Technisches Gebiet
Die Erfindung bezieht sich auf die analytische Chemie - Schnellmethoden zur Analyse zusammengesetzter Gemische von in flüssigem Medium aufgelösten Stoffen - und betrifft insbesondere ein Verfahren zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Stoffes in der Mikrosäulen-Flüssigkeitschromatografie.
Stand der Technik
Es ist ein Verfahren zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Stoffes in der Mikrosäulen-Flüssigkeitschromatografie bekannt, bei welchem eine Probe des Stoffes mit einem Eluentenstrom durch eine Chromatografie-Mikrosäule durchgepumpt, am Austritt der Chromatografiesäule eine quantitative und qualitative Analyse einer einen Eluenten und Komponenten der zu analysierenden Probe enthaltenden Lösung, eine quantitative und qualitative Analyse einer Kontrollösung durchgeführt, die Ergebnisse der ersten und zweiten Analyse miteinander verglichen und nach den Ergebnissen des Vergleiches die Zusammensetzung des zu analysierenden Stoffes bewertet werden. Die Analyse der einen Eluenten und Komponenten der zu analysierenden Probe enthaltenden Lösung wird vorgenommen, indem sie durch eine am Austritt der Mikrosäule angeordnete Durchlauf-Messküvette eines Detektors durchgelassen wird.
Die Analyse der Kontrollösung wird durchgeführt, indem diese Lösung mit der gleichen Geschwindigkeit wie auch für die Lösung mit der Probe durch eine der Messküvette ähnliche Vergleichsküvette des Detektors durchgelassen wird. Als Kontrollösung wird ein reiner Eluent benutzt. Die Signale der beiden Küvetten werden verglichen, vom Signal der Messküvette wird das Signal der Ver gleichsküvette abgezogen und das daraus erhaltene Differenzsignal registriert, nach dem die Zusammensetzung der Probe (Dzh. Kirklend, "Sovremennoe sostoyanie zhidkostnoi khromatografii" ("Heutiger Stand der Flüssigkeitschromatografie"), 1974, Mir (Moskau), S. 82 bis 84) beurteilt wird.
Das bekannte Verfahren wird durch eine niedrige Empfindlichkeit wegen einer Temperaturdifferenz der zwei Ströme der Lösung sowie wegen einer Nichtübereinstimmung der Zusammensetzungen der beweglichen Phase in der Vergleichs- und Messküvette gekennzeichnet. In der Messküvette trägt die bewegliche Phase Reste der vorhergehenden Proben, Spuren des aufgelösten Sorbens und andere Beimischungen, die für die empfindlichen Detektoren den Verlauf der Änderungen und Pegel eines Hintergrundsignals bestimmen, das veränderlich sein und nach seinem Pegel vom Hintergrundsignal der Vergleichsküvette wesentlich abweichen kann. Ausserdem wird das bekannte Verfahren durch hohe Kosten der Analysen wegen einer doppelten Menge des für die Durchführung der Analyse benötigten Eluenten und des Vorhandenseins einer zweiten Druckquelle gekennzeichnet.
Es ist auch ein Verfahren zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Stoffes in der Mikrosäulen-Flüssigkeitschromatografie bekannt, bestehend darin, dass eine Probe des Stoffes mit einem Eluentenstrom durch eine Chromatografie-Mikrosäule durchgepumpt, am Austritt der Chromatografiesäule eine quantitative und qualitative Analyse einer einen Eluenten und Komponenten der zu analysierenden Probe enthaltenden Lösung, eine quantitative und qualitative Analyse einer Kontrollösung durchgeführt, die Ergebnisse der ersten und zweiten Analyse miteinander vergleichen und nach den Ergebnissen des Vergleiches die Zusammensetzung des zu analysierenden Stoffes bewertet werden.
Die Analyse der einen Eluenten und Komponenten der zu analysierenden Probe enthaltenden Lösung wird am Austritt der Chromatografie-Mikrosäule vorgenommen, indem diese Lösung durch eine Durchlauf-Messküvette eines Detektors durchgelassen wird. Die Analyse der Kontrollösung wird durchgeführt, indem die letztere durch eine Durchlauf-Vergleichsküvette des Detektors durchgelassen wird. Der Vergleichsküvette wird die einen Eluenten und Komponenten einer zum Vergleich ausgenutzten Vergleichsprobe enthaltende Kontrollösung zugeführt, nachdem sie durch eine der Betriebssäule ähnliche zusätzliche Chromatografie-Mikrosäule durchgelassen worden ist (US-A 3 847 550).
Dieses Verfahren wird auch durch eine niedrige Empfindlichkeit auf Grund dessen gekennzeichnet, dass es nicht möglich ist, absolut identische Säulen zu schaffen. Die Bedingungen für die Trennung der ähnlichen Proben werden sich in den zwei Säulen stets unterscheiden. Ausserdem haben diese Säulen verschiedene Vorgeschichten, da durch sie verschiedene Proben durchgelassen werden. Bei Detektoren mit einer hohen Empfindlichkeit werden die Unterschiede in der Zusammensetzung der die Betriebs- und die Vergleichssäule verlassenden beweglichen Phasen wegen deren unterschiedlicher Vorgeschichte registriert werden.
Es ist schliesslich ein Verfahren zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Stoffes in der Mikrosäulen-Flüssigkeitschromatografie bekannt, bei welchem Verfahren eine Probe des Stoffes mit einem Eluentenstrom durch eine Chromatografie-Mikrosäule durchgepumpt, am Austritt der Chromatografiesäule eine quantitative und qualitative Analyse einer einen Eluenten und Komponenten der zu analysierenden Probe enthaltenen Lösung durchgeführt, indem sie durch eine Messküvette eines Detek tors durchgelassen wird. Darüber hinaus wird eine quantitative und qualitative Analyse einer Kontrollösung durchgeführt, indem diese durch eine Vergleichsküvette des Detektors durchgelassen wird. Die Ergebnisse der ersten und der zweiten Analyse werden verglichen, und nach den Ergebnissen des Vergleiches wird die Zusammensetzung des zu analysierenden Stoffes beurteilt.
In diesem Verfahren wird als in die Vergleichsküvette einströmende Kontrollösung eine die Messküvette verlassende und durch einen Verdünnungsbehälter mit einem durch einen reinen Eluenten gefüllten Volumen von 10 000- bis 100 000mal grösser als das Volumen der Probe durchgelassene Lösung ausgenutzt. Der Austritt des Verdünnungsbehälters ist mit dem Eintritt der Vergleichsküvette verbunden (US-A 3 981 179).
Das Volumen des für die Durchführung einer Analyse benötigten Eluenten beträgt 1 bis 2% des Volumens des Verdünnungsbehälters. Im Ergebnis wird die Zusammensetzung der Flüssigkeit im Verdünnungsbehälter durch den die Säule verlassenden Eluenten jedoch geringfügig beeinflusst. Der Gehalt der Flüssigkeit wird aber langsam ausgewechselt, und der die Vergleichsküvette passierende Eluent kann nicht eine wahre Zusammensetzung des die Chromatografiesäule bei der Durchführung einer konkreten Analyse verlassenden Eluenten widerspiegeln. Die Zusammensetzung des die Säule passierenden Eluenten kann von der des Eluenten, der durch die Säule nicht durchgelassen worden ist, wesentlich abweichen. Der Eluent kann in sich Stoffe tragen, die in diesen durch Auflösung des Sorbens oder der Reste von sich schwer auswaschen lassenden Stoffen der vorherigen Serie der Analysen hineingelangen.
Darüber hinaus kann der Eluent selbst seine Eigenschaften in der Zeit wegen einer Abtrennung in den Behältern, einer Oxydation, Gasaufnahme, Änderung der Umgebungstemperatur ändern.
Bei jeder konkreten Analyse kann die Hintergrund-Messignallinie bei Verwendung der hochempfindlichen Detektoren in verschiedenen Höhen der Skale der Registriergeräte liegen. Werden die Änderungen der Zusammensetzung und der Eigenschaften des Eluenten nicht genau genug kompensiert, können bei einem differentialen Messverfahren Scheinsignale auftreten, die das Bild der Verteilung der chromatografischen Zacken, welches das Ergebnis der Analyse des Stoffgemisches anzeigt, verzerren.
Das bekannte Verfahren wird ebenso wie die obenbeschriebenen durch eine niedrige Empfindlichkeit gekennzeichnet, denn praktisch wird bei jeder konkreten Analyse mit ihrer eigenen laufenden Nummer zum Vergleich eine Kontrollösung ausgenutzt, die einer Analyse entspricht, welche eine von der zur Zeit durchgeführten Analyse weit entfernte Nummer besitzt.
Darstellung der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Stoffes in der Mikrosäulen-Flüssigkeitschromatografie zu schaffen, bei dem die als Vergleichslösung benutzte Kontrollösung nach ihren Eigenschaften an die Zusammensetzung einer in der konkreten Analyse verwendeten eluierenden Lösung maximal angenähert ist, was es gestattete, die hohe Empfindlichkeit der in der Mikrosäulen-Chromatografie angewendeten hochempfindlichen Detektoren vollständig zu realisieren sowie die Genauigkeitkeit und die Sicherheit der Durchführung der chromatografischen Analyse zu erhöhen.
Das Erfindungswesen besteht darin, dass in dem Verfahren zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Stoffes in der Mikrosäulen-Flüssigkeitschromatografie, dahin gehend, dass eine Probe des Stoffes mit einem Eluentenstrom durch eine Chromatografie-Mikrosäule durch gepumpt, am Austritt der Chromatografie-Mikrosäule eine quantitative und qualitative Analyse einer einen Eluenten und Komponenten der zu analysierenden Probe enthaltenden Lösung, eine quantitative und qualitatitve Analyse einer Kontrollösung durchgeführt, die Ergebnisse drer ersten und zweiten Analyse verglichen und nach den Ergebnissen des Vergleiches die Zusammensetzung des zu analysierenden Stoffes bewertet werden, gemäss der Erfindung als Kontrollösung ein Eluent benutzt wird, der durch die Chromatografie-Mikrosäule unmittelbar vor der Einführung der zu analysierenden Probe in diese durchgepumpt wird.
Das erfindungsgemäss durchgeführte Verfahren zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Stoffes in der Mikrosäulen-Flüssigkeitschromatografie gestattet es, die Genauigkeit und Sicherheit der Bestimmung der Zusammensetzung des Stoffes durch eine wesentliche Erhöhung der Empfindlichkeit der Detektion durch Ermöglichung der Berücksichtigung der Änderungen der Eigenschaften des Eluenten und des Sorbens in der Zeit zu erhöhen.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
Die Erfindung wird durch die nachstehende Beschreibung einer konkreten Ausführungsform anhand der beiliegenden Zeichnung näher erläutert, in der eine Einrichtung für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Stoffes in der Mikrosäulen-Flüssigkeitschromatografie schematisch dargestellt ist.
Bester Weg zur Ausführung der Erfindung
Das Wesen des erfindungsgemässen Verfahrens zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Stoffes in der Mikrosäulen-Flüssigkeitschromatografie besteht in folgendem.
Eine Probe des Stoffes wird mit dem Strom eines Eluenten durch eine Chromatografie-Mikrosäule durchgepumpt, am Austritt der Chromatografie-Mikrosäule wird eine quantitative und qualitative Analyse einer einen Eluenten und Komponenten der zu analysierenden Probe enthaltenden Lösung vorgenommen, es wird eine quantitative und qualitative Analyse einer Kontrollösung durchgeführt, es werden die Ergebnisse der ersten und der zweiten Analyse verglichen und nach den Ergebnissen des Vergleiches die Zusammensetzung des zu analysierenden Stoffes bewertet. Als Kontrollösung wird ein Eluent benutzt, der durch die Chromatografie-Mikrosäule unmittelbar vor der Einführung der zu analysierenden Probe in diese durchgepumpt wird.
Die in der Zeichnung dargestellte Einrichtung für die Durchführung des Verfahrens zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Stoffes in der Mikrosäulen-Flüssigkeitschromatografie enthält eine Druckquelle 1, deren Hohlraum über einen Dosierer 2 mit dem Eintritt einer Chromatografie-Mikrosäule 3 verbunden ist, die mit einem Sorbens gefüllt ist. Am Austritt der Mikrosäule 3 ist eine Küvetteneinheit 4 angeordnet, die eine mit dem Austritt der Mikrosäule 3 unmittelbar verbundene Durchlauf-Messküvette 5 und eine an dieser mit der Seitenwand anliegende und ihr ähnliche Vergleichsküvette 6 umfasst. Der Austritt der Messküvette 5 kann mit Hilfe eines Umschalthahns 7 entweder mit einem Abflussbehälter 8 oder mit dem Eintritt der Vergleichsküvette 6 verbunden werden (die Verbindungen sind durch eine ausgezogene bzw. gestrichelte Linie angedeutet).
Eine Laserlichtquelle 9 ist gegenüber der Küvetteneinheit 4 derart angeordnet, dass die zwei durch diese ausgestrahlten Parallelstrahlen die jeweiligen Küvetten 5, 6 passieren und auf den Eingang eines hinter der Küvetteneinheit 4 angeordneten Fotoempfän gers 11 auftreffen. An die Ausgänge des Fotoempfängers 11 sind die Eingänge einer Vergleichseinheit 12 (jeder Eingang an den zugeordneten Ausgang) angeschlossen, an deren Ausgang ein Registriergerät 13 gelegt ist.
Die in der Zeichnung dargestellte Einrichtung arbeitet nach dem erfindungsgemässen Verfahren wie folgt.
Durch die Druckquelle 1 wird ein Eluentenstrom durch den Dosierer 2 und die Säule des Sorbens in der Chromatografie-Mikrosäule 3 erzeugt. Mit Hilfe des Dosierers 2 wird diesem Eluentenstrom am Eintritt der Mikrosäule 3 eine Probe eines Gemisches der zu analysierenden Stoffe zugesetzt. Der Eluentenstrom mit der Probe wird durch die Messküvette 5 der transparenten Küvetteneinheit 4 und im weiteren durch den Umschalthahn 7 in einen Behälter 8 mit einem grossen Volumen durchgepumpt. Die zwei Laserstrahlen 10 von der Lichtquelle 9 werden durch die Mess- und Vergleichsküvette 5 bzw. 6 durchgelassen und am Eingang des Fotoempfängers 11 empfangen. Die zwei optischen Signale werden in elektrische umgewandelt und miteinander mit Hilfe der Vergleichseinheit 12 verglichen. Das Summensignal wird dem Registriergerät 13 zugeführt und registriert.
Nach Abschluss der Analyse wird der Umschalthahn 7 in die Stellung umgelegt, wo sich die Mess- und die Vergleichsküvette 5 bzw. 6 als hintereinander- und ferner in Reihe mit dem Behälter 8 geschaltet erweisen (wie in der Zeichnung gestrichelt angedeutet). Der Eluent wird durch den Flüssigkeitskanal des Chromatografen, einschliesslich der Mikrosäule 3, durchgepumpt. Man vergewissert sich darüber, dass sich das Hintergrundsignal des Detektors (der Aufnahmepegel am Registriergerät 13) auf einem bestimmten Niveau stabilisiert hat, worauf der Umschalthahn 7 in die vorherige Stellung zurückgebracht wird, wo die Säule 3 mit dem Behälter 8 über die Messküvette 5 verbunden ist (wobei sich die Vergleichsküvette 6 als beidseitig überdeckt erweist). Dem Eluentenstrom wird eine weitere Probe des Gemisches der zu analysierenden Stoffe zugesetzt, und es wird eine Analyse durchgeführt.
Nach Beendigung der Analyse wird die Vergleichsküvette erneut durch einen Eluenten gepült, der nach seiner Zusammensetzung dem Zeitpunkt der nächsten Analyse entspricht. Das Hintergrundsignal wird durch den realen Zustand des Sorbens der Chromatografiesäule zum gegebenen Zeitpunkt beeinflusst. Dies wird bei Messungen durch Subtraktion des Signals der Vergleichsküvette vom Signal der Messküvette berücksichtigt.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Stoffes sichert eine höhere Messgenauigkeit, da Änderungen der Zusammensetzung des die Chromatographie-Mikrosäule 3 nach einer konkreten Analyse und vor der nachfolgenden Analyse real verlassenden Eluenten, verursacht durch Beimischungen des Sorbens, Reste der zu analysierenden Stoffe, zeitliche Änderungen der Zusammensetzung des Eluenten selbst, in Betracht gezogen werden.
Zum besseren Verständnis des Wesens des erfindungsgemässen Verfahrens werden nachfolgend konkrete Ausführungsbeispiele aufgeführt.
Beispiel 1
Dür die Detektion wurde ein differentialer refraktometrischer Detektor eingesetzt.
Es wurden Polystyrole mit einem Molekulargewicht von 2 . 10<3> bis 2 . 10<6> und Eiweissstoffe getrennt.
Zur Analyse der Polystyrole wurde eine Mikrosäule aus Fluorkunststoff mit einer Länge von 300 mm und mit einem Innendurchmesser von 0,5 mm angewendet. Als Füllstoff wurde ein Gemisch von makroporigen Gläsern mit Poren verschiedener Grösse benützt. Die mittlere Grösse der Teilchen des Sorbens beträgt 6 +/- 1 mu m. An den Enden der Mikrosäule 3 wurden Filter aus porigen Titan mit einer Dicke von ca. 0,2 mm angeordnet.
Als Eluent wurde (chemisch reines) Methyläthylketon eingesetzt. Die Durchpumpgeschwindigkeit des Eluenten belief sich auf 4 bis 6 mu l/min. Das Volumen der Probe übertraf 0,03 mu l bei einer Konzentration der Polystyrole von ca. 0,5 mg/ml nicht. Es wurden fünf geeichte Polystyrollösungen mit einem Trennfaktor von 0,8 getrennt. Die Wirksamkeit der Säule betrug 10 000 theoretische Böden.
Nach jeder Analyse wurde die Mikrosäule 3 durch Spülung mit dem Eluenten regeneriert, bis ein stabiles Hintergrundsignal erhalten ist. Hierbei lagen die beiden Küvetten 5, 6 (die Mess- und Vergleichsküvette) des Detektors in Reihe zwischen dem Austritt der Säule 3 und dem Abflussbehälter 8.
Danach wurde mit Hilfe des Umschalthahns 7 der Ein- und der Austritt der Vergleichsküvette 6 überdeckt und sie selbst aus dem Flüssigkeitskanal des Chromatografen herausgeführt, wobei diese in Wechselwirkung mit den Analysiergeräten des Vergleichsweges des Detektors gebracht wurde. Hierbei verband der gleiche Umschalthahn 7 den Austritt der Messküvette 5 mit dem Abflussbehälter 8.
Der im Verlauf der Operation der Vorbereitung des Chromatografen zur Analyse erhaltene konkrete Pegel des optischen Hintergrundsignals wurde zum gegebenen Zeitpunkt durch die Zusammensetzung des reinen, jedoch durch die Chromatografie-Mikrosäule 3 durchgelaufenen Eluenten bedingt, wobei es um die konkrete Chromatografie-Mikrosäule geht, in die nachher die nächste Probe zur Analyse eingeführt wird. Der auf diese Weise erreichte Pegel des Hintergrundsignals trug den Bedingungen der nachfolgenden Trennung von allen in anderen Verfahren erhaltenen (differentialen) Vergleichsmessungen am besten Rechnung.
Das erfindungsgemässe Verfahren gestattet es, eine hohe Empfindlichkeit des refraktometrischen differentialen Laserdetektors zu realisieren.
Beispiel 2
Es wurden einer Trennung Eiweissstoffe aus einem Gemisch von Myoglobin, Eier-, Blutalbumin und Ferritin unterzogen. Als Eluent diente die Trifluoressigsäure mit einem Wasserzusatz von 5 Vol.-%.
Zur Trennung wurde eine Mikrosäule 3 der gleichen Abmessungen wie auch im Beispiel 1 eingesetzt, die mit einem makroporigen Glas gefüllt war. Die mittlere Korngrösse des Sorbens betrug 5 bis 6 mu m.
Zur Analyse wurde ein Gemisch von Eiweissstoffen mit einer Konzentration von 1 mg/ml vorbereitet, während das Volumen der Probe 0,03 ml ausmachte. Hierbei wiesen die Zacken von jeder der Komponenten des Gemisches einen Wert von 0,8 der Skale auf. Die optische Null änderte sich nach jeder Analyse beträchtlich, und es wurde eine sorgfältige Spülung der Mikrosäule 3 und der Küvetten 5, 6 mit einem reinen Eluenten benötigt. Die auf der Messskale eingestellte Null entsprach den Bedingungen der nachfolgenden Analyse am genauesten. Die Portion der Waschmittellösung wurde nach der Nulleinstellung in der Vergleichsküvette 6 unmittelbar vor Beginn der nächsten Analyse belassen und als Kontrollösung benutzt.
An Hand der angeführten Beispiele für die Durchführung des Verfahrens wurden folgende Angaben ermittelt.
1. Zeit für die typische Analyse eines Polymers mit einem Bereich der Molekularmassen von 2 . 10<3> bis 2 . 10<6> ca. 7 min.
2. Menge des Lösungsmittels für eine typische Analyse 0,1 ml.
3. Minimale nachweisbare Stoffmenge ca. 2 mg.
4. Untere Nachweisbarkeitsgrenze 0,5 mg.
5. Mittlere quadratische Abweichung der Ausgangssignale nach der Abweichung der Höhen der Zacken maximal 2%, nach der Haltezeit für die Zacken maximal 1%.
6. Wirksames Volumen der Küvette 0,1 mu l.
7. Betriebsdruck am Eintritt der Säule 12 MPa.
Im Vergleich zu den bekannten Verfahren zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Stoffes in der Mikrosäulen-Flüssigkeitschromatografie gestattete das erfindungsgemässe Verfahren, die Nachweisempfindlichkeit um zwei Grössenordnungen durch Ermöglichung der Berücksichtigung der zeitlichen Änderungen des Eluenten und des Sorbens zu erhöhen.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Stoffes kann für Schnellanalysen von Mikroproben zusammengesetzter Gemische von in Flüssigkeiten lösbaren Stoffen, für Untersuchungen auf dem Gebiet der Biotechnologie, Medizin, Landwirtschaft, Chemie Anwendung finden.
Technical field
The invention relates to analytical chemistry - rapid methods for the analysis of composite mixtures of substances dissolved in a liquid medium - and relates in particular to a method for determining the composition of a substance in microcolumn liquid chromatography.
State of the art
A method for determining the composition of a substance in microcolumn liquid chromatography is known, in which a sample of the substance is pumped through an chromatography microcolumn with an eluent flow, and a quantitative and qualitative analysis of an eluent and components of the analyte to be analyzed is obtained at the exit of the chromatography column Sample-containing solution, a quantitative and qualitative analysis of a control solution is carried out, the results of the first and second analysis are compared and the composition of the substance to be analyzed is evaluated according to the results of the comparison. The analysis of the solution containing an eluent and components of the sample to be analyzed is carried out by passing it through a flow measuring cuvette of a detector arranged at the outlet of the microcolumn.
The analysis of the control solution is carried out by passing this solution at the same speed as for the solution with the sample through a comparison cuvette of the detector similar to the measuring cuvette. A pure eluent is used as the control solution. The signals of the two cuvettes are compared, the signal of the comparison cuvette is subtracted from the signal of the measuring cuvette and the difference signal obtained therefrom is registered, according to which the composition of the sample (Dzh. Kirklend, "Sovremennoe sostoyanie zhidkostnoi khromatografii" ("Current state of liquid chromatography" ), 1974, Mir (Moscow), pp. 82 to 84).
The known method is characterized by a low sensitivity because of a temperature difference between the two flows of the solution and because of a mismatch in the compositions of the mobile phase in the comparison and measurement cuvette. In the measuring cuvette, the moving phase bears the remains of the previous samples, traces of the dissolved sorbent and other admixtures, which determine the course of the changes and levels of a background signal for the sensitive detectors, which can be variable and its level can differ significantly from the background signal of the comparison cuvette. In addition, the known method is characterized by the high cost of the analyzes because of the double amount of the eluent required for carrying out the analysis and the presence of a second pressure source.
A method for determining the composition of a substance in microcolumn liquid chromatography is also known, consisting in that a sample of the substance is pumped through an chromatography microcolumn with an eluent stream, and a quantitative and qualitative analysis of one eluent and components at the exit of the chromatography column the solution containing the sample to be analyzed, a quantitative and qualitative analysis of a control solution is carried out, the results of the first and second analysis are compared, and the composition of the substance to be analyzed is evaluated according to the results of the comparison.
The analysis of the solution containing an eluent and components of the sample to be analyzed is carried out at the exit of the chromatography microcolumn by passing this solution through a flow measuring cell of a detector. The analysis of the control solution is carried out by passing the latter through a flow comparison cuvette of the detector. The comparative cuvette is supplied with the eluents and components of a control solution containing the comparative sample used after it has been passed through an additional chromatography microcolumn similar to the operating column (US Pat. No. 3,847,550).
This method is also characterized by a low sensitivity due to the fact that it is not possible to create absolutely identical columns. The conditions for the separation of the similar samples will always differ in the two columns. In addition, these columns have different histories because they allow different samples to pass through. In the case of detectors with a high sensitivity, the differences in the composition of the moving phases leaving the operating and comparison columns will be registered because of their different history.
Finally, a method for determining the composition of a substance in microcolumn liquid chromatography is known, in which method a sample of the substance is pumped through an chromatography microcolumn with an eluent flow, and a quantitative and qualitative analysis of an eluent and components of the chromatography column at the outlet of the chromatography column Solution to be analyzed sample carried out by passing it through a measuring cuvette of a detector. In addition, a quantitative and qualitative analysis of a control solution is carried out by passing it through a comparison cuvette of the detector. The results of the first and second analyzes are compared, and the composition of the substance to be analyzed is assessed on the basis of the results of the comparison.
In this method, the control solution flowing into the comparison cuvette is a solution leaving the measuring cuvette and passed through a dilution container with a volume filled with a pure eluent of 10,000 to 100,000 times greater than the volume of the sample. The outlet of the dilution container is connected to the inlet of the comparison cuvette (US Pat. No. 3,981,179).
The volume of the eluent required to carry out an analysis is 1 to 2% of the volume of the dilution container. As a result, however, the composition of the liquid in the dilution container is slightly influenced by the eluent leaving the column. However, the content of the liquid is slowly changed, and the eluent passing through the comparison cuvette cannot reflect a true composition of the eluent leaving the chromatography column when carrying out a specific analysis. The composition of the eluent passing through the column can differ significantly from that of the eluent which has not passed through the column. The eluent can contain substances that get into these substances from the previous series of analyzes that are difficult to wash out due to dissolution of the sorbent or the residues.
In addition, the eluent itself can change its properties over time due to separation in the containers, oxidation, gas absorption, change in the ambient temperature.
For each specific analysis, the background measurement signal line can lie at different heights of the scale of the recording devices when using the highly sensitive detectors. If the changes in the composition and properties of the eluent are not compensated for with sufficient accuracy, apparent signals can appear in a differential measurement method, which distort the image of the distribution of the chromatographic spikes, which indicates the result of the analysis of the mixture of substances.
The known method, like the ones described above, is characterized by a low sensitivity, because practically every concrete analysis with its own serial number uses a control solution for comparison, which corresponds to an analysis which has a number far removed from the analysis currently being carried out.
Presentation of the invention
The invention has for its object to provide a method for determining the composition of a substance in microcolumn liquid chromatography, in which the control solution used as a comparative solution is as close as possible in terms of its properties to the composition of an eluting solution used in the specific analysis, which it is allowed to fully realize the high sensitivity of the highly sensitive detectors used in micro-column chromatography and to increase the accuracy and reliability of the implementation of the chromatographic analysis.
The invention consists in that in the method for determining the composition of a substance in microcolumn liquid chromatography, in that a sample of the substance is pumped through with an eluent stream through a chromatography microcolumn, a quantitative and qualitative at the outlet of the chromatography microcolumn Analysis of a solution containing an eluent and components of the sample to be analyzed, a quantitative and qualitative analysis of a control solution was carried out, the results of the first and second analysis were compared and the composition of the substance to be analyzed was evaluated according to the results of the comparison, according to the invention as a control solution an eluent is used which is pumped through the chromatography micro column immediately before the sample to be analyzed is introduced into it.
The method according to the invention for determining the composition of a substance in microcolumn liquid chromatography allows the accuracy and certainty of determining the composition of the substance by significantly increasing the sensitivity of the detection by making it possible to take into account the changes in the properties of the eluent and the sorbent to increase the time.
Brief description of the drawing
The invention is explained in more detail by the following description of a specific embodiment with reference to the accompanying drawing, in which a device for carrying out the method according to the invention for determining the composition of a substance in microcolumn liquid chromatography is shown schematically.
Best way to carry out the invention
The essence of the method according to the invention for determining the composition of a substance in microcolumn liquid chromatography is as follows.
A sample of the substance is pumped with the flow of an eluent through a chromatography micro column, at the outlet of the chromatography micro column a quantitative and qualitative analysis of a solution containing an eluent and components of the sample to be analyzed is carried out, a quantitative and qualitative analysis of a Control solution carried out, the results of the first and the second analysis are compared and the composition of the substance to be analyzed is evaluated according to the results of the comparison. An eluent is used as the control solution, which is pumped through the chromatography micro column immediately before the sample to be analyzed is introduced into it.
The device shown in the drawing for carrying out the method for determining the composition of a substance in microcolumn liquid chromatography contains a pressure source 1, the cavity of which is connected via a meter 2 to the inlet of a chromatography microcolumn 3 which is filled with a sorbent . At the outlet of the microcolumn 3 there is a cuvette unit 4, which comprises a continuous measuring cuvette 5 which is directly connected to the outlet of the microcolumn 3 and a comparison cuvette 6 which bears against the side wall and is similar to it. The outlet of the measuring cuvette 5 can be connected with the help of a switch tap 7 either to a drain tank 8 or to the inlet of the comparison cuvette 6 (the connections are indicated by a solid or dashed line).
A laser light source 9 is arranged opposite the cuvette unit 4 in such a way that the two parallel beams emitted by it pass through the respective cuvettes 5, 6 and strike the entrance of a photo receiver 11 arranged behind the cuvette unit 4. The inputs of a comparison unit 12 (each input to the associated output) are connected to the outputs of the photo receiver 11, and a recording device 13 is connected to the output of the comparison unit.
The device shown in the drawing works according to the inventive method as follows.
The pressure source 1 generates an eluent stream through the metering device 2 and the column of sorbent in the chromatography microcolumn 3. With the aid of the dosing device 2, a sample of a mixture of the substances to be analyzed is added to this eluent stream at the entrance of the micro column 3. The eluent flow with the sample is pumped through the measuring cuvette 5 of the transparent cuvette unit 4 and further through the switch tap 7 into a container 8 with a large volume. The two laser beams 10 from the light source 9 are transmitted through the measuring and comparison cuvette 5 and 6 and received at the entrance of the photo receiver 11. The two optical signals are converted into electrical signals and compared with one another using the comparison unit 12. The sum signal is fed to the registration device 13 and registered.
After completion of the analysis, the switch tap 7 is switched to the position where the measuring and the comparison cuvettes 5 and 6 prove to be connected in series and also in series with the container 8 (as indicated by the broken line in the drawing). The eluent is pumped through the liquid channel of the chromatograph, including the micro column 3. It is ensured that the background signal of the detector (the recording level on the recording device 13) has stabilized at a certain level, whereupon the switch tap 7 is returned to the previous position, where the column 3 is connected to the container 8 via the measuring cell 5 (The comparison cuvette 6 proves to be covered on both sides). Another sample of the mixture of the substances to be analyzed is added to the eluent stream and an analysis is carried out.
After the end of the analysis, the comparison cuvette is rinsed again by an eluent which, according to its composition, corresponds to the time of the next analysis. The background signal is influenced by the real state of the sorbent of the chromatography column at the given time. This is taken into account in measurements by subtracting the signal from the comparison cell from the signal from the measuring cell.
The method according to the invention for determining the composition of a substance ensures a higher measurement accuracy, since changes in the composition of the eluent actually leaving the chromatography microcolumn 3 after a concrete analysis and before the subsequent analysis, caused by admixtures of the sorbent, residues of the substances to be analyzed, over time Changes in the composition of the eluent itself should be considered.
In order to better understand the nature of the method according to the invention, specific exemplary embodiments are listed below.
example 1
A differential refractometric detector was used for the detection.
Polystyrenes with a molecular weight of 2. 10 <3> to 2. 10 <6> and protein substances separated.
For the analysis of the polystyrenes, a micro column made of fluoroplastic with a length of 300 mm and an inner diameter of 0.5 mm was used. A mixture of macroporous glasses with pores of different sizes was used as filler. The average size of the particles of sorbent is 6 +/- 1 µm. Filters made of porous titanium with a thickness of approx. 0.2 mm were arranged at the ends of the microcolumn 3.
(Chemically pure) methyl ethyl ketone was used as the eluent. The pumping rate of the eluent was 4 to 6 μl / min. The volume of the sample did not exceed 0.03 μl at a polystyrene concentration of approx. 0.5 mg / ml. Five calibrated polystyrene solutions with a separation factor of 0.8 were separated. The effectiveness of the column was 10,000 theoretical plates.
After each analysis, the microcolumn 3 was regenerated by rinsing with the eluent until a stable background signal was obtained. Here, the two cuvettes 5, 6 (the measurement and comparison cuvette) of the detector were in series between the outlet of the column 3 and the drain container 8.
Then the inlet and outlet of the comparison cuvette 6 were covered with the aid of the switch tap 7 and they themselves led out of the liquid channel of the chromatograph, this being brought into interaction with the analyzers of the comparison path of the detector. Here, the same switch tap 7 connected the outlet of the measuring cuvette 5 to the drain container 8.
The specific level of the optical background signal obtained in the course of the preparation of the chromatograph for analysis was determined at the given time by the composition of the pure eluent, however, which had passed through the chromatography microcolumn 3, which relates to the specific chromatography microcolumn afterwards the next sample is introduced for analysis. The level of the background signal achieved in this way best took into account the conditions of the subsequent separation from all (differential) comparison measurements obtained in other methods.
The method according to the invention makes it possible to achieve a high sensitivity of the refractometric differential laser detector.
Example 2
Protein substances from a mixture of myoglobin, egg albumin, blood albumin and ferritin were subjected to a separation. The trifluoroacetic acid with a water addition of 5% by volume served as the eluent.
A microcolumn 3 of the same dimensions as in Example 1, which was filled with a macroporous glass, was used for the separation. The average grain size of the sorbent was 5 to 6 μm.
A mixture of proteins with a concentration of 1 mg / ml was prepared for analysis, while the volume of the sample was 0.03 ml. The peaks of each of the components of the mixture had a value of 0.8 on the scale. The optical zero changed considerably after each analysis and careful rinsing of the microcolumn 3 and the cuvettes 5, 6 with a pure eluent was required. The zero set on the measuring scale most closely corresponded to the conditions of the subsequent analysis. The portion of the detergent solution was left in the comparison cuvette 6 after zeroing immediately before the start of the next analysis and used as a control solution.
The following information was determined on the basis of the examples given for the implementation of the method.
1. Time for the typical analysis of a polymer with a molecular mass range of 2. 10 <3> to 2. 10 <6> approx. 7 min.
2. Amount of solvent for a typical analysis 0.1 ml.
3. Minimum detectable amount of substance about 2 mg.
4. Lower detectability limit 0.5 mg.
5. Average quadratic deviation of the output signals after the deviation of the heights of the peaks maximum 2%, after the holding time for the peaks maximum 1%.
6. Effective volume of the cuvette 0.1 ml.
7. Operating pressure at the entry of the column 12 MPa.
In comparison to the known methods for determining the composition of a substance in microcolumn liquid chromatography, the method according to the invention made it possible to increase the detection sensitivity by two orders of magnitude by making it possible to take into account the changes over time of the eluent and sorbent.
Industrial applicability
The method according to the invention for determining the composition of a substance can be used for rapid analyzes of micro-samples of composed mixtures of substances soluble in liquids, for investigations in the field of biotechnology, medicine, agriculture, chemistry.