantiene actividades normales en la ausencia, o en la presencia de cantidades reducidas, de inmunosupresores generales, por ejemplo, corticósteroides . Cuando el antígeno de interés es uno o más antígenos de transplante, la inducción de la tolerancia inmune específica del antígeno permite al órgano transplantado sobrevivir y funcionar en el huésped receptor en la ausencia, o en la presencia de cantidades reducidas, de inmunosupresores generales. Un método alternativo para determinar tolerancia inmune a antígeno específica es observar la presencia de anticuerpos específicos de antígeno en el suero del animal huésped después de la administración sucesiva del agente terapéutico. En un huésped no tolerante, la titulación de anticuerpos específicos para un antígeno, por ejemplo, un agente terapéutico, auto-antígeno , antígeno de transplante, etc., se incrementará por muchas órdenes de magnitud en administración sucesiva o exposición. Por ejemplo, se muestra en la presente que las titulaciones del anticuerpo específico pueden ascender a más de aproximadamente 50 veces después de aproximadamente 8 semanas de administración sucesiva de una proteína terapéutica, con frecuencia más de 100 veces, y con el tiempo puede incrementarse tanto como 100 veces o m s. En un huésped tolerante, la elevación en la titulación del anticuerpo específico no será más de 10% del incremento para un huésped no tolerante correspondiente, y puede ser no más de aproximadamente 5% del incremento. Por ejemplo, un incremento de menos de 50 veces en la titulación del anticuerpo específico puede observarse durante un periodo de aproximadamente 8 semanas, a varios meses. El nivel específico de incremento observado contra un agente particular varía dependiendo de la naturaleza del agente, antes de la exposición del huésped al agente, el modo en el cual el agente de administra, el método por el cual la respuesta se mide y similares. Los métodos bien conocidos en la técnica para determinar la presencia de un anticuerpo específico en suero del paciente, por ejemplo, RIA, ELISA, etc., y no necesita elaborarse aquí. Otro aspecto de tolerancia es la presencia de un sistema inmune de otra manera sustancialmente normal . Los métodos de la presente invención no se dirigen a una inmunosupresión general, y después del régimen de tolerización la respuesta inmune a antígenos diferentes del antígeno de interés son sustancialmente normales, usualmente reducidos por no más de aproximadamente cinco veces cuando se compara con un control sin tratar, más usualmente reducido por no más de aproximadamente dos veces cuando se compara con un control sin tratar, y puede ser indistinguible de una respuesta normal . Especies de mamíferos que pueden beneficiarse de los métodos de la invención incluyen caninos; felinos; equinos; bovinos; ovinos, etc., y primates, particularmente seres humanos. Los modelos animales, particularmente pequeños mamíferos, por ejemplo, murinos, lagomorpha, etc., pueden utilizarse para investigaciones experimentales. Los modelos animales de interés incluyen aquellos para modelos de administración de proteína terapéutica, autoinmunidad, rechazo de injerto, y similares. Tolerágeno que comprende una porción de absorción elevada: El tolerágeno es la forma del antígeno de interés que se administra al huésped durante el régimen de tolerización, y comprenderá sustancialmente todos los epítopes presentes en el antígeno, cuyos epítopes pueden proporcionarse como uno o un cóctel de agentes. En algunos casos, el tolerágeno y el antígeno serán idénticos, pero estos pueden también diferenciarse en la presencia de modificaciones, ormulaciones y similares. Los toleragenos se administran en una forma soluble, es decir, sustancialmente libre de agregados, y en una forma acelular, mientras que el antígeno de interés puede no ser soluble. Los toleragenos pueden también comprender portadores para mejorar la interacción con el sistema inmune, pueden comprender múltiples fragmentos derivados del antígeno de interés; pueden conjugarse a grupos que incrementan la toleragenicidad, pueden ser proteínas de fusión que comprenden porciones de polipéptido de interés, y similares. Los toleragenos comprenden ya sea o se conjugan covalentemente a una porción de absorción elevada. Las porciones de absorción elevadas son polipéptidos que se reconocen ampliamente e internalizan por receptores presentados en células de presentación de antígeno no profesionales. Preferiblemente, se elige un receptor el cual se expresa ampliamente en células periféricas y centrales que se tolerizan cuando presentan un antígeno, y que no se expresan exclusivamente en macrófagos, células dendríticas u otras células de presentación de antígeno profesionales. Las células que tolerizan cuando se presentan antígenos incluyen, por ejemplo, células endoteliales sinusoidales del hígado, células del epitelio tímico cortical/medular, y tipos de células similares. Se prefiere especialmente que el receptor tenga una Kabsorción para el ligando de al menos 10"6 M, usualmente al menos aproximadamente 10 "7 M más usualmente al menos aproximadamente 10~8 M y preferiblemente al menos aproximadamente 10"9 M en donde Kabsorción representa la titulación de ligando en donde la absorción máxima media ocurre en una célula. Los receptores de interés incluyen el receptor de transíerrina , el receptor de melanotransferrina, el receptor de 6-fosfato de mañosa, receptor de hormona de crecimiento, y similares. Los ligandos semejantes incluyen: factor II de crecimiento similar a insulina (IGF2) , transferrina , hormona de crecimiento, insulina, y fragmentos de unión del mismos, particularmente polipéptidos que tienen receptores de afinidad específica y elevada en diversos tipos celulares. Los anticuerpos de una sola cadena y agentes de unión a partir de sistemas de despliegue de fago aleatorizado podría utilizarse si tienen afinidad adecuada para el receptor. Para determinar la Kabsorción de una combinación del ligando y receptor, los métodos conocidos en la técnica pueden utilizarse, por ejemplo véase Kakkis et al. (1994) Protein Expr Purif 5(3):225-32 para ensayos utilizados para determinar la KabsorCión de alfa-L- iduronidasa . Los métodos descritos se adaptan fácilmente a cualquier combinación de ligando y receptor. Tales ensayos son también útiles para supervisar la absorción de toleragenos que comprenden porciones de absorción elevadas exógenas . Cuando el antígeno es un polipéptido ocupado por tales receptores, el antígeno y el tolerágeno pueden ser idénticos. Cuando el antígeno de interés es un polipéptido que no se ocupa por células de presentación de antígeno no profesionales, el tolerágeno puede ser una forma modificada del antígeno, por ejemplo, puede ser un conjugado del antígeno y una porción de absorción elevada (ligando) , tal como 6-fosfato de mañosa, transferrina , etc. Alternativamente, el tolerágeno puede ser una forma modificada del polipéptido antigénico, que comprende cambios de aminoácido, por ejemplo, sustituciones, eliminaciones, adiciones, y similares, que proporcionan el polipéptido con secuencias para absorción elevada. Por ejemplo, los motivos de glicosilación pueden agregarse o alterarse, para proporcionar modificaciones post-translacionales, por ejemplo un motivo para la adición de 6-fosfato de mañosa (véase Cantor et al. (1992) J. Biol . Chem 267 (32 ) : 23349 - 56 ) : En una modalidad de la invención el tolerágeno es una proteína de fusión que comprende (a) todo o una parte del antígeno de interés y (b) un fragmento de una proteína que tiene una porción de absorción elevada, en donde el fragmento es suficiente para conferir las propiedades de absorción elevadas. Por ejemplo, un fragmento de a-L-iduronidasa que comprende los motivos necesarios para glicosilación post-translacional y además del 6-fosfato de mañosa pueden combinarse a un antígeno de interés. Los métodos para conjugar grupos químicos a un polipéptido se conocen bien en la técnica. Los grupos químicos que encuentran uso en unión incluyen carbamato; amida (amida más ácido carboxilico) ; éster (alcohol más ácido carboxilico) ; tioéter (haloalcano más sulfhidrilo; maleimida más sulfhidrilo) , base de Schiff (amina más aldehido) , urea (amina más isocianato) , tiourea (amina más isotiocianato) , sulfonamida (amina más cloruro de sulfonilo) , disulfuro; hidrazona, lípidos y similares, como se conoce en la técnica. Las uniones de éster y disulfuro se prefieren si la unión va a degradarse fácilmente en el citosol después del transporte de la sustancia. Entidades ilustrativas incluyen: azidobenzoil hidracida, N- [4 - (p-azidosalicilamino) bu il] - 3 ' -[2 ' -piridilditio] propionamida) , suberato de bis-sulfosuccinimidilo , dimetiladipimidato, disuccinimidiltar-trato, éster de ?-?-maleimidobutiriloxisuccinimida , sulfosuccinimidil -4 -azidobenzoato de N-hidroxi, [4-azidofenil] - 1 , 3 ' -ditiopropionato de N-succinimidilo, [4-yodoacetil] aminobenzoato de N-succinimidilo, glutaraldehído, NHS-PEG-MAL ; 4 - [N-maleimidometil] ciclohexan- 1 -carboxilato de succinimidilo ; N-hidroxisuccinimida éster del ácido 3- (2-piridiltio) ropiónico (SPDP) ; ?,?' - (1 , 3-fenilen) bismaleimida ; N, N' -etilen-bis- (yodoacetamida) ; o N-hidroxisuccinimida éster del ácido 4- (N-maleimidometil) -ciclohexan-1-carboxílico (S CC) ; m-maleimidobenzoil -N-hidroxisuccinimida éster (MBS) , y 4 - (p-maleimidofenil ) butirato de succinimida (SMPB) , un análogo de cadena extendida de MBS. El grupo succinimidilo de estos reticuladores reacciona con una amina primaria, y la tiol -maleimida reactiva forma una unión covalente con el tiol de un residuo cisteína.

Agentes Supresores Agente ínmunosupresor de célula T. Los agentes inmunosupresores de célula T son compuestos que inhiben la actividad de células T, particularmente células auxiliadoras T, usualmente sin supresión general de la proliferación y activación de otras células, tales como células B, monocitos, células progenitoras hematopoyéticas de médula espinal, etc. Los métodos para evaluar la inmunosupresión de la célula T son bien conocidos en la técnica, incluyen ensayos in vi tro tales como liberación de IL-2 por células auxiliadoras T en la presencia del antigeno, incorporación de 3H timidina en ADN en la presencia del antígeno o un estimulante tal como Con A, liberación de 51Cr en la presencia de células estimuladoras alogeneicas, etc. Ensayos in vivo pueden basarse en la medición de la proliferación de células T, la liberación de citocinas, incapacidad para rechazar un injerto mientras que se suprime activamente, y similares. Un grupo de compuestos de interés particular para estos propósitos son las inmunofilinas , también referidas como inhibidores de calcineurina, que inhiben las células auxiliadoras T. La calcineurina es fosfatasa 2B de proteína S/T dependiente de Ca2+/calmodulina , que se ha reportado que es importante en la trayectoria de señal de calcio. Esta encima es un eterodímero de una subunidad catalítica que une calmodeulina 61 kDa (calcineurina A) y una subunidad reguladora pequeña (19 kDa) (calcineurina B) . Los fármacos i munosupresores , ciclosporina A, rapamicina, FK506, etc., inhiben calcineurina, que es necesaria para la importancia nuclear de NF-AT (factor nuclear de células T activadas) . La dosis del agente inmunosupresor de célula T para el propósito de tolerización puede ser más elevada que aquella normalmente utilizada para inmunosupresión general, como se discutirá en detalle posteriormente. Las inmunofilinas pueden administrarse en una manera como se practica convencionalmente . Véase, por ejemplo, Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therpeutics, 7th Ed, 1985, p. 1299. Por ejemplo, CSA puede proporcionarse como una solución oral de 100 mg/kg con 12.5% de alcohol, y para administración intravenosa como una solución de 50 mg/ml con 33% de alcohol y 650 mg de aceite de ricino pol ioxietilado . Cuando se administra intravenosamente, CSA puede ser dado como una solución diluida de 50 mg a 20-100 mg de solución salina normal o 5% de dextrosa en agua, por infusión lenta durante un periodo de varias horas. La dosis intravenosa es normalmente un tercio de la dosis oral. Más preferiblemente, la administración de CSA es oralmente, ya sea en forma de cápsula o tableta. Tales formulaciones pueden prepararse por cualquier método adecuado de farmacia que incluye la etapa de traer en asociación el compuesto activo y un portador adecuado (que puede contener uno o más ingredientes accesorios). En general, las formulaciones pueden prepararse mezclando uniforme e íntimamente el compuesto activo con un líquido o portador sólido finamente dividido, o ambos, y luego, si es necesario, conformar la "mezcla resultante. La preparación de CSA se describe en la Patente Norteamericana No. 4,117,118. CSA que puede ser utilizado en la práctica de la invención está comercialmente disponible bajo el nombre de SANDIMMUNE® de Sandoz Pharmaceuticals Corporation. FK506, también conocido como tacrolimus, está comercialmente disponible bajo el nombre comercial PROGRAF® de Fujisawa Healthcare. La rapamicina, también conocida como sirolimus está comercialmente disponible bajo el nombre comercial RAPAMUNE® de Wyeth-Ayerst Pharmaceuticals Inc. Agente antiproliferativo. Los agentes antiproliferativos, para los propósitos de los métodos de la presente invención, son compuestos farmacéuticamente activos que reducen la proliferación celular. Como las células del sistema inmune se dividen activamente con frecuencia, incluso agentes anti -proliferativos generales frecuentemente tienen un efecto inmunosupresor . Muchos de tales fármacos anti- proliferativos se conocen en la técnica, por ejemplo como se utiliza en quimioterapia. Los fármacos de interés anti-proliferativos incluyen antimetabolitos , por ejemplo, análogos nucleótidos tales como azatioprina, 6-mercaptopurina, tioguanina, citarabina, etc.; otros análogos, tales como metotrexato, ácido micofenólico , o ácido 6- (1 , 3-Dihidro-4-hidroxi-6-metoxi - 7 -meti1 - 3 -oxi - 5 - isobenzofuraní1 ) -4 -met 1 -4 -hexanoico , y similares. Aunque menos preferidos, los agentes de alquilación tales como ciclofosfamida, clorambucilo , etc., pueden también encontrar uso como antiproliferativos inmunosupresores , por ejemplo, cuando existe una respuesta inmune pre-existente al antígeno de interés. En una modalidad de la invención, el agente antiproliferativo es azatioprina (AZA) o 6-mercaptopurina (6-MP) . Como se utiliza en la presente, el término "fármaco 6-mercaptopurina" o "fármaco 6-MP" se refiere a cualquier fármaco que puede metabol izarse a un metabolito 6-mercaptopurina activo que tiene eficacia terapéutica. Los fármacos 6-mercaptopurina ejemplares como se define en la presente incluyen 6-mercaptopurina (6-MP) y azatioprina (AZA) . Otros fármacos 6-MP incluyen, por ejemplo, 6-metilmercaptopurina ribosida y 6-TG. 6-TG es un fármaco 6-MP particularmente útil en pacientes que tienen actividad de TPMT elevada. Los pacientes que exhiben actividad de TPMT elevada se espera que conviertan más fácilmente los fármacos 6-MP tal como 6-MP y AZA a 6-MMP. Como se utiliza en la presente, el término "6 -tioguanina" o "6-TG" se refiere a 6-tioguanina o análogos de la misma, incluyendo moléculas que tienen la misma estructura base, por ejemplo, ribonucleosido 6 - tioguanina , mono-, di- y trifosfato de ribonucleotido 6-tioguanina, desoxiribonucleosido de 6-tioguanina y mono-, di y trifosfato de desoxiribonucleotido 6-tioguanina. El término "6-TG" también incluye derivados de 6-tioguanina que incluye modificaciones químicas de 6-TG, siempre y cuando la estructura de la base de 6-TG se conserve. Como se utiliza en la presente, el término "6 -metil-mercaptopurina" o "6-MMP" se refiere a 6 -metil -mercaptopurina o análogos de la misma, incluyendo análogos que tienen la misma estructura base, por ejemplo, ribonucleosido de 6-metil-mercaptopurina, mono- di-y tri-fosfato de ribonucleotido 6-metil-mercpatopurina, desoxiribonucleosido de 6-metil-mercaptopurina, mono-, di- y tri-fosfato de desoxiribonucleotido 6-metil-mercaptopurina. El término "6-MMP" también incluye derivados de 6-metil-mercpatopurina, incluyendo modificaciones químicas de 6-MMP, siempre y cuando la estructura de la base de 6-MMP se conserve . Los fármacos 6-MP pueden suministrarse como una suspensión, solución o emulsión en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener tales agentes formularios tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Los vehículos acuosos adecuados incluyen solución salina fisiológica, solución salina regulada con fosfato, y otros vehículos para suministro de fármaco parenteral, genéricamente referidos como "soluciones intravenosas" . Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo, obtenida por aislamiento aséptico de sólido estéril o liofilizado a partir de solución, con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua libre de pirógeno, estéril, antes del uso.

Métodos de la Invención Se induce la tolerancia inmune a antígeno específica en un huésped mamífero administrando al mismo tiempo un tolerágeno y un agente inmunosupresor de célula T, el cual puede combinarse además con la administración de un agente antiproliferati o, como se describe anteriormente. Estos agentes pueden formularse en forma separada o juntos, usualmente en forma separada. Los agentes son tales que se administran al mismo tiempo cuando se introducen en el huésped simultáneamente a la vez o en diferentes tiempos durante el curso de un horario de tratamiento común. En el último caso, los compuestos se administran suficientemente cercanos en tiempo para lograr el efecto deseado. Normalmente, si un agente se administra aproximadamente dentro de la vida media in vivo del otro agente, los dos agentes se consideran que se administran al mismo tiempo. Cualquier agente activo debe presentarse en el paciente en suficientes niveles combinados para ser terapéuticamente efectivo . El régimen de tolerización se precede opcionalmente por un periodo de acondicionamiento, en donde durante el periodo de acondicionamiento el agente o agentes supresores se administran en la ausencia del tolerágeno durante un periodo de aproximadamente 1 a 3 semanas. El periodo de tiempo para el acondicionamiento será suficiente para suprimir las respuestas de célula T en el huésped antes de la administración del tolerágeno. El periodo de tiempo para acondicionamiento puede variar dependiendo del huésped, los agentes^ supresores, etc. El periodo de tiempo puede determinarse empíricamente, u obtenerse de fuentes publicadas. El régimen de tolerización requiere que el agente inmunosupresor de célula T se mantenga durante un periodo de tiempo suficiente para inducir tolerancia inmune. Usualmente, el agente inmunosupresor de célula T se administrará al huésped por al menos aproximadamente 3 semanas, usualmente al menos aproximadamente 5 semanas, y pueden ser al menos aproximadamente 8 semanas o más. El fármaco antiproliferativo se administra también durante este periodo de tiempo, en un horario apropiado al fármaco, usualmente al menos cada tercer día, diariamente, dos veces por día o más. Mientras que el régimen de tolerización puede continuarse por periodos más largos de tiempo, es deseable usualmente minimizar el periodo de tiempo en el cual el paciente se trata con los agentes supresores . Un aspecto importante de la invención es mantener una dosis elevada del agente inmunosupresor de célula T durante las etapas iniciales del procedimiento de tolerización . - En farmacocinéticas , se observa que la concentración de un fármaco en la corriente sanguínea alcanza un "pico" después de la administración, y luego los niveles sanguíneos caen al punto más bajo o "depresión" , antes de la administración de la siguiente dosis. En los métodos de la presente invención, es importante mantener niveles terapéuticos del agente inmunosupresor de la célula T durante este periodo de tiempo, de manera que los niveles de "depresión" no caen a niveles no supresores. Esto puede empíricamente determinarse midiendo periódicamente la concentración del fármaco en la corriente sanguínea para determinar los valores de depresión para un protocolo de administración dado. El nivel de inmunosupresión para una concentración dada de fármaco puede determinarse empíricamente, como se discute previamente, u obtenerse a partir de valores publicados. La concentración del fármaco será suficiente para evitar la iniciación in vivo o mantenimiento de una respuesta inmune mediada por la célula T. Incrementar los niveles de depresión para mantener los niveles supresores del fármaco puede lograrse administrando dosis más elevadas del fármaco, o administrando una dosis estándar más frecuentemente. Por ejemplo, en humanos, con ciclosporina A, es deseable tener una depresión en el nivel sanguíneo de no menos de aproximadamente 200 ng/ml, usualmente no menos de aproximadamente 300 ng/ml, y puede ser de aproximadamente 500 ng/ml o más elevado. Los niveles que se conoce que inducen tolerancia en las especies caninas son aproximadamente 400 ng/ml en la depresión, sin embargo el nivel apropiado en otras especies tomará en cuenta la sensibilidad del huésped al inmunosupresor que se administra. En particular, los seres humanos pueden ser más sensibles a los efectos de ciclosporina que los caninos. Los rangos de dosis para seres humanos pueden ser más bajos que para caninos debido a la velocidad de disminución del metabolismo en general en seres humanos en relación a los caninos. Se espera que la dosis humana pueda ser aproximadamente una mitad de la dosis canina (aproximadamente 10 mg/kg/día a aproximadamente 15 mg/kg/día) en base a la diferencia en índices metabólicos para lograr los mismos niveles de plasma o el mismo grado de efecto fisiológico. Los niveles requeridos pueden ser comparables a aquellos utilizados en de novo renal u otros transplantes (aproximadamente 8 +/-3 mg/kg/día) en donde el nivel de depresión de aproximadamente 350 +/- 150 ng/ml se logró, Physicians Desk Reference, ed. 56 publicada por Medical Economics Co . , Montvale, NJ, p 2381). Por ejemplo, la dosis inicial del agente inmunosupresor de la célula T puede estar en una dosis equivalente a al menos aproximadamente 125% de la dosis estándar para inmunosupresión, al menos aproximadamente 150% de la dosis estándar, o 200% de la dosis estándar, o más. En otras modalidades, la dosis puede ser la dosis convencional, administrada más frecuentemente, por ejemplo dos veces diariamente en lugar de diariamente, etc. Una dosis convencional para tacrolimus oral es 0.2 mg/kg/día. Una dosis convencional para sirolimus es 2 mg/kg/día. Se apreciará por alguien con experiencia en la técnica que la dosis estándar variará dependiendo del fármaco específico, en el método de administración, es decir, oral, intravenosa, etc., y en el huésped . En el final del periodo de dosis elevado, la dosis del agente inmunosupresor de la célula T se ahusará hasta el final del régimen de tolerización, a cuyo punto será descontinuado. Cualquier protocolo conveniente puede utilizarse, por ejemplo dividiendo en dos la dosis cada semana o dos semanas . La dosis elevada se mantendrá durante un periodo de tiempo suficiente para permitir al tolerágeno tomarse por células tolerizantes , procesarse y presentarse en la superficie celular, y para las células T que interactúan con tales células tolerizantes, usualmente durante al menos aproximadamente 2 semanas, más usualmente al menos aproximadamente 3 semanas, y puede ser durante 4 semanas o más. El nivel de dosis e intervalo de tiempo pueden determinarse para ser suficientes para medir la titulación de anticuerpo utilizando un método tal como ELISA para evaluar el suero o plasma del huésped en las semanas 6 a 8 en el régimen. Los huéspedes que no son tolerantes tendrán montada una respuesta inmune por casi el final del ahusamiento de los fármacos inmunosupresores . El periodo de tiempo para el cual la dosis elevada es necesaria puede incluir el periodo de acondicionamiento, de manera que si existe un periodo de acondicionamiento de dos semanas, entonces la dosis elevada puede ahusarse brevemente después de la iniciación del régimen de tolerización. Cuando un agente antiproliferativo se incluye en el régimen, éste se administrará en una dosis convencional mientras que el agente inmunosupresor de célula T se administra, usualmente por al menos aproximadamente dos semanas, más usualmente al menos aproximadamente 3 semanas, y puede ser durante 4 semanas o más. Por ejemplo, la dosis estándar de azatioprina es de aproximadamente 1 a 5 mg/kg/día, en donde el final superior de aproximadamente 3 a 5 mg/kg/día se utiliza inicialmente , y el rango inferior, de aproximadamente 1 a 3 mg/kg/día se da después del establecimiento del régimen. El agente anti-proliferativo puede también darse cada semana. Como se describe anteriormente para el agente inmunosupresor de célula T, el periodo de tiempo para el cual la dosis inicial es necesaria puede incluir el periodo de acondicionamiento, de manera que si existe un periodo de acondicionamiento de dos semanas, entonces la dosis elevada puede ahusarse brevemente después de la iniciación del régimen de tolerización. Usualmente, es preferible ahusar la dosis, sobre el régimen de tolerización, por cualquier protocolo conveniente. El tolerágeno se administra al menos 2 veces, usualmente al menos aproximadamente 4 veces, y puede administrarse 6 veces o más, durante el periodo de tolerización. El tolerágeno no se administrará durante el periodo de acondicionamiento, si existe. En contraste a los agentes supresores, el tolerágeno se administrará menos frecuentemente, por ejemplo después de aproximadamente 4 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 10 días, y similares. Es conveniente la administración semanalmente . La dosis de tolerágeno será generalmente más bajo que la dosis terapéutica del antígeno correspondiente, y puede variar tanto como la dosis terapéutica normal ¦ del antígeno tan poco como aproximadamente 5% de la dosis terapéutica, aproximadamente 10% de la dosis terapéutica, 50% de la dosis terapéutica, y similares. Cuando el tolerágeno es un polipéptido, se administrará a una dosis de al menos aproximadamente 0.005 mg/kg/semana, usualmente al menos aproximadamente 0.01 mg/kg/semana , más usualmente al menos aproximadamente 0.05 mg/kg/semana; y usualmente no más de aproximadamente 1 mg/kg/semana. Sin embargo, se apreciará que la dosis específica dependerá de la ruta de administración, actividad del agente, etc. La dosis del tolerágeno se eleva gradualmente para alcanzar la dosis terapéutica normal iniciando después de aproximadamente 3 semanas, usualmente después de aproximadamente 4 semanas, y puede ser después de aproximadamente 6 semanas u 8 semanas. Donde el tolerágeno y el antígeno no son idénticos, el paciente puede intercambiarse al antígeno después del régimen de tolerización cuyo cambio puede implicar administrar una mezcla de los dos durante un periodo de tiempo. El tolerágeno se administrará por cualquier ruta conveniente, usualmente intravenosa, en una forma soluble. Más particularmente, el tolerágeno puede formularse por combinación con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables apropiados, y puede formularse en preparaciones en formas sólida, semi-sólida, líquida o gaseosa, tales como tabletas, cápsulas, polvos, gránulos, ungüentos, soluciones, supositorios, inyecciones, inhaladores, geles, microesferas y aerosoles. Como tal, la administración de los compuestos puede lograrse en varias maneras, incluyendo administración oral, bucal, rectal, parenteral, intraperitoneal , intradérmica, transdérmica , intraqueal, etc. En las formas de dosis farmacéuticas, el tolerágeno puede -administrarse en la forma de sales farmacéuticamente aceptables. Éstas pueden utilizarse también en asociación apropiada con otros compuestos farmacéuticamente activos. Los siguientes métodos y excipientes son simplemente ejemplares y no son de ninguna manera limitantes. El tolerágeno puede formularse en preparaciones para inyecciones disolviendo, suspendiendo o emulsificándolas en un solvente acuoso o no acuoso, tal como aceites vegetales u otros similares, glicéridos del ácido alifático sintéticos, ésteres o ácidos alifáticos elevados o propilenglicol ; y si se desea, con aditivos convencionales tale como solubilizadores , agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsificantes , estabilizadores y conservadores. El término "forma de unidad de dosis" como se utiliza en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y animales, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuestos de la presente invención calculados en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado en asociación con un diluyente, portador o vehículo farmacéuticamente aceptable. Las especificaciones para las formas de unidad de dosis de la presente invención dependerán del compuesto particular empleado y el efecto para lograrse, y los farmacodinámicos asociados con cada compuesto en el huésped . Los excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como vehículos, adyuvantes, portadores o diluyentes, están fácilmente disponibles al público. Además, las sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de ajuste y regulación de pH, agentes de ajuste de tonicidad, estabilizadores, agentes humectantes y similares, están fácilmente disponibles al público. Los antígenos adecuados para los métodos de la invención incluyen un número de agentes terapéuticamente activos, particularmente polipéptidos, que pueden ser inmunológicamente activos, factores de crecimiento, hormonas, factores de coagulación, enzimas metabólicas, etc. Ejemplos de proteínas terapéuticas de interés incluyen factores de coagulación sanguínea, tales como Factor VIII; alfa-glucosidasa; iduronidasa, anticuerpos terapéuticos tales como herceptina; ADNasa; factor de crecimiento humano; insulina; y similares . Donde el antígeno de interés es un autoantígeno, o donde el huésped se ha previamente expuesto a un agente terapéutico, puede ser necesario extirpar algunos o todas las células inmunes maduras presentes en los pacientes. Tales métodos se conocen en la técnica, por ejemplo, o pueden utilizar un agente inmunosupresor fuerte, por ejemplo, ciclofosfamida, globulina antitimocito, irradiación corporal total (TBI) , etc. Los autoantígenos de interés para tolerización incluyen lo siguiente. El tolerágeno puede comprender uno o un cóctel de autoantígenos. Para esclerosis múltiple, la proteína de proteolípido (PLP) ; proteína básica de mielina (MBP) ; proteína de oligodendrocito de mielina (MOG) ; fosfodiesterasa nucleótida cíclica (CNPasa) ; glicoproteína asociada con mielina (MAG) y proteína básica oligodendrocítica asociada con mielina (MBOP) ; alfa-B-cristalina (una proteína de choque caliente) ; OSP (proteína específica de oligodendrocito) ; MBP modificado con citrulina (la isoforma C8 de MBP en donde 6 argininas se han desiminado a citrulina) , etc. Los autoantígenos en artritis reumatoide incluyen el colágeno del tipo II; hnRNP; A2/RA33; Sa; filagrina; keratina; citrulina; proteínas de cartílago incluyendo gp38; colágenos tipo I, III; IV, V, IX, XI; HSP-65/60; IgM (factor reumatoide); ARN polimerasa; hnRNP-B1 ; hnRNP-D; cardiolipina ; aldolasa A; filagrina y fibrina modificadas con citrulina. Los autoantígenos en diabetes mellitus dependiente de insulina humana incluyen tirosina fosfatasa IA-2; ??-2ß; descarboxilasa del ácido glutámico (GAD) ambas formas 65 kDa y 67 kDa; carboxipeptidasa H; insulina; proinsulina; proteínas de choque de calor (HSP) ; glima 38; antígeno de célula de isleta 68 kDa (ICA69) ; p52 ; dos antígenos gangliosida (GT3 y GM2-1) y un transportador de glucosa de célula de isleta (GLUT 2) . Los autoantígenos para miastenia gravis pueden incluir epítopes dentro del receptor acetilcolina. Los autoantígenos seleccionados en pemphigus vulgaris pueden incluir desmogleina- 3. Los antígenos del síndrome de Sjogren pueden incluir SSA (Ro) ; SSB (La); y fodrina. El autoantígeno dominante para pemphigus vulgaris puede incluir desmogleina-3. El rechazo inmune de transplantes de tejido, incluyendo pulmón, corazón, hígado, riñon, páncreas y otros órganos y tejidos, se media por respuestas inmunes en el receptor de transplante dirigido contra el órgano transplantado. Los órganos transplantados alogeneicos contienen proteínas con variaciones en sus secuencias aminoácido cuando se comparan a las secuencias aminoácido del receptor de transplante. Debido a que las secuencias de aminoácido del órgano transplantado difieren de aquellas del receptor de transplante frecuentemente producen una respuesta inmune en el receptor contra el órgano transplantado. El rechazo de órganos transplantados es una complicación mayor y limitación del transplante de tejido, y puede provocar falla del órgano transplantado en el receptor. La inflamación crónica que resulta del rechazo frecuentemente conduce a disfunción en el órgano transplantado. El tolerágeno para un receptor de transplante pretendido puede incluir uno o - más antígenos de histocompatibilidad mayor, por ejemplo, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP, etc., y puede comprender un cóctel de tales antígenos, en donde los antígenos incluirán aquellos no emparejados entre el receptor y el donador. Como aquellas son proteínas de superficie celular, la forma administrada puede ser una forma soluble, es decir, una que se trunca en el dominio de transmembrana. Aunque no se requiera, para mejorar la tolerancia después del cese de los agentes supresores, puede proporcionarse una dosis de mantenimiento del tolerágeno, en donde la dosis de mantenimiento se proporciona en una dosis equivalente a 0.056 mg/kg por semana o inferior en dosis, o de 1/10 de aquella dosis o inferior, o menos frecuencia como en una vez por mes o una vez cada pocos meses o menos, o ambas dosis y frecuencia. En casos en donde el tolerágeno es diferente a partir del antígeno, el tolerágeno se utilizará para fase de mantenimiento, si se requiere una fase de mantenimiento . El agente utilizado en los métodos de la invención puede proporcionarse en un equipo, cuyo equipo puede además incluir instrucciones para uso. Tal equipo comprenderá un tolerágeno, usualmente en una dosis y forma adecuada para administración al huésped. El equipo puede comprender además un agente inmunosupresor de célula T, en una forma adecuada para la administración, y puede además incluir evaluar reactivos para supervisar niveles sanguíneos del agente y/o para la determinación de supresión de la actividad de célula T. Un agente antiproliferativo puede también incluirse, en una forma adecuada para la administración. Puede también proporcionarse un equipo para la conjugación de un antígeno, particularmente un antígeno de polipéptido, a una porción de absorción elevada, para generar una composición toleragénica . Por ejemplo, una porción tal como un grupo 6- fosfato de mañosa, ya sea conjugado o un enlazador adecuado para unir azúcares y polipéptidos, como se describe anteriormente, puede proporcionarse. La porción de absorción elevada puede también proporcionarse en una forma no conjugada, en combinación con un enlazador adecuado, e instrucciones para uso.

Ejemplos Se publican los siguientes ejemplos para proporcionar a aquellos con experiencia ordinaria en la técnica con una descripción de cómo se realiza y usa la presente invención, y no se pretende limitar el alcance de lo que los inventores con respecto a su invención no se pretenden para representar que los experimentos siguientes son todos o únicamente experimentos realizados. Se han hechos esfuerzos para asegurar exactitud con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero algunos errores experimentales y desviaciones deben justificarse. A menos que se indique de otra manera, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio en peso, la temperatura es en grados centígrados, y la presión está o es casi atmosférica.

Experimental EJEMPLO 1 Inducción de tolerancia a a-L-iduronidasa humana en perros normales y MPS I Los mucopolisacáridos I es una condición genética provocada por mutaciones en el gen alfa-L- iduronidasa que conduce a una deficiencia en la iduronidasa enzimática. Esta deficiencia conduce a trastorno de almacenamiento lisosomal de multi-sistema progresivo que incluye características faciales toscas, lengua grande, vaso e hígado grande, problemas respiratorios, problemas cardiacos, rigidez de articulación y enfermedad ósea. La enfermedad conduce a muerte en pacientes usualmente en su primera o segunda década de vida. La iduronidasa enzimática deficiente es una hidrolasa lisosomal que desdobla el residuo iduronida terminal de sulfato de heparano y dermatano. La enzima puede hacerse en células recombinantes y se produce con un marcador de 6 -fosfato de mañosa en carbohidratos post-translacionalmente unidos, que es importante para su absorción en células. La terapia de reemplazo enzimático se ha propuesto como un método de tratamiento, en donde la forma recombinante de la enzima se administra intravenosamente, se distribuye a tejidos y se toma en células a través del receptor de 6-fosfato de mañosa. La terapia se ha estudiado en perros y más recientemente en seres humanos (Kakkis et al. (2001) NEJM 344 : 182) . La administración de a-L- iduronidasa humana recombinante a perros normales o MPS I induce una fuerte respuesta inmune a la enzima (Shull et al. (1994) P.N.A.S 91:12937-12941; Kakkis et al. (1996) Biochem Mol. Med . 58:156-167) que imita aquella observada en pacientes MPS I humanos. Estas respuestas pueden interferir con la eficacia de la terapia enzimática. Para estudiar métodos para inducir tolerancia, se les administró a los perros normales la proteína oc-L- iduronidasa humana heteróloga bajo varias condiciones diseñadas para evitar una respuesta inmune activa y para permitir la inducción de tolerancia. Los estudios demuestran que la dosis apropiada de ciclosporina y azatioprina, seguida por la administración semanal de la a-L-iduronidasa humana recombinante y la remoción gradual de los fármacos inmunosupresores puede inducir tolerancia a la enzima que tarda al menos 6 meses de administración enzimática semanal. Una dosis menos frecuente de ciclosporina , con o sin la adición de la inyección intratímica de anticuerpos monoclonales anti-célula T no tiene impacto en inducción de tolerancia. CsA solo en la dosis apropiada sin Aza, no indujo tolerancia. El régimen de tolerancia utilizó tratamiento de CsA+Aza (con dosis CsA a 25 mg/kg/d£a) , junto con infusiones de tolerágeno en el horario mostrado en la Figura 1. Los tratamientos adicionales indicados, tales como inyección intratímica y anticuerpos monoclonales, se muestran como ejemplos de tratamiento que no trabajaron o no mejoraron la inducción de tolerancia. Estos regímenes no efectivos se incluyen en los ejemplos para proporcionar contraste con la respuesta de aquellos caninos óptimamente tolerizados al antígeno de la invención. Para regímenes que no inducen tolerancia utilizan inyección o anticuerpos monoclonales, pero no dosis de 25 mg/kg/día de CsA, el día 4 es el día en que los caninos reciben inyección intratímica. En el diagrama de régimen de fondo (Figura 1) para IT+fármacos, el canino recibe CsA+Aza de 0-4 días, y luego recibe una inyección intratímica (IT Iny. O ITI) . Si los anticuerpos monoclonales se indican, éstos se dan en los días anteriores a inyección IT. La dosis exacta realizada depende del experimento. En los experimentos no tolerantes, los caninos reciben cada tercer día CsA a 25 mg/kg en días alternos con - el Aza . En experimentos tolerizantes , los caninos reciben diariamente CsA con día alterno de Aza. En cualquier caso, la dosis administrada se dividió en dos en la secuencia descrita. Para caninos que reciben el régimen tolerizante, el diagrama de régimen superior describe el curso de tratamiento. El canino PA recibe CsA únicamente, comenzando 4 días antes del comienzo y ahusamiento de las infusiones después del régimen de inducción de tolerancia superior.

Materiales y Métodos Animales . Los caninos normales y MPS I se obtuvieron a partir de la colonia de caninos MPS I en Harbor-UCLA. Los perros son una cruza entre beagles y Plott hounds y 12-20 kg de promedio en peso. Los caninos tenían menos de 2 años y al menos 4 meses de edad para estos experimentos. Los caninos BI, BE, BC, BO, JA, JO, ME, MA, MO y PA fueron caninos normales o portadores a partir de la colonia de caninos MPS I y por lo tanto no se afectan con MPS I, y reciben una serie de diferentes regímenes que no indujeron tolerancia. Cuando CsA+Aza fueron parte del régimen, éstos recibieron el CsA cada tercer día. BI recibe inyección intratímica salina regulada de fosfato (ITI) ; BE y BC reciben iduronidasa ITI ; BO recibe CsA(cada tercer día) +Aza+ITI ; JA, JO, ME, MA y MO reciben CsA+Aza, ITI y varios anticuerpos monoclonales que agotan células T maduras. PA recibieron diariamente dosis de CsA pero al contrario de menos de los perros que volvieron tolerante, ella no recibió Aza. Los caninos RH, RI y RO fueron caninos normales o portadores de la colonia MPS I que recibieron un régimen de CsA+Aza mínimo que induce tolerancia y en el caso de RH y RI , también recibieron inyección intratímica. El CsA se administró diariamente. El canino RU es un perro afectado con MPS I que no recibió régimen de tolerancia y sirvió como un control . Los perros PE, SA y NI son perros afectados con MPS I que recibieron el régimen de tolerancia inducido de CsA+Aza. Anticuerpos monoclonales . Una serie de anticuerpos monoclonales fueron obtenidos de Peter Moore (UC Davis Veterinary School) y fueron específicos al receptor de célula T canino (anti-TCR) , antígeno CD3 canino (anti-CD3; IgG2b) ) y el equivalente canino de Thy-1 (anti -Thyl ; IgGl) . El anticuerpo anti-TCR se preparó acrecentando el hibridoma en un medio que contiene suero bajo y purificación del anticuerpo por cromatografía de proteína A. Los anticuerpos anti-CD3 y anti -Thyl se prepararon por la producción de ascitas en ratones utilizando los hibridomas, CA17.6B3 y CA1.4G8 y la purificación de la proteína A, en un laboratorio de convención (Strategic Biosolutions ) . Cuando se utilizan, los anticuerpos monoclonales se administraron en 2 ó 3 dosis justo antes .de ITI . Fármacos inmunsoupresores : La ciclosporina (Neoral o Sandimmune) y Azatioprina (Imuran) se obtuvieron de una farmacia local . Ambos fármacos se dosificaron oralmente en la dosis y frecuencia observada en los experimentos. Los dos regímenes probados se muestran inmediatamente después. Régimen de Fármaco Inmunosupresor con Dosis de CsA diaria que induce tolerancia: CsA Neoral® 25 mg/kg/día dividida dos veces al día por vía oral Aza Imuran® 5 mg/kg cada tercer día por vía oral CsA+Aza dio una dosis total del día 0-32, 1/3 dosis del día 33-46, y 1/4 de dosis de 47-60, y luego se terminó. Se supervisaron a los animales para reacciones adversas . Se supervisan niveles de depresión y pico CsA y se ajusta la dosis para mantener un nivel de depresión objetivo de 400-500 ng/ml en la circulación. Régimen de Fármaco Inmunosupresor con cada tercer día de dosificación de CsA que no induce tolerancia: CsA Neoral® 25 mg/kg/día cada tercer día dividido dos veces al día por vía oral Aza Imuran® 5 mg/kg cada tercer día en días alternos de CsA CsA+Aza dio una dosis completa del día 0-18, 1/2 dosis del día 19-32, y 1/4 de dosis del 33-46 y 1/8 del día 47-60 y luego se terminó. Se supervisan los animales para reacciones adversas . Se supervisan niveles pico y depresión CsA y un nivel de depresión de 100-200 ng/ml en la circulación. Inyección Intratímica. Durante la anestesia general se hizo una incisión de 3 pulgadas en el lado izquierdo del tercer especio intercostal. La incisión se continuó a través de todas las capas musculares hasta que la cavidad del pecho se alcanzó. Un separador de costilla se empleó y el timo se observó directamente como un órgano lobulado, vascularizado debajo de los pulmones. La solución de enzima se inyectó en el timo con una jeringa y aguja de 25 G. Un patrón de "zigzag" se hizo cuando se insertó la aguja en el timo en un intento para evitar fuga de enzima hasta el retiro de la aguja. El timo se inspeccionó visualmente para cualquier fuga de solución enzimática hecha visible por tinte Azul de Evan. El sitio de cirugía se cerró y la función respiratorio se restauró utilizando vacío extraído a través del catéter Foley insertado en la cavidad del pecho. Se aplicaron antibióticos a todos los sitios de incisión y se siguió la cirugía por una ruta corta de antibióticos y la medicación del tratamiento para el dolor como sea necesario. Solución de inyección, 1.5 mi total: 1 mg/kg de 12.1 mg/ml de iduronidasa (3xlOsU/ml) . Trae 1.5 mi con 40% de PEG + 2 mg/ml de tinte Azul de Evan en PBS acídico (solución final aproximadamente 6% de PEG , 0.3 mg/ml de Evan) . Infusiones Enzimáticas . Se prepara iduronidasa recombinante en una forma altamente purificada y se ha demostrado tener potencial de absorción elevado con absorción máxima media en fibroblastos Hurler en una concentración enzimática de aproximadamente 1 nanomolar (kabSorción) y una especificación de absorción menor de 3.3 nanomolar. Para infusiones toleragénicas , se administraron intravenosamente durante 2 horas 14,000 U/kg/semana de a-L- iduronidasa en 50 mi de infusión en solución salina con 1 mg/ml de albúmina canina y 10 mM de NaP04 (Ia hora, 3,000 U/kg/hora; 2a hora 11,000 U/kg/hora) . Se supervisaron los animales para una reacción anafiláctica . 250,000 U es igual a 1 mg de proteína.

Resultados Se muestra el perfil básico del plan experimental en la Figura 1. El grupo entero de perros se pre-trató con fármacos inmunosupresores , seguidos por una inyección de IT si se programa, y luego comienza 2 semanas después, una serie de pruebas semanales de iduronidasa. Los caninos reciben ya sea el régimen de inducción no tolerante con cada tercer día CsA (véase regímenes anteriores) con o sin otros tratamientos (inyección intratímica, anticuerpos monoclonales) o el régimen que induce tolerancia con dosificación de CsA diaria con o sin los otros tratamientos. Un perro, PA recibió la dosis de CsA diaria pero no de Aza. Se iniciaron los caninos en fármacos inmunosupresores en el día 0, equivalente a 18 días antes de la primera prueba de enzima. Si se programan, los caninos reciben anticuerpos monoclonales por infusión intravenosa (2-5 mg) justo antes de ITI . En el día 4, los perros reciben, si se programa, una inyección intratímica de iduronidasa a 1 mg/kg. Dos semanas después, los perros se iniciaron en un horario semanal de infusiones de enzimas y iduronidasa que consisten de una infusión intravenosa semanal de 14,000 U/kg (0.056 mg/kg/semana) de iduronidasa recombinante humana. La dosis de CsA y Aza se dividieron a la mitad cada dos semanas como se observó en los materiales y métodos como se indican. Después de 6-8 semanas de pruebas enzimáticas, los caninos reciben el protocolo óptimo de CsA (diariamente) +Aza con o sin inyección IT (Figura 2 símbolos abiertos) , fueron tolerantes a iduronidasa mientras que los perros reciben otros regímenes tuvieron respuestas inmunes fuertes como se evalúa por ELISA (Figura 2 símbolos cerrados) . El canino RO tolerante a iduronidasa se continuó en pruebas de enzima semanales durante 6 meses sin inducción de una titulación ELISA significativa a iduronidasa. La titulación del anticuerpo a iduronidasa en los caninos tolerantes y no tolerantes se muestra en la Tabla 1. Únicamente caninos que completaron al menos 12 semanas se incluyen en la tabla; los caninos no tolerantes BE, BI, BC y BO se detuvieron a las 7 semanas con titulación ya de suero de 21-74 OD/µ? . Los caninos no tolerantes tuvieron inducción de 181 veces de un nivel de línea base de 0.8 a un nivel de inducción promedio de 144.6 de ELISA de unidades OD por microlitro de suero. Los perros tolerantes tuvieron un incremento de titulación de 13 veces, a partir de 0.4 inicial en la línea base a 5.2 después del tratamiento con iduronidasa. Los perros no tolerantes tuvieron una inducción más elevada de ~28 veces de anticuerpos a iduronidasa que los perros tolerantes. Un perro NI tuvo la titulación más elevada en el grupo tolerante de 13.8. Este perro vomitó la dosis de CsA en múltiples ocasiones que puede contar para la inducción menos completa de tolerancia y además soporta la naturaleza crítica de la dosis de CsA. PA recibe la dosis diaria preferida de CsA pero no recibió Aza y no tolerizó. Aunque, dos de los perros normales tolerantes, RH y RI , también recibieron inyección intratímica, la inyección no fue necesaria ya que se mostró tolerancia en el perro RO. ?/? o s? LTl TABLA 1. Respuesta inmune en caninos tolerantes y no tolerantes Título de anticuerpo a Iduronidasa (OD unidades/µ?. de suero no diluido) Canino Tratamiento Pre-tratamiento Promedio Post-tratamiento Promedio No tolerante JA (CsA+Aza+ITI+TCR mAb) 0 230.7 (cada tercer día JO (CsA+Aza+ITI+TCR mAb) 2.6 101.2 CsA más otros ME (CsA+Aza+ITI+TCR mAb) 0.3 60.2 tratamientos) MA (CsA+Aza+m+CD3/Thyl/TCR mAb) 1.5 0.8 120.8 144.6 MO (CsA+Aza+ITI+CD3/Thyl/TCR mAb) 0 377.9 PA CSA) 0.3 64.4 RU (Control MPS I Sin Fármaco Afectado) 1.2 56.7 RH (CsA(diáriamente)+Aza+nT) 0.3 8.7 RI (CsA(díariamente)+Aza+rn) 0.3 0.5 RO (CsA(diariamente)+Aza) 0.2 0.7 PE (CsA(diariamente)+Aza, MPS I Afectado) 0.6 0.4 0.8 5.2 SA (CsA(diariamente)+Aza, MPS I Afectado) 0.4 6.8 NI (CsA(díariamente)+Aza, MPS I Afectado) 0.8 13.8 En la Tabla 1, la titulación del anticuerpo a iduronidasa para 6 caninos tolerantes y 7 caninos no tolerantes se muestra como suero no diluido de unidades O?/µh como se mide por ELISA. Los caninos recibieron fármacos u otros tratamientos como se describe en el ejemplo 1, y se les administró iduronidasa. Todos los caninos recibieron 0.056 mg/kg/semana de pruebas intravenosas de iduronidasa rh. Los valores de pretratamiento ELISA representan niveles de anticuerpo en suero antes de la primera prueba de antígeno con iduronidasa. Los puntos de post tratamiento representan niveles de anticuerpo de suero en la semana 12 de la prueba de enzima, o en el último punto medido (ME, MA, MO en la semana 11; PA en la semana 9) . Las titulaciones de anticuerpo de post-tratamiento promedio para caninos tolerantes (5.2 OD/microlitro) es 1/25 de la titulación de perros no-tolerantes (144.6 OD/microlitro). La respuesta enormemente reducida para iduronidasa en los perros tolerantes ocurre a pesar del hecho que los perros fueron anulados de todos los fármacos inmunosupresores por el final de la semana 6. La titulación en los perros tolerantes permaneció baja durante varios meses y se estudió en RO y SA durante 6 meses de infusiones semanales (Figura 2) . Los intentos para reducir tolerancia a otra ovalbúmina de antígeno con oligosacáridos N unidos terminados con mañosa, no tuvieron éxito. Estos datos sugieren que la absorción más elevada y el receptor de 6 -fosfato de mañosa ampliamente presente pueden requerirse o que la absorción mediada por el receptor de ma osa no es suficiente para el tolerágeno que induce exitosamente la tolerancia. La inducción de tolerancia a una proteína terapéutica se ha lograda en caninos. Los caninos tratados con un régimen óptimo de CsA y Aza, mostraron una respuesta inmune reducida dramáticamente a infusiones semanales de la enzima iduronidasa que tardó al menos 4-6 meses. La tolerancia no depende de otros reactivos o procedimientos tales como anticuerpos monoclonales o inyección intratímica. El estado de tolerancia se mantiene en la ausencia de fármacos inmunosupresores por al menos 6 meses. La diferencia clave entre los perros tolerantes y los otros perros fue el uso de CsA diariamente. CsA solo, sin embargo no fue suficiente en perros, como canino PA no tolerizó utilizando diariamente CsA solo. Los fármacos inmunosupresores solos no pueden inducir tolerancia en perros, y el uso de infusiones de antígeno bajo la cubierta protectora de fármacos inmunosupresores es una parte clave del protocolo de tolerancia. La enzima está siendo probablemente presentada como un antígeno tolerizante mientras las células T que podría activarse se frenan por los fármacos . Otras partes del régimen se pretendieron para mejorar los cambios de tolerancia de inducción pero no tuvieron efecto. La inyección intratímica se diseñó para presentar antígeno en un sitio conocido para ser tolerogénico, pero esta no tuvo efecto y si lo hubo, condujo a respuesta inmune prematura. Parece que tal presentación periférica y tolerización en este modelo son más efectivas. Los anticuerpos monoclonales a marcadores de célula T no contribuyeron tampoco a tolerancia. Estos monoclonales se pretendieron reducir tanto como 90% de las células T maduras a partir de la circulación como se ha mostrado en experimentos pilotos, pero su uso no ¦ se agregó, y no se requirió para tolerancia. Mientras el canino huésped podría haber sido un factor importante, de hecho, la tolerancia a iduronidasa humana se indujo en caninos normales con iduronidasa endógena así como también en caninos afectados con MPS I sin iduronidasa endógena.

EJEMPLO 2 Inducción de Tolerancia a Iduronidasa Terapéutica en Perros afectados con MPS I y Mantenimiento de Tolerancia Durante Infusiones de Dosis Terapéuticas Elevadas La inducción de tolerancia debe evitar una respuesta inmune clínicamente significativa a la proteína terapéutica para ser útil en la clínica. Los caninos MPS I en terapia de reemplazo de enzima con iduronidasa responden con anticuerpos de titulación elevada que retrasa la depuración o altera la estabilidad de la enzima, evita la absorción de la enzima y limita probablemente la eficacia de la terapia enzimática. El mismo fenómeno se ha reportado en otros modelos animales. Para estudiar si los caninos PS I sin afectar pueden tolerizarse a iduronidasa y subsecuentemente recibir altos niveles de dosis terapéuticas de enzima en una base semanal, una serie de cuatro perros afectados con MPS I se tolerizaron (3 perros) o se mantuvieron como control (1 perro) . Después de 12 semanas, los perros tolerantes recibieron una dosis semanal incrementada de iduronidasa y finalmente recibieron al menos 6 semanas de dosis terapéuticas de enzima, sin una respuesta inmune significativa. El perro control no tolerante tuvo una titulación rápidamente ascendente a la enzima como se ha observado previamente y las infusiones se terminaron en la semana 16 debido a una reacción anafiláctica.

Métodos y Materiales Animales. Los perros MPS I se obtuvieron de la colonia canina MPS I en Harbor-UCLA. Los perros son una cruza entre beagles y Plott hounds y un promedio de 12-20 kg en peso. Los caninos tenían menos de 2 años y al menos 4 meses de edad para estos experimentos . Fármacos Inmunosupresores . Se obtuvieron ciclosporina (Neoral o Sandimmune) y Azatioprina (I-muran) se obtuvieron a partir de una farmacia local . Ambos fármacos se dosificaron oralmente en la dosis y frecuencia observada en los experimentos. El régimen probado se mostró inmediatamente después . El Régimen de Fármaco Inmunosupresor con Dosificación de CsA diaria que induce tolerancia: Este régimen fue como se describió en el Ejemplo 1. Infusiones Enzimáticas . Se prepara la iduronidasa recombinante en una forma altamente purificada y se ha demostrado tener potencial de absorción elevado con absorción máxima media en fibroblastos Hurler en una titulación enzimática de aproximadamente 1 nanomolar ( abSorción) y una especificación de absorción menor de 3.3 nanomolar. Se les administró a los perros 14,000 U/kg/semana a-L-iduronidasa o dosis más elevadas como dosis se elevaron hasta en una infusión de 50 mL en solución salina conteniendo 1 mg/mL de albúmina canina, 10 mM de NaP04, pH 5.8. Administrados intravenosamente durante 2 horas (1 hora, 3,000 U/kg/hora, 2a hora 11,000 U/kg/hora, o una velocidad más elevada en la 2a hora dependiendo de la dosis) . Se les supervisó a los animales para reacción anafiláctica .

Resultados La inducción de tolerancia en tres perros MPS I, aunque no en un perro MPS I control. Se tolerizaron tres perros MPS I utilizando el régimen de tolerancia incluyendo 18 días de CsA+Aza antes de iniciar las infusiones enzimáticas semanales. Un perro MPS I sirvió como un control y no recibió el régimen de tolerancia. Los 4 perros recibieron infusiones de iduronidasa intravenosa de 0.056 mg/kg/semana en las semanas 1-12. La titulación del anticuerpo a iduronidasa en los tres perros MPS I tolerantes (Figura 3; símbolos abiertos) y un perro MPS I no tolerante (Figura 3; símbolo cerrado) se muestran como se mide por ELISA. Los niveles de anticuerpo bajos (<20 OD) con prueba de antígeno continuo indican tolerancia. El régimen de fármaco tolerizante (CsA+Aza) finaliza en la semana 7 de la prueba enzimática y los niveles de anticuerpo bajos más allá del punto son indicativos de tolerancia inducida. Los perros MPS I tolerantes son tolerantes a terapia de enzima de dosis terapéutica completa. Los cuatro caninos MPS I reciben un incremento etapa por etapa en dosis de iduronidasa durante 3 semanas a dosis terapéuticas de 0.500 mg/kg/semana en la semana 15 de la prueba enzimática. Esta es la misma dosis utilizada en pruebas terapéuticas anteriores en los perros MPS I y se utiliza en terapia enzimática MPS I humana (Kakkis et al 2001, supra) . Los niveles de anticuerpos en perros tolerantes permanecieron <20 unidades OD en la semana 15 comparados a niveles de anticuerpo RU control de >500 Unidades OD en la semana 15 en respuesta a dosis de antígeno incrementada. Dos perros MPS I previamente tratados con esta dosis de enzima (0.5 mg/kg/semana) tuvieron titulación de 1800 y 2000 por la semana 14 de terapia enzimática para comparación. En la semana 16, ningún canino tolerante RU tuvo una reacción anafalactoide clínica seria durante la infusión y el tratamiento se finalizó. Los caninos tolerantes no exhibieron reacciones anafalactoides durante las infusiones. Los perros MPS I completamente deficientes en la iduronidasa de antígeno, canina o humana, pueden tolerizarse a la proteína de iduronidasa humana reproduciblemente . Estos perros tolerantes pueden también recibir dosis terapéuticas completas de enzima sin una respuesta inmune significativa. Este resultado indica que la tolerancia inducida es contundente y puede proteger un perro a partir de niveles elevados de exposición a un antígeno incluyendo niveles que podría esperarse durante la administración de la proteína terapéutica .

EJEMPLO 3 Inducción de Tolerancia a Alfa Glucosidasa La inducción de tolerancia a infusiones de iduronidasa se ha demostrada en perros MPS I y normales utilizando un régimen de CsA+Aza diariamente, seguidos por infusiones semanales de antígeno tolerizante mientras que ahusa los fármacos inmunosupresores. Para demostrar que la tolerancia puede inducirse a otra enzima con características de absorción de afinidad elevada, se preparó la alfa glucosidasa humana recombinante y se estudió con el régimen de tolerancia. Se estudiaron dos perros normales, uno con el régimen de tolerancia y uno control. Las infusiones semanales con glucosidasa comenzaron y por la semana 3, el perro control tuvo una titulación inmune ascendente. Por la semana 5, el perro control unas 100 veces de la titulación más elevada, y el perro tratado no tuvo titulación significativa. Los datos muestran que el régimen de tolerancia puede ser exitosamente utilizado con otros antígenos.

Materiales y Métodos Animales . Los perros MPS I se obtuvieron a partir de la colonia canina MPS I en Harbor-UCLA. Los perros son una cruza entre beagles y Plott hounds y un promedio de 12-20 kg en peso. Los caninos tenían menos de 1 año y al menos 4 meses de edad para estos experimentos. Fármacos inmunosupresores. Se obtuvieron ciclosporina (Neoral o Sandimmune) y Azatioprina (Imuran) a partir de una farmacia local. Ambos fármacos se dosificaron oralmente en la dosis y frecuencia observadas en los experimentos. El régimen probado se muestra inmediatamente después Régimen de Fármaco Inmunosupresor con Dosificación de CsA diaria que induce Tolerancia: CsA Neoral® 25 mg/kg/día dividido dos veces al día por vía oral Aza Imuran® 5 mg/kg cada tercer día por vía oral Dosis divididas en dos para todos los fármacos cada 2 semanas después de la primera infusión enzimática Se supervisaron los animales para reacciones adversas Los niveles de depresión y pico CsA se supervisaron para mantener un nivel de depresión objetivo óptimo de 400-500 ng/ml en la circulación. Infusiones Enzimáticas . Se prepara la alfa-glucosidasa recombinante en una forma altamente purificada y se ha demostrado tener potencial de absorción elevado con absorción máxima media en fibroblastos y en una titulación enzimática de aproximadamente 1 nanomolar (KabSorción) y una especificación de absorción menor de 3.3 nanomolar. Las infusiones se realizaron con 0.056 mg/kg/semana de alfa-glucosidasa humana recombinante en una infusión de 50 mi de solución salina y 10 mM de NaP04, pH 5.8. Las infusiones se administraron intravenosamente durante 2 horas (1 hora 21% de dosis total; 2a hora el equilibrio de la enzima) . Se supervisaron los animales para reacción anafiláctica .

Resultados Los caninos ST control no recibieron tratamiento de fármaco y comenzaron a recibir alfa-glucosidasa por infusiones intravenosas semanales. Por 3 semanas, se detectó una titulación significativa y la titulación se incrementó a más de 100 unidades OD por microlitro de suero por la semana 4. Subsecuentemente, la titulación varío entre casi 100-200 unidades por microlitro de suero. En contraste, el canino SC recibió el régimen CsA+Aza y tuvo mínima si la tuvo respuesta inmune durante 12 semanas de infusiones. Esto incluye las semanas 7-12 en donde no se administraron fármacos inmunosupresores . El régimen de CsA+Aza con infusiones de antígeno tolerizante en una base semanal puede inducir tolerancia a otros antígenos. El resultado demuestra la utilidad más amplia del régimen y protocolo de antígeno tolerizante para inducir un estado profundo de tolerancia inmune. En particular, la respuesta inmune a alfa-glucosidasa se ha reportado para inhibir o limitar la utilidad de terapia de reemplazo de enzima en pacientes Pompe. Este resultado demuestra la utilidad del régimen de tolerancia para evitar una respuesta inmune a esta proteína terapéutica.

EJEMPLO 4 La inducción de tolerancia es dependiente en dosis de CsA - - Anteriormente se trabajo sobre desarrollar un protocolo de tolerancia enfocado en una combinación de inyección intratímica, fármacos inmunosupresores y anticuerpos monoclonales de eliminación de célula T madura. Se pensó que una combinación completa de expresión antigenica tolerizante (inyección intratímica) , supresión de respuestas de célula T antígeno específicas madura (CsA y Aza) así como también la eliminación de las células T maduras capaces de responder a antígeno, fue necesario bloquear una respuesta inmune de activación y preparar el sistema inmune para aceptar la exposición antigénica. Durante el desarrollo de este trabajo, un canino JH, comenzó a ser tolerante, aunque el canino recibió únicamente ITI y CsA+Aza. El análisis adicional de este canino demostró que su metabolismo de CsA condujo a niveles de suero sustancialmente más elevados de CsA. Este hallazgo llegó a ser el resultado central que permitió experimentos adicionales en la inducción de tolerancia con los fármacos inmunosupresores y tolerágeno únicamente .

Materiales y Métodos Animales . Se obtuvieron caninos normales y MPS I a partir de la colonia canina MPS I en Harbor-UCLA. Los perros son una cruza entre beagles y Plott hounds y un promedio de 12-20 kg en peso. Los caninos tenían menos de 2 años y al menos 4 -meses de edad para estos experimentos. Anticuerpos monoclonales . Una serie de anticuerpos monoclonales se obtuvieron a partir de Peter Moore (UC Davis Veterinary School) y fueron específicos al receptor de célula T canina (anti-TCR) , antígeno CD3 canino (anti-CD3; IgG2b) ) y el equivalente canino de Thy-1 (anti-Thyl; IgGl) . Se preparó el anticuerpo anti-TCR acrecentando el hibridoma en un medio que contiene suero bajo y purificación del anticuerpo por cromatografía de proteína A. Los anticuerpos anti-CD3 y anti-Thyl se prepararon por producción de ascitos en ratones utilizando los hibridomas, CA17.6B3 y CA1.4G8 y purificación de proteína A, en un laboratorio de contrato (Strategic Biosolutions ) . Cuando se utilizan, los anticuerpos monoclonales se administraron en 2 ó 3 dosis justo antes de ITI . Fármacos Inmunosupresores . Se obtuvieron ciclosporina (Neoral o Sandimmune) y Azatioprina (Imuran) a partir de una farmacia local. Ambos fármacos se dosificaron oralmente en la dosis y frecuencia observada en los experimentos . El uso de Neoral o Sandimmune se evaluó como un factor en si la tolerancia se indujo y no se encontró que sea factor . Régimen de Fármaco Inmunosupresor con dosis de CsA Cada Tercer Día que no induce tolerancia: CsA Neoral® 25 mg/kg/cada tercer día dividida dos veces al día por vía oral Aza Imuran® 5 mg/kg cada tercer día en días alternos de CsA CsA+Aza da una dosis completa del día 0-18, ¾ dosis del día 19-32, y ¼ dosis de 33-46 y 1/8 del día 47-60 y luego se terminó. Se supervisaron animales para reacciones adversas Los niveles de depresión y pico CsA se supervisaron y un nivel de depresión de 100-200 ng/ml en la circulación. Inyección Intratímíca. Durante la anestesia general una incisión de 3 pulgadas se hizo en el lado izquierdo en el 3er espacio intercostal. La incisión se continuó a través de todas las capas musculares hasta que la cavidad de pecho se alcanzó. Se empleó un separador de costilla y el timo observó directamente como un órgano lobulado vascularizado debajo de los pulmones. La solución enzimática se inyectó en el timo con una jeringa y aguja 25 G. Un patrón de "zigzag" se hizo cuando se insertó la aguja en el timo en un intento para evitar fuga enzimática hasta el retiro de la aguja. El timo se inspeccionó visualmente para cualquier fuga de solución enzimática hecha visible por tinte Azul de Evan. El sitio de cirugía se cerró y la función respiratoria se restauró utilizando vacío extraído a través de un catéter Foley insertado en la cavidad de pecho. Los antibióticos se aplicaron a todos los sitios de incisión y la cirugía se siguió por una ruta corta de antibióticos y la medicación del tratamiento para el dolor como sea necesario. Solución de inyección: 1.5 mL total; 1 mg/kg de 12.1 mg/mL de iduronidasa (3xl05 U/mL) . Convirtió 1.4 mL con 40% de PEG + 2 mg/mL de tinte Azul de Evan en PBS acídico (solución final aproximadamente 6% de PEG, 0.3 mg/mL de Evan) . Inyección enzimática: 14,000 U/kg/semana de a-L-iduronidasa en 50 mL de infusión en solución salina con 1 mg/mL de albúmina canina, y 10 mM de NaP04 administrado intravenosamente durante 2 horas (Ia hora, 3,000 U/kg/hora, 2a hora 11,000 U/kg/hora). Los animales se supervisaron para reacción anafiláctica .

Resultados Los experimentos de tolerancia previos incluyeron dosis de CsA en un intervalo cada tercer día. Estos experimentos previos buscaron estabilizar si ITI, fármacos inmunosupresores y/o anticuerpos monoclonales que eliminan las células T se requieren para inducción de tolerancia. La Figura 5 muestra los resultados para algunos caninos previos estudiados utilizando ITI y fármacos. BI es un perro control que recibió un ITI o PBS únicamente, y BE y BC fueron dos perros tratados con ITI de iduronidasa. Ninguno de los tres fue tolerante cuando la titulación excedió 20 por 7 semanas. BO recibió cada tercer día CsA+Aza además de ITI y no fue tampoco tolerante con una titulación de 42 por 7 semanas. JA y JO tuvieron el mismo régimen pero en adición, un anticuerpo monoclonal anti-TCR se infundió antes del ITI para determinar si las células T de eliminación podrían permitir la inducción de tolerancia. Ambos caninos acumularon respuestas inmunes y alcanzaron titulación de 148 y 135 por 12 semanas. Curiosamente, el perro control JH no acumuló una respuesta inmune aún cuando tuvieron CsA+Aza y protocolo ITI que no había trabajado previamente con BO . La tolerancia incluyó un periodo de titulación modesta para iduronidasa para alcanzar un pico de 15.1 en la semana 1 y después declinando a 7.1 en la semana 18. La evaluación de niveles de CsA rutinarios mostró un patrón que explica este resultado. La mayoría de los perros con CsA cada tercer día tuvieron niveles de depresión de 60-190 ng/ml sin embargo un perro (JO) alcanzó 342 (Tabla 2) . Ninguno de estos perros fue tolerante. JH tuvo un nivel de 570 que excedió los otros perros por al menos 200 ng/ml. El perro recibió el régimen correcto basado en una revisión de la jaula y los registros de administración de fármaco y aún el nivel fue mucho más elevado. JH se tolerizó a infusiones de iduronidasa utilizando un régimen de CsA+Aza e G?? . Curiosamente, tuvo un nivel mucho más elevado de Csa en su suero que sugirió que el nivel de CsA podría ser un factor crítico. Después de este experimento, el trabajo adicional en dosificación de CsA demostró que la dosificación de CsA diaria podría mantener los niveles mínimos sobre 400 ng/ml y que esto, con cada dosificación Aza, fue suficiente para inducir tolerancia.

Ln O ?? O U1 Tabla 2 Comparación de niveles sanguíneos mínimos de Ciclosporina en caninos tolerantes a iduronidasa y no tolerantes a iduronidasa Canino Tratamiento Nivel de CsA Promedio Minio (ng/ml) No tolerante BO (CsA+Aza+m) 190 148 (cada tercer día CsA más otros JA (CsA+Aza +TCR mAb tratamientos) +rn ) 63 ME (CsA+Aza+ITI+TCR mAb) 60 MA (CsA+Aza+ITI+CD3 Thyl/TCR mAb) 120 MO (CsA+Aza+ITI+CD3 Thyl/TCR mAb) 110 Tolerante JH (CsA+Aza+??) 570 (cada tercer día CsA más otros tratamientos) Tolerante H (CsA (diariamente) +Aza+nT) 520 (Régimen de fármaco tolerante: SI (CsA (diariamente)+Aza 450 diariamente CsA más Aza) +rrr) O (CsA (diariamente) +Aza 680 545 PE (CsA(diariamente)+Aza, MPS I Afectado) 440 SA (CsA(diariamente)+Aza, MPS 1 Afectado) 520 NI (CsA (diariamente) +Aza, MPS I Afectado) 660 No Tolerante (diariamente CsA, sin Aza) PA (CsA (diariamente) en forma única) 490 En la Tabla 2, los niveles sanguíneos mínimos de Ciclosporina para caninos tolerantes y no tolerantes se muestran como sangre ng/mL. Los niveles de ciclosporina se midieron después de al menos 4 dosis consecutivas de ciclosporina. PA reciben diariamente tratamiento de ciclosporina solo comenzando 4 días antes de la prueba de iduronidasa inicial y no se tolerizó a iduronidasa. Todos los otros caninos recibieron fármacos inmunosupresores comenzando 18 días antes de la primer prueba de iduronidasa intravenosa (4 días antes de ITI) . Todos los perros recibieron 0.056 mg/kg/semana rh de pruebas intravenosas de iduronidasa. La tolerancia exitosa a iduronidasa se asoció consistentemente con niveles mínimos de ciclosporina de 400-700 ng/mL. Los caninos con niveles mínimos de ciclosporina menor de 400 ng/ml no se tolerizaron a iduronidasa. (CsA Ciclosporina A; Aza = Azatioprina; ITI = Inyección intratímica de iduronidasa; mAb = anticuerpo monoclonal). La Tabla 2 muestra datos adicionales de otros perros tolerizados que corroboran el papel de dosis CsA en el régimen tolerizante. Los perros no tolerizantes en la sección superior de la tabla recibió cada tercer día CsA a 25 mg/kg y los 6 perros tratados con fármacos con o sin otros tratamientos tuvieron niveles de CsA mínimos de 60-190 ng/ml, con un caso JO a 342 ng/ml . Estos niveles se toman después de al menos 4 dosis de los fármacos que habían sido dados durante el régimen. El nivel de CsA promedio de los perros no tolerantes es 148 ng/ml. En la tercera sección, los perros tolerantes tuvieron niveles CsA mínimos de 440-680 y un promedio de 545 ng/ml, más de 3 veces más elevado. JH tuvo un nivel mostrado en la segunda sección de la tabla de 570 ng/ml y aunque su dosis fue únicamente cada tercer día, el nivel fue suficientemente elevado y llegó a ser tolerante. En contraste, PA muestra que en la cuarta sección de la tabla tuvo un nivel de CsA adecuado de 490, pero no tuvo Aza tampoco, y no llegó a ser tolerante. Estos datos demuestran la importancia de un efecto de CsA adecuado en el protocolo de tolerancia.

EJEMPLO 5 La inducción de tolerancia es duradera sin estimulación de tolerágeno crónico La inducción de tolerancia por un tolerágeno es particularmente útil si el estado de tolerancia es duradero, aún en la ausencia de administración de tolerágeno. Para dirigir la estabilidad del estado de tolerancia, los caninos que fueron tolerantes y no tolerantes se retuvieron para intervalos variables de tiempo y luego se volvieron a probar con infusiones de iduronidasa. Los datos muestran que por al menos 6 meses, un animal tolerante permanece tolerante a infusión de iduronidasa aún sin tolerágeno continuo o exposición de antígeno.

Métodos y Materiales Se indujo tolerancia como se describe en los ejemplos anteriores para cada canino observado (se utilizan las mismas iniciales) . JO fue el canino tolerizado con dosis de CsA cada tercer día, diferente de los otros caninos. Este canino no tuvo tolerancia completa inicialmente , sino una respuesta de anticuerpo enmudecida. Otros caninos tolerantes fueron completamente tolerantes con base en estudios descritos en otros ejemplos. La iduronidasa fue la misma iduronidasa de absorción elevada como se describe anteriormente. Los caninos se probaron con 0.58 mg/kg de enzima administrada intravenosamente en una base semanal por 3-6 dosis.

Resultados y Discusión En la Figura 6, las titulaciones de caninos que fueron tolerantes o no tolerantes se muestran con una abertura indicada por el periodo en donde no ocurrió tolerágeno o infusiones terapéuticas. Tan poco como 5 semanas y tanto como 6 meses de hiato de tolerágeno no cambió la respuesta de los perros tolerantes, quienes permanecieron tolerantes y no acumularon una respuesta inmune significativa. El perro U no tolerante mostró una inducción de >20 veces una titulación de anticuerpo recibieron 2 dosis de enzima después de un hiato de 4.5 meses. El perro JH mostró alguna respuesta a 3 semanas de reinducción que excede aquella de más perros tolerantes pero no alcanzaron aquella de un perro RU no tolerante. JH también tuvo una respuesta más significativa cuando se prueba originalmente y no fue tan tolerante como los perros tolerizados con régimen óptimo. Su patrón de titulación original también descendió y declinó con infusiones continuas, que se estudiará en este caso. Estos datos demuestran que la tolerancia inducida por los métodos y composiciones de la presente invención son duraderos y clínicamente útiles.

EJEMPLO 6 Inducción de Tolerancia en Seres Humanos Materiales y Métodos Pacientes: Los pacientes con mucopolisacaridosis I se seleccionan para tratamiento. Se evaluaron los pacientes en la línea base y a 6, 12, 26 y 52 semanas por examinaciones clínicas detalladas, representación de imagen de resonancia magnética del abdomen y cerebro, ecocardiografía, mediciones de rango de movimiento, polisomnografía, evaluaciones de laboratorio clínico, mediciones de actividad de a-L-iduronidasa de leucocito y excreción de glucoaminoglicano urinario .

Fármacos inmunosupresores . Se obtienen ciclosporina (Neoral o Sandimmune) y Azatioprina (Imuran) a partir de fuentes comerciales. Ambos fármacos se dosifican oralmente en la dosis y frecuencia como sigue: CsA Neoral® 12.5 mg/kg/cada tercer día dividido dos veces al día por vía oral; Aza Imuran® 5 mg/kg cada tercer día por vía oral por dos semanas del periodo de acondicionamiento. Los fármacos se administraron entonces en esa dosis durante dos semanas adicionales en la presencia de tolerágeno. Las dosis se dividen en dos para todos los fármacos cada 2 semanas después de la primera infusión de tolerágeno. Los pacientes se supervisan para reacciones adversas, y para niveles mínimos y pico CsA. Tolerágeno : Se produce oc-L- iduronidasa recombinante en células de ovario de hámster chino con el uso de bioreactores y cromatografía de columna estándar, y analizó extensivamente para seguridad y pureza. La actividad de a-L-iduronidasa se mide de acuerdo al método de Shull et al., supra . , o con un ensayo cuyo resultados se reportan en unidades SI (Kakkis et al., 2001, supra). Cuando el último ensayo se utilizó, una dosis de 125,000 U de a-L- iduronidasa por kilogramo es equivalente a 100 unidades SI por kilogramo. La excreción de glicosaminoglicano urinario se mide de acuerdo a una adaptación del método de Bjornsson. Los ensayos inmunosorbentes unidos con enzima para anticuerpos a ot-L-iduronidasa utiliza una variación del método de Shull et al., y transferencia Western se realizó de acuerdo a un método estándar . El tolerágeno se administra por infusión intravenosa (diluida en solución salina con 0.1 por ciento de albúmina de suero humano) en una dosis de 14,000 U (0.056 mg/kg) , suministrado semanalmente . La primera dosis se da después de la terminación del periodo de acondicionamiento de dos semanas, y más adelante semanalmente. Los pacientes se pre-medicaron con difenilhidramina (0.5 a 1.25 mg por kilogramo de peso corporal) . Después de la inducción de tolerancia, usualmente 6 a 8 semanas después del inicio del periodo de acondicionamiento, la dosis se incrementa una vez semanalmente, 125,000 U (0.58 mg) por kilogramo; la velocidad es 3000 U por kilogramo durante la primera hora y 61,000 U por kilogramo durante cada una de las siguientes dos horas.

EJEMPLO 7 El Régimen de Tolerancia Inmune Evita la Inducción de Otras Inmunoglobulinas Además de IgG El régimen de tolerancia en canino evita la inducción de IgG como se manifiesta por una disminución en la respuesta IgG total contra iduronidasa cuando se compara con la respuesta IgG observada en caninos no tolerantes. El presente Ejemplo proporciona evidencia adicional que muestra que además de evitar la inducción de IgG, el régimen tolerizante evita la inducción de otros subtipos de inmunoglobul inas también. Los análisis del suero inmune de caninos que fueron ya sea caninos tolerantes (perros PE y SA) o controles (perros RU y U ) que no había recibido el régimen tolerizante se estudiaron para la presencia de anticuerpos IgG, IgA e IgE a iduronidasa. Los datos a partir de estas determinaciones se muestran en las Figuras 7A a 7D . Estos datos muestran que los perros tolerantes no tuvieron un incremento significativo (>3 veces) en titulación en estos otros subtipos y perros no tolerantes no tuvieron una respuesta de IgA o IgE significativa ~10 veces en algunos casos. Aunque la titulación de IgA e IgE no fueron elevadas en relación a IgG, estas titulaciones fueron significativas y positivas en los caninos no tolerantes. Los datos muestran que el régimen de tolerancia también evita otros subtipos Ig a partir de inducirse consistentes con un efecto más amplio de la respuesta humoral.

EJEMPLO 8 Inducción de Tolerancia en Animales con Respuestas Inmune Pre-Existente En otro aspecto de la presente invención, se demostró que es posible reducir o eliminar una respuesta inmune existente. El presente ejemplo discute datos generados a partir del caninos Nitro. Nitro se tolerizó originalmente, pero después de un periodo de casi 6 meses de hiato a partir de la exposición antigénica, una re-exposición indujo una profunda respuesta anamnéstica con una titulación que alcanzó 400+ . Después de varias semanas sin exposición al antígeno, el canino se colocó en el régimen de tolerancia y dio infusiones semanales de dosis baja (0.056 mg) de iduronidasa. La titulación inicialmente se elevó durante la administración del régimen de CsA+Aza a más de 100 en una respuesta anamnéstica típica y cayó rápidamente debajo de 20 (véase la Figura 8) . La respuesta se redujo por el régimen y la respuesta inmune a enzima se mutó relativamente en comparación con el nivel >400 previamente en infusiones de 0.5 mg/kg/semana . Estos datos demuestran que es posible reinducir la tolerancia al tolerágeno aún si el animal ya posee una respuesta inmune contra el antígeno en la composición de tolerágeno.

EJEMPLO 9 Presencia del Residuo de Absorción de Alta Afinidad en el Antígeno que Suministra Antígeno Más Efectivo como un Tolerágeno Los efectos de una porción de alta afinidad en el tolerágeno se discutieron en el Ejemplo 1 anterior, que mostró que el uso de una porción tal como 6 -fosfato de mañosa puede ser útil para aumentar la capacidad de tolerización en un antígeno. Este aspecto de las composiciones de tolerágeno se investigó además y los resultados se reportan en el presente Ejemplo y en la FIGURA 9. La iduronidasa normalmente comprende un 6-fosfato de mañosa y esta porción de absorción elevada facilita la absorción de la iduronidasa por las células objetivo a través del receptor 6-fosfato de mañosa. En el presente ejemplo, la iduronidasa recombinante se desfosforiló por la incubación con fosfatasa ácida unida a perlas. La enzima se desfosforiló exitosamente como se demuestra por la falta de absorción eficiente en los fibroblastos Hurler y una Kabsorción que no fue demasiado baja para calcularse. La desfosfo- iduronidasa se utilizó en un régimen de tolerización similar a los experimentos de tolerización conducidos con la iduronidasa discutida en los ejemplos anteriores. Los datos se muestran en la FIGURA 9. Este estudio mostró que el canino tolerizado con desfosfo-iduronidasa no fue capaz de tolerizar, nuevamente sugiriendo que la afinidad de absorción elevada es necesaria para la tolerancia .

Ejemplo 10 Métodos para Inducir Tolerancia al Factor VIII El tratamiento de hemofilia A se basa en la capacidad para suministrar una cantidad efectiva del Factor VIII al hemofílico. Sin embargo, los anticuerpos o inhibidores a la terapia del Factor VIII pueden ser un problema significativo en pacientes con enfermedad de hemofilia A. El paciente hemofílico que ha desarrollado inhibidores de anticuerpo al Factor VIII pueden experimentar sangrado incontrolado suministrando la terapia del Factor VIII inefectiva. Los Ejemplos 1-9 describen métodos y composiciones para inducir una administración de tolerancia inmune a antígeno específica de o-iduronidasa o alfa-glucosidasa como un tolerágeno en combinación con un régimen de inmunosupresión durante un periodo de tiempo suficiente para tolerizar el huésped al tolerágeno. El presente ejemplo se dirige para inducir tolerancia inmune al Factor VIII. El presente ejemplo proporciona un protocolo para utilizarse para evitar y revertir la formación del inhibidor contra el Factor VIII. Preparación de un factor VIII tolerágenico El Factor VIII toleragénico se hace conjugando la proteína a una proteína de absorción elevada. En el enfoque más simple, la proteína del Factor VIII se conjuga utilizando una enzima lisosomal, iduronidasa que contiene un marcador de absorción de alta afinidad en sus carbohidratos N-unidos. Las proteínas se conjugan utilizando un agente de reticulación heterobifuncional (SBDB por ejemplo) . Óptimamente, la reticulación podría ocurrir en una relación de 1:1 y las proteínas reticuladas purificadas. Tolerización de un paciente hemofílico: El paciente recibiría ciclosporina A en la dosis esperada para ser 12.5 mg/kg/día dividida para lograr un nivel sanguíneo de más de 400 ng/ml . El paciente recibiría también Azatioprina a 2-5 mg/kg cada tercer día como sea apropiado para un paciente humano. Después de 18 días de los fármacos, el paciente recibiría 0.6 mg/kg del tolerágeno en una infusión en una base semanal. Después del día 32, el CsA y Aza se cortan a la mitad en un tamaño de dosis y después del día 46 los fármacos se cortan a ½. En el día 60, el CsA+Aza se termina y las infusiones semanales continúan. La supervisión de la respuesta inmune mostraría únicamente una respuesta modesta si la hay que fue menor de 20% veces la respuesta anterior sin tolerancia. El paciente recibe infusiones del factor VIII normal y el tolerágeno se termina. Si es necesario, el tolerágeno adicional puede administrarse para mantener el estado tolerante a intervalos.

Ejemplo 11 Tolerancia a Antígenos de célula ß en Diabetes Los anticuerpos y respuestas inmunes celulares a antígenos de célula ß, tales como, descarboxilasa del ácido glutámico (GAD) son responsables para la destrucción de la célula ß pancreática en el inicio de la diabetes. La inducción de tolerancia a estos antígenos proporcionaría un método importante para evitar la progresión e inicio de diabetes en pacientes con riesgo o que tiene inicio de síntomas de diabetes del Tipo 1. GAD es un importante antígeno pero otros antígenos tales como IA2 e insulina podrían también estudiarse de esta manera. Preparación de GAD toleragénico: El toleragénico de GAD puede hacerse por fusión con una porción de péptido de absorción elevada. El gen para GAD humano se conecta en el cuadro con el gen para un péptido de absorción elevada tal como IGF2 , que se conoce une el receptor de 6 -fosfato de mañosa. Tal fusión permitiría a ambas proteínas hacerse en la estructura correcta y con la antigenicidad correcta y forma. Tolerización de un paciente con diabetes del tipo 1. Un nuevo paciente con inicio de diabetes quien estuvo antes en el curso de la enfermedad y retuvo alguna función de la célula ß, se utilizaría preferiblemente. El paciente recibiría ciclosporina A en una dosis esperada para ser 12.5 mg/kg/día dividida dos veces al día para lograr un nivel sanguíneo de más de 400 ng/ml . El paciente recibiría también azatioprina a 2-5 mg/kg cada tercer día como sea apropiado para un paciente humano. Después de 18 días de los fármacos, el paciente recibiría 0.06 mg/kg de tolerágeno en una infusión en una base semanal. Después del día 32, el CsA y Aza pueden cortarse a la mitad en un tamaño de dosis y después del día 46 los fármacos pueden cortarse a ¼. En el día 60, el CsA+Aza se termina y las infusiones semanales continúan. La dosis de tolerágeno puede entonces incrementarse a 0.6 mg/kg cada semana. Verificando la respuesta inmune probablemente mostraría únicamente una respuesta modesta si la hay que fue menor de 20% veces la respuesta anterior sin tolerancia. El paciente tendría tolerancia a la glucosa normalizada y el tolerágeno sería terminado. Si es necesario, el tolerágeno adicional podría administrarse para mantener el estado tolerante a intervalos para determinarse por la condición clínica del paciente.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para inducir tolerancia inmune a antígeno específica en un huésped mamífero, el método comprende : administrar una dosis efectiva de un tolerágeno que comprende una porción de absorción elevada durante un régimen de tolerización en donde el huésped se mantiene en un agente inmunosupresor de célula T; en donde el siguiente régimen de tolerización, hasta el retiro del agente inmunosupresor de célula T, el huésped mamífero es específicamente tolerante a epítopes presentes en el tolerágeno y de otra manera comprende un sistema inmune sustancialmente normal. 2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el régimen de tolerización además comprende · la administración de un agente antiproliferativo . 3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el régimen de tolerización se precede por un periodo de acondicionamiento, el periodo de acondicionamiento comprende .¦ administrar una combinación del agente inmunosupresor de célula T y el agente antiproliferativo en la ausencia del tolerágeno durante un periodo de tiempo suficiente para suprimir respuestas de célula T huésped. 4. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la dosis inicial del agente inmunosupresor de célula T se administra para mantener niveles supresores del agente en la sangre huésped al nivel mínimo. 5. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde durante el régimen de tolerización, el huésped se mantiene en una combinación de un agente ínmunosupresor de célula T y un agente antiproliferativo durante un periodo de al menos 6 semanas . 6. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el agente ínmunosupresor de célula T es una inmunofilina . 7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la inmunofilina es ciclosporina A. 8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde una dosis inicial de la ciclosporina A se administra de manera que el nivel mínimo es al menos aproximadamente 200 ng/m. 9. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde una dosis inicial de la ciclosporina A se administra de manera que el nivel mínimo es al menos aproximadamente 300 ng/mls. 10. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el agente antiproliferativo es un análogo nucleótido . 11. El método de acuerdo a la reivindicación 10, en donde el análogo nucleótido es un fármaco 6-mercaptopurina. 12. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el fármaco 6 -mercaptopurina es azatioprina. 13. El método de acuerdo con la reivindicación 2 , en donde el agente antiproliferativo es un fármaco antimetabolito . 14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el fármaco antimetabolito es un inhibidor de dihidrofolato reductasa u otras enzimas implicadas en metabolismo de nucleótido. 15. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la enzima metabólica nucleótida es dihidrofolato reductasa y el inhibidor es metotrexato, o un análogo del mismo . 15. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la azatioprina se mantiene en una dosis de 1 a 5 mg/ml/día por al menos aproximadamente dos semanas. 17. El método de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende : administrar una dosis efectiva del tolerágeno al menos 6 veces durante un régimen de tolerización de al menos aproximadamente 6 semanas. 18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la dosis 'efectiva del tolerágeno es menor de 50% de la dosis terapéutica normal. 19. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la dosis efectiva del tolerágeno es menor de 10% de la dosis terapéutica normal. 20. El método de acuerdo¦- con la reivindicación 17, en donde el tolerágeno es un polipéptido por el cual un 5 receptor de absorción elevado se expresa ampliamente en el huésped mamífero. 21. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el tolerágeno comprende 6-fosfato de mañosa. 22. El método de acuerdo con la reivindicación 21, 10 en donde el tolerágeno es un conjugado de 6-fosfato de mañosa de un antígeno de interés. 23. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el tolerágeno es un polipéptido terapéutico. 24. El método de acuerdo con la reivindicación 23, G5 en donde el polipéptido terapéutico se selecciona del grupo que consiste de anticuerpos, factores de coagulación, enzimas y factores de crecimiento. 25. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el tolerágeno es un autoantígeno . 20 26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el tolerágeno comprende una pluralidad de autoantígenos . 27. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el tolerágeno comprende un antígeno de transplante. 25 28. El método de acuerdo con la reivindicación 27, en donde el tolerágeno comprende una pluralidad de antígenos de transplante. 29. El método de acuerdo con -la reivindicación 1, que además comprende supervisar el huésped mamífero para una respuesta anamnéstica al antígeno, y reinducir tolerización al antígeno repitiendo el régimen de tolerización hasta un incremento de titulación de inmunoglobulina contra el antígeno . 30. Una composición tolerizante que comprende: un antígeno de polipéptido conjugado a una porción de absorción elevada; y un excipiente farmacéuticamente aceptable. 31. Un equipo, que comprende: una composición tolerizante que comprende un antígeno de péptido y un excipiente farmacéuticamente aceptable ; instrucciones para uso. 32. Un equipo de acuerdo con la reivindicación 31, que además comprende un agente inmunosupresor de célula T. 33. Un equipo de acuerdo con la reivindicación 32, que además comprende un agente antiproliferativo . 34. El equipo de acuerdo con la reivindicación 32, en donde el antígeno de péptido se conjuga a una porción de absorción elevada. 35. El uso de un tolerágeno, el tolerágeno comprende un antígeno y una porción de absorción elevada, para la fabricación de medicamento para uso en terapia de combinación con un agente inmunosupresor de célula T en la inducción profiláctica de tolerancia inmune al componente de antígeno del tolerágeno. 36. El uso de la reivindicación 35, en donde la terapia de combinación además comprende un agente antiproliferativo . 37. El uso de la reivindicación 35, en donde el agente inmunosupresor de célula T es una inmunofilina . 38. El uso de la reivindicación 37, en donde la inmunofilina es ciclosporina A. 39. El uso de la reivindicación 38, en donde la ciclosporina A se presenta en una cantidad entre aproximadamente 0.5 mg y 10 mg. 40. El uso de la reivindicación 36, en donde el agente antiproliferativo es un análogo nucleótido. 41. El uso de la reivindicación 40, en donde el análogo nucleótido es un fármaco 6-mercaptopurina. 42. El uso de la reivindicación 41, en donde el fármaco 6-mercaptopurina es azatioprina. 43. El uso de la reivindicación 36, en donde el agente antiproliferativo es un fármaco antimetabolito . 44. El uso de la reivindicación 43, en donde el fármaco antimetabolito es un inhibidor de dihidrofolato reductasa u otras enzimas implicadas en metabolismo nucleótido . 45. El uso de la reivindicación 43, en donde la enzima metabólica de nucleótido es dihidrofolato reductasa y el inhibidor es metotrexato, o un análogo de los mismos. 46. El uso de la reivindicación 42, en donde la azatioprina se formula en una composición que comprende de aproximadamente 0.5 mg a 10 mg. 47. El uso de la reivindicación 35, en donde el tolerageno es un polipéptido para el cual el receptor de absorción elevado se expresa ampliamente en el huésped mamífero . 48. El uso de la reivindicación 35, en donde el tolerágeno comprende 6-fosfato de mañosa. 49. El uso de la reivindicación 35, en donde el tolerágeno es un conjugado de 6-fosfato de mañosa de un antígeno de interés. 50. El uso de la reivindicación 35, en donde el tolerágeno es un polipéptido terapéutico. 51. El uso de la reivindicación 50, en donde el polipéptido terapéutico se selecciona del grupo que consiste de anticuerpos, factores de coagulación, enzimas y factores de crecimiento. 52. El uso de la reivindicación 50, en donde el polipéptido terapéutico es el Factor VIII. 53. El uso de la reivindicación 52, en donde el Factor VIII se conjuga a una porción de absorción elevada. 54. El uso de la reivindicación 53, en donde la porción de absorción elevada es iduronidasa que comprende un marcador de absorción de afinidad elevada en sus carbohidratos N-unidos. 55. El uso de la reivindicación 35, en donde el tolerágeno comprende un antígeno de célula ß. 56. El uso de la reivindicación 55, en donde el antígeno de célula ß se selecciona del grupo que consiste de descarboxilasa del ácido glutámico (GAD), IA2 e insulina. 57. El uso de la reivindicación 56, en donde el antígeno de célula ß es GAD. 58. El uso de la reivindicación 57, en donde el GAD se conjuga a una porción de absorción elevada. 59. El uso de la reivindicación 58, en donde la porción de absorción elevada es un péptido que se une a un receptor seleccionado del grupo que consiste del receptor transíerrina , receptor melanotransferrina y receptor 6-fosfato de mañosa. 60. El uso de la reivindicación 58, en donde la porción de absorción elevada es un péptido que se une a un receptor de 6- fosfato de mañosa. 61. El uso de la reivindicación 60, en donde el péptido es un factor de crecimiento similar a insulina (IGF) . 62. El uso de la reivindicación 35, en donde el tolerágeno es un autoantígeno . 63. El uso de la reivindicación 62, en donde el tolerágeno comprende una pluralidad de autoantígenos. 64. El uso de la reivindicación 35, en donde el tolerágeno comprende un antígeno de transplante. 65. El uso de la reivindicación 64, en donde el tolerágeno comprende una pluralidad de antígenos de transplante . 66. Un equipo que comprende un medicamento de cualquiera de las reivindicaciones 35-65.