CH694888A5 - Verfahren zur Gewinnung von Polyhydroxyalkanoaten (PHA) oder deren Copolymeren. - Google Patents

Description

  



   Die Erfindung betrifft ein enzymatisch-chemisches Verfahren zur Gewinnung  von Polyhydroxyalkanoaten (PHA), insbesondere von Polyhydroxybutyrat  (PHB), oder deren Copolymeren aus Biomasse, das eine chemische Behandlung  der Biomasse mit einem Reduktionsmittel, das die Nicht-PHA-Zellanteile  der Biomasse vermindert, beinhaltet, wobei die chemische Behandlung  vor und/oder nach einem ggf. auch mehreren, enzymatischen Zellaufschlüssen  erfolgt. Das erfindungsgemässe Verfahren, ermöglicht, im Gegensatz  zu anderen Zellaufschlüssen, auch die Gewinnung von Polyhydroxyalkanoaten  aus Biomassen mit relativ geringen PHA-Gehalten (z.B < 60%), ohne  dadurch, die Polymereigenschaften oder -reinheit drastisch zu verändern  bzw. zu verschlechtern. 



   Für die mikrobielle Herstellung der PHA-Polyester, deren bekanntester  Vertreter das Polyhydroxybutyrat (PHB) ist, bzw. für die Herstellung  von PHA-Copolymeren sind eine Reihe von Verfahren bekannt, die in  zahlreichen Dokumenten des Standes der Technik beschrieben sind,  denn PHB und andere PHA gewinnen als biologisch voll abbaubare Polymere  mit thermoplastischen Eigenschaften zunehmend wirtschaftliche Bedeutung.  So ist die mikrobielle Produktion von PHB aus Methanol z.B. in EP  0 015 669 A2 dargestellt, die Gewinnung von Copolymeren kann z.B.  EP 0 304  293 A2 und EP 0 069 497 A2 entnommen werden. Hierbei kommen  beispielsweise Glucose/Propionsäure als Substratgemisch zum Einsatz.                                                           



     Weitere Verfahren zur Gewinnung von PHB mit einem guten Ertragskoeffizienten  und Saccharose als Substrat sind z.B. EP 0 149 744 A1 oder zur Herstellung  von PHB und deren Copolymeren DE 19 619 084 C2 zu entnehmen. 



   Nach dem Stand der Technik erfolgt die Aufarbeitung PHA-haltiger  Biomasse entweder durch Extraktion einer getrockneten Biomasse mit  entsprechenden PHB/PHA-Lösungsmitteln, chemisch durch Zugabe zellzerstörender  Substanzen oder enzymatisch. 



   Die chemische Extraktion wird in der Regel mit halogenierten Lösungsmitteln  durchgeführt. Zur Anwendung kommen Lösungsmittel, die relativ viel  PHA zu lösen vermögen (wie z.B. Chloroform) oder Lösungsmittel, mit  denen sehr reine PHA gewonnen werden kann, da sich in diesen nur  geringe Mengen an anderen Zellbestandteilen lösen (wie z.B. in Dichlorethan).  Beispielsweise sei EP 0 015 669 A2 genannt, in dem verschiedene Methoden  zur Zellzerstörung und eine daran sich anschliessende PHB-Extraktion  aus den zerstörten Zellen durch halogenierte Kohlenwasserstoffe (z.B.  Chloroform, Dichlormethan, 1,2-Dichlorethan und 1,2-Dichlorpropan)  dargestellt sind. Der Einsatz von halogenierten Lösungsmitteln wird  auch in zahlreichen anderen Druckschriften (z.B. US-A 3 275 610 -  Chloroform, 1,2-Dichlormethan in EP 0 014 490 A und EP 0 015 123  A) beschrieben. 



   Um die gesundheitsgefährdenden halogenierten Lösungsmittel zu umgehen,  sind auch andere Verfahren, die unbedenklichere Lösungsmittel verwenden,  entwickelt worden. So ist z.B. die Verwendung von cyclischen Kohlensäureestern  bekannt (US-A 410 533) oder die Verwendung von Ethyl- bzw. Methyllactat  (DE 2 701 278 A1, DB 19 533 459 C1 und DE 19 623 778). Auch die Verwendung  von Essigsäure oder Essigsäureanhydrid als    Lösungsmittel seien  erwähnt (DE 19 712 702 A1, DD 229 428 A1). 



   Die einzelnen Verfahrensschritte bei PHA-Extraktionen können dabei  wie folgt dargestellt werden: 



   Die mikrobielle Biomasse wird zunächst von der Kulturflüssigkeit  durch Filtration, Separation oder Zentrifugation abgetrennt (sofern  es sich nicht um gentechnisch veränderte, pflanzliche Biomasse handelt),  wobei sich ggf. - je nach Effizienz - ein mechanischer Zellaufschluss  (z.B. mittels Kugelmühle) zur Steigerung von Extraktionsausbeuten  anschliesst. Die Biomassetrocknung erfolgt z.B. durch Gefrier- bzw.  Sprühtrocknung. 



   Aus der getrockneten Biomasse wird die PHB, PHA bzw. deren Copolymere  mit einem geeigneten Extraktionsmittel gewonnen. Durch Vorextraktionen  der Biotrockenmasse unter Verwendung von Lösungsmitteln, die nicht  die Polyester lösen, kann die Reinheit der gewonnenen Polymere noch  erhöht werden. 



   So beschreibt z.B. EP 0 124 309 A1 die Vorextraktion der Biomasse  mit Aceton, während in EP 0 058 480 A1 Methanol verwendet wird. 



   Neben der häufig notwendigen Vorextraktionen und aufgrund der allgemein  relativ schlechten Löslichkeit von PHB bzw. vor allem der sogenannten  short-side-chain-/ssc-PHA müssen generell grosse Mengen an Extraktionsmittel  verwendet werden. Daneben bereitet die Abtrennung der hochviskosen  Polymerlösung von den restlichen Zellbestandteilen Schwierigkeiten.  Zusätzlich stehen viele der verwendeten PHS-/PHA-Lösungsmittel, insbesondere  die halogenierten, im Verdacht, starke gesundheitsschädigende Wirkungen  zu haben. Auch die Verwendung, Handhabung und Lagerung von grossen  Mengen an Lösungsmitteln stellt im Allgemeinen ein ökonomisches wie  auch ökologisches Problem dar. 



     Aus diesem Grunde sind auch Verfahren entwickelt worden, die lösungsmittelfrei  oder -arm arbeiten. Mit solchen Verfahren werden nicht die Polymergranula  physikalisch aufgelöst, sondern die sogenannten NPCM-Zellbestandteile  (non-PHA-cell-matter) werden mit Ausnahme der intrazellulären Granulat  chemisch oder enzymatisch so weit wie möglich wasserlöslich gemacht.  Die Granula können dann von der wässrigen Lösung auf bekannte Weise  abgetrennt werden. 



   Zu den am längsten bekannten Verfahren der PHB-/PHA-Gewinnung gehört  zum Beispiel der chemischen Zellaufschluss mittels Hypochlorid. Mit  diesem Verfahren können nahezu alle Zellbestandteile mit Ausnahme  der Polymergranula oxidativ zerstört werden. Das Verfahren hat jedoch  auch Nachteile. So bleibt die äussere Form der Granula bei dieser  Methode zwar erhalten, jedoch die Makromoleküle werden ebenfalls  teilweise geschädigt. Sowohl durch die starke Herabsetzung der Molmasse  der Polymere als auch durch die Freisetzung umweltgefährdender Abwässer  ist diese Methode auf den Laborbereich im Kleinmassstab beschränkt.                                                            



   Ein anderes oxidatives Verfahren ist in DE 69 407 177 T2 dargestellt.  Die Gewinnung von PHA, speziell von Polyhydroxybutyrat-hydroxyvalerat-Copolymeren  (PHBHV) erfolgt entweder mittels Wasserstoffperoxid (bevorzugt) oder  mit Peressigsäure, Perborat, Percarbonat bzw. mit Chlor und Chlor-haltigen  Oxidationsmitteln in Gegenwart von Chelatbildern. Die Wirkung der  Oxidationsmittel zur PHA-Gewinnung, v.a. von Peroxiden, wird auch  ausführlich in EP 0 669 970 A2 beschrieben. 



   Durch die oxidativen Methoden werden jedoch nicht nur unerwünschte  Zellbestandteile, wie z.B. Nukleinsäuren und Zellwandpolymere, abgebaut,  sondern die durchschnittliche Molmase der PHA-Polymere wird ebenfalls  in unerwünschter Weise herabgesetzt. Diese PHB/PHA-Gewinnung ist  deshalb ebenfalls nicht ohne Qualitätseinbussen des gewünschten    Polymerwerkstoffes durchführbar. Ein besonderer Nachteil ist dies  verständlicherweise bei Biomassen mit geringerem PHA-Gehalt, denn  je geringer der PHA-Gehalt ist, desto stärker muss oxidiert werden  und umso wahrscheinlicher ist die Schädigung der Polyester. Ausserdem  können die Makromoleküle auch durch Radikalbildung (z.B. am Methin-Kohlenstoff  eines Poly- beta -hydroxyalkanoats) miteinander vernetzt werden.

    Diese teilweise Vernetzung verursacht eine Herabsetzung der Löslichkeit  in PHA-Lösungsmitteln, bis das Polymer nur noch quellfähig ist. Für  Anwendungen, bei denen eine Weiterverarbeitung der Polymerlösung  vorgesehen ist, macht sich diese Vernetzung negativ bemerkbar. Darüber  hinaus reduziert eine partielle Vernetzung die biologische Abbaubarkeit,  die Bioresorbierbarkeit, sowie die Biokompatibilität und mindert  damit wichtige Eigenschaften der Polyhydroxyalkanoate. 



   Bekannte Verfahren, die diese Nachteile vermeiden, lysieren die unerwünschten  Zellbestandteile mit Hilfe von Enzymen. So beschreibt EP 0 145 233  A2 den Einsatz von proteolytischen Enzymen, teilweise im Zusammenwirken  mit einer Phospholipase und/oder mit oberflächenaktiven Substanzen.  In einem Verfahren nach DE 69 311 738 T2 werden Wärmeeinwirkung,  evtl. Nucleasen, proteolytische Enzyme und/oder Phosholipasen und/oder  Lysozym, Chelatbildner, oberflächenaktive Substanzen und oxidative  Nachbehandlung bzw. Lösungmittelumfällung kombiniert. Nach KR 9502866  werden z.B. lediglich Vorextraktionsmittel eingesetzt, wie heisses  Wasser oder Aceton, sowie eine Protease unter stark alkalischen Bedingungen.                                                   



   Die in den beschriebenen enzymatischen Zellaufschlüssen eingesetzten  Mikroorganismen [grösstenteils Ralstonia eutrophus (früher: Alcaligenes  eutrophus), Alcaligenes latus, diverse Pseudomonas-Stämme u.Ä.] sind  sämtlich als PHA-Produzent mit hohem PHA-Gehalt bekannt - ca. 60-80%  in Trockenmasse, und diese Verfahren wurden oft mehr oder    weniger  in Abhängigkeit von den verwendeten Mikroorganismen entwickelt. Aus  Mikroorganismen mit relativ hohem PEA-Gehalt oder besonderen Lyse-Eigenschaften  sind zudem bekanntermassen die Polymergranula leicht, z.B. unter  Anwendung weniger Schritte, isolierbar. Oft genügt der Einsatz von  einem bis zwei Enzymen, oberflächenaktiven Substanzen und evtl. Chelatbildnern  zur Gewinnung der Polymere.

   Teilweise genügt ein oxidatives Verfahren,  um eine Reinheit von 90 bis ca. 98% zu erreichen, insbesondere wenn  Mikroorganismen eingesetzt werden können, deren PHA-Gehalt schon  im Vorfeld relativ hoch ausfällt, z.B. 70-80%. 



   Die Gewinnung von PHA aus Biomasse mit einem geringen PHA-Gehalt  von beispielsweise 30-60%. ist dagegen nur mit höherem Aufwand (d.h  mit mehreren Schritten) möglich. Der Aufwand ist umso höher, je niedriger  der PHA-Gehalt der Biomasse ist. Bisher bekannte Verfahren sind nicht  oder nur bedingt für die Gewinnung von PHA aus Mikroorganismen mit  geringem PHA-Gehalt geeignet. 



   Es hat sich nämlich herausgestellt, dass die an sich übliche, sofortige  Zellwandlyse in einem ersten Schritt (z.B. mit Lysozym) nicht unbedingt  die beste Möglichkeit ist, den NPCM-Anteil der Biomasse auszuwaschen.  Dies gilt besonders für PHA-Produzenten mit niedrigerem PHA-Gehalt.  Eine oft auftretende unvollständige Lyse und Agglomeration der Biomasse,  einschliesslich der PHA können dann die weitere Reinigung der PHA-Granula  durch Einschluss von Verunreinigungen deutlich, erschweren. 



   Bei der Auswahl der Mikroorganismen zur PHA-Gewinnung stand bisher  deren Akkumulationsfähigkeit für höhe PHA-Gehalte im Vordergrund.  Aufgrund der Änderung der Anwendungsgebiete, vom früher angestrebten  Massenprodukt zum heutigen Spezialprodukt aus PHA kommt es vor, dass  ein Mikroorganismus mit einem relativ niedrigen Polymer-Gehalt zu  bevorzugen ist, der andere Vorteile aufweist. Dies    können z.B.  herausragende mechanische Eigenschaften der PHA, hohe Molmassen etc.  sein, sowie eine schnelle, kostengünstige Kultivierung des Stammes  (z.B. keine Sterilisation der Geräte nötig etc.) 



   Aufgabe der Erfindung war es deshalb, ein Verfahren, zur PHA-Homo-  und Copolymeren-Gewinnung aus Biomasse, insbesondere mit geringeren  PHA-Gehalten, bereitzustellen, das einfach und zuverlässig zu handhaben  ist, welches ohne oder mit geringen Mengen an PHB/PHA-Lösungsmitteln  auskommt und bei dem eine gesundheitliche Belastung für den Verarbeiter  bzw. negative Auswirkungen auf die Umwelt praktisch auszuschliessen  sind. Dennoch sollte die Qualität und Ausbeute der gewonnenen PHA  mindestens mit denen der bekannten Extraktionsverfahren vergleichbar  sein. 



   Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch ein Verfahren zur enzymatischen  Gewinnung von Homo- oder Copolymeren von Polyhydtroxyalkanoaten (PHA)  aus Biomasse, bei dem die Biomasse vor und/oder nach dem enzymatischen  Aufschluss mindestens einmal mit einem Reduktionsmittel behandelt  wird, welches die Nicht-PHA-Zellanteile der Biomasse vermindert. 



   Damit kann unter Anwendung eines chemisch enzymatischen Verfahrens  die PHA in hoher Ausbeute und guter Qualität aus einer Biomasse gewonnen  werden, auch wenn diese relativ geringe PHA-Gehalte, z.B. Gehalte  <60% aufweist. Dabei ist es unerheblich, wann ein Zusatz des/der  erfindungsgemässen Reduktionsmittel(s) erfolgt, welche(s) überraschend  die Nicht-PHA-Zellanteile (NPCM) der Biomasse in einem erheblichen  Ausmass reduziert und somit den PHA-Gehalt erhöht. Die Reduktionsmittelbehandlung  kann vor, zwischen und nach enzymatischen Aufschlüssen erfolgen.  Unter Reduktionsmitteln werden im Sinne der Erfindung chemische Mittel  verstanden, die die Fähigkeit zur Spaltung und zum Abbau von Proteinen,  Nukleinsäuren und Polysacchariden    (Zellwandspaltung) aufweisen.

    Die Reduktionsmittel können gegebenenfalls in Kombination mit Tensiden  und/oder Komplexbildnern eingesetzt werden. 



   In einer bevorzugten Variante der Erfindung werden als Reduktionsmittel  ein Dithionit-Salz, ein Disulfit-Salz, phosphorige Säue und/oder  eine Hyroxylammonium-Verbindung angewendet, beispielsweise Natriumdithionit,  Natriumdisulfit oder Hydroxylammoniumchlorid. Erfindungsgemäss besonders  bevorzugt wird Dithionit als Reduktionsmittel eingesetzt. 



   Das erfindungsgemässe Verfahren ist im Einzelnen weiter unten beschrieben,  wobei die Reihenfolge der einzelnen Schritte austauschbar ist. So  kann der als Verfahrensschritt 3 bezeichnete Schritt vor Schritt  2 erfolgen oder Schritt 1 sich auch noch einmal nach Schritt 3 anschliessen.  Ebenso werden bei Bedarf andere Schritte wiederholt oder weggelassen.  Die zeitliche Anordnung hängt sowohl von der Bio-masse und/oder ihrem  PHA-Gehalt ab wie auch von der späteren Anwendung und gewünschten  Reinheit der PHA. 



   Erfindungswesentlich ist dabei die mindestens einmalige Durchführung  der chemischen Behandlung der Biomasse zur Entfernung von NPCM, wie  in Verfahrensschritt 1 beschrieben. 



   In einer bevorzugten Ausführungsvariante der Erfindung erfolgt vor  dem eigentlichen chemisch-enzymatischen Aufschluss der Biomasse eine  Vorbehandlung der Biomasse mit dem Ziel der vermehrten Bildung von  Agglomeraten zur schnelleren und leichteren Abtrennung der Biomasse  von der Kulturflüssigkeit durch Sedimentation, Filtration, Separation  und/oder Zentrifugation. Die Wahl dieser Abtrennmethode ist weitgehend  abhängig vom eingesetzten Mikroorganismus. 



     Gemäss vorliegender Erfindung wird eine Agglomeration dadurch  erreicht, dass der pH-Wert der Biomasse durch Ansäuern unter den  ursprünglichen Wert, auf jeden Fall unter den Neutralpunkt in den  sauren Bereich verschoben wird. Gegebenenfalls wird auch schon während  dieser Vorbehandlung enzymatisch aufgeschlossen. Bevorzugt sind pH-Werte  von 1 bis 6,5, besonders bevorzugt wird ein pH-Wert von 1 bis 5,5,  besonders bevorzugt von 1-4, eingestellt. Die kurzzeitige, d.h. 5-  bis 60-minütige Einwirkung höherer Temperaturen auf die Biomasse-Suspension  zwischen 30 und 140 DEG C, bevorzugt zwischen 30 und 90 DEG C, wirken  sich günstig auf die Partikelvergrösserung aus.

   In einer Ausführungsvariante  zur Agglomerisation wird der pH-Wert der Biomasse vor der Säuerung  kurzzeitig für max. 5-30 Minuten bei stufenweise eingestellten Temperaturen  zwischen 30 und 140 DEG C auf 7 bis 12 eingestellt. Besonders bevorzugt  auf einen Wert von 8 bis 9. 



   Zur erhöhten Agglomerat-Bildung in der Biomasse, und um eine gleichzeitige  Zellwandschädigung und Reduzierung des Proteingehaltes herbeizuführen,  werden ggf. zusätzlich Chelatbildner und/oder proteolytische Enzyme  eingesetzt. Bei der Flockung der Mikroorganismen im Sauren hat sich  der gleichzeitige Einsatz von Pepsin als besonders vorteilhaft herausgestellt.                                                 



   Im Anschluss daran werden die noch festen, geflockten Biomasse-Bestandteile  in bekannter Weise von der Flüssigkeit abgetrennt. Dies kann zum  Beispiel durch Filtration, Separation, Zentrifugation oder Sedimentation,  z.B. in einem Schrägklärer, erfolgen.   Verfahrensschritt 1:  



   Sofern die Biomasse in Form von fester Biofeuchtmasse oder Biotrockenmasse  vorliegt, wird sie so weit mit Wasser verdünnt, dass die entstehende  Suspension gerührt werden kann. Eine effektive Verminderung der Nicht-PHA-Zellanteile  erreicht man durch Reaktion der Biomasse mit geeigneten chemischen  Reduktionsmitteln. Dafür kommen theoretisch alle Reduktionsmittel  in Frage, die in einem wässrigen Medium einsetzbar sind und keine  Schädigungen oder Verunreinigungen an der PHA hervorrufen, also ihre  Eigenschaften drastisch verschlechtern.

   Besonders bevorzugt ist erfindungsgemäss  der Einsatz eines Dithionit-Salzes, vorzugsweise Natriumdithionit,  welches auf Nicht-PHA-Zellbestandteile (partiell) reduzierend wirkt  und/oder deren Hydrolyse fördert. Überraschenderweise ist die deutliche  Verringerung der Nicht-PHA-Zellanteile grösser, als durch die chemische  Reduktion von bestimmten funktionellen Gruppen zu erwarten wäre. 



   Je nach Art der Biomasse und deren PHA-Gehalt werden 1-200 g, bevorzugt  10-100 g, besonders bevorzugt 20-80 g Dithionit-Salz pro Kilogramm  Biotrockenmasse verwendet. Das Verfahren mit Dithionit-Salz wird  unter neutralen bis alkalischen Bedingungen, vorzugsweise bei pH-Werten  von 7 bis 10, besonders bevorzugt bei pH-Werten von 8 bis 9, durchgeführt.  Temperaturen zwischen 20 bis 110 DEG C, bevorzugt zwischen 40 bis  90 DEG C, sind vorteilhaft. 



   Zur Destabilisierung der Zellwände werde ggf. weitere Zusatzstoffe  wie z.B. Chelatbildner und/oder Tenside zugegeben. Geeignete Chelatbildner  sind z.B. EDTA (Ethylendiamintertraessigsäure), 1,2-Bis (2-aminoethoxy)-ethan-N,  N, N', N'-tetraessigsäure, Nitrilotriessigsäure, Citronensäure, Weinsäure,  Polyphosphate u.a. Als Tenside werden bevorzugt nicht-ionische oder  anionische Tenside eingesetzt. 



     Nach dieser Behandlung wird die Suspension aus PHA, Roh-PHA oder  PHA-haltige Biomasse auf bekannte Weise (z.B. durch Zentrifugation  oder (Querstrom-)Filtration) von der Flüssigkeit abgetrennt, welche  nunmehr die solubilisierten. Nicht-PHA-Zellanteile enthält. Anschliessend  wird die PHA-haltige Feuchtmasse in zumindest einem oder auch mehreren  Schritten mit, vorzugsweise 40 bis 100 DEG C heissem, besonders bevorzugt  60 bis 80 DEG C heissem, deionisiertem, tensidhaltigem Wasser gewaschen,  bis keine solubilisierten Nicht-PHA-Zellanteile mehr ausgewaschen  werden können.   Verfahrensschritt 2  (optional je nach Restgehalt  an Nicht-PHA-Zellanteilen u. Reinheitsanforderungen - kann auch Schritt  1 sein):  



   Zur weiteren Solubilisierung von Nicht-PHA-Zellanteilen wird die  Feuchtmasse resuspendiert und mit proteolytischen Enzymen behandelt.  In Frage kommen Pancreatin oder die darin enthaltenen Einzelenzyme  Trypsin, Chymotrypsin sowie Papain, Bromelain, Ficin, Rennin, Subtilisin  u.a. bzw. deren Mischungen, sofern kein deutlicher gegenseitiger  Abbau erfolgt. Vorteilhaft ist weiterhin der Einsatz von Esterasen,  wie z.B (Triacylglyceryl-)Lipase(n) entweder als Bestandteil des  Pancreatin-Gemisches oder als Einzelenzym bzw. andere Esterasen,  sofern sie die Esterbindung der PHA nicht spalten. Dadurch wird z.B.  die Solubilisierung von Fetten und Lipiden, v.a. des Lipopolysaccharid-Anteils  der Zellwand gram-negativer Bakterien erleichtert. Zur Entfernung  der freiwerdenden Fettsäuren wird die Suspension mit entsprechenden  Tensiden versetzt.

   Nach dieser Behandlung werden die Partikel auf  bekannte Art von der Flüssigkeit abgetrennt und die erhaltene Feuchtmasse  zumindest einmal oder mehrmals mit ionisiertem, tensidhaltigem Wasser  gewaschen.   Verfahrensschritt 3  (optional je nach Restgehalt  an Nicht-PHA-Zellanteilen und Reinheitsanforderungen):  



     Die Feuchtmasse oder deren Suspension wird zur Entfernung des  (teilweise) verbliebenen Peptidoglykans mit Lysozymen, wie z.B. Mureinase,  und evtl. mit Cellulasen zur Unterstützung der Spaltung der  beta  -1,4-Bindung, behandelt. Nach der Behandlung werden die Partikel  aus der Suspension abgetrennt und die Feuchtmasse wie schon beschrieben  gewaschen. Falls nicht schon in einem vorherigen Schritt erfolgt,  wird nun die erhaltene PHA auf bekannte Weise getrocknet. Bei genügend  hohem PHA-Gehalt erfolgt die Trocknung durch die hydrophobe Eigenschaft  der PHA relativ schnell und kann bereits bei Raumtemperatur beobachtet  werden.   Verfahrensschritt 4  (optional je nach Restgehalt an  Nicht-PHA-Zellanteilen und Reinheitsanforderungen):  



   Die trockene Masse aus PHA-Granula wird ggf. zur Entfernung von restlichen  Verunreinigungen, insbesondere von Lipiden, mit Nicht-PHA-Lösungsmitteln  nachgereinigt. Besonders geeignet sind dazu Alkohole wie Methanol,  Ethanol oder Propanole, Ketone wie Aceton oder Ethylmethylketon,  Ester wie Methyl- und Ethylacetat, sowie Alkane wie Pentan, Hexan,  Heptan bzw. Gemische aus allen beschriebenen Lösungsmitteln bzw.  Gemische mit Wasser. 



   Eine andere Möglichkeit zur Nachreinigung ist die Umfällung der PHA  mittels PHA-Lösungsmitteln, wobei die PHA-Lösung zuvor von evtl.  unlöslichen Verunreinigungen z.B. durch Filtration gereinigt wird.                                                             



   Eine Reinigung der bereits erhaltenen relativ reinen PHA kann ebenfalls  in einem weiteren Schritt durch eine erneute Behandlung mit dem Reduktionsmittel,  z.B. dem Dithionit, erfolgen. 



   Der grosse Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens besteht in seiner  vereinfachten Abtrennung der Biomasse aus der Kulturflüssigkeit durch  eine eventuelle Vorbehandlung (Agglomeration) und der Sedimentation  der (partiell    abgebauten) Mikroorganismen bzw. der Polymergranula,  sowie die sofortige Weiterbehandlung ohne - wie oft bei der Lösungsmittel-Extraktion  - einen langwierigen Trocknungsschritt während der Aufarbeitung durchführen  zu müssen. Darüber hinaus wird der mechanische Zellaufschluss durch  die zeitlich kürzere und effektivere chemisch enzymatische Behandlung  ersetzt.

   Besonders hervorzuheben ist die effiziente Reduzierung der  Nicht-PHA-Zellanteile aus der Biomasse durch den chemischen Schritt,  vor allem in Verbindung mit enzymatischen Schritten. Überraschend  war dabei insbesondere die deutliche Reduzierung der Nicht-PHA-Zellanteile  durch den chemischen Schritt, ohne starke Qualitätseinbussen der  Polymer-Eigenschaften, so dass die Methode besonders die Gewinnung  von PHA aus Biomassen mit relativ geringem PHA-Gehalt erlaubt. 



   Die erzielten Ausbeuten liegen deutlich höher als bei Verwendung  üblicher PHA-Extraktionsmittel, da die Zellmasse mit den Polyestern  praktisch immer in denselben Gefässen verbleibt und daher Materialverluste  gering sind. Mit dem erfindungsgemässen Verfahren können mindestens  etwa. 75%, vorzugsweise bis mehr als 95% der in der Biomasse vorhandenen  PHB bzw. der an Copolymere gewonnen werden. 



   Auch die gesundheitliche Belastung ist bei dem erfindungsgemässen  Verfahren als äusserst gering anzusehen, besonders im Vergleich zu  Extraktionen mit (halogenhaltigen) Extraktionsmitteln, die zum Teil  nachgewiesenermassen Leberschäden oder sogar Krebs hervorrufen. Auch  für die Umwelt sind die Gefahren als sehr gering einzuschätzen, da  als Lösungsmittel hauptsächlich Wasser verwendet wird. Die eingesetzten  Chemikalien und Enzyme werden nur in relativ geringen Mengen eingesetzt  und sind praktisch biologisch abbaubar. Für eine eventuelle Nachextraktion  eingesetzte Lösungsmittel sind relativ ungiftig und recyclebar. 



     Nachfolgend soll die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen  näher beschrieben werden, ohne sie darauf zu beschränken.   Beispiel  1:  Gewinnung von PHB aus einer Methylocyst-Biomasse  



   Als Rührkesselablauf wurden 6,5 Liter einer durch Separation eingedickten  Suspension des PHB-Produzenten Methylocystis spec. GB 25, mit einer  Biomassekonzentration von 138,5 g/l verwendet (d.h. insgesamt 900  g Biotrockenmasse). Der PHB-Gehalt betrug zu Beginn 55,3% bezogen  auf Biotrockenmasse. Die Gewinnung der PHB erfolgte in einem üblichen  Doppelmantel-Reaktionsgefäss mit Rührer. 



   In Schritt 1 wurde der pH-Wert der Suspension von anfangs 5,1 mit  Natronlauge auf 8,5 erhöht. Dazu kamen 1,8 g (0,2% bezogen auf Biotrockenmasse)  nichtionisches Tensid und 4,5 g (0,5%) Ethylendiamintetra-essigsäure-Natriumsalz.  Schliesslich wurden 90,0 g (10,0%) Natriumdithionit (mit iodometrisch  gemessen 87% Dithionit-Gehalt) zugegeben und unter Rühren und Schutzatmosphäre  innerhalb einer Stunde von 20 DEG C auf 80 DEG C erwärmt. Nach einer  halben Stunde bei 80 DEG C wurde die Suspension, auf 60 DEG C abgekühlt  und warm zentrifugiert (ca. 20 000 xg). Daran wurden die Feuchtmasse-Pellets  in demineralisiertem Wasser resuspendiert und erneut zentrifugiert.  Die auf diese Weise einmal gewaschene Feuchtmasse wurde für Schritt  2 erneut auf das ursprüngliche Volumen resuspendiert. 



   In Schritt 2 wurde der pH-Wert kontrolliert, er lag wie gefordert  bei 8,5. Die leicht alkalischen Bedingungen sind für das pH-Optimum  der folgend zugesetzten Enzym-Mischung Triacylglyceryl-Lipase (1,8  g bzw. 0,2%) und Pancreatin (1,8 g bzw. 0,2%) wichtig. Dazu wurde  erneut 1,8 g    nichtionisches Tensid zugesetzt. Die Einwirkungsdauer  betrug 12 h unter Rühren und Schutzgas bei 40 DEG C. Im Anschluss  erfolgte wieder die Abtrennung der Partikel durch Zentrifugation,  eine Wäsche, sowie die Resuspendierung auf das Ausgangsvolumen. 



   In Schritt 3 wurde der pH-Wert mittels verdünnter Schwefelsäure von  mittlerweile 7,5 auf 5,0 abgesenkt und 1,8 g (0,2% auf die ursprüngliche  Biotrockenmasse) Lysozym (Mureinase) zugesetzt. Die Einwirkung dauerte  4 h bei 40 DEG C unter Rühren und Schutzatmosphäre. Im Anschluss  kamen 1,8 g Papain dazu und die Suspension wurde 2 h bei 60 DEG C  belassen. Am Ende erfolgte Zentrifugation und 3 weitere Wäschen mit  deionisiertem Wasser. Zur Trocknung bei Raumtemperatur wurde die  feuchte Masse aus PHB in flacher Form ausgebreitet. Die so gewonnene  PHB enthielt noch Verunreinigungen, v.a. freie Fettsäuren (Analyse  mittels GC-MS), welche mit einer Nachextraktion mit dem Nicht-PHB-Lösungsmittel  Ethylacetat entfernt werden konnten (Schritt 4). Es wurden bei einer  Ausbeute von ca. 95% insgesamt 472 g PHB gewonnen.

   Die gaschromatographische  Untersuchung der Reinheit der PHB lieferte am Ende der Aufarbeitung  einen Durchschnittsgehalt von 99,5%. 



   Fig. 1 zeigt die Anreicherung des PHB-Gehaltes während der Aufarbeitung.  Hier zeigt sich auch deutlich der Effekt des erfindungsgemässen,  chemischen Zusatzes von Dithionit. 



    <tb><TABLE> Columns = 2  <tb>Head Col 1: Schritt <tb>Head Col  2: Beschreibung <tb><SEP> Vorbehandlung<SEP> 6,5 Liter Suspension  mit 900 g Trockenmasse M. spec. GB 25: PHB-Gehalt: 55,3% <tb><SEP>  1<SEP> Chemischer Schritt mit Dithionit, Tensid, Chelatbildner:  PHB-Gehalt: 82,9% <tb><SEP> 2<SEP> 1. Enzymatischer Schritt mit  Lipase und Pancreatin: PHB-Gehalt: 86,2% <tb><SEP> 3<SEP> 2. Enzymatischer  Schritt mit Lysozym und Papain: PHB-Gehalt: 97,1% <tb><SEP> 4<SEP>  Nachextraktion der PHB mit Ethylacetat: PHB-Gehalt 99,5%  <tb></TABLE>   Beispiel 2: Gewinnung von PHB aus einer Paracoccus-Biomasse  



   Als Rührkesselablauf wurden 15 Liter, einer durch Flockung und Dekantieren  eingedickten Suspension des PHB-Produzenten Paracoccus denitrificans  verwendet. Die Biotrockenmasse betrug insgesamt 5848 g, d.h. es lag  eine Biomassekonzentration von 390 g/l vor. Der PHB-Gehalt betrug  zu Beginn 54,0%, bezogen auf die Biotrockenmasse. Die Gewinnung der  PHB erfolgte wieder im Doppelmantel-Reaktionsgefäss mit Rührer. 



   In Schritt 1 wurde der pH-Wert der Suspension von anfangs 4,8 mit  Natronlauge auf 8,5 erhöht. Dazu kamen 11,5 g (ca. 0,2% bezogen auf  Biotrockenmasse) nichtionisches Tensid und 30,0 g (0,5%) Ethylendiamintetraessigsäure-Natriumsalz.  Schliesslich wurden 180,0 g (3,0%) Natriumdithionit zugegeben und  unter Rühren und Schutzatamosphäre innerhalb einer Stunde von 20  DEG C auf 80 DEG C erwärmt. Nach einer halben Stunde bei 80 DEG C  wurde die Suspension auf 60 DEG C abgekühlt und warm zentrifugiert  (ca. 20 000 xg). Daran schloss sich die Resuspendierung der Feuchtmasse-Pellets  in demineralisiertem Wasser und eine weitere Zentrifugation an. Die  auf diese Weise einmal gewaschene Feuchtmasse wurde für Schritt 2  erneut auf das ursprüngliche Volumen resuspendiert. 



   In Schritt 2 wurde der pH-Wert kontrolliert und von 7,2 mit Natronlauge  erneut auf 8,5 eingestellt. Wie in Beispiel 1 wurde jetzt die Enzym-Tensid-Mischung  aus Triacylglyceryl-Lipase, Pancreatin und Tensid zugesetzt. Die  Einwirkungsdauer betrug 12 h unter Rühren und Schutzgas bei 40 DEG  C. Im Anschluss erfolgte wieder die Abtrennung der Partikel durch  Zentrifugation, eine Wäsche, sowie die Resuspendierung auf das Ausgangsvolumen.                                                



   In Schritt 3 wurde der pH-Wert mittels verdünnter Schwefelsäure auf  5,5 abgesenkt und Lysozym zugesetzt. Die Einwirkung dauerte 4 h bei  40 DEG C unter Rühren und Schutzatmosphäre. Im Anschluss kamen Papain  dazu und die Suspension wurde 2 h bei 60 DEG C belassen. Am Ende  erfolgten wie in Beispiel 1 Zentrifugation und 3 Wäschen mit deionisiertem  Wasser. Die erhaltene PHB-Masse wurde flach ausgebreitet und bei  Raumtemperatur getrocknet. Wie in Beispiel 1 enthielt die PHB wieder  Verunreinigungen wie freie Fettsäuren und Indolverbindungen (GC-MS-Analyse),  welche mittels Nachextraktion mit Ethylacetat entfernt wurden (Schritt  4). Es wurden bei einer Ausbeute von ca. 85%, insgesamt 2653 g PHB  gewonnen. 



   Fig. 2 zeigt die Anreicherung des PHB-Gehaltes während der Aufarbeitung.  Auch hier zeigt sich der Effekt des erfindungsgemässen, chemischen  Zusatzes von Dithionit. 



    <tb><TABLE> Columns = 2  <tb>Head Col 1: Schritt <tb>Head Col  2: Beschreibung <tb><SEP> Vorbehandlung<SEP> 15 Liter nach Flockung  mit 2000 g Biotrockenmasse: PHB-Gehalt 56% <tb><SEP> 1<SEP> Chemischer  Schritt mit Tensid, Chelatbildner, Dithionit: PHB-Gehalt: 78% <tb><SEP>  2<SEP> 1. Enzymatischer Schritt mit Lipase und Pancreatin: PHB-Gehalt  85% <tb><SEP>    3<SEP> 2. Enzymatischer Schritt mit Lysozym und  Papain: PHB-Gehalt 98,7% <tb><SEP> 4<SEP> Nachextraktion der PHB  mit Ethylacetat: PHB-Gehalt >99%  <tb></TABLE>   Vergleichsbeispiel  3  



   Aus üblicherweise zur Verfügung stehenden PHA-Produzenten mit einem  durchschnittlichen PHB-Gehalt von 45% konnte zum Beispiel durch alleinige  Oxidation mittels Wasserstoffperoxid im Alkalischen in Anlehnung  an DE 69 407 177 T2 nur eine 80%ige Roh-PHB erhalten werden. 



   Auch eine alleinige stufenweise enzymatische Behandlung mit drei  proteolytischen Enzymen (Papain, Pepsin, Bromelain), Tensiden und  Chelatbildnern, sowie einer sich anschliessenden Behandlung mit einer  Mureinase erbrachte nur einen maximalen PHB-Gehalt von 88%.   Beispiel 4: Auswäsche von NPCM (non-PHA-cell-matter) und Erhöhung  des PHB-Gehaltes einer Methyl-ocystis-Biomasse mit relativ geringem  PHB-Gehalt durch erfindungsgemässe Reduktionsmittel  



   Als Biomasse wurde eine, durch Zentrifugation eingedickte, mit demineralisiertem  Wasser gewaschene, erneut eingedickte und anschliessend gefriergetrocknete  Suspension des PHB-Produzenten Methylocystis spec. GB 25 verwendet.  Die PHB-Bildung erfolgte in den Zellen unter Sulfat-Mangelbedingungen;  der PHB-Gehalt betrug zu Beginn 34%, bezogen auf Biotrockenmasse.                                                              



   In 5 Versuchen wurden jeweils 30,00 g dieser Biomasse in 150 ml demineralisiertem  Wasser resuspendiert und der pH-Wert der Suspension von anfangs 4,5  mit Natronlauge auf 8,5 erhöht. Der erste Bio-masse-Ansatz (RED 0)  wurde daraufhin unter Stickstoffatmosphäre gesetzt und anschliessend  auf    85 DEG C für eine Stunde lang erwärmt. Nach der Wärmebehandlung  wurde die Biomasse aus der Suspension 30 Minuten lang bei ca. 20  000 xg abzentrifugiert, in demineralisiertem Wasser erneuert resuspendiert,  wieder abzentrifugiert, d.h. einmal gewaschen, und das Biomassepellet  schliesslich im schulterlosen Zentrifugenbecher bei -17 DEG C eingefroren.

    Zum zweiten Versuch (RED 1) wurden zur Biomasse-Suspension zusätzlich  2,45 g Natriumdithionit-Salz (12,375% Dithionit pro NPCM; mit iodometrisch  gemessenem 87% Dithionit-Gehalt) vor dem Erwärmen in Stickstoffatmosphäre  und alle folgenden Schritte wie oben durchgeführt. 



   Bei den weiteren Versuchen wurden zum Dithionit äquimolare Mengen  (des wirksamen Prinzips) an Natriumdisulfit, phosphoriger Säure bzw.  Hydroxylammoniumchlorid gegeben. 



   Die gefrorenen Biomasse-Pellets der Versuche wurden jeweils in einem  Stück aus den Zentrifugenbechern entnommen, gefriergetrocknet und  auf Auswäsche des NPCM bzw. auf PHB-Gehalt untersucht. 



    <tb><TABLE> Columns = 3  <tb>Head Col 1: Versuch  <tb>Head Col  2: Zusatz <tb>Head Col 3: PHB-Gehalt der Biotrockenmasse (%) nach  Zusatz und 1 h bei 85 DEG C unter Schutzatmosphäre <tb><SEP> RED  0<SEP> Kein<SEP> 35 <tb><SEP> RED 1<SEP> Natriumdithionit<SEP> 41 <tb><SEP>  RED 2<SEP> Natriumdisulfit<SEP> 41 <tb><SEP> RED 3<SEP> Phosphorige  Säure<SEP> 40 <tb><SEP> RED 4<SEP> Hydroxylammoniumchlorid<SEP>  41  <tb></TABLE> 



   Die Tabelle verdeutlicht den Vorteil des erfindungsgemässen Einsatzes  von Reduktionsmitteln.  Figur 1:  



   
EMI18.1
 Figur 2:  



   
EMI18.2

Claims (10)

1. Verfahren zur chemisch-enzymatischen Gewinnung von Homo- oder Copolymeren von Polyhydroxyalkanoaten (PHA) aus Biomasse, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomasse vor und/oder nach dem enzymatischen Aufschluss mindestens einmal mit einem Reduktionsmittel behandelt wird, welches die Nicht-PA-Zellanteile der Biomasse vermindert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Reduktionsmittel ein Dithionit-Salz, ein Disulfit-Salz, phosphorige Säure und/oder eine Hydroxylammonium-Verbindung eingesetzt wird, vorzugsweise Dithionit.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass bei einem pH-Wert von 7 bis 10 und einer Temperatur von 20 bis 110 DEG C gearbeitet wird.

4.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die aufzuschliessende Biomasse zur vermehrten Bildung von Agglomeraten vorbehandelt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bildung von Agglomeraten der pH-Wert der Biomasse in den sauren Bereich verschoben wird, vorzugsweise auf pH-Werte von 1 bis 6,5.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich zur Entfernung von Restverunreinigung die gewonnene PHA mit Nicht-PHA-Lösungsmitteln, vorzugsweise Wasser, Alkohole, Ketone, Ester, Alkane oder deren Gemische nachextahiert wird und/oder dass die PHA mit PHA-Lösungsmitteln umgefällt wird.

7.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische und enzymatische Behandlung und ggf. die Vorbehandlung in einem Reaktionsgefäss erfolgen.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass Biomasse mit einem PHA-Gehalt <60 Gew.-% eingesetzt wird.

9. Reduktionsmittel zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8.

10. Reduktionsmittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Reduktionsmittel ein Dithionit-Salz, ein Disulfit-Salz, phosphorige Säure und/oder eine Hydroxylammonium-Verbindung ist.