CN100355900C - N取代α氨基酸的酶催化拆分方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种N取代α氨基酸外消旋异构体的酶催化拆分方法。包括如下步骤：使N-取代α氨基酸酯在缓冲液中和脂肪酶反应，反应混合物用乙醚萃取，水层酸化，乙醚萃取，乙醚层干燥，旋转蒸发，得到一种构型N取代α氨基酸；未反应的另一种构型N取代α氨基酸酯通过酶的第二次拆分可得到另一种构型N-取代α氨基酸。该方法条件温和，基本没有副产物；操作简单，拆分反应效率高，得到的目标化合物具有高化学纯度和光学纯度。本发明还提供一种测定N取代α氨基酸转化率和对映体过量值的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种外消旋光学异构体生物化学拆分方法，特别涉及一种N取代α氨基酸外消旋光学异构体的酶催化拆分方法。
背景技术
非蛋白氨基酸具有独特的生物学功能和药用价值，使其成为研究和开发的新方向和热点之一。N取代α氨基酸是非蛋白氨基酸衍生物中的一类化合物，是合成药物，农药，液晶材料的重要原料。它通常具有两个异构体，由单一构型的N取代α氨基酸出发，可以为药物分子引入手性，如：(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸是手性除草剂异丙甲草胺的关键中间体。
目前制备单一构型N取代α氨基酸通常采用化学拆分方法(5002606；United States Patent；Magden H.M.，Binnigen C.V.；1991)，然而，化学方法需要消耗较多的有机溶剂、污染环境、反应后处理也比较复杂。另外反应所需要的高温有可能导致产物的外消旋化、降解等副反应的发生，从而影响N取代α氨基酸的光学纯度。利用酶进行高选择性和高效的有机合成是当今合成化学的热点之一，其中以酶催化制备单一手性化合物备受瞩目，研究相当活跃。采用酶法对N取代α氨基酸进行拆分同化学方法相比，具有底物专一性好，立体选择性强，反应条件温和，产品易分离等化学方法所不能比拟的优点。
发明内容
本发明提供了一种在温和条件下，酶催化拆分N取代α氨基酸外消旋光学异构体，制备高光学纯和高化学纯的N取代α氨基酸的方法。
本发明提供的脂肪酶催化拆分N取代α氨基酸外消旋光学异构体方法，按如下步骤进行：
(a)使结构式为
的外消旋N-取代α氨基酸酯、缓冲溶液和脂肪酶，在恒温搅拌或振荡下反应，达到最高转化率后，终止反应，反应混合物含有一种构型N取代α氨基酸和未反应的另一种构型N取代α氨基酸酯；
(b)该混合物用乙醚萃取除去未反应的另一种构型N取代α氨基酸酯；
(c)水层酸化到PH5.5，用乙醚萃取；
(d)乙醚层用无水硫酸钠干燥后，旋转蒸发，得到一种构型N取代α氨基酸；
(e)含未反应的另一种构型N取代α氨基酸酯的乙醚层经旋转蒸发，进一步酶催化水解，加入缓冲液和另行选择的脂肪酶，在恒温搅拌或振荡下反应，达到最高转化率后，终止反应；
(f)水层酸化到PH5.5，用乙醚萃取；
(g)乙醚层用无水硫酸钠干燥后，旋转蒸发，得到另一种构型N取代α氨基酸。
上述(a)的反应可用以下反应式表示：
本发明所拆分的结构式为
的N-取代α氨基酸酯
式中R1和R2分别可以是直链烷烃、支链烷烃、烷烃衍生物、芳香烃及芳香烃衍生物；R3可以是直链烷烃，优选C1-C5的直链烷烃。
本发明所选用的脂肪酶可以是动物、微生物等各种来源的脂肪酶。
本发明所用的脂肪酶可以是游离酶也可以是固定化酶。
本发明所使用的游离脂肪酶与底物的质量比可以是1∶20-1∶1、固定化脂肪酶与底物的质量比可以是3∶1-9∶1。
本发明所使用的缓冲溶液可以是pH7.0-8.5范围的任何类型缓冲溶液。
本发明酶催化反应时间为4-96小时。
本发明恒温温度可选择范围为20-45℃。
本发明酸化剂可用盐酸、硫酸、磷酸、醋酸的溶液。
本发明所用的反应装置可因反应量多少设计，如果在实验室，可以把反应体系设在0.5mL到1000mL之间，用单颈三角烧瓶、圆底烧瓶，磁力搅拌，热电耦控温，或放到恒温摇床中振荡；如果在反应釜中大量生产，可用机械搅拌，水浴恒温。
本发明还提供一种测定N取代α氨基酸转化率和对映体过量值的方法：
转化率的检测：通过高效毛细管电泳，以三乙胺/乙酸缓冲液作为背景电解质溶液，反向电场强度340V/cm，电泳温度20℃，样品浓度50mg/L，紫外检测器200nm。
对映体过量值检测：通过高效毛细管电泳，以三乙胺/乙酸缓冲液作为背景电解质溶液，采用环糊精作为手性选择剂，不需要处理毛细管柱，反向电场强度340V/cm，电泳温度20℃，样品浓度50mg/L，紫外检测器200nm，就可以使N取代α氨基酸对映体得到较好分离。
本发明利用脂肪酶催化拆分制备N取代α氨基酸方法具有以下优点：
(1)酶催化拆分反应条件温和，基本没有副产物生成，可以得到高化学纯和光学纯的目标化合物N取代α氨基酸。
(2)拆分反应效率高，经过两步酶法拆分过程可以得到高化学纯和光学纯的另一构型的N取代α氨基酸，这样可以降低成本。
(3)实验操作简单，不需要减压蒸馏、柱层析等复杂的纯化过程，仅需要简单的萃取操作过程，就可以得到高化学纯和光学纯的N取代α氨基酸。而且萃取所需要的有机溶剂-乙醚经低温旋转蒸发后可重复使用；
(4)反应完全在纯缓冲溶液体系中进行，避免了化学方法中的大量有机溶剂的使用，减少了环境污染。
以下实施例旨在说明本发明：
实施例一
100mL反应瓶中，分别加入外消旋2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸苄基酯(5mmol)，磷酸缓冲液(pH7.0)，枯草杆菌脂肪酶(100mg)，37℃恒温摇床中开始反应。反应48小时后结束反应，用乙醚萃取除去未反应的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸苄基酯，水层用0.1mol/L HCL酸化到pH5.5，然后用乙醚进行萃取，乙醚层经无水硫酸钠干燥后，旋转蒸发，得到高化学纯和光学纯的(R)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸产品，产量：0.48g，化学纯度：94％，旋光纯度：90％e.e.p。
未反应的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸苄基酯(0.5g)加入到含有南极假丝酵母脂肪酶(0.1g)的磷酸缓冲液(pH8.0)中，25℃恒温摇床中开始反应，反应4小时后，结束反应，用0.1mol/LHCL酸化到pH5.5，然后用乙醚进行萃取，乙醚层经无水硫酸钠干燥后旋转蒸发，得到高化学纯和光学纯的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸产品，产量：0.46g，化学纯度：96％，旋光纯度：92％e.e.p。
以下证明(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸的绝对构型：
通过旋光仪测定拆分后得到的2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸的比旋光度同专利(5002606；United States Patent；Magden H.M.，Binnigen C.V.；1991)所报告的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸的比旋光度相比较，可以判定拆分得到的酸的绝对构型。
以下方法测定(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸的转化率和对映体过量值：
转化率的检测：通过高效毛细管电泳，以三乙胺/乙酸缓冲液作为背景电解质溶液(100mmol/L，pH＝5.5)，反向电场强度340V/cm，电泳温度20℃，样品浓度50mg/L，紫外检测器200nm。
对映体过量值检测：通过高效毛细管电泳，以三乙胺/乙酸缓冲液作为背景电解质溶液(100mmol/L pH＝5.5)，采用2，6-O-二甲基-β-环糊精(40mmol/L)作为手性选择剂，不需要处理毛细管柱，反向电场强度340V/cm，电泳温度20℃，样品浓度50mg/L，紫外检测器200nm，就可以使2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸对映体得到较好分离。
实施例二
100mL反应瓶中，分别加入外消旋2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸叔丁酯(5mmol)，碳酸钠缓冲液(pH8.5)，猪胰脂肪酶(0.4g)，37℃恒温摇床中开始反应，96小时后结束反应，用乙醚进行萃取除去未反应的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸叔丁酯，水层用0.1mol/L H2SO4酸化到pH5.5，然后用乙醚进行萃取，乙醚层经无水硫酸钠干燥后旋转蒸发，得到高化学纯和光学纯的(R)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸产品，产量：0.50g，化学纯度：98％，旋光纯度：94％e.e.p。
未反应的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸叔丁酯(0.6g)加入南极假丝酵母脂肪酶(0.1g)，磷酸缓冲液(pH8.0)，25℃恒温摇床中开始反应。反应4小时后，结束反应，用0.1mol/L H2SO4酸化到pH5.5，然后用乙醚进行萃取，乙醚层经无水硫酸钠干燥后旋转蒸发，得到高化学纯和光学纯的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸产品，产量：0.40g，化学纯度：96％，旋光纯度：92％e.e.p。
拆分得到的酸的绝对构型的证明、转化率和对映体过量值测定同实施例一。
实施例三
100mL反应瓶中，分别加入外消旋2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸甲酯(5mmol)，磷酸缓冲液(pH7.5)，柱状假丝酵母脂肪酶(0.3g)，40℃恒温摇床中开始反应，反应70小时后结束反应，用乙醚萃取除去未反应的(R)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸甲酯，水层用0.1mol/L醋酸酸化到pH5.5，然后用乙醚萃取，乙醚层经无水硫酸钠干燥后旋转蒸发，得到(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸产品，产量：0.5g，化学纯度：99％，旋光纯度：99％e.e.p。
未反应的(R)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸甲酯(0.5g)加入假单胞菌脂肪酶(0.2g)，磷酸缓冲液(pH8.0)，45℃恒温摇床中开始反应。反应60小时后结束反应，用0.1mol/L醋酸酸化到pH5.5，然后用乙醚进行萃取，乙醚层经无水硫酸钠干燥后旋转蒸发，得到高化学纯和光学纯的(R)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸产品，产量：0.4g，化学纯度：96％，旋光纯度：92％e.e.p。
拆分得到的酸的绝对构型的证明、转化率和对映体过量值的测定同实施例一。
实施例四
100mL反应瓶中，分别加入外消旋2-(3-氟甲基苯基氨基)丙酸异丙酯(5mmol)，磷酸缓冲液(pH8.0)，假单胞菌脂肪酶(0.2g)，45℃恒温摇床中开始反应，反应60小时后，用乙醚进行萃取除去未反应的(S)-2-(3-氟甲基苯基氨基)丙酸异丙酯，水层用0.1mol/L HCL酸化到pH5.5，然后用乙醚进行萃取，乙醚层经无水硫酸钠干燥后旋转蒸发，得到(R)-2-(3-氟甲基苯基氨基)丙酸产品，产量：0.5g，化学纯度：99％，旋光纯度：92％e.e.p。
未反应的(S)-2-(3-氟甲基苯基氨基)丙酸异丙酯(0.5g)加入到含有南极假丝酵母脂肪酶(0.1g)的磷酸缓冲液(pH8.0)中，25℃恒温摇床中开始反应，反应4小时后，结束反应，用0.1mol/LHCL酸化到pH5.5，然后用乙醚进行萃取，乙醚层经无水硫酸钠干燥后旋转蒸发，得到高化学纯和光学纯的(S)-2-(3-氟甲基苯基氨基)丙酸产品，产量：0.45g，化学纯度：96％，旋光纯度：85％e.e.p。
拆分得到的酸的绝对构型的证明、转化率和对映体过量值的测定同实施例一。
实施例五
100mL反应瓶中，分别加入外消旋2-异丙基氨基丙酸苄基酯(5mmol)，磷酸缓冲液(pH8.0)，南极假丝酵母脂肪酶(0.2g)，25℃恒温摇床中开始反应。反应4小时后结束反应，用乙醚萃取除去未反应的(R)-2-异丙基氨基丙酸苄基酯，水层用0.1mol/L HCL酸化到pH5.5，然后用乙醚萃取，乙醚层经无水硫酸钠干燥后旋转蒸发，得到(S)-2-异丙基氨基丙酸产品，产量：0.55g，化学纯度：99％，旋光纯度：98％e.e.p。
未反应的(R)-2-异丙基氨基丙酸苄基酯(0.5g)加入假单胞菌脂肪酶(0.2g)，磷酸缓冲液(pH8.0)，45℃恒温摇床中开始反应。反应60小时后结束反应，用0.1mol/L HCL酸化到pH5.5，然后用乙醚进行萃取，乙醚层经无水硫酸钠干燥后旋转蒸发，得到高化学纯和光学纯的(R)-2-异丙基氨基丙酸产品，产量：0.45g，化学纯度：99％，旋光纯度：98％e.e.p。
拆分得到的酸的绝对构型的证明、转化率和对映体过量值的测定同实施例一。
实施例六
100mL反应瓶中，分别加入外消旋2-[(2，6-二甲基)苯基氨基]丁酸甲酯(5mmol)，磷酸缓冲液(pH8.0)，固定化假单胞菌脂肪酶(9.0g，)(假单胞菌脂肪酶以分子筛为载体固定化)，37℃恒温摇床中开始反应，反应50小时后结束反应，反应混合物滤去酶，用乙醚进行萃取除去未反应的(S)-2-[(2，6-二甲基)苯基氨基]丁酸甲酯，水层用0.1mol/L HCL酸化到pH5.5，然后用乙醚萃取，乙醚层经无水硫酸钠干燥后旋转蒸发，得到高化学纯和光学纯的(R)-2-[(2，6-二甲基)苯基氨基]丁酸产品，产量：0.52g，化学纯度：91％，旋光纯度：90％e.e.p。
未反应的(S)-2-[(2，6-二甲基)苯基氨基]丁酸甲酯(0.5g)加入南极假丝酵母脂肪酶(0.1g)，磷酸缓冲液(pH8.0)，25℃恒温摇床中开始反应，反应4小时后，结束反应，用0.1mol/L HCL酸化到pH5.5，然后用乙醚进行萃取，乙醚层经无水硫酸钠干燥旋转蒸发，得到高化学纯和光学纯的(S)-2-[(2，6-二甲基)苯基氨基]丁酸产品，产量：0.5g，化学纯度：99％，旋光纯度：98％e.e.p。
滤出的固定化脂肪酶经处理后，可以重复使用多次。
转化率和对映体过量值的测定同实施例一。
Claims (5)
1.一种脂肪酶催化拆分N取代α氨基酸外消旋光学异构体的方法，按如下步骤进行：
(a)使结构式为
外消旋N取代α氨基酸酯，缓冲液和脂肪酶，在恒温搅拌或振荡下反应，达到最高转化率后，终止反应，反应混合物中含有一种构型N取代α氨基酸和未反应另一种构型N取代α氨基酸酯；
(b)该混合物用乙醚萃取除去未反应的另一种构型N取代α氨基酸酯；
(c)水层酸化到pH5.5，用乙醚萃取；
(d)乙醚层用无水硫酸钠干燥后，旋转蒸发，得到一种构型N取代α氨基酸；
(e)含有未反应的另一种构型N取代α氨基酸酯的乙醚层经旋转蒸发后，进一步酶催化水解，加入缓冲液和根据步骤(a)未反应N取代α氨基酸酯的构型选择相应的脂肪酶，未反应N取代α氨基酸酯的构型为S型，选择柱状假丝酵母脂肪酶或南极假丝酵母脂肪酶，未反应N取代α氨基酸酯为R型选择枯草杆菌脂肪酶或假单胞菌脂肪酶或猪胰脂肪酶；
在恒温搅拌或振荡下反应，达到最高转化率后，终止反应；
(f)水层酸化到pH5.5，用乙醚萃取；
(g)乙醚层用无水硫酸钠干燥后，旋转蒸发可得另一种构型N取代α氨基酸；
其中N取代α氨基酸酯结构式中的R1和R2表示C1-C5的直链烷烃、支链烷烃、烷烃衍生物、芳香烃及芳香烃衍生物，R2表示C1-C5直链烷烃；
其中脂肪酶是动物、微生物来源的脂肪酶；
其中缓冲液是pH7.0-8.5范围的缓冲溶液。
2.按照权利要求1的方法，其中所用的酶是游离酶或者是固定化酶。
3.按照权利要求1或2的方法，其中所使用的游离脂肪酶与底物的质量比为1∶20-1∶1、固定化脂肪酶与底物的质量比为3∶1-9∶1。
4.按照权利要求1的方法，其中恒温温度范围为20-45℃。
5.按照权利要求1的方法，其中酶催化反应时间为4-96小时。
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