CN100352423C - 一种含龟皮胶原的护肤品及其制备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含龟皮胶原组合物的护肤品。发明在添加剂中加入了龟皮胶原，龟皮胶原的加入量以重量百分比计为护肤品的2～8%。龟皮胶原的制备采用酶解法提取并保留了微量物质的天然活性。把提取的龟胶等制成产品配以添加剂制成护肤品。本发明制备的龟胶纯度高，成本低，经检测符合化妆品卫生标准和微生物标准；经动物试验，对大白鼠皮肤无刺激无过敏反应。产品对大白鼠皮肤中羟脯氨酸含量有明显提高，保水性也明显比同类高。此护肤品具明显抑制脂质过氧化物的功效并含有皮肤抗交联老化的因子，也具有祛斑、防皱、保湿功能。

Description

一种含龟皮胶原的护肤品及其制备

技术领域

本发明涉及一种护肤品，具体涉及含胶原添加剂的护肤品。

背景技术

胶原是一种天然蛋白质，广泛存在于动物的皮肤、骨、软骨、牙齿、肌腱韧带和血管中，是结缔组织极重要的结构蛋白质，起着支撑器官、保护肌体的功能。胶原一般是白色透明、无分支的原纤维，在它的周围是由粘多糖和其它蛋白质构成的基质。胶原分解后产生的寡肽及氨基酸中均含有羟脯氨酸，这在其它蛋白分解产物中少见。因而测定尿中羟脯氨酸或含羟脯氨酸的短肽的含量，可作为判断体内胶原分解的指标。胶原具有很强的生物活性及生物功能，能参与细胞的迁移、分化和增殖，使骨、腱、软骨和皮肤具有一定的机械强度。胶原因其弱的抗原性和良好的生物相容性，在烧伤、创伤、眼角膜疾病、美容、矫形、硬组织修复、创面止血等医药卫生领域用途广泛。胶原蛋白是皮肤组织的主要蛋白质成分，资源丰富，口感柔和、味道清淡，易于消化，也一直受到食品领域的关注，在许多食品中被用作功能物质和营养成分。

随着年龄的增长、肌肤的弹性降低、新陈代谢减慢而产生的生物垃圾，在水质、空气的污染、过度的阳光曝晒等自然界中存在的许多氧自由基诱导因子以及饮食不均、食物污染及压力指数增加等因素诱导下加速了自由基的产生。大量的自由基蓄积在体内脏器和皮肤上，很容易破坏胶原的分解和合成的代谢平衡，使人的自身抵抗力、机体创伤修复下降，胶原蛋白交联老化，可影响到心血管、肺组织、肾脏、肝脏等行使正常的生理功能。同时肌肤容易失水干燥，肤色变暗，没有光泽，出现皱纹。

申请人经多年研究和实验发现，胶原交联、色素产生还有一个更重要的生化机制(Yin，D.，Biochemical basis of lipofuscin，ceroid，and age pigment-like fluorophores.Free Radic.Biol.Med.，1996，21：871-888.)，老年色素(色斑)荧光物质是人体基本生命过程中多种生化副反应的终产物，主要有与脂过氧化相关的通过羰基与蛋白质氨基交联而形成的荧光物质；以及不需氧而与糖类有联系的糖基化或美拉德反应而形成的荧光糖基化产物等。生物体内老年色素的形成是动态的连续变化过程，各个生化过程产生的棕黄色老年色素物质或游离存在、或结合到蛋白等其他生物分子上。从本质上看，生化副反应损变失修性累积是生理性衰老过程的生化本质(Yin，D.，Chen，K.，Theessential mechanisms of aging：Irreparable damage accumulation of biochemicalside-reactions.Exp.Gerontol.，2005，40：455-465).即申请人提出的广义衰老学说。

本研究室有关龟胶蛋白质组学的最新研究结果表明，乌龟的长寿与其身体组织杰出的抗衰老功效密切相关。乌龟胶原组织在增龄过程中不发生与人类皮肤和血管类似的老化交联改变则为龟胶抗衰老作用的重要表现之一(吴耀松，廖艳阳，印大中，胶原蛋白在美容中的应用及皮肤衰老机制研究进展，  中华现代皮肤科学杂志，2004，1：219-224.及向丹，贺慰光，印大中，朱泽瑞，冬眠乌龟体液与组织中可溶性蛋白质的SDS电泳及荧光分析，中国科学学报，2004，1：47-53.)。

当前市场上的护肤品种类繁多，不少品种在皮肤保湿、防皱及抗衰老方面都有一些作用，但保湿时间短，防皱及抗衰老效果不明显；而人们对护肤品在这方面功效的要求又越来越高，因此研制开发一种安全、保湿时间较长、防皱及抗衰老效果更为明显的护肤品是人们的迫切需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种含龟皮胶原的护肤品，以解决当前护肤品存在的上述问题。

实现本发明目的的技术方案为：含龟皮胶原的护肤品，包括由油相原料和水相原料组成的基料以及具有一定功效的添加剂，本发明在添加剂中加入了龟皮胶原，龟皮胶原的加入量以重量百分比计为护肤品的2～8％。含龟皮胶原组合物的护肤品的制备方法，包括油相原料的溶解，水相原料的加入、加热及灭菌，乳化与稀释以及含龟皮胶原的添加剂的加入，龟皮胶原的制备方法，依次按下列步骤进行：

1)：前处理：龟皮先后用水及去离子水洗净，洗净的龟皮用0.5％～10％的稀碱溶液在室温下浸泡1～5天，稀碱溶液的用量为1～10(升/千克龟皮)，再用去离子水反复冲洗碱处理的龟皮，直到pH6.5～7.0，

2)：龟胶的提取：把上述洗净的龟皮加入pH2.5～5.0的乙酸或中性去离子水，加入量以覆盖龟皮即可，并添加蛋白酶，蛋白酶与龟皮的重量比为1∶10～1∶100，置于4℃酶解2～3天，过滤，提取重复3次，合并提取液，

3)：龟胶的纯化：将上述pH2.5～5.0或中性的滤液，以3000～10000r/min离心，去渣取离心液，把离心后清液放入透析袋内用去离子水透析，每隔3～4小时换水一次，直到用10％的AgNO₃溶液检验无沉淀生成，此时pH值在6.5～7.0左右。

4)龟胶的酶解：将胶原蛋白从透析袋中倒出，用适量水调节胶原粘稠度，用20000赫兹的超声波处理10min，在pH＝5，温度37℃条件下加1.5％胃蛋白酶与木瓜蛋白酶在恒温水浴中水解12h，然后在60℃温度下5min使酶失活，冷冻后于0～15℃保存，待用。

上述的蛋白酶包括胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等中的至少一种。

下面结合附图进一步详述本发明

附图说明

图1为龟胶与牛皮胶原、猪皮胶原、标准胶原的电泳对照图；

图中标号：1-样一是牛胶原蛋白；    2-样二是猪皮胶原蛋白样；

3-样三是标准I型胶原蛋白；         4-样四是龟皮的胶原蛋白；

5-样五是龟皮的胶原蛋白

图2为2种胶原多肽的水分残存率曲线；

图中线型：

-水

-丙二醇

-猪胶

-龟胶

图3为羟脯氨酸紫外分光吸收值变化表。

龟是长寿动物，龟作为中药材，主要是用龟板，而龟全身都是宝，随着养殖业的发展及中药材龟板的取用，亦会副产大量的龟皮原料，是用于制作胶原蛋白的很好原料。

本发明的护肤品中除了加入芦荟提取物、前花青素与维生素A外，还加入了2～8％的龟皮胶原，龟皮胶原组织在增龄过程中不发生与人类皮肤和血管类似的老化交联改变，因此具有抗衰老作用，还具有长时间的保湿效果。同时加入与龟皮胶原相配伍的芦荟提取物、前花青素与维生素A能增强护肤品的美白、清除自由基和滋润的功效。

龟皮胶原蛋白及含龟皮胶原蛋白组合物的护肤品的制备方法如下：

1、前处理

把龟皮先后用水与去离子水洗净，洗净的龟皮用0.5％～10％的稀碱溶液在室温下浸泡处理1～5天，稀碱溶液的用量为1～10(升/千克龟皮)，再用去离子水反复冲洗碱处理的龟皮，直到pH6.5～7.0。

2、龟胶的提取

一般蛋白质的提取方法分为碱法、酸法和酶法。酸水解法迅速而彻底，但色氨酸全部被破坏，丝氨酸和酪氨酸部分被破坏，且产品得率低。碱水解法迅速且彻底，但含羟基和巯基的氨基酸，全部被破坏且产生消旋作用(结构变异)。为更好更完全地得到活性蛋白，采用酶解法。将上述洗净的龟皮加入pH2.5～5.0的乙酸或中性去离子水，加入量以覆盖龟皮即可，并添加蛋白酶，蛋白酶与龟皮的重量比为1∶10～1∶100，在4℃酶解2～3天，过滤，龟胶的提取重复3次，合并提取液。

3、龟胶的纯化

将上述pH2.5～5.0或中性的滤液，用3000～10000r/min离心机离心，去渣取离心液，把离心后清液放入透析袋内透析，用去离子水透析，每隔3～4小时换水一次，直到用10％的AgNO₃溶液检验无沉淀生成，此时pH值在6.5～7.0左右。

4、龟胶的酶解

将胶原蛋白从透析袋中倒出，用适量水调节胶原粘稠度，用20000赫兹的超声波处理10min，在pH＝5，温度37℃条件下加1.5％胃蛋白酶与木瓜蛋白酶在恒温水浴中水解12h，然后在60℃温度下5min使酶失活，冷冻后于0～15℃保存，待用。

本发明采用的龟皮可以是新鲜的也可冰冻保存的，先用自来水冲洗，再用去离子水冲洗。所用的龟皮有海龟、两栖类龟、陆龟、旱龟等龟属的皮肤。

上述的蛋白酶包括胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、微生物酶中至少一种。

从图1可以看出纯化的龟胶与牛皮胶原、猪皮胶原以及标准胶原的纯度较高，分子大小、亚基构成相似。

5、含龟皮胶原的组合物护肤品

作为本发明化妆品中所用典型的添加剂或赋形剂，包括油相原料和水相原料，其中油相原料有动植物油，矿物油，脂油，蜡，高级醇，脂肪醇，硅油，磷脂，脂肪醇醚，多元醇脂等，水相原料有水溶性聚合物，粘土矿物质和净化水，三乙醇胺等。还可根据需要加入pH调节剂，表面活性剂，抗氧化剂，螯合剂，防腐剂，防霉剂，颜料物和香料等。另外，也可以与具有增白美容作用或皮肤化妆作用的其他活性成分，如血液循环促进剂，消毒剂，消炎剂，细胞活化剂，维生素类，氨基酸类，润湿剂和角质层分离剂等结合使用。

本发明产品进行了动物实验，用该产品涂布受试动物大白鼠后，观察大白鼠皮肤的刺激反应、皮肤中羟脯氨酸含量。实验结果为受试大白鼠皮肤均无红肿异常发生，该产品大白鼠皮肤中羟脯氨酸含量有明显提高(见图3)实验方法：大白鼠6只雌雄各半剪去背部鼠毛面积5cm²，用0.1克该产品涂于无毛皮肤每日二次，每次0.1克连续3个月，观察有无刺激反应。同时取皮用氯氨T法进行羟脯氨酸含量分析。后进行人体皮肤试验也没发现有任何刺激现象。

保水实验：准确称取1.0g胶原蛋白多肽，溶于一定量的蒸馏水中，并定容至100ml，然后量取1ml样液，将其平铺于直径为10cm的培养皿中，至于恒温恒湿的培养箱中，每隔10min测一次样液的水分残存率。同时用蒸馏水做对比。结果表明，龟皮胶原多肽的水分残存率明显高于猪胶多肽(见图2)。

本发明的化妆品可按需要配制成霜剂、油剂、乳剂、膏剂、保湿乳液、面膜、乳状洗液等。

本发明研制的护肤品经检测符合化妆品卫生化学标准和微生物标准；经动物试验，对大白鼠皮肤无刺激无过敏反应。产品在大白鼠皮肤中羟脯氨酸含量有明显提高，保水性也明显比同类高，因此本发明研制的护肤品具明显抑制脂质过氧化物的功效并含有皮肤抗交联老化的因子，因而具有祛斑、防皱、保湿功能；本发明制备的龟胶纯度高，成本低，具有开发应用的前景。

具体实施方式

本护肤品发明两个应用实施例。

实施例3：巴西龟皮胶原的制备

1：将冰冻保存的巴西龟皮1千克用15℃的自来水冲洗干净，去掉鳞片和皮下组织，再用去离子水冲洗干净。

2：用5％的Na₂CO₃溶液10升浸泡冲洗干净后的龟皮5天左右，再用水充分清洗碱处理的龟皮，直到呈中性。

3：在上述处理的龟皮里加入pH2.5的乙酸5升，并加入10克胃蛋白酶，于4℃下酶解2天，用纱布过滤，残渣再次酶解，处理同上，合并滤液。

4：用5000r/min的离心机离心，去渣取清液，把离心后清液放入透析袋内，用去离子水透析，每3～4小时换一次水，直到用10％的AgNO₃溶液检验无沉淀生成，此时pH值在6.5～7.0左右。

5：龟胶的酶解：将胶原蛋白从透析袋中倒出，用适量水调节胶原粘稠度，用20000赫兹的超声波处理10min，在pH＝5，温度37℃条件下加1.5％胃蛋白酶与木瓜蛋白酶在恒温水浴中水解12h，然后在60℃温度下5min使酶失活，冷冻后于0～15℃保存，待用。

实施例4：乌龟皮胶原的制备

1：将新鲜的乌龟皮500克用20℃的自来水冲洗干净，去掉皮下组织，再用去离子水冲洗干净。

2：用0.5％的NaOH溶液1升浸泡冲洗干净后的龟皮1天左右，再用水充分清洗碱处理的龟皮，直到呈中性。

3：在上述处理的龟皮里加入中性水2.5升，并加入50克木瓜蛋白酶，于4℃下酶解2天，用纱布过滤，残渣再次酶解，处理同上，合并滤液。

4：用10000r/min的离心机离心，去渣取清液，把离心后清液放入透析袋内，用去离子水透析，每3～4小时换一次水，直到用10％的AgNO₃溶液检验无沉淀生成，此时pH值在6.5～7.0左右。

5：龟胶的酶解：将胶原蛋白从透析袋中倒出，用适量水调节胶原粘稠度，用20000赫兹的超声波处理10min，在pH＝5，温度37℃条件下加1.5％胃蛋白酶与木瓜蛋白酶在恒温水浴中水解12h，然后在60℃温度下5min使酶失活，冷冻后于0～15℃保存，待用。

实施例5：龟胶化妆品的制备

油相：将实施例1或2中油相原料加入到融解锅中，进行加热，在不断搅拌下加热至70～75℃，使其充分溶化。要避免过度加热和长时间加热以防止原料成分氧化变质。容易氧化的油分、防腐剂和乳化剂等可在乳化之前加入油相，溶解均匀即可进行乳化。

水相：先将30％～50％去离子水加入到融解锅中，同时加入实施例1或2中水相原料，搅拌下加热至90～100℃，维持20分钟灭菌，待用。如配方中含有水溶性聚合物，应单独配制，将其溶解在水中，在室温下充分搅拌使其均匀溶胀，防止结团，如有必要还可进行均质，在乳化前加入水相。要避免长时间加热，以免引起粘度变化。为补充加热和乳化时挥发掉的水分，可按配方多加3％～5％的水。

先将上述将水相加入到油相中，进行均质乳化搅拌，开始乳化体是W/O型，随着水相的加入，变型成为O/W型乳化体，称为浓缩乳化体。

再加入剩余50％～70％未经加热而经过紫外线灭菌的去离子水进行稀释，因为浓缩乳化体的外相是水，所以乳化体的稀释能够顺利完成，此过程中，乳化体的温度下降很快。当去离子水加完后，乳化体的温度能下降到50～60℃。

此时加入防腐剂、香精，缓慢搅拌冷却到40℃左右时，加入龟皮胶原蛋白、维生素等添加剂，搅拌均匀冷却至16℃停止，瓶装，并进行质量评定。

Claims (2)

1、一种含龟皮胶原的护肤品，包括由油相原料和水相原料组成的基料以及具有一定功效的添加剂，本发明的特征在于添加剂中加入了龟皮胶原，龟皮胶原的加入量以重量百分比计为护肤品的2～8％；龟皮胶原的制备方法，依次按下列步骤进行：

1)、前处理：龟皮先后用水及去离子水洗净，洗净的龟皮用0.5％～10％的稀碱溶液在室温下浸泡1～5天，稀碱溶液的用量为1～10升/千克龟皮，再用去离子水反复冲洗碱处理的龟皮，直到pH6.5～7.0；

2)、龟胶的提取：把上述洗净的龟皮加入PH2.5～5.0的乙酸或中性去离子水，加入量以覆盖龟皮即可，并添加蛋白酶，蛋白酶与龟皮的重量比为1∶10～1∶100，置于4℃酶解2～3天，过滤，龟胶的提取重复3次，合并提取液；

3)、龟胶的纯化：将上述PH2.5～5.0或中性的滤液，以3000～10000r/min离心，去渣取离心液，把离心后清液放入透析袋内用去离子水透析，每隔3～4小时换水一次，直到用10％的AgNO₃溶液检验无沉淀生成，此时pH值在6.5～7.0左右；

4)、龟胶的酶解：将胶原蛋白从透析袋中倒出，用适量水调节胶原粘稠度，用20000赫兹的超声波处理10min，在pH＝5，温度37℃条件下加1.5％胃蛋白酶与木瓜蛋白酶在恒温水浴中水解12h，然后在60℃温度下5min使酶失活，冷冻后于0～15℃保存，待用。

2、如权利要求1所述的一种含龟皮胶原的护肤品，其特征在于龟胶的制备方法中所述的蛋白酶包括胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶中的至少一种。