CN100335479C - 糖元合成酶激酶3的双环抑制剂 - Google Patents

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Abstract

提供了用于在体外抑制糖元合成酶激酶(GSK3)的活性，和在体内治疗GSK3介导疾病的，新颖的基于双环的，具有结构(I)的化合物，组合物和方法。本发明的方法、化合物和组合物可单用，或和其它用于治疗GSK3活性介导的疾病，如用于治疗糖尿病、阿耳茨海默氏病和其它神经变性疾病、动脉硬化性心血管疾病、原发性高血压、多囊卵巢综合征、X综合征、缺血、外伤性脑损伤、双向性精神障碍、免疫缺陷或癌症等的药物学上活性的药剂联用。

Description

糖元合成酶激酶3的双环抑制剂
发明领域
本发明涉及抑制糖元合成酶激酶3(GSK3)的活性的新的双环化合物，和含有这些化合物的药物组合物，以及该化合物和组合物单独或联合其它药物学上活性的药剂的用途。本发明提供的化合物和组合物具有在治疗由GSK3活性介导的疾病，如糖尿病、阿耳茨海默氏病和其它神经变性疾病、肥胖、动脉硬化性心血管疾病、原发性高血压、多囊卵巢综合征、X综合征、缺血(特别是大脑缺血)、外伤性脑损伤、双向性精神障碍，免疫缺陷或癌症等疾病中的实用性。
发明背景
糖元合成酶激酶3(GSK3)是丝氨酸/苏氨酸激酶，对其已鉴别出了两种同工型：α和β。Woodgett，Trends Biochem Sci.，16：177-81(1991)。两种GSK3同工型在静止细胞中都具有组成型活性。最初，GSK被鉴定为通过直接磷酸化而抑制糖元合成酶的激酶。在胰岛素活化时，GSK3被灭活，从而能够激活糖元合成酶，并可能还有其它胰岛素依赖性的事件，如葡萄糖运输。后来，已显示其它生长因子，它们像胰岛素一样，通过受体酪氨酸激酶(RTK)发出信号也灭活GSK3活性。这些信号分子的例子包括：IGF-1和EGF。Saito等，Biochem J.，303：27-31(1994)；Welsh等，Biochem J.，294：625-29(1993)；和Cross等，Biochem J.，303：21-26(1994)。
抑制GSK3活性的药剂在治疗由GSK3的活性介导的疾病中是有用的。另外，GSK3的抑制模仿生长因子信号传递途径的活化，因此GSK3抑制剂对治疗这些途径活性不足的疾病是有用的。下文描述了可用GSK3抑制剂治疗的疾病的例子。
糖尿病
2型糖尿病是老化过程中持续增长的普遍疾病。其最初特征是对胰岛素敏感性的降低，和循环的胰岛素浓度的补偿性上升，后者是维持正常的血糖水平所必需的。胰腺β细胞的分泌的增加导致了胰岛素水平提高，而导致的高胰岛素血症是与糖尿病的心血管并发症相关的。随着胰岛素抗性恶化，对胰腺β细胞的要求稳定提高，直到胰腺不再能提供足够水平的胰岛素，导致血糖水平提高。最终，发生明显的高血糖症和高血脂症，导致与糖尿病有关的破坏性的长期并发症，包括心血管疾病、肾衰竭和失明。尚未了解导致2型糖尿病的确切机制，但该机制导致葡萄糖对骨骼肌的运输受到损害，肝葡萄糖生产增加，和胰岛素应答不充分。膳食改善通常是无效的，因此大多数病人最终需要药物干涉，来有效防止和/或减缓疾病并发症的发展。可用一种或多种可购得的口服抗-糖尿病药剂治疗许多病人，包括磺脲，来提高胰岛素分泌。磺脲药物的例子包括：抑制肝葡萄糖生产的甲福明，和曲格列酮，一种胰岛素敏化药物。尽管利用这些药剂，30-40％的糖尿病不能用这些药物充分控制，而需要皮下胰岛素注射。另外，这些治疗各有副作用。例如，磺脲能导致低血糖，而曲格列酮能导致严重的肝中毒。目前，需要新颖和改良的药物来治疗前驱糖尿病和糖尿病病人。
如上所述，GSK3的抑制刺激胰岛素依赖性的过程，而且因此在治疗2型糖尿病中是有用的。最近用锂盐获得数据提供了支持该观点的证据。最近已报道锂离子能抑制GSK3活性。Klein等，PNAS 93：8455-9(1996)。1924年以来，已报道锂具有抗糖尿病效果，包括减少血浆葡萄糖水平，提高糖元吸收，加强胰岛素，上调葡萄糖合成酶活性和刺激皮肤、肌肉和脂肪细胞中的糖元的合成。然而，在抑制GSK3活性的使用中锂还未被广泛接受，可能是因为其文献记载的对GSK3以外的分子靶标的效果。嘌呤类似物5-碘结核菌素(也是GSK3抑制剂)，在大鼠肝细胞中也刺激糖元合成并拮抗胰高血糖素和后叶加压素对糖元合成酶的灭活。Fluckiger-Isler等，Biochem J，292：85-91(1993)；和Massillon等，BiochemJ 299：123-8(1994)。然而，也已显示该化合物抑制其它丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸激酶。Massillon等，Biochem J 299：123-8(1994)。
阿耳茨海默氏病
GSK3也涉及与阿耳茨海默氏病(AD)相关的生物途径。AD的病理学特征是淀粉样前体蛋白(APP)的非正常加工形式的胞外斑，称为β-类淀粉肽(β-AP)，和含有大部分由高磷酸化τ蛋白组成的成对螺旋纤丝的胞内神经纤维缠结的发展。GSK3是已发现的许多在PHFτ特征性非正常位点上体外磷酸化τ蛋白的激酶之一，而且是已被证明在活细胞和动物体内进行该作用的唯一激酶。Lovestone等，Current Biology 4：1077-86(1994)；和Brownlees等，Neuroreport 8：3251-3255(1997)。另外，GSK3激酶抑制剂，LiCl，在细胞中封闭τ高磷酸化。Stambolic等，Current Biology 6：1664-8(1996)。因此GSK3活性可能对于神经纤维缠结的产生和因此对于疾病的发展作出贡献。近来已显示GSK3β和另一种AD发病机理中的关键蛋白，早老蛋白1(PS1)有关。Takashima等，PNAS 95：9637-9641(1998)。PS1基因中的突变导致β-AP产生的增加，但该文作者也证明突变的PS1蛋白与GSK3β结合得更紧密，并且加强τ的磷酸化，其与PS1的相同区域结合。
有趣的是，也已显示另一种GSK3底物，β-连环蛋白，与PS1结合。Zhong等，Nature 395：698-702(1998)。GSK3磷酸化时降解的目标是胞液β-连环蛋白，而降低的β-连环蛋白活性与神经元细胞对β-AP诱导的神经元凋亡敏感性的增加有关。因此，GSK3β和突变PS1增加的缔合可说明在PS1突变性AD病人大脑中已观察到的β-连环蛋白水平的降低，和疾病相关的神经元细胞死亡的增加。与这些观察一致，显示注射反义而不是有义GSK3在体外封闭了β-AP对神经元的病理学作用，导致细胞死亡开始延迟24小时，并使1小时的细胞存活率从12提高到35％。Takashima等，PNAS 90：7789-93(1993)。在这些后来的研究中，胞内GSK3活性的加倍先于对细胞死亡的作用(施用β-AP3-6小时内)，提示除了提高GSK3与其底物的接近性的遗传机制外，β-AP确实能提高GSK3活性。通过观察到：GSK3蛋白质表达水平(但就此而言，不是比活性)在AD的突触后上清液中，比在正常脑组织中增加了50％提供了GSK3对AD的作用的进一步证据。Pei等，J Neuropathol Exp 56：70-78(1997)。因此，相信GSK3的特异性抑制剂将对缓解阿耳茨海默氏病的发展起作用。
其它CNS疾病
除了锂盐对上述疾病的作用，使用锂盐治疗双向性精神障碍疾病(躁狂抑郁综合征)已有很长的历史。该对锂的临床反应可反映GSK3活性和双向性精神障碍的病源有关，在该情况下GSK3抑制剂将与该指标有关。为了支持该观点，最近已显示2-丙基戊酸盐(valproate)(另一种常用于治疗双向性精神障碍的药物)也是GSK3抑制剂。Chen等，J.Neurochemistry 72：1327-1330(1999)。锂和其它GSK3抑制剂可对治疗双向性精神障碍起作用的一种机制是提高经受反常高水平的，由神经递质谷氨酸诱导的兴奋的神经元的存活率。Nonaka等，PNAS，95：2642-2647(1998)。还相信谷氨酸诱导的神经元兴奋毒性是与急性损伤，如脑缺血、外伤性脑损伤和细菌感染等有关的神经变性的主因。另外，相信过量谷氨酸信号是阿耳茨海默氏病，杭廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、AIDS相关性痴呆、肌萎缩性侧索硬化症(AML)和多发性硬化(MS)等疾病中可见的慢性神经元损伤的因子。Thomas，J.Am.Geriatr.Soc 43：1279-89(1995)。因此相信GSK3抑制剂是对这些疾病和其它神经变性疾病治疗是有用的。
免疫加强
GSK3使转录因子NF-AT磷酸化，并促进其从核中运出，和钙调磷酸酶的作用正相反。Beals等，Science 275：1930-33(1997)。因此，GSK3通过NF-AT封闭早期免疫应答的基因活化，而GSK3的抑制剂可允许并延长免疫应答的活化。因此，相信GSK抑制剂能延长和加强某些细胞因子的免疫刺激作用，而且这种作用能加强那些用于肿瘤免疫治疗或一般用于免疫治疗的细胞因子的能力。
其它疾病
锂还有其它生物学上的作用。它在体外和在体内都是造血作用的强刺激剂。Hammond等，Blood 55：26-28(1980)。在犬中，碳酸锂消除了嗜中性白血球减少症的复发，并使其它血细胞计数正常化。Doukas等，Exp Hematol 14：215-221(1986)。如果锂的这些作用是通过GSK3的抑制介导的，则GSK3抑制剂将具有更广泛的治疗用途。
由于GSK3的抑制剂能用于治疗许多疾病，新颖GSK3抑制剂的鉴定是非常需要的。
发明简述
现在，已惊人的发现，糖元合成酶激酶3(GSK3)活性能在体外或在体内被本发明提供的一些基于嘧啶并吡啶的衍生物抑制。另外，已发现本发明的化合物对GSK3具有特异性。因此，本发明提供了用于在体外抑制GSK3活性和在体内治疗GSK3介导的疾病的新颖化合物、组合物和方法。在一个方面，本发明提供了具有GSK3抑制活性的下式(I)的新颖化合物：
其中W和Z是可任选取代的碳、氮或硫；
X和Y分别选自氮、氧和可任选取代的碳；
n是0、1或2；
A1和A2是可任选取代的芳基、芳氧基、芳氨基或杂芳基；
R1、R2、R3和R4分别选自氢、羟基、和可任选取代的低级烷基、环状低级烷基、烷基氨基烷基、低级烷氧基、氨基、烷基氨基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、杂芳基羰基、杂芳烷基羰基、芳基和杂芳基；
R1’、R2’、R3’和R4’分别选自氢和可任选取代的低级烷基；
R5、R6和R7分别选自氢、羟基、卤素、羧基、硝基、氨基、酰氨基、脒基、亚酰胺基、氰基和取代或未取代的低级烷基、低级烷氧基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、杂芳基羰基、杂芳烷基羰基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、芳烷基羰氧基、烷基氨基羰氧基、芳基氨基羰氧基、甲酰基、低级烷基羰基、低级烷氧基羰基、氨基羰基、氨基芳基、烷基磺酰基、磺酰氨基、氨基烷氧基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、杂芳基氨基、杂芳烷基氨基、烷基羰基氨基、烷基氨基羰基氨基、芳基氨基羰基氨基、芳烷基羰基氨基、杂芳烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基、脒基、环烷基、环酰氨基、环硫代酰氨基、环脒基、杂环脒基、环亚酰氨基、杂环亚酰氨基、胍基、芳基、联芳基、杂芳基、杂联芳基、杂环、杂环烷基、芳基磺酰基和芳基磺酰氨基；
和其药物学上可接受的盐。
下式的化合物提供了本发明目前特别优选和新颖的化合物：
Figure C0081894000081
其中W、X、Y、A1、A2和R1-R7具有上述意义，及其药物学上可接受的盐。
本发明的方法、化合物和组合物可单独，或与其它药理学活性剂联用，可应用在治疗GSK3活性介导的疾病，如治疗糖尿病、阿耳茨海默氏病和其它神经变性疾病、肥胖症、动脉硬化性心血管疾病、原发性高血压、多囊卵巢综合征、X综合征、缺血、外伤性脑损伤、双向性精神障碍，免疫缺陷或癌症等。
发明详述
根据本发明，提供了在体外或体内抑制糖元合成酶激酶3(GSK3)活性的化合物、组合物和方法。在一个方面，本发明提供了具有GSK3抑制活性的下式(I)的新颖化合物：
其中W和Z是可任选取代的碳、氮或硫；
X和Y分别选自氮、氧和可任选取代的碳；
n是0、1或2；
A1和A2是可任选取代的芳基、芳氧基、芳氨基或杂芳基；
R1、R2、R3和R4分别选自氢、羟基、和可任选取代的低级烷基、环状低级烷基、烷基氨基烷基、低级烷氧基、氨基、烷基氨基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、杂芳基羰基、杂芳烷基羰基、芳基和杂芳基；
R1’、R2’、R3’和R4’分别选自氢和可任选取代的低级烷基；
R5、R6和R7分别选自氢、羟基、卤素、羰基、硝基、氨基、酰氨基、脒基、亚酰胺基、氰基和取代或未取代的低级烷基、低级烷氧基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、杂芳基羰基、杂芳烷基羰基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、芳烷基羰氧基、烷基氨基羰氧基、芳基氨基羰氧基、甲酰基、低级烷基羰基、低级烷氧基羰基、氨基羰基、氨基芳基、烷基磺酰基、磺酰氨基、氨基烷氧基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、杂芳基氨基、杂芳烷基氨基、烷基羰基氨基、烷基氨基羰基氨基、芳基氨基羰基氨基、芳烷基羰基氨基、杂芳烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基、脒基、环烷基、环酰氨基、环硫代酰氨基、环脒基、杂环脒基、环亚酰氨基、杂环亚酰氨基、胍基、芳基、联芳基、杂芳基、杂联芳基、杂环、杂环烷基、芳基磺酰基和芳基磺酰氨基；
和其药物学上可接受的盐。
在本发明的一个目前的优选例中，X和Y中至少一个是氮。该组的代表性化合物包括其中X和Y之一是氮，而X和Y中另一个是氧或可任选取代的碳的那些化合物。优选X和Y都是氮。
构成部分A1和A2分别可以是具有3-10个环上原子和可任选的一个或多个环上杂原子的芳环。因此在一个实施例中，A1和/或A2可以是任选取代的碳环芳基。另外，A1和/或A2是任选取代的杂芳基，如取代或未取代的吡啶基、嘧啶基、噻唑基、吲哚基、咪唑基、二唑基、四唑基、吡嗪基、三唑基、噻吩基、呋喃基、喹啉基、嘌呤基、萘基、苯并噻唑基、苯并吡啶基和苯并咪唑基，其可被至少一个，不多于三个取代基团取代。代表性取代基团可选自例如硝基、氨基、氰基、卤素、硫代酰氨基、脒基、氨肟基、烷氧基脒基、亚脒基、胍基、磺酰氨基、羧基、甲酰基、低级烷基、卤代低级烷基、低级烷氧基、卤代低级烷氧基、低级烷氧基烷基、低级烷基氨基低级烷氧基、低级烷基羰基、低级芳烷基羰基、低级杂芳烷基羰基、烷硫基，氨基烷基和氰基烷基。
在本发明的一个目前特别优选例中，A1和/或A2具有式：
Figure C0081894000101
其中Y是-NH或-O-；和R8和R9分别选自氢、硝基、氨基、氰基、卤素、硫代酰氨基、脒基、氨肟基、烷氧基脒基、亚脒基、胍基、亚磺酰氨基、羧基、甲酰基、低级烷基、卤代低级烷基、低级烷氧基、卤代低级烷氧基、低级烷氧基烷基、低级烷基氨基低级烷氧基、低级烷基羰基、低级芳烷基羰基、低级杂芳烷基羰基、烷硫基、芳基和芳烷基。最优选的A是选自硝基吡啶基、氨基硝基吡啶基、氰基吡啶基、氰基噻唑基、氨基氰基吡啶基、三氟甲基吡啶基、甲氧基吡啶基、甲氧基硝基吡啶基、甲氧基氰基吡啶基和硝基噻唑基。
在本发明的其它实施例中，R1、R2、R3和R4的至少一个是氢、未取代或取代的低级烷基，选自卤代低级烷基、杂环氨基烷基和低级烷基氨基低级烷基；或低级烷基氨基低级烷基。目前本发明优选例包括其中R1、R2和R3是氢，而R4选自氢、甲基、乙基、氨基乙基、二甲基氨基乙基、吡啶基乙基、哌啶基、吡咯烷基乙基、哌嗪基乙基和吗啉基乙基的化合物。
目前，本发明的其它优选化合物包括式(I)的化合物，其中R5和R7的至少一个选自取代和未取代的芳基、杂芳基和联芳基。在目前的优选例中，R5和R7的至少一个是取代或未取代的下式的基团：
Figure C0081894000111
其中R10、R11、R12、R13和R14分别选自氢、硝基、氨基、氰基、卤素、硫代酰氨基、羧基、羟基和可任选取代的低级烷基、低级烷氧基、低级烷氧基烷基、卤代低级烷基、卤代低级烷氧基、氨基烷基、烷基氨基、烷硫基、烷基羰基氨基、芳烷基羰基氨基、杂芳烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基、氨基羰基、低级烷基氨基羰基、氨基芳烷基、低级烷基氨基烷基、芳基、杂芳基、环杂烷基、芳烷基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、芳烷基羰氧基、芳基羰氧基烷基、烷基羰氧基烷基、杂芳基羰氧基烷基、芳烷基羰氧基烷基、和杂芳烷基羰氧基烷基。目前获得的特别优选的化合物是其中R10、R11、R13和R14是氢，而R12是选自卤素、低级烷基、羟基、低级烷氧基、卤代低级烷基、氨基羰基、烷基氨基羰基和氰基；R11、R13和R14是氢，而R10和R12分别选自卤素、低级烷基、羟基、低级烷氧基、卤代低级烷基和氰基；R10、R11、R13和R14是氢，而R12是杂芳基；R10、R11、R13和R14是氢，而R12是杂环烷基；和其中R10、R11、R12、R13和R14的至少一个是卤素，而R10、R11、R12、R13和R14的剩下基团是氢。优选的，R5和R7中的至少一个选自二氯苯基、二氟苯基、三氟甲基苯基、氯氟苯基、溴氯苯基、乙基苯基、甲基氯苯基、咪唑基苯基、氰基苯基、吗啉代苯基和氰基氯苯基。
在本发明的代表性实施例中，R6可以是芳烷基、羟基烷基、氨基烷基、氨基芳烷基、羰基氨基烷基、烷基羰基氨基烷基、芳基羰基氨基烷基、芳烷基羰基氨基烷基、氨基烷氧基烷基和芳基氨基烷基等取代烷基；烷基氨基、烷基羰基氨基、烷氧基羰基氨基、芳基烷基氨基、芳基羰基氨基、烷硫基羰基氨基、芳基磺酰基氨基、杂芳基氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基、芳烷基羰基氨基和杂芳烷基羰基氨基等取代氨基；或未取代或取代的氨基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、芳烷氧基羰基和烷基氨基烷氧基羰基等取代羰基。在其它实施例中，R6可选自脒基、胍基、环酰亚氨基、杂环酰亚氨基、环酰氨基、杂环酰氨基、环硫代酰氨基和杂环低级烷基。在其它优选例中，R6可以是芳基或杂芳基，如取代或未取代的吡啶基、嘧啶基、噻唑基、吲哚基、咪唑基、二唑基、四唑基、哌嗪基、三唑基、噻吩基、呋喃基、喹啉基、吡咯并吡啶基、苯并噻唑基、苯并吡啶基、苯并三唑基和苯并咪唑基。本文所用的代表性杂环基团包括：例如下列所示基团(其中取代基团和其它下文所示的取代基团的结合点，是通过上部的左手键)。这些杂环基团可进一步取代，并可在如对于有机和医学化学领域的技术人员结合本文公开的内容是明显的不同位置结合。
Figure C0081894000121
代表性杂芳基基团包括下文所示的那些。这些杂芳基基团可被进一步取代，并可在如对于有机和医学化学领域的技术人员结合本文公开的内容是明显的不同位置结合。
Figure C0081894000131
代表性环亚酰氨基和杂环酰亚氨基基团包括下文所示的那些。这些环酰亚氨基和杂环酰亚氨基可被进一步取代，并可在如对于有机和医学化学领域的技术人员结合本文公开的内容是明显的不同位置结合。
Figure C0081894000132
代表性取代脒基和杂环脒基基团包括下文所示的那些。这些取代脒基和杂环脒基基团可被进一步取代，并可在如对于有机和医学化学领域的技术人员结合本文公开的内容是明显的不同位置结合。
Figure C0081894000141
代表性取代烷基羰基氨基、烷氧基羰基氨基、氨基烷氧基羰基氨基和芳基羰基氨基基团包括例如下文所示的那些。这些基团可被进一步取代，并可在如对于有机和医学化学领域的技术人员结合本文公开的内容是明显的不同位置结合。
Figure C0081894000142
代表性取代氨基羰基基团包括例如下文所示的那些。这些杂环基团可被进一步取代，并可在如对于有机和医学化学领域的技术人员结合本文公开的内容是明显的不同位置结合。
Figure C0081894000143
代表性取代烷氧基羰基基团包括例如下文所示的那些。这些烷氧基羰基基团可被进一步取代，并可在如对于有机和医学化学领域的技术人员结合本文公开的内容是明显的不同位置结合。
Figure C0081894000151
目前本发明的特别优选化合物包括具有下列结构的化合物：
Figure C0081894000152
其中W、X、Y、A1、A2和R1-R7具有上述意义，及其药物学上可接受的盐。目前优选的该组的代表性化合物包括例如：4-氯-2-甲硫基-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯、4-(2，4-二氯苯基)-2-甲硫基-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯、4-(2，4-二氯苯基)-2-(甲基磺酰基)-5，6，7，8-四氢-吡啶并[3，4-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯、[4-(2，4-二氯苯基)(5，6，7，8-四氢-吡啶并[4，3-d]嘧啶-2-基)]{2-[(5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}胺盐酸盐、{2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}[4-(2，4-二氯苯基)-(5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-2-基)]胺盐酸盐、6-[(2-{[4-(2，4-二氯苯基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-2-基]氨基}乙基)-氨基]吡啶-3-甲腈盐酸盐、4-(2，4-二氯苯氧基)-2-甲硫基-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯、4-(2，4-二氯苯氧基)-2-(甲基磺酰基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯、{2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}{4-[(2，4-二氯苯基)氨基](5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-2-基)}胺盐酸盐、4-[(2，4-二氯苯基)氨基]-2-甲硫基-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯、4-[(2，4-二氯-苯基)氨基]-2-(甲基磺酰基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯、{2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}{4-[(2，4-二氯苯基)氨基](5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-2-基)}胺盐酸盐、4-(2，4-二氟苯基)-2-甲硫基-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]-嘧啶-6-羧酸叔丁酯、4-(2，4-二氟苯基)-2-(甲基磺酰基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯、4-(2，4-二氯苯基)-2-(甲基磺酰基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶、6-乙酰基-4-(2，4-二氯苯基)-2-(甲基磺酰基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶、6-乙酰基-2-({2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}氨基)-4-(2，4-二氯苯基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶和6-[(2-{[6-乙酰基-4-(2，4-二氯苯基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-2-基]氨基}乙基)氨基]吡啶-3-甲腈。
在另一方面，本发明提供了组合物，该组合物含有一定量的式(I)的化合物(该量的化合物当被施用到在人或动物体内时，能有效调节GSK3的活性)和药物学上可接受的载体。
在另一个实施例中，本发明提供了在人或动物中抑制GSK3活性的方法，包括对人或动物个体施用GSK3抑制量的结构(I)的化合物。
本发明还提供了治疗患GSK3介导的疾病的人或动物个体的方法，包括将治疗有效量的上式(I)的化合物，单独或联合其它治疗上活性的药剂一起施给人或动物个体。
在其它实施例中，本发明提供了用作药物的如上文限定的式I的化合物，以及在制造用于治疗糖尿病、阿耳茨海默氏病和其它神经变性疾病、肥胖、动脉硬化性心血管疾病、原发性高血压、多囊卵巢综合征、X综合征、缺血(特别是脑部缺血)、外伤性脑损伤、双向性精神障碍、免疫缺陷或癌症的药剂中使用这些化合物的方法。
如上文和本文其它地方所用，下列术语具有如下定义的意义：
“糖元合成酶激酶3”和“GSK3”可在本文中交替使用，指任何与人GSK3β氨基酸序列(Genbank登录号L33801)的56和340位之间的氨基酸具有60％以上的序列同源性的蛋白质。为了测定两条氨基酸序列或两条核酸之间的同源性百分数，按最佳比较目的排列该序列(如，可在一条多肽或核酸中引入缺口，来与另一条多肽或核酸最佳排列)。然后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当一条序列中的一个位置被另一条序列中对应位置上的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，分子在那一个位置是同源的(即，如本文所用氨基酸或核酸“同源”等价于氨基酸或核酸“等同”)。两条序列之间的同源性百分数是2条序列共有的相同位置数的函数(即，％同源性＝#相同位置/总#位置×100)。如Woodgett，Trends Biochem Sci.，16：177-81(1991)所述(在此引入以供参考)，最初通过其使糖元合成酶磷酸化作用鉴定了GSK3。通过调节GSK3激酶活性，可抑制或可刺激GSK活性的下游活性。例如，当GSK3活性被抑制时，可活化糖元合成酶，使糖元的生产增加。也知道GSK3能在各种其它环节(包括例如：c-jun、β-连接蛋白和τ-蛋白)中作为激酶。可理解，GSK3激酶活性的抑制可在不同的生物学环节中导致各种效果。然而，本发明不受任何本发明运作机制的理论限制。
本文所用的“GSK3抑制剂”指显示在下文一般描述的对GSK3抑制剂活性的无细胞试验中测量的，与GSK3相关的IC50不大于约100μM，更典型的不大于约50μM的化合物。“IC50”是将酶(如GSK3)活性降低到最大值一半的水平的抑制剂浓度。已发现，本发明代表性的化合物展示对GSK3的抑制剂活性。本发明的化合物优选展示如在无细胞GSK3激酶试验中测量得到的，对GSK3的IC50不大于约10μM、更优选不大于5μM，而更优选不大于约1μM，而最优选不大于200nM。“可任选取代”指用单价或二价基团取代氢。合适的取代基团包括例如：羟基、硝基、氨基、亚氨基、氰基、卤素、硫代、硫代酰氨基、脒基、亚脒基、氧代、氨肟基、甲氧肟基、亚脒基、胍基、亚磺酰氨基、羧基、甲酰基、低级烷基、卤代低级烷基、低级烷氧基、卤代低级烷氧基、低级烷氧基烷基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、杂芳基羰基、杂芳烷基羰基、烷硫基、氨基烷基、氰基烷基等。
取代基团自身可被取代。取代取代基团的基团可以是羧基、卤素、硝基、氨基、氰基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、氨基羰基、-SR、硫代酰氨基、-SO3H、-SO2R或环烷基、其中R通常是氢、羟基或低级烷基。
当被取代的取代基包含直链基团时，取代可在链内(如2-羟基丙基、2-氨基丁基等)或在链末端(如2-羟乙基、3-氰基丙基等)发生。被取代的取代基可以是共价键合的碳或杂原子的直链、支链或环状排列。
本文所用的“低级烷基”指支链或直链烷基基团，包含：1到10个未取代或取代(如用1个或多个卤素、羟基或其它基团，包括：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、新戊基、三氟甲基、五氟乙基等)的碳原子。
“亚烷基”指具有1到20个碳原子的二价直链或支链饱和脂族基团。本发明化合物中使用的典型亚烷基基团是低级亚烷基基团(在骨架中具有1到约6个碳原子)。本文的“烯基”指具有1个或多个双键和2到20个碳原子的直链、支链或环状基团。本文的“炔基”指具有1或多个三键和2到20个碳原子的直链、支链或环状基团。
本文所用的“低级烷氧基”指RO-，其中R是低级烷基。低级烷氧基的代表例包括甲氧基、乙氧基、叔丁氧基、三氟甲氧基等。
“环烷基”指单-或多环、杂环或碳环烷基取代基。典型的环烷基取代基具有3到8个骨架(即环)原子，其中各骨架原子是碳或杂原子。本文的术语“杂环烷基”指在环结构中具有1到5、更典型是1到4个杂原子的环烷基取代基。本发明化合物中使用的合适杂原子是氮、氧和硫。代表性杂环烷基基团包括：吗啉代基、哌嗪基、哌啶基(Piperadinyl)等。碳环烷基基团是环烷基基团，其中所有的环上原子都是碳。当与环烷基取代基联用时，术语“多环”在本文中指稠合或非稠合的烷基环状结构。
本文的“卤素”指卤素基团，如氟、氯、溴或碘。“卤代烷基”指被一个或多个卤素原子取代的烷基基团。术语“卤代低级烷基”指被一个或多个卤素原子取代的低级烷基基团。术语“卤代烷氧基”指被一个或多个卤素原子取代的烷氧基基团。术语“卤代低级烷氧基”指被一个或多个卤素原子取代的低级烷氧基基团。
“芳基”指具有3到14个骨架碳或杂原子的单环和多环芳族基团，同时包括碳环芳族基团和杂环芳族基团。碳环芳基是芳环中的所有成环原子都是碳的芳基。本文术语“杂芳基”指具有1到4个在芳族环中作为环上原子的杂原子，而剩下的环上原子是碳原子的芳基。当与芳基取代基联用时，本文的术语“多环”指稠合和非稠合的环状结构，其中至少一个环状结构是芳族的，如苯并二唑基(具有与苯基稠合的杂环，即
Figure C0081894000181
，)萘基等。本发明化合物中用作取代基的示范性芳基基团包括：苯基、吡啶基、嘧啶基、噻唑基、吲哚基、咪唑基、二唑基、四唑基、哌嗪基、三唑基、苯硫基、呋喃基、喹啉基、嘌呤基、萘基、苯并噻唑基、苯并吡啶基和苯并咪唑基等。
“芳烷基”指被芳基取代的烷基基团。通常，本发明化合物中使用的芳烷基基团具有结合在芳烷基基团的烷基部分的1到6个碳原子。本发明化合物中使用的合适芳烷基包括例如：苄基、甲基吡啶基等。
本文的“氨基”指-NH2基团。本文术语“烷基氨基”指-NRR’基团，其中R和R’分别选自氢或低级烷基。本文术语“芳基氨基”指-NRR’基团，其中R是芳基而R’是氢、低级烷基或芳基。本文的术语“芳烷基氨基”指-NRR’基团，其中R是低级芳烷基，而R’是氢、低级烷基、芳基、或低级芳烷基。
本文的术语“芳基环烷基氨基”指芳基-环烷基-NH-基团，其中环烷基是二价环烷基基团。通常，环烷基具有3到6个骨架原子，其中可任选1到约4个为杂原子。术语“氨基烷基”指末端被氨基取代的烷基基团。
术语“烷氧基烷基”指-烷基1-O-烷基2基团，其中烷基1指亚烷基或链烯基，而烷基2是烷基或链烯基。术语“低级烷氧基烷基”指烷氧基烷基，其中烷基1是低级亚烷基或低级链烯基，而烷基2是低级烷基或低级链烯基。术语“芳氧基烷基”指-亚烷基-O-芳基基团。术语“芳烷氧基烷基”指-亚烷基-O-芳烷基基团，其中芳烷基是低级芳烷基。
本文的术语“烷氧基烷基氨基”指-NR-(烷氧基烷基)基团，其中R通常是氢、低级芳烷基或低级烷基。本文的术语“氨基低级烷氧基烷基”指氨基烷氧基烷基，其中烷氧基烷基是低级烷氧基烷基。
本文的术语“氨基羰基”指-C(O)-NH2基团。本文的术语“取代的氨基羰基”指-C(O)-NRR’基团，其中R是低级烷基，而R’是氢或低级烷基。本文的术语“芳基氨基羰基”指-C(O)-NRR’基团，其中R是芳基而R’是氢、低级烷基或芳基。本文的“芳烷基氨基羰基”指-C(O)-NRR’基团，其中R是低级芳烷基，而R’是氢、低级烷基、芳基或低级芳烷基。
本文的“氨基磺酰基”指-S(O)2-NH2基团。本文的“取代的氨基磺酰基”指-S(O)2-NRR’基团，其中R是低级烷基，而R’是氢或低级烷基。本文的术语“芳烷基氨基磺酰基芳基”指-芳基-S(O)2-NH-芳烷基基团，其中芳烷基是低级芳烷基。
“羰基”指二价-C(O)-基团。
“羰氧基”一般指-C(O)-O-基团，这些基团包括酯-C(O)-O-R，其中R是低级烷基、环烷基、芳基或低级芳烷基。本文的术语“羰氧基环烷基”一般同时指“羰氧基碳环烷基”和“羰氧基杂环烷基”，即，其中R分别是碳环烷基或杂环烷基。本文的术语“芳基羰氧基”指-C(O)-O-芳基基团，其中芳基是单-或多环，碳环芳基或杂环芳基。本文的术语“芳烷基羰氧基”指-C(O)-O-芳烷基基团，其中芳烷基是低级芳烷基。
本文的术语“磺酰基”指-SO2-基团。“烷基磺酰基”指结构为-SO2R-的取代的磺酰基，其中R是烷基。本发明化合物中使用的烷基磺酰基基团通常是低级烷基磺酰基基团，在其骨架结构中具有1到6个碳原子。因此，本发明化合物中使用的典型烷基磺酰基基团包括例如：甲基磺酰基(即，R是甲基)，乙基磺酰基(即，其中R是乙基)，丙基磺酰基(即，其中R是丙基)等。本文的术语“芳基磺酰基”指-SO2-芳基基团。本文的术语“芳烷基磺酰基”指-SO2-芳烷基基团，其中芳烷基是低级芳烷基。本文的术语“磺酰氨基”指-SO2NH2。
本文所用的术语“羰基氨基”指二价-NH-C(O)-基团，其中羰基氨基基团的酰胺氮的氢原子可被低级烷基、芳基或低级芳烷基基团取代。这些基团包括氨基甲酸酯(-NH-C(O)-O-R)和酰胺-NH-C(O)-NR’-R，其中R和R’是直链或支链低级烷基，环烷基、或芳基、或低级芳烷基。术语“低级烷基羰基氨基”指烷基羰基氨基，其中R是在骨架结构中具有1到6个碳原子的低级烷基。术语“芳基羰基氨基”指-NH-C(O)-R基团，其中R是芳基。相似的，术语“芳烷基羰基氨基”指羰基氨基，其中R是低级芳烷基。
本文所用的术语“胍基(guanidino)”或“胍基(guanidyl)”指衍生自胍：H2N-C(＝NH)-NH2的基团。这些基团包括键合在带有形式双键的氮原子上的(胍的“2”-位，如二氨基亚甲基氨基，(H2N)2C＝NH-))和键合在带有形式单键的各氮原子上的(胍的“1-”位和/或“3-”位，如H2N-C(＝NH)-NH-)那些。任一这些氮原子上的氢原子可被合适的取代基，如低级烷基、芳基、或低级芳烷基取代。
本文所用的术语“脒基”指基团R-C(＝N)-NR’(基团在“N1”氮上)和R(NR’)C＝N-(基团在“N2”氮上)，其中R和R’可以是氢、低级烷基、芳基、或低级芳烷基。
可用本文所述的方法，或其它本领域熟知的方法容易合成本发明的化合物。
可用已知方法，如层析、结晶等纯化本发明的GSK3抑制剂化合物。
和至少一种其它激酶比较，本发明的化合物优选展现对GSK3相对充分选择性的抑制剂活性。本文所用的术语“选择性”指和至少一种其它激酶比较，更高的对GSK3的抑制性。优选本发明的GSK3抑制剂与其它两类激酶比较，对GSK3是选择性的。对GSK3以外的其它激酶的激酶活性试验是公知的。见Havlicek等，J.Med.Chem.，40：408-12(1997)，在此引入以供参考。可根据下式定量GSK3选择性：GSK3选择性＝IC50(其它激酶)÷IC50(GSK3)，其中当IC50(其它激酶)＞IC50(GSK3)时，GSK3抑制剂对GSK3是选择性的。因此，对GSK3有选择性的GSK3抑制剂展示的GSK3选择性比对GSK3以外的其它激酶的抑制性的选择性大1倍以上。在本文中，术语“其它激酶”指GSK3以外的激酶。这种选择性通常用实施例20中所述的无细胞试验测量。
通常，本发明的GSK3抑制剂对GSK3比对其它激酶展示至少约2倍(即IC50(其 它激酶)÷IC50(GSK3))以上的选择性，而更典型的是它们至少展示约5倍的选择性。通常，本发明的GSK3抑制剂展示的对GSK3的选择性，是至少一种其它激酶的至少约10倍，理想的至少约100倍，而更优选的，至少约1000倍。
可用本文所述的试验，以及本领域普通技术人员公知的试验容易地检测出GSK3抑制活性。鉴定GSK3特异性抑制剂的示范性方法包括无细胞的和基于细胞的GSK3激酶试验。无细胞GSK3激酶试验检测通过与多肽GSK3直接相互作用起作用的抑制剂，而基于细胞的GSK3激酶试验可通过与GSK自身直接相互作用，或干扰GSK3表达或干扰产生成熟活性GSK3所需的转录后加工起作用鉴定抑制剂。
一般，无细胞GSK3激酶试验可容易地通过下列步骤进行：(1)将GSK3与肽底物、放射性标记的ATP(如γ33P-或γ32P-ATP，两者都购自Amersham，ArlingtonHeights，Illinois)、镁离子、和可任选的一种或多种候选抑制剂一起培育；(2)将混合物培育一段时间，使放射性标记的磷酸通过GSK3活性掺入肽底物中；(3)将全部或部分酶反应混合物转移到另一个容器中，一般是微量滴定孔中，其含有均一量的捕获配体，它结合到在肽底物上的锚定配体上；(4)洗涤，以除去未反应的放射性标记ATP；然后(5)对留在各孔中的33P或32P定量。该量代表掺入肽底物的放射性标记磷酸的量。抑制作用被观察为掺入肽底物的放射性标记的减少。
用于无细胞试验的合适肽底物可以是任何肽、多肽或合成的肽衍生物，其在适量ATP存在下可被GSK3磷酸化。合适的肽底物可基于GSK3的各种天然蛋白底物序列的部分，而且还可含有N-末端或C-末端修饰或延伸，包括间隔序列和锚定配体。因此，肽底物可置于较大的多肽中，或可是为GSK3磷酸化而设计的孤立的肽。
例如，可基于DNA结合蛋白CREB的亚序列，如Wang等，Anal.Chem.，220：397-402(1994)(在此引入以供参考)中所述的CREB DNA结合蛋白中的SGSG-连接的CREB肽序列，来设计肽底物。在Wang等报道的试验中，CREB肽SXXXS基元的C-末端丝氨酸是可被cAMP-依赖典型蛋白激酶(PKA)酶促预磷酸化的，这是一个使基元N-末端丝氨酸能被GSK3磷酸化的步骤。或者，可用修饰的CREB肽底物(其具有同样的SXXXS基元，而且也含有N-末端锚定配体，但其合成时C-末端丝氨酸是被预磷酸化的(这样的底物可从Chiron Technologies PTY Ltd.，Clayton，Australia商业购得))。当肽合成时，在SXXXS基元中第二个丝氨酸的磷酸化免除了对作为独立步骤的，用PKA酶促磷酸化该残基的需要，而且锚定配体的掺入促进了在其与GSK3反应后肽底物的捕获。
一般，用于激酶活性试验的肽底物可含有一个或多个可被GSK3磷酸化的位点，和一个或多个可被其它激酶，但不被GSK3磷酸化的位点。因此，这些其它位点可被预磷酸化，来产生可被GSK3磷酸化的基元。本文的术语“预磷酸化”指在用底物肽进行激酶试验之前，用非放射性标记的磷酸磷酸化底物肽。在肽底物合成中，可方便的进行这种预磷酸化。
SGSG-连接的CREB肽可与锚定配体(如生物素)连接，其中P和Y之间靠近C末端的丝氨酸被预磷酸化。本文所用的术语“锚定配体”指可与肽底物结合，使肽底物易于被捕获配体捕获的配体，它能在洗涤步骤中固定肽底物，而使得未反应的放射性标记的ATP能被除去。示范性锚定配体是生物素。本文的术语“捕获配体”指能以高亲和力结合锚定配体的分子，其并与固体结构结合。结合的捕获载体的例子包括例如：抗生素蛋白或抗生蛋白链菌素涂布的微量滴定孔或琼脂糖珠。带有捕获配体的珠还可以与闪烁材料联合，来提供检测捕获到的放射性标记的底物肽的工具，或可在以后步骤中将闪烁材料加到捕获的肽中。
用已知方法可在闪烁计数器中定量捕获到的放射性肽底物。如果酶反应在仅有限部分(如少于20％)肽底物被磷酸化的条件下进行，在闪烁计数器中检测到的信号将与GSK3的活性成正比。如果在反应中存在抑制剂，GSK3活性将降低，因此掺入肽底物的放射性标记的磷酸量将变少。因此，将检测到较低的闪烁信号。结果，GSK3抑制活性将作为闪烁信号，与阴性对照(在反应中不存在抑制剂)比较的降低被检测出来。下文实施例20中更详细描述了该试验。
基于细胞的GSK3激酶活性测试通常利用能同时表达GSK3和GSK3底物的细胞，如用编码GSK3及其底物的基因，包括表达该基因的调控序列转化的细胞。为了实施基于细胞的试验，在本发明化合物存在下培育能表达这些基因的细胞。细胞被裂解，通过观察其相对于未磷酸化的形式在SDS PAGE上的泳动性，或通过测定对底物的磷酸化形式特异性的抗体识别的底物量来测定磷酸化形式的底物比例。底物磷酸化的量是化合物抑制活性的指标，即，作为与不存在抑制剂下进行的试验比较，磷酸化的减少检测了抑制作用。在基于细胞的试验中检测到的GSK3抑制活性可以是由于GSK3表达的抑制，或通过对GSK3激酶活性的抑制。
因此，基于细胞的试验也可用来具体测试与GSK3抑制有关的活性，如τ蛋白磷酸化的抑制、胰岛素信号的加强等。例如，为了评估GSK3抑制剂抑制阿耳茨海默氏病类微管相关的蛋白τ的磷酸化，可用人GSK3β和人τ蛋白共转染细胞，然后与一种或多种候选抑制剂一起培育。对于这类试验可用各种哺乳动物细胞系和表达载体。例如，可同时用人GSK3β表达质粒(根据Stambolic等，1996，CurrentBiology，6：1664-68中所述的方案(在此引入以供参考))和含有在SV40早启动子下的人τ蛋白编码序列的表达质粒，如pSG5转染COS细胞。还可见Goedert等，EMBO J，8：393-399(1989)，在此引入以供参考。可用特异性抗体，如AT8，其可从Poiymedco Inc.(Cortlandt Manor，New York)购得，在裂解细胞后容易的检测出τ的阿耳茨海默氏病类磷酸化。该下文实施例中更详细描述了该试验。
类似的，GSK3抑制剂化合物通过活化糖元合成酶加强胰岛素信号的活性可容易的用基于细胞的糖元合成酶活性试验来确定。该试验使用通过提高糖元合成酶活性，来响应胰岛素刺激的细胞，如CHO-HIRC细胞系，其过度表达野生型胰岛素受体(～100,000结合位点/细胞)。可如Moller等，J Biol.Chem.，265：14979-14985(1990)和Moller等，Mol.Endocrinol.，4：1183-1191(1990)(两者都在此引入以供参考)所述产生CHO-HIRC细胞系。试验可通过在培养基中存在各种浓度的本发明化合物的条件下，培育血清-饥饿的CHO-HIRC细胞来进行，然后在培育期终点裂解细胞。如Thomas等，Anal.Biochem.，25：486-499(1968)所述，在裂解液中检测到糖元合成酶活性。对各样品作为最大糖元合成酶活性的百分数，计算糖元合成酶活性，如Thomas等，同上所述，并作为候选GSK3抑制剂浓度的函数作图。可用本领域一般技术人员熟知的常规拟合方法拟合一条四参数S形曲线，来计算将糖元合成酶活性提高到其最高水平一半(即，EC50)的候选GSK3抑制剂浓度。这在下文实施例21中更详细的描述。
用本领域一般技术人员熟知的方法可轻易的筛选GSK3抑制剂的体内活性。例如，可通过检测在2型糖尿病动物模型中提高葡萄糖耐受性的能力来方便的鉴定在2型糖尿病治疗中具有加强的治疗活性的候选化合物。特别是，可在糖尿病小鼠(如KK、db/db、ob/ob)或糖尿病大鼠(如Zucker Fa/Fa或GK)中施用葡萄糖丸前，用数种途径之任一施给候选化合物。施用候选化合物和葡萄糖后，在预定时间间隔取血，并评估血清葡萄糖和胰岛素水平。在不存在内源胰岛素分泌水平的升高的情况下，葡萄糖处理的改善可看作胰岛素敏化和可指示化合物效力。下文实施例中更详细描述了该试验。
可以衍生自无机或有机酸的盐形式使用本发明的化合物。这些盐包括但不限于下列：乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、环戊烷丙酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、葡庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、延胡索酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐(pamoate)、果胶酸盐(pectinate)、硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。含氮基团还可用低级烷基卤化物(如甲基、乙基、丙基和丁基氯、溴和碘化物)；硫酸二烷酯(如硫酸二甲基、二乙基、二丁基和二戊基酯)；长链卤化物(如癸基、十二烷基、肉豆蔻基和十八烷基氯、溴和碘化物)；芳烷基卤化物(如苄基和苯乙基溴化物)等试剂季铵化。从而获得可溶或可分散于水或油的产物。
可用来形成药物学上可接受的酸加成盐的酸的例子包括盐酸、硫酸和磷酸等无机酸，和草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸等有机酸。可在式(I)的化合物最后分离和纯化中原位制备碱加成盐，或独立的通过使羧酸部分与合适的碱，如药物学上可接受的金属阳离子或铵的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐，或有机的伯、仲或叔胺反应。药物学上可接受的盐包括但不限于：基于碱金属和碱土金属的阳离子，如钠、锂、钾、钙、镁、铝盐等，以及无毒的铵盐、季铵盐和胺阳离子，包括但不限于：铵、四甲基铵、四乙基铵、甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙胺、乙胺等。其它可用来形成碱加成盐的代表性有机胺包括：二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。
可用各种途径，包括：肠内、肠道外和外用途径施药来施用本发明的化合物。例如，施药的合适模式包括：口服、皮下、透皮、透粘膜、电离子透入、静脉内、动脉内、肌肉内、腹腔内、颊内、舌下、鼻内、硬膜下、直肠等。
根据本发明的其它实施例，提供了一种含有本发明的GSK3抑制剂化合物和药物学上可接受的载体或赋形剂的组合物。
合适的药物学上可接受的赋形剂包括：加工剂和药物传递调节剂和增强剂，如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、单糖、二糖、淀粉、明胶、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、葡萄糖、羟基丙基-β-环糊精、聚乙烯基吡咯烷酮、低熔点蜡、离子交换树脂等，以及其中两种或多种的联合体。在“Remingtong’sPharmaceutical Science”Mack Pub.Co.，New Jersey(1991)，在此引入以供参考。
含有本发明GSK3抑制剂化合物的药物组合物可以是任何适于预期施药方法的形式，包括例如：溶液、悬液或乳液等。通常在制备溶液、悬液和乳液中使用液相载体。考虑在本发明的实施中使用的液相载体包括例如：水、盐水、药物学上可接受的有机溶剂，药物学上可接受的油或脂等，以及其中两种或更多种的混合物。液相载体可含有其它合适的药物学上可接受的添加剂，如增溶剂、乳化剂、营养素、缓冲剂、防腐剂、悬浮剂、增稠剂、粘度调节剂、稳定剂等。合适的有机溶剂包括：例如单羟基醇(如乙醇)，和多羟基醇(如二醇)。合适的油包括例如：大豆油、椰子油、橄榄油、红花油、棉籽油等。对于肠道外施药，载体还可以是油性酯(如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯等)。本发明的组合物也可以是微粒、微胶囊、脂质体包裹物等，和其中两种或多种的联合体的形式。
可经口、胃肠外、舌下，通过吸入喷剂、直肠或外用给药，以含有所需的常规无毒性的药物学上可接受的载体、佐剂和赋形剂的配成剂量单位的形式来施用本发明的化合物。外用也包括透皮施药(如透皮贴片或电离子透入装置)。本文所用的术语胃肠外包括：皮下注射、静脉内、肌肉内、胸骨内注射或输液技术。
可注射的制剂(如无菌可注射水性或油质悬液)可根据已知技术，用合适的分散或湿润剂、或悬浮剂配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒性的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬液，如1，3-丙二醇中的溶液。在可使用的可接受的载体和溶剂中有水、Ringer’s溶液和等渗氯化钠溶液。另外，常规使用无菌的不挥发性油作为溶剂或悬浮基质。为了该目的，可使用任何无刺激性的不挥发性油，包括合成的单-或二甘油酯。另外，油酸等脂肪酸可用于制备可注射物中。
药物直肠内施用的栓剂可通过将药物与合适的无刺激性赋形剂(如椰子油脂和聚乙二醇)混合来制备。该赋形剂在常温下是固体，但在直肠温度下是液体，而且将因此在直肠中融化并释放药物。
口腔施药的固体剂量形式可包括：胶囊、片剂、丸剂、粉末和颗粒。在这些固体剂量形式中，可将活性化合物与至少一种惰性稀释剂(如蔗糖、乳糖或淀粉)混合。这些剂量形式还可包括(如正常实施中所用的)，除惰性稀释剂以外的额外物质，如硬脂酸镁等润滑剂。就胶囊、片剂和丸剂而言，剂量形式还可含有缓冲剂。还可用肠溶包衣制备片剂和丸剂。
口腔施药的液体剂量形式可包括药物学上可接受的含有本领域常用的惰性稀释剂(如水)的乳液、溶液、悬液、糖浆和酏剂。这些组合物还可含有佐剂(如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、环糊精和甜味剂、调味剂和加香剂。
根据其它实施例，本发明提供了在人或动物体内抑制GSK3活性的方法，所述方法包含：施给个体一定量的具有结构(I)的GSK3抑制剂化合物(或含有这些化合物的组合物)，其量在该个体内能有效抑制GSK3活性。其它实施例提供了治疗细胞或在人或动物体内治疗GSK3-介导的疾病的方法，包含：施给细胞或人或动物一定量的本发明的化合物或组合物，其量在该细胞或个体内能有效抑制GSK3的活性。优选个体是人或非人动物个体。GSK3活性的抑制包括与对照比较或与所期望的GSK3活性比较，GSK3活性可检测的抑制。
本发明化合物的有效量一般包括：通过任何本文所述试验，通过本领域一般技术人员已知的其它GSK3激酶活性试验，或通过检测在患GSK3-介导疾病的个体内症状的减轻，检测到的任何足够引起抑制GSK3活性的量。
根据本发明可治疗的GSK3-介导的疾病包括：任何生物学或医学疾病，其中涉及GSK3活性，或其中GSK3的抑制加强了信号通过一途径传递，而这是要治疗的疾病的特征性缺陷。异常GSK3活性可以是该情况或疾病的原因或特征。代表性GSK3-介导的疾病包括：2型糖尿病、阿耳茨海默氏病和其它神经变性疾病、肥胖、动脉硬化性心血管疾病、原发性高血压、多囊卵巢综合征、X综合征、特别脑部缺血、外伤性脑损伤、双向性精神障碍、免疫缺陷或癌症等。
根据本发明，对个体的成功治疗可导致患医学或生物学疾病的个体体内症状减轻或缓和，如，疾病进一步进展停止，或疾病被预防。因此，例如，对糖尿病的治疗可使病人中葡萄糖或HbAlc水平下降。类似的，对阿耳茨海默氏病的治疗可导致通过测量痴呆增强速率的下降，而检测到疾病发展速率的减缓。
可联合载体材料来产生单剂形式的活性组分量将根据治疗的宿主和具体施药模式而变化。然而可理解，任何具体病人的特定剂量水平将根据各种因素，包括：使用的特定化合物的活性、年龄、体重、健康状况、性别、饮食、施药时间、施药途径、排泄率、药物配伍和经受治疗的具体疾病的严重程度而定。对于给定情况的治疗有效量可容易的由常规实验测定，并在普通技术人员的技能和判断能力的范围内。
对于本发明，治疗有效量一般将是约0.1mg/kg/日到100mg/kg/日，优选约1mg/kg/日到约20mg/kg/日，和最优选的约2mg/kg/日到约10mg/kg/日本发明的GSK3抑制剂化合物，其可用单剂或多剂施用。
还可用脂质体的形式施用本发明的化合物。如本领域已知的，脂质体一般是衍生自磷脂或其它脂类物质。脂质体是由分散在水基质中的单-或多层水合液晶形成的。可用任何无毒性的，生理学上可接受的，并且是可代谢的能形成脂质体的脂类。脂质体形式的本组合物除了本发明的化合物以外，还可含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选脂类是磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)，天然和合成的均可。形成脂质体的方法是本领域已知的。见例如，Prescott编，细胞生物学方法，卷XIV，Academic Press，New York，N.W.，p.33以及下列等等(1976)。
虽然本发明的化合物可作为单一的活性药物学试剂施用，它们也可与一种或多种在治疗疾病中使用的其它药剂联用。对于治疗2型糖尿病，代表性的可与本发明的化合物联用的药剂包括：胰岛素、曲格列酮、罗格列酮(rosiglitazone)、匹格列酮、格列甲嗪、甲福明、阿卡波糖等。对于治疗阿耳茨海默氏病，代表性的可与本发明的化合物联用的药剂包括：donepezil、他克林等。对于治疗双向性精神障碍，代表性的可与本发明的化合物联用的药剂包括：锂盐、2-丙基戊酸钠、卡巴米嗪等。对于治疗中风，代表性的可与本发明的化合物联用的药剂包括：组织血纤维蛋白溶酶原激活剂。
当其它活性试剂与本发明化合物联用时，一般如PHYSICIANS’DESKREFERENCE(PDR)53rd版(1999)(在此引入以供参考)使用这些额外的活性药剂，或这些治疗上有用的量是本领域一般技术人员已知的。
可以推荐的最大临床剂量或以较低的剂量施用本发明的化合物和其它治疗上的活性药剂。本发明组合物中活性化合物的水平是可变的，因此可根据施药途径、疾病严重程度和病人的反应获得所要的治疗反应。可将联合体作为独立组合物或作为含有这些药剂的单剂施用。当作为联合体施用时，可将治疗剂配制成独立的、在相同时间或不同时间施给的组合物，或治疗剂可作为单一组合物给药。
联系下列代表例，可更好的理解本发明的前述和其它部分。
实施例
实施例1
表征和纯化方法
通过高效液相层析(HPLC)，用带有2690分离模块的Waters Millennium层析系统(Milford，Massachusetts)确定了本发明化合物的特征。分析柱是来自Alltech的Alltima C-18反相柱，4.6×250mm(Deerfield，Illinois)。使用梯度洗脱，通常用5％乙腈/95％水开始，并在40分钟内进行到100％乙腈。所有溶剂均含有0.1％的三氟乙酸(TFA)。通过在220或254纳米处的紫外光(UV)吸收检测化合物。HPLC溶剂来自Burdick and Jackson(Muskegan，Michigan)，或fisherScientific(Pittsburgh，Pennsylvania)。在一些情况下，通过薄层层析(TLC)，使用衬有玻璃或塑料的硅胶板，如Baker-Flex Silica Gel 1B2-F可弯曲片评估了纯度。可在紫外光下目测TLC结果，或使用熟知的碘蒸汽和其它各种染色技术。
在Fisons VG Electrospray Mass Spectrometer上进行质谱分析。作为质子化的母离子报道了所有的质量。
用Varian 300MHz NMR(Palo Alto，California)进行了核磁共振分析。光谱参照是TMS或已知的溶剂化学位移。在提高的温度(即，75℃)下分析一些化合物样品，来促使样品溶解度提高。
可用元素分析(Desert Analytics，Tucson，Arizona)来评估本发明的一些化合物的纯度。
在Laboratory Devices Mel-Temp apparatus(Holliston，Massachusetts)上测定了熔点。
用Flash 40层析系统和KP-Sil，60A(Biotage，Charlottesville，Virginia)、Chromatotron径向色谱装置(Harrison Research，Palo Alto，California)、或通过HPLC使用-18反相柱进行制备性分离。通常使用的溶剂是二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯和三乙胺。
实施例2
1-[(叔丁基)氧羰基]-4-氧代哌啶-3-羧酸甲酯的合成
在Waters 2690分离模块上用Column Engineering 5μReliasil C18柱(50×4.6mm)和5％-80％乙腈水溶液的梯度斜率在18分钟内进行了HPLC。
在4-氧代哌啶-3-羧酸甲酯(5.0克，25.8毫摩尔)、氢氧化钠(1.24克，31.0毫摩尔)的1，4-二烷和水(60毫升∶30毫升)的溶液中分部加入二碳酸二叔丁酯(6.76克，31.0毫摩尔)。得到的溶液室温搅拌过夜。在乙酸乙酯和水之间分配反应混合物。分离有机层，用盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩，得到定量产率的黄色粘性油状的1-[(叔丁基)氧羰基]-4-氧代哌啶-3-羧酸甲酯。粗产物得到满意的NMR，不经纯化用于下一步。
实施例3
2-甲硫基-4-氧代-3，5，6，7，8-五氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯的合成
将含有1-[(叔丁基)氧羰基]-4-氧代哌啶-3-羧酸甲酯(6.64克，25.8毫摩尔)、2-甲基-2-硫代假尿硫酸酯(7.19克，25.8毫摩尔)和碳酸铯(16.8克，51.6毫摩尔)的1-甲基-2-吡咯烷酮(100毫升)溶液在氮气下加热至80℃过夜。在反应混合物中加入水，得到均匀溶液，用冰醋酸调节到pH4-5。在该过程中形成了白色沉淀。过滤混合物。用水和乙酸乙酯洗涤收集的固体，得到白色粉末状2-甲硫基-4-氧代-3，5，6，7，8-五氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯(3.0克)。滤液在乙酸乙酯和水之间分配。分离有机层，用盐水洗涤，干燥(MgSO4)并过滤。真空浓缩滤液得到黄色固体，用乙醚研磨得到更多白色茸毛状粉末的2-甲硫基-4-氧代-3，5，6，7，8-五氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯(1.0克，总产率52％)。
HPLC[方法AZ-S]，6.78分钟(100％)；
MS(M+H/Z)，298
实施例4
4-氯-2-甲硫基-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯的合成
在2-甲硫基-4-氧代-3，5，6，7，8-五氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯(820毫克，2.76毫摩尔)的二氯甲烷(50毫升)溶液中在0℃滴加草酰氯(261毫升，3.03毫摩尔)。在其中加入两滴N，N-二甲基甲酰胺，得到的溶液在1小时内缓慢温至室温。浓缩反应混合物得到黄色固态/油状混合物，滤过硅胶床并用乙醚洗涤。浓缩滤液和洗液得到黄色粘性泡沫状4-氯-2-甲硫基-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯(850毫克，产率97％)。
HPLC[方法AZ-S]，12.04分钟(100％)；
MS(M+H/Z)，316
实施例5
4-(2，4-二氯苯基)-2-甲硫基-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯的合成
在氮气下回流加热4-氯-2-甲硫基-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯(334毫克，1.06毫摩尔)、2，4-二氯苯硼酸(boronic acid)(222毫克，1.16毫摩尔)、二(二亚苄基丙酮)合钯(0)(48毫克，0.053毫摩尔)和1，4-二(二苯膦基)丁烷(45毫克，0.11毫摩尔)的甲苯(2毫升)、1M碳酸钠水溶液(1毫升)和乙醇(0.5毫升)的混合物19小时。然后冷却反应混合物，加入水，分离甲苯层。用乙酸乙酯抽提水层，干燥(MgSO4)合并的有机抽提物，过滤并真空浓缩滤液。通过柱层析用15％丙酮的己烷溶液作为洗脱液纯化粗产物，得到淡黄色粘性泡沫状4-(2，4-二氯苯基)-2-甲硫基-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯(471毫克，产率大于100％)。
HPLC[方法AZ-S]，14.90分钟(75％)；
MS(M+H/Z)，426
实施例6
4-(2，4-二氯苯基)-2-(甲基磺酰基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯的合成
在4-(2，4-二氯苯基)-2-甲硫基-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯(383毫克，0.898毫摩尔)的二氯甲烷(10毫升)溶液中分部加入3-氯过苯甲酸(680毫克，57-86％，2.25毫摩尔)。室温搅拌混合物4小时，倾倒入含有10％碳酸钠水溶液和二氯甲烷的分液漏斗。分离有机层，用10％硫化钠、盐水洗涤，干燥(MgSO4)并过滤。浓缩滤液得到淡黄色泡沫/固态4-(2，4-二氯苯基)-2-(甲基磺酰基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯(430毫克，粗产率大于100％)。
HPLC[方法AZ-S]，11.93分钟(83％)；
MS(M+H/Z)，458
实施例7
砜的胺取代，Boc-基团的除去和最终产物盐酸盐制备的通用方法
80℃加热砜(1毫摩尔)和胺(2毫摩尔)的乙腈(1毫升)溶液过夜。浓缩反应混合物得到粗产物，通过用3％甲醇的二氯甲烷溶液作为洗脱液快速层析纯化。然后将得到的产物溶于乙腈(4毫升)和盐酸(0.5毫升，37％)。室温搅拌均匀溶液过夜，冻干后得到作为盐酸盐的最终产物。
用上述方法制备了下列化合物：
[4-(2，4-二氯苯基)(5，6，7，8-四氢-吡啶并[4，3-d]嘧啶-2-基)]{2-[(5-硝基(2-吡啶))氨基]乙基}胺盐酸盐
使4-(2，4-二氯苯基)-2-(甲基磺酰基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯和2-(2-氨基乙基氨基)-5-硝基吡啶反应，得到4-(2，4-二氯苯基)-2-({2-[(5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}氨基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯。
HPLC[方法AZ-S]，11.83分钟(91％)；
MS(M+H/Z)，560
用HCl处理并冻干得到[4-(2，4-二氯苯基)(5，6，7，8-四氢-吡啶并[4，3-d]嘧啶-2-基)]{2-[(5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}胺盐酸盐。
HPLC[方法AZ-S]，6.52分钟(80％)；
MS(M+H/Z)，460
{2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}[4-(2，4-二氯苯基)-(5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-2-基)]胺盐酸盐
使4-(2，4-二氯苯基)-2-(甲基磺酰基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯和2-氨基-3-硝基-6-(2-氨基-乙基氨基)吡啶反应，得到2-({2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}氨基)-[4-(2，4-二氯苯基)-(5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-2-基)]羧酸叔丁酯。
HPLC[方法AZ-S]，10.98分钟(100％)；
MS(M+H/Z)，575
用HCl处理并冻干得到{2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}[4-(2，4-二氯苯基)-(5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-2-基)]胺盐酸盐。
HPLC[方法AZ-S]，5.79分钟(95％)；
MS(M+H/Z)，475
6-[(2-{[4-(2，4-二氯苯基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-2-基]氨基}乙基)-氨基]吡啶-3-甲腈盐酸盐
使4-(2，4-二氯苯基)-2-(甲基磺酰基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯和2-(2-氨基乙基氨基)-5-氰基吡啶反应，得到4-(2，4-二氯苯基)-2-({2-[(5-氰基(2-吡啶基))-氨基]乙基}氨基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯。
HPLC[方法AZ-S]，10.66分钟(100％)；
MS(M+H/Z)，540
用HCl处理并冻干得到6-[(2-{[4-(2，4-二氯苯基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-2-基]氨基}乙基)-氨基]吡啶-3-甲腈盐酸盐
HPLC[方法AZ-S]，5.18分钟(80％)；
MS(M+H/Z)，440
实施例8
4-(2，4-二氯苯氧基)-2-甲硫基-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯的合成
回流加热4-氯-2-甲硫基-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯(100毫克，0.317毫摩尔)、2，4-二氯苯酚(57毫克，0.348毫摩尔)和二(三甲基甲硅烷基)氨化钠(1.0M钠的THF溶液，412微升，0.412毫摩尔)的四氢呋喃(2毫升)过夜。在乙酸乙酯和水之间分配混合物。分离有机层并用盐水洗涤，干燥(MgSO4)并过滤。浓缩滤液得到粗产物(180毫克)，并快速层析(0.5％甲醇的二氯甲烷溶液作为洗脱液)纯化，得到白色泡沫状4-(2，4-二氯苯氧基)-2-甲硫基-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯(52毫克，产率37％)。
HPLC[方法AZ-S]，15.93分钟(100％)；
MS(M+H/Z)，442
实施例9
4-(2，4-二氯苯氧基)-2-(甲基磺酰基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯的合成
按实施例6的方法，用3-氯过苯甲酸氧化4-(2，4-二氯苯氧基)-2-甲硫基-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯(52毫克，0.118毫摩尔)得到定量产率的4-(2，4-二氯苯氧基)-2-(甲基磺酰基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯。
HPLC[方法AZ-S]，12.85分钟(95％)；
MS(M+H/Z)，474
实施例10
{2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}{4-[(2，4-二氯苯基)氧基](5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-2-基)}胺盐酸盐的合成
按实施例7的方法，用2-氨基-3-硝基-6-(2-氨基乙基氨基)吡啶处理4-(2，4-二氯苯氧基)-2-(甲基磺酰基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯得到2-{2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}氨基)-4-(2，4-二氯苯氧基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯。
HPLC[方法AZ-S]，10.76分钟(95％)；
MS(M+H/Z)，591
用HCl处理并冻干得到{2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}{4-[(2，4-二氯苯基)氧基](5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-2-基)}胺盐酸盐。
HPLC[方法AZ-S]，5.18分钟(99％)；
MS(M+H/Z)，491
实施例11
4-[(2，4-二氯苯基)氨基]-2-甲硫基-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯的合成
回流加热4-氯-2-甲硫基-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸酯(100毫克，0.317毫摩尔)、2，4-二氯苯胺(56毫克，0.348毫摩尔)和二(三甲基甲硅烷基)氨化钠(1.0M的THF溶液，412微升，0.412毫摩尔)的四氢呋喃(2毫升)溶液的混合物过夜。在乙酸乙酯和水之间分配混合物。分离有机层并用盐水洗涤，干燥(MgSO4)并过滤。浓缩滤液得到粗产物，用快速层析(0.5％甲醇的二氯甲烷溶液作为洗脱液)纯化得到淡黄色油状4-[(2，4-二氯苯基)氨基]-2-甲硫基-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯(85毫克，产率61％)。
HPLC[方法AZ-S]，9.88分钟(100％)；
MS(M+H/Z)，441。
实施例12
4-[(2，4-二氯苯基)氨基]-2-(甲基磺酰基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯的合成
按实施例6的方法，用3-氯过苯甲酸氧化4-[(2，4-二氯苯基)氨基]-2-甲硫基-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯(84.7毫克，0.192毫摩尔)得到定量产率的4-[(2，4-二氯-苯基)氨基]-2-(甲基磺酰基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯。
HPLC[方法AZ-S]，11.40分钟(95％)；
MS(M+H/Z)，473
实施例13
{2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}{4-[(2，4-二氯苯基)氨基](5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-2-基)}胺盐酸盐的合成
按实施例7的方法，用2-氨基-3-硝基-6-(2-氨基乙基氨基)吡啶处理4-[(2，4-二氯苯基)氨基]-2-(甲基磺酰基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯得到2-{2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}氨基)-4-[(2，4-二氯苯基)氨基]-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-羧酸叔丁酯。
HPLC[方法AZ-S]，9.47分钟(95％)；MS(M+H/Z)，590
用HCl处理并冻干得到{2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}{4-[(2，4-二氯苯基)氨基](5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-2-基)}胺盐酸盐。
HPLC[方法AZ-S]，4.81分钟(99％)；
MS(M+H/Z)，490
实施例14
4-(2，4-二氟苯基)-2-甲硫基-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]-嘧啶-6-羧酸叔丁酯的合成
按实施例5的方法，偶联4-氯-2-甲硫基-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯(1.94克，6.14毫摩尔)和2，4-二氯苯硼酸(1.07克，6.76毫摩尔)得到白色泡沫状4-(2，4-二氟苯基)-2-甲硫基-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]-嘧啶-6-羧酸叔丁酯(1.54克，产率64％)。
HPLC[方法AZ-S]，13.21分钟(95％)；
MS(M+H/Z)，394
实施例15
4-(2，4-二氟苯基)-2-(甲基磺酰基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯的合成
按实施例6的方法，用3-氯过苯甲酸(2.48克，8.61毫摩尔)氧化4-(2，4-二氟苯基)-2-甲硫基-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯(1.54克，3.91毫摩尔)得到定量产率的白色泡沫状4-(2，4-二氟苯基)-2-(甲基磺酰基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯。
HPLC[方法AZ-S]，10.34分钟(95％)；
MS(M+H/Z)，426
实施例16
4-(2，4-二氯苯基)-2-(甲基磺酰基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶的合成
在4-(2，4-二氯苯基)-2-(甲基磺酰基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6-羧酸叔丁酯(100毫克，0.218毫摩尔)的二氯甲烷(2毫升)溶液中小心加入三氟乙酸(1毫升)。在室温下搅拌得到的溶液2小时，浓缩并在高真空下干燥得到定量产率的4-(2，4-二氯苯基)-2-(甲基磺酰基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶。
HPLC[方法AZ-S]，4.74分钟(86％)；
MS(M+H/Z)，358
实施例17
6-乙酰基-4-(2，4-二氯苯基)-2-(甲基磺酰基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶的合成
在4-(2，4-二氯苯基)-2-(甲基磺酰基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶(100毫克，0.279毫摩尔)、三乙胺(78微升，0.558毫摩尔)的二氯甲烷(2毫升)溶液中滴加乙酸酐(53微升，0.558毫摩尔)。室温搅拌得到的混合物过夜。在乙酸乙酯和使之间分配混合物。分离有机层并用盐水洗涤，干燥(MgSO4)并过滤。浓缩滤液得到定量产率的粗产物6-乙酰基-4-(2，4-二氯苯基)-2-(甲基磺酰基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶。
HPLC[方法AZ-S]，7.09分钟(81％)；
MS(M+H/Z)，400
实施例18
6-乙酰基-2-({2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}氨基)-4-(2，4-二氯苯基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶的合成
按实施例7的方法，用2-氨基-3-硝基-6-(2-氨基乙基氨基)吡啶与6-乙酰基-4-(2，4-二氯苯基)-2-(甲基磺酰基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶反应得到6-乙酰基-2-({2-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]乙基}氨基)-4-(2，4-二氯苯基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶。
HPLC[方法AZ-S]，7.23分钟(96％)；
MS(M+H/Z)，517
实施例19
6-[(2-{[6-乙酰基-4-(2，4-二氯苯基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-2-基]氨基}乙基)氨基]吡啶-3-甲腈的合成
按实施例7的方法，用2-(2-氨基乙基氨基)-5-氰基吡啶与6-乙酰基-4-(2，4-二氯苯基)-2-(甲基磺酰基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶反应得到6-[(2-{[6-乙酰基-4-(2，4-二氯苯基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-2-基]氨基}乙基)氨基]吡啶-3-甲腈。
HPLC[方法AZ-S]，6.87分钟(90％)；
MS(M+H/Z)，482
实施例20
用无细胞试验筛选对GSK3的抑制活性
将本发明的化合物溶于DMSO，测试对人GSK3β的抑制(人GSK3β的核苷酸序列存于GenBank登录号L33801)。在Hughes等，Eur.J.Biochem，203：305-11(1992)(其在此引入以供参考)中描述了GSK3β的表达。
将1等份的300微升底物缓冲液(30mM tris-HCl，10mM MgCl2，2mM DTT，3μg/ml GSK3β)和0.5μM生物素化的预磷酸化的SGSG-连接的CREB肽(ChironTechnologies PTY Ltd.，Clayton，Australia)加到96孔聚丙烯微量滴定板的各孔中去。每孔加入3.5微升含有要试验的各种可变浓度的化合物的DMSO或星形孢菌素(一种已知的激酶抑制剂，用作阳性对照)，或阴性对照(即，仅加入DMSO)，并充分混合。然后，加入每孔50微升1μM未标记的ATP和1-2×107cpmγ33P-标记的ATP，来引发反应，使反应在室温下进行三小时。
当反应在进行时，通过与每孔300微升含有1％牛血清清蛋白的PBS一起在室温下培育至少1小时，封闭被链霉亲和素包裹的Labsystems″Combiplate8″捕捉板(Labsystems，Helsinki，Finland)。然后抽吸除去封闭溶液，用100微升/孔中止试剂(50μM ATP/20mM EDTA)填充捕捉板。
当三小时酶反应结束时，将一式三份100微升等份的各反应混合物转移到含有中止溶液的三个孔，三块捕捉板上每块1孔中，并将孔内容物充分混合。室温下1小时后，抽吸清空捕捉板的孔，用PBS和12管Corning 430474ELISA板洗涤器洗5次。最后，将200微升Microscint-20闪烁液加到板的各孔中。用板密封剂涂布各板，然后在摇床上摇30分钟.在Packard TopCount闪烁计数器(Meridian，Connecticut)中对各捕捉板进行计数，将结果标为化合物浓度的函数的曲线。
然后根据该试验，筛选本发明化合物的对GSK3的抑制活性。实施例3-19的化合物显示了对该无细胞试验中GSK3的1μM或更低的IC50。
因此，这些结果表明，本发明的化合物显示对GSK3的抑制活性。
实施例21
用基于细胞的糖元合成酶试验筛选对GSK3的抑制活性
将CHO-HIRC细胞维持在10厘米组织培养板的Ham’s F12培养液/10％透析过的胎牛血清中。收集来自汇合的10厘米平板的细胞，并分散到6孔组织培养板的6个孔中，最终体积是2毫升培养基。使细胞37℃生长24小时。然后在不含胎牛血清的Ham’s F12培养基中洗涤三次，最终使细胞在2毫升无血清的培养基中，37℃再生长24小时。
在该时间终点，在各孔中加入20微升溶于DMSO的化合物，并在37℃培育。20分钟后，除去培养基，在室温下用PBS洗涤细胞一次，然后在培养板中用液氮迅速冷冻。然后在每孔存在140微升裂解缓冲液(50mM Tris pH7.8；1mM EDTA，100mMNaF，25微克/毫升亮抑蛋白酶肽，1mM DTT，1mM PMSF)的条件下，在冰上融化细胞。从板上刮下细胞，冻在干冰上的Eppendorf管中。然后融化裂解液，并在干冰上重新冻结。
在重新融化后，14,000g离心裂解液15分钟。然后取出上清液，存于冰上。将各上清液(45微升)加到45微升反应缓冲液(65mM Tris pH7.8；26mM EDTA，32.5mM KF，9.3mM UDP-葡萄糖；11mg/ml糖原；500nCi/ml 14C-UDP-葡萄糖)中，并将另45微升加到45微升反应缓冲液/20mM葡萄糖-6-磷酸中。30℃培育反应物30分钟，然后在2厘米方形31ET层析纸(Whatman)上点样。用66％乙醇洗涤滤纸2次费时20分钟，在丙酮中简单漂洗，并在室温下干燥1小时。
将滤纸加到5毫升闪烁液中，在液体闪烁计数器中计数。将总糖元合成酶在任何裂解液中是活性的百分数表示成为100×(cpm-葡萄糖-6-磷酸)/(cpm+葡萄糖-6-磷酸)。对于5种不同浓度的化合物和单用DMSO一式两份测定这些值，然后对浓度的对数标出这些值的曲线。通过对标出的点拟合一条S形曲线，确定了能刺激糖元合成酶活性至其最高水平的50％的化合物浓度。最高水平的定义是当试验化合物的浓度增大至超过EC50时，糖元合成酶活性不变化的水平。
实施例22
对τ蛋白磷酸化抑制作用的筛选
A.用GSK3表达质粒瞬时转染COS细胞和τ表达
质粒构建
将COS细胞置于T25组织培养瓶中的高葡萄糖MEM培养基/5％胎牛血清中。收集来自汇合的T25瓶的细胞，以80,000细胞/孔接种于Corning6-孔组织培养板中，最终体积是每孔2毫升培养液。使细胞在37℃生长48小时。然后用不含胎牛血清的Opti-MEM洗涤两次，最终将细胞保留在1毫升Opti-MEM中。
将编码τ蛋白的多核苷酸亚克隆入在SV40早启动子的控制下的质粒pSG5中，来产生τ表达质粒。在Goedert等，EMBO J，8(2)：393-399(1989)，在此引入以供参考，一般描述了编码τ蛋白的cDNA的克隆。通过将编码GSK3β的多核苷酸亚克隆入pCG(它是Giese等，Gene & Development，9：995-1008(1995)和Matthias等，Nucleic Acid Research，17：6418(1989)(都在此引入以供参考)所述的ApEVRF衍生物)，制备了GSK3表达质粒。
在1.5毫升的Eppendorf管中制备了下列溶液：溶液A：用于各转染，将2微克DNA(τ表达质粒)和0.7微克DNA(GSK3表达质粒)稀释于100微升Opti-MEM(Gibco BRL)中；溶液B：用于各转染，将8微升Lipofectamine试剂稀释于100微升Opti-MEM中。合并这两种溶液，温和振荡，并在室温下培育45分钟，使得形成DNA-脂质体复合物。对于各转染，将0.8毫升Opti-MEM加到该复合物的试管中。温和振荡该稀释好的溶液，铺在漂洗过的细胞上。将细胞与复合的DNA/Lipofectamine在CO2培养箱中37℃培育6小时。培育后，在各孔加入1毫升生长培养基(高葡萄糖MEM)和20％FBS，并在37℃培育过夜。用新鲜的完全培养基在转染开始的18小时后替换培养基，使细胞在37℃再生长48小时。
B.τ磷酸化抑制试验
收集前2小时，将溶于DMSO的2微升试验化合物(GSK3抑制剂)加到各孔中，37℃培育。2小时后，除去培养基，在板上用干冰迅速冷冻细胞，并储藏在-70℃。在200微升裂解液(TritonX-100，20mM Tris pH7.5，137mM NaCl，15％甘油，25％亮抑蛋白酶肽，1微克/毫升胃酶抑素-A，1μMPMSF，21微克/ml抑蛋白酶肽，50mM NaF，50mM β-甘油磷酸酯，15mM焦磷酸钠，1mM原钒酸钠)的存在下，在冰上融化细胞。将各孔的内容物14,000g，4℃离心5分钟，将上清液转移到干净的试管中。这时可将裂解液储藏于-20℃。
C.ELISA检测细胞裂解液中的磷酸化τ
用5微克/毫升溶于含有CA++和Mg++的PBS(每孔100微升)单克隆抗-磷酸化τ(AT8，Polymedco，Inc.)包裹Immulon4薄膜(Dunatech)。4℃培育过夜后，用洗涤缓冲液(含有0.05％Tween20的PBS)洗涤薄膜两次，用含有1％BSA，5％正常小鼠血清和0.05％Tween20的PBS在室温下封闭1小时。用洗涤缓冲液洗涤薄膜5次。在各孔中加入用含有1％BSA，0.1％NaN3的PBS1：10稀释的裂解液(100微升)，在室温下培育1小时。洗涤后，在各孔中加入100微升溶于PBS的0.5微克/毫升生物素化的单克隆抗-(未磷酸化的)τ(HT7，Polymedco，Inc.)。将薄膜洗涤5次，加入缀合HRP的链霉亲和素，室温培育30分钟，并用洗涤缓冲液充分洗涤。用TMB底物(Pierce)显色，通过加入等体积的0.8M的硫酸，中止反应。在ELISA平板阅读仪上，用450纳米滤色片对薄膜读数。通过对标出的数据拟合出一条S形曲线，测定将τ磷酸化抑制到最高水平的50％的化合物浓度(即，IC50)。
实施例23
测试GSK3抑制剂保护原代海马细胞抵抗谷氨酸盐兴奋性中毒的能力
从胚胎期18-19天的大鼠中剖分到海马。将组织收集在Hibernate TM培养基(Gibco BRL)中，切成大约1毫米的小块。用Papain DissociationSystem(Worthington Biochemical Corporation)解离组织。分离后，将细胞重新悬浮于由Neurobasal TM(Gibco BRL)，2％B27补充液(GibcoBRL)，L-谷氨酰胺和抗生素的无血清培养基中。将细胞置于用聚-L-赖氨酸涂布的35毫米组织培养板上(浓度为每培养皿7.5×104细胞)。37℃在5％CO2中培育10-14天后，漂洗细胞，用新鲜培养基喂养。第二天，在培养液中以最终浓度为1nM和100μM之间加入本发明的代表性化合物。加入化合物4到8小时后，从细胞中除去培养液，储存在37℃。将培养物用含有10μM甘氨酸的HEPES缓冲平衡的盐溶液(HBSS)漂洗培养物两次。Grabb和Choi，J Neuroscience，19：1657-62(1999)。然后使培养物在室温下接触溶于同样的HBSS的200μM谷氨酸。接触后，用该缓冲液漂洗三次培养物，然后转到它们原来条件下的，含有化合物的培养液中。接触谷氨酸20-24小时后，用HBSS漂洗培养物，接触酞酚蓝10分钟。该染料被死细胞吸收。漂洗培养物，然后在4％聚甲醛中固定30分钟。通过相差显微镜对活的和死的(蓝色核)大神经元进行计数，并拍照。用该方法，已显示本发明的化合物能显著降低谷氨酰胺诱导神经元细胞死亡的能力。
实施例24
对糖尿病啮齿动物的效力的评估(葡萄糖耐受试验)
口服给药的化合物配方：
对于口服强饲，通常将试验化合物在施药1天前配制成水溶液或在1％羧甲基纤维素/0.1％tween-80(都来自Sigma Chem.，MO)中的悬液。将一些早期化合物根据与下文相同的程序，配制成15％Captisol(一种改良的环化糊精，CyDex，Co.，IL)的溶液。对于水溶液，将干燥和冻干的试验化合物粉末溶于蒸馏水，并通过涡旋和超声充分混合。如需要，用1N NaOH或1N HCl调节试验溶液的pH，并最终通过装有0.2微米的乙酸纤维素酯膜(Millipore Co.，MA)注射器，来过滤除菌。对于口服悬液，用1％羧甲基纤维素/0.1％tween-80的新鲜悬液与试验化合物粉末混合，并充分超声，如需要，如上所述调节pH，并涡旋，直到粒度均一，并＜10微米。
糖尿病小鼠葡萄糖耐受试验
从Jackson Labs(Bar Harbor，ME)获得8周龄的Obese db/db(雌C57BlKs/J)小鼠，并在1-2周后用于效力测试。在试验日的早晨，在清早除去食物(施用葡萄糖丸前7-8小时)。对尾末端使用局部麻醉剂(EMLA Creme，Astra Pharm.，MA)，剪断尾巴尖取得50-100微升血样，并收集在含有5微升500U/ml肝素钠(Elkins-Sinn，NJ)的eppendorf管中，然后分离血浆。在该日的各个间隔时间(总的是6-8个时间点)获得样品。随机将小鼠编入处理组，在施用葡萄糖4.5小时前首先口腔施用试验化合物(0.2ml体积)，然后在通过口腔强饲(oGTT)或腹膜内注射施用0.2毫升50％葡萄糖(Abbott Lab，IL)之前0.5小时再次施用化合物。在葡萄糖施用2小时后取得最终血样后，将食物再投给小鼠。
基础高血糖症和胰岛素血症的调控
一般将试验化合物以多日，多剂方案或作为单个丸剂经口施给db/db小鼠(见上)或ZDF大鼠(Genetic Models，Inc.；Indianapolis，IN)。ZDF大鼠是在8周龄时收到的，并在1-2周后用于效力试验。在施药30分钟前移去食物，并施用一颗试验化合物丸剂(剂量范围在1-8毫克/毫升之间)如上所述，在后2-3小时中的1-6个时间点取血样。取血样后，将食物放回鼠笼。
主要终点：
从血浆和/或血样测量了葡萄糖和胰岛素水平。从全血，用One-Touch葡糖计(Lifescan Co.，CA)，和从血浆，用Beckman葡萄糖分析仪测量葡萄糖水平。一般葡萄糖结果反映了小鼠的血液值和大鼠研究的血浆值。根据供应商的方法，用ELISA(Crystal Chem.Co.，IL)测量了胰岛素水平。
结果定量：
可用mg/dL葡萄糖或ng/ml胰岛素，或用曲线下方的面积(AUC)表示对血浆葡萄糖(取自正常血糖基线100mg/dL上方)和胰岛素(取自正常血液胰岛素基线1ng/ml上方)的效力。一般，当用AUC表示时，实际上将结果表示成减少的AUC([(载体对照AUC-试验组的AUC)/载体对照AUCX100])。与安慰剂对照组比较，这些表达提供了对葡萄糖分解提高和/或基础高血糖血症或胰岛素储藏的减少的数量级的单一定量表达。
结果：
本发明的代表性化合物在体外显示了良好的效力，而且当用captisol配制时并皮下施给小鼠(30mg/kg)时，在体内显示高生物可用性和组织渗透性。观察到就在葡萄糖耐受试验之前，基础高血糖血症的显著降低，和在用葡萄糖攻击后，葡萄糖分解的显著改善。如果用测定血液葡萄糖曲线下方面积(AUC)来定量葡萄糖反应，可观察到从-60分钟到+120分钟，与对照组比较，AUC减少了45-50％。这可与由曲格列酮(以每天60或100毫克/公斤口服施药至少数天)得到的效力媲美。还观察到在处理的动物中，胰岛素水平显著低于对照小鼠中的水平。
虽然已说明并描述了本发明的优选例，可理解的是，可进行各种改变，而不违背本发明的精神和范围。

Claims (11)

1.一种化合物，其特征在于，该化合物具有结构：
Figure C008189400002C1
其中：
A1是被一或两个取代基取代的吡啶基，所述取代基选自硝基、氨基或氰基；
A2是被卤素取代的苯基、卤素取代的苯基氨基或卤素取代的苯氧基；
R6是氢或C1-C10烷基羰基；
或其药物学上可接受的盐。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，A2被至少一个但不多于3个卤素取代。
3.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述A2选自2，4-二氯苯基、2，4-二氯苯氧基和2，4-二氯苯氨基。
4.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，A2具有式：
Figure C008189400002C2
其中Y是-NH-或-O-；和
R8和R9是卤素。
5.如权利要求4所述的化合物，其特征在于，R8和R9是氯。
6.一种组合物，其特征在于，该组合物含有一定量的当施给人或动物个体时能有效调节GSK3活性的权利要求1所述的化合物，和药物学上可接受的载体。
7.权利要求6所述的组合物的用途，其特征在于，该组合物用于制备在人或动物体内抑制GSK3活性的药物。
8.权利要求1所述的化合物的用途，其特征在于，该化合物用于制备处理细胞，以抑制细胞中的GSK3活性的药物。
9.权利要求6所述的组合物的用途，其特征在于，该组合物用于制备在人或动物体内治疗GSK3-介导的疾病的药物。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，通过以下施药模式：口服、皮下、透皮、透粘膜、电离子透入、静脉内、动脉内、肌肉内、腹腔内、颊内、舌下、鼻内、硬膜下和直肠施药，来施用所述组合物。
11.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述GSK3-介导的疾病选自：2型糖尿病、阿耳茨海默氏病、肥胖症、动脉硬化性心血管疾病、原发性高血压、多囊卵巢综合征、X综合征、缺血、外伤性脑损伤、双向性精神障碍、免疫缺陷症和癌症。
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