CN100349918C - 呼吸道合胞病毒和腺病毒特异性免疫球蛋白制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种有既可预防，又可治疗、标本兼治的抗呼吸道合胞病毒和腺病毒高效价特异性免疫球蛋白的制备方法，首先用呼吸道合胞病毒或腺病毒经Hep-2细胞或人胚肾细胞培养增殖，制备病毒抗原，或根据呼吸道合胞病毒和腺病毒基因序列用基因工程方法表达制备的保护性抗原。其次经组织培养制备的病毒抗原，以不连续梯度密度离心纯化抗原，或以20%蔗糖淀层浓缩抗原，或层析吸附柱方法纯化抗原。然后用所制备的纯化抗原，建立筛选高效价抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白的方法，及体外中和病毒试验等。最后用低温乙醇方法或离子交换层析法方法或亲和层析法在具有高效价呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白血源中提取免疫球蛋白。

Description

呼吸道合胞病毒和腺病毒特异性免疫球蛋白制备方法

                         技术领域

本发明属于病毒学和免疫学领域，涉及一种药物制备方法，特别涉及一种用于预防和治疗的呼吸道合胞病毒和腺病毒特异性免疫球蛋白制备方法。

                         背景技术

呼吸合胞病毒(Respiratory virus RSV)和腺病毒(Adenovirus Adv)是引起呼吸道感染最常见的两种病毒。尤其是小儿上呼吸道感染，超过50％的病毒类感染是由这两种病毒所致，每年冬春季节流行，全年有散发病例存在。成人一般都具有抗这两种病毒免疫力，但在一些免疫功能低，如长期应用放、化疗病人，外科手术病人，器官移植病人等，也会引起感染，目前抗病毒感染常用的药物，一般为化学合成药，中草药，以及干扰素等生物制剂，在这些药物中尚无一种针对病毒且疗效肯定的药物。抗病毒免疫球蛋白是由病毒感染后，在体内产生的主要特异性的抗病毒物质。由于呼吸道合胞病毒和腺病毒的广泛流行，就会有一部分人是由隐性感染而获得抗病毒能力而产生高效价的抗呼吸道合胞病毒和腺病毒特异性免疫球蛋白。从血源中筛选高效价抗这两种病毒免疫球蛋白，可获得广泛供血来源，能有效满足临床的需要。

                         发明内容

本发明目的在于，提出一种抗呼吸道合胞病毒和腺病毒特异性免疫球蛋白的制备方法，采用该方法制备的抗呼吸道合胞病毒和腺病毒特异性免疫球蛋白，具有既可预防、又可治疗标本兼治的特点。

本发明的技术思路是，根据病毒感染后，人体可产生抗病毒免疫球蛋白，正常人群由于呼吸道合胞病毒和腺病毒的普遍存在隐性感染，其中有一部分人群具有高效价抗上述病毒免疫球蛋白的免疫学原理。采用呼吸道合胞病毒和腺病毒提取的抗原，建立ELISA方法免疫荧光方法及生物芯片方法，在健康献血源中筛选高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白，经肝炎病毒、艾滋病毒、梅毒等血源性传染病检验合格后，用低温乙醇方法提取免疫球蛋白，制备成药物应用于临床用以预防和治疗。

本发明所采用的技术方案是，抗呼吸道合胞病毒和腺病毒高效价特异性免疫球蛋白制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)制备呼吸道合胞病毒腺病毒抗原

将呼吸道合胞病毒和腺病毒分别接种于已成长单层的Hep-2细胞或人胚肾细胞，37℃孵育，每天观察细胞病变情况，当致细胞病变(CPE)出现+++以上时或经病毒抗原检测阳性(+++表示75％细胞出现明显病变)，收集细胞及上清，病毒灭活后经超声打碎、冰冻保存；

或按呼吸道合胞病毒和腺病毒的基因序列用基因工程方法表达制备保护性抗原；

按呼吸道合胞病毒和腺病毒的基因序列用基因工程方法表达制备保护性抗原的方法是，用低温乙醇分离法或离子交换层析法方法或亲和层析法筛选的含高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白的原料提取高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白，原料选自下组：人血浆、人血清、低温乙醇分离法的含特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白的中间产物；

2)纯化病毒抗原

以蔗糖淀层浓缩或以不连续梯度密度离心纯化病毒抗原，或层析吸附柱方法纯化病毒抗原；

蔗糖淀层浓缩或以不连续梯度密度离心纯化病毒抗原的方法是，将超声打碎的呼吸道合胞病毒和腺病毒抗原5000g离心20分钟，弃去沉渣留上清，装入以15％、30％、45％、60％的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，以165000g超速离心2小时，根据病毒的分子量确定该病毒所在离心管位置，吸出冰冻保存；

用离子交换层析法提取高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白时，原料经DEAE-Sepharose CL-6B或DEAE-Sepharose FF柱，抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白流穿出柱；平衡条件为pH5.0～6.0，离子强度为0.01～0.03；

3)建立筛选高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白方法

用提取的呼吸道合胞病毒及腺病毒抗原10μg/ml～20μg/ml包被酶板，建立ELISA方法或用病毒感染的细胞建立免疫荧光方法或用病毒抗原建立生物芯片方法，用以筛选正常人群献血源中高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白；并用中和试验方法确定高效价特异性免疫球蛋白的有效起始浓度，经血源性传染病原检测合格后，将血源冰冻保存，以备免疫球蛋白的制备；

所述的免疫荧光法是，用呼吸道合胞病毒和腺病毒接种Hep-2细胞，当细胞出现病变后，刮下细胞，以PH7.2，0.01M PBS缓冲液洗3次，制备抗原片，经冷丙酮固定后，冰冻保存，取待检血清或血浆，经稀释后，加于抗原片孵育，经洗涤后，加羊抗人荧光抗体，在荧光显微镜下观察，正常Hep-2细胞抗原片做阴性对照，判定结果；

所述的生物芯片方法是：抗原固化→抗原抗体反应→标记物显色→阅读仪阅读→结果判定。

用微孔滤膜为载体，固化入呼吸道合胞病毒及腺病毒抗原，利用微孔滤膜的渗滤，浓缩，凝集作用，使待检的献血员血清或血浆与载体上的抗原进行快速反应，再与抗人IgG标记物直接在膜上反应显色，反应后的芯片放入芯片阅读系统，在专用的软件的支持下，对不同点阵的灰度值进行分析，从而实现对呼吸道合胞病毒和腺病毒特异性IgG抗体的快速筛选。该方法较适合大样本量的筛选。

4)筛选的呼吸道合胞病毒及腺病毒抗原用低温乙醇方法或离子交换层析法方法或亲和层析法提取高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白；

所述的低温乙醇分离方法分离特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白的乙醇浓度为15％～25％；pH为5.1～7.2；温度为-3℃～-7℃；离出含特异性抗病毒免疫球蛋白的沉淀或上清，经超滤浓缩脱醇，若提取的呼吸道合胞病毒及腺病毒抗原纯度低于97％，用离子交换层析法提高纯度，使用含DEAE-或S-基团的离子交换树脂，直接吸附除特异性抗病毒免疫球蛋白之外的杂质，从而直接从流穿液获得纯化的抗病毒免疫球蛋白，其中条件为pH为5.0～6.8；

所述的离子交换树脂选自下组：DEAE-Sepharose、DEAE-Sepharose FF、S-Sepharose、S-Sepharose FF和DEAE-SepHadx A-50所述的离子交换层析法流穿出柱的抗病毒免疫球蛋白再通过Lysine-Sepharose 4B，将穿透液与洗涤液合并后，加入SP-Sephadex C50或CM-Sepharose FF吸附，使用pH11的甘氨酸解析出特异性抗病毒免疫球蛋白；平衡条件为pH值6.0～5.4；解析条件为pH11的甘氨酸；

所述的离子交换层析法流穿出柱的抗病毒免疫球蛋白再通过Lysine-Sepharose 4B，将穿透液与洗涤液合并后，加入SP-Sephadex C50或CM-Sepharose FF吸附，使用pH11的甘氨酸解析出特异性抗病毒免疫球蛋白；平衡条件为pH值6.0～5.4；解析条件为pH11的甘氨酸；

所述的亲和层析法提取高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白时，对原料进行缓冲液处理后，通过亲和层析柱，特异性抗病毒免疫球蛋白穿过亲和层析柱，特异性抗病毒免疫球蛋白进行离子交换层析，从而获得纯化的特异性抗病毒免疫球蛋白；

亲和层析的固体载体选自：Sephadex、PDX、Sephacryl、Sepharose、Sepharose CL、Sepharose FF、Superdex、Superose、Trisaceyl、Trisacylplus、Ultrogel A、Ultrogel AcA、高孔隙度的再生纤维素珠；缓冲液的盐浓度为0.004～0.04，pH值为4.8～9.2；

5)提纯后的抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白经60±1℃，10小时灭活病毒和/或在pH值4.1±0.3，在24±1℃条件下放置21天灭活病毒，再经除菌过滤，分装成抗病毒免疫球蛋白。

本发明的抗呼吸道合胞病毒和腺病毒特异性免疫球蛋白药物可在体内外中和病毒，调动免疫细胞特异地杀灭病毒，具有既可预防，又可治疗，标本兼治的特点。

                       具体实施方式

以下结合发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细说明。

依照上述技术方案，高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白药物制备方法，包括以下步骤：

首先，制备呼吸道合胞病毒和腺病毒抗原；把呼吸道合胞病毒及腺病毒，分别接种于已长成单层的Hep-2细胞或Hala或人胚肾细胞，37℃孵育，每天观察细胞病变情况，当细胞病变(CPE)出现+++时或经病毒抗原检测阳性，收集细胞及上清，经病毒灭活后超声打碎，放冰箱冰冻保存；或按呼吸道合胞病毒及腺病毒和基因序列，用基因工程方法表达制备的抗原。

其次，以20％蔗糖淀层浓缩抗原或以不连续梯度密度离心纯化病毒抗原或通过层析吸附柱纯化抗原。

将超声打碎的抗原离心，弃去沉渣留上清，装入15％、30％、5％、60％的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，165000g超速离心，时间2h，根据病毒的分子量确定，病毒所在离心管的位置，吸出冰冻保存备用。

然后，建立筛选高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白方法。

用提取和呼吸道合胞病毒及腺病毒抗原10μg/ml～20μg/ml包被酶板，建立ELISA方法或用病毒感染的细胞建立免疫荧光方法，或用病毒抗原建立生物芯片方法，用以筛选正常人群血源中高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白。用中和试验等方法确定特异性抗呼吸道病毒和腺病毒免疫球蛋白的高效价的起始浓度。经血源性传染病原检测合格后，将血源冰冻保存，以备免疫球蛋白的制备。

最后，用低温乙醇方法或离子交换层析法提取高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白。

1、以低温乙醇分离法分离的Cohn’s组分II+III(FII+III)或Cohn’s组分I+II+III(FI+II+III)为原料，利用乙醇调节溶液介电常数，在乙醇浓度15％-25％条件下，调节pH为5.1～7.2，控制温度在-3～-7℃分离出含特异性抗病毒免疫球蛋白的沉淀或上清，经超滤浓缩脱醇，如纯度低于97％，用离子交换层析提高纯度，尤其是使用含DEAE-或S-基团的离子交换树脂(如DEAE-sepharose、DEAE-sepharose FF、S-sepharose、S-sepharose FF和DEAE-sephadx A-50)直接吸附除特异性抗病毒免疫球蛋白之外的杂质，从而直接从流穿液获得纯化的抗病毒免疫球蛋白，其中条件为pH为5.0～6.8，提纯后的免疫球蛋白经60±1℃，10h灭活病毒和/或调pH4.1±0.3，在24±1℃放置21天灭活病毒，再经除菌过滤，分装成抗病毒免疫球蛋白。

2、特异性抗病毒免疫球蛋白的原料被引入平衡的DEAE-sepharose CL-6B或DEAE-sepharose FF柱，条件为pH5.0～6.0，离子强度为0.01～0.03，抗病毒免疫球蛋白流穿出柱，流穿出柱的抗病毒免疫球蛋白再通过Lysine-Sepharose 4B，将穿透液与洗涤液合并，并调pH值为6.0～5.4后，加入SP-Sephadex C50或CM-sepharose FF使用pH11的甘氨酸解析出特异性抗病毒免疫球蛋白，此分离方法分离的抗病毒免疫球蛋白纯度近100％，聚合体含量低，经60±1℃，10h灭活病毒和/或调pH4.1±0.3，在24±1℃放置21天灭活病毒，再经除菌过滤，分装成抗病毒免疫球蛋白。

3、采用亲和层析法提取高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白时，对原料进行缓冲液处理后，通过亲和层析柱，特异性抗病毒免疫球蛋白穿过亲和层析柱，特异性抗病毒免疫球蛋白进行离子交换层析，使用含DEAE-或S-基团的离子交换树脂，直接吸附除特异性抗病毒免疫球蛋白之外的杂质，从而直接从流穿液获得纯化的抗病毒免疫球蛋白，其中条件为pH为5.0～6.8。从而获得纯化的特异性抗病毒免疫球蛋白。

亲和层析的固体载体选自：Sephadex、PDX、Sephacryl、Sepharose、Sepharose CL、Sepharose FF、Superdex、Superose、Trisaceyl、Trisacylplus、Ultrogel A、Ultrogel AcA、高孔隙度的再生纤维素珠；缓冲液的盐浓度为0.004～0.04，pH值为4.8～9.2。

以下是发明人完成的实施例。

实施例1：抗呼吸道合胞病毒和腺病毒特异性免疫球蛋白喷雾剂

按上述方法制备的抗病毒特异性免疫球蛋白，加入可局应用III其水溶中活性稳定的抗菌素，通过上呼吸道喷雾吸入，可在上呼吸道粘膜中起到局部中和病毒及抗细菌继发感染的作用。冰冻保存，结冰后1周内用完。

实施例2：抗呼吸道合胞病毒和腺病毒高效价特异性免疫球蛋白注射液

按上述方法制备的抗病毒免疫球蛋白经无菌实验，安全实验合格后，可经静脉较大剂量输入体内，可用于危重病人的抢救，免疫功能低下等病人应用。

Claims (1)

1.抗呼吸道合胞病毒和腺病毒高效价特异性免疫球蛋白制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)制备呼吸道合胞病毒腺病毒抗原

将呼吸道合胞病毒和腺病毒分别接种于已成长单层的Hep-2细胞或人胚肾细胞，37℃孵育，每天观察细胞病变情况，当致细胞病变出现+++以上时或经病毒抗原检测阳性，收集细胞及上清，病毒灭活后经超声打碎、冰冻保存；

或按呼吸道合胞病毒和腺病毒的基因序列用基因工程方法表达制备保护性抗原；

按呼吸道合胞病毒和腺病毒的基因序列用基因工程方法表达制备保护性抗原的方法是，用低温乙醇分离法或离子交换层析法方法或亲和层析法筛选的含高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白的原料提取高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白，原料选自下组：人血浆、人血清、低温乙醇分离法的含特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白的中间产物；

2)纯化病毒抗原

以蔗糖淀层浓缩或以不连续梯度密度离心纯化病毒抗原，或层析吸附柱方法纯化病毒抗原；

所述的蔗糖淀层浓缩或以不连续梯度密度离心纯化病毒抗原的方法是：将超声打碎的呼吸道合胞病毒和腺病毒抗原5000g离心20分钟，弃去沉渣留上清，装入以15％、30％、45％、60％的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，以165000g超速离心2小时，根据病毒的分子量确定该病毒所在离心管位置，吸出冰冻保存；

所述的层析吸附柱方法是：用离子交换层析法提取高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白时，原料经DEAE-Sepharose CL-6B或DEAE-Sepharose FF柱，抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白流穿出柱；平衡条件为pH5.0～6.0，离子强度为0.01～0.03；

3)建立筛选高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白方法

用提取的呼吸道合胞病毒及腺病毒抗原10μg/ml～20μg/ml包被酶板，建立常规的ELISA方法或用病毒感染的细胞建立免疫荧光方法或用病毒抗原建立生物芯片方法，用以筛选正常人群献血源中高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白；并用中和试验方法确定高效价特异性免疫球蛋白的有效起始浓度，经血源性传染病原检测合格后，将血源冰冻保存，以备免疫球蛋白的制备；

所述的免疫荧光法是，用呼吸道合胞病毒和腺病毒接种Hep-2细胞，当细胞出现病变后，刮下细胞，以PH7.2，0.01M PBS缓冲液洗3次，制备抗原片，经冷丙酮固定后，冰冻保存，取待检血清或血浆，经稀释后，加于抗原片孵育，经洗涤后，加羊抗人荧光抗体，在荧光显微镜下观察，正常Hep-2细胞抗原片做阴性对照，判定结果；

所述的生物芯片方法是：用微孔滤膜为载体，固化入呼吸道合胞病毒及腺病毒抗原，利用微孔滤膜的渗滤，浓缩，凝集作用，使待检的献血员血清或血浆与载体上的抗原进行快速反应，再与抗人IgG标记物直接在膜上反应显色，反应后的芯片放入芯片阅读系统，在专用的软件的支持下，对不同点阵的灰度值进行分析，从而实现对呼吸道合胞病毒和腺病毒特异性IgG抗体的快速筛选；

4)筛选的呼吸道合胞病毒及腺病毒抗原用低温乙醇分离方法或离子交换层析法方法或亲和层析法提取高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白；

所述的低温乙醇分离方法分离特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白的乙醇浓度为15％～25％；pH为5.1～7.2；温度为-3℃～-7℃；离出含特异性抗病毒免疫球蛋白的沉淀或上清，经超滤浓缩脱醇，若提取的呼吸道合胞病毒及腺病毒抗原纯度低于97％，用离子交换层析法提高纯度，使用含DEAE-或S-基团的离子交换树脂，直接吸附除特异性抗病毒免疫球蛋白之外的杂质，从而直接从流穿液获得纯化的抗病毒免疫球蛋白，其中条件为pH为5.0～6.8；

所述的离子交换树脂选自下组：DEAE-Sepharose、DEAE-Sepharose FF、S-Sepharose、S-Sepharose FF和DEAE-SepHadx A-50所述的离子交换层析法流穿出柱的抗病毒免疫球蛋白再通过Lysine-Sepharose 4B，将穿透液与洗涤液合并后，加入SP-Sephadex C50或CM-Sepharose FF吸附，使用pH11的甘氨酸解析出特异性抗病毒免疫球蛋白；平衡条件为pH值6.0～5.4；解析条件为pH11的甘氨酸；

所述的亲和层析法提取高效价特异性抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白时，对原料进行缓冲液处理后，通过亲和层析柱，特异性抗病毒免疫球蛋白穿过亲和层析柱，特异性抗病毒免疫球蛋白进行离子交换层析，从而获得纯化的特异性抗病毒免疫球蛋白；

亲和层析的固体载体选自：Sephadex、PDX、Sephacryl、Sepharose、Sepharose CL、Sepharose FF、Superdex、Superose、Trisaceyl、Trisacylplus、Ultrogel A、Ultrogel AcA、高孔隙度的再生纤维素珠；缓冲液的盐浓度为0.004～0.04，pH值为4.8～9.2；

5)提纯后的抗呼吸道合胞病毒和腺病毒免疫球蛋白经60±1℃，10小时灭活病毒和/或在pH值4.1±0.3，在24±1℃条件下放置21天灭活病毒，再经除菌过滤，分装成抗病毒免疫球蛋白。