SE462664B

SE462664B - PROCEDURE FOR DETERMINATION OF SUBJECT SUBMISSION OF SCIENCE BY SCIENCE MICROCOLONIC CHROMATOGRAPHY

Info

Publication number: SE462664B
Application number: SE8900468A
Authority: SE
Inventors: M L Alexandrov
Original assignee: Nt Ob Akademii Nauk Sssr
Priority date: 1987-06-16
Filing date: 1989-02-10
Publication date: 1990-08-06
Also published as: DE3790973T1; JPH01503805A; CH675304A5; SE8900468D0; GB8902975D0; FI890677A; FI890677A0; SE8900468L; GB2217449A; WO1988010426A1; GB2217449B

Description

(H34 2 kostnader på grund av fördubblad eluentkvantitet, som är nödvändig för åstadkommande av själva analysen och på grund av närvaro av en annan tryckkälla. (H34 2 costs due to doubled quantity of eluent, which is necessary for performing the analysis itself and due to the presence of another pressure source.

Ett annat förfarande för bestämning av ämnessammansättning vilket förfarande bygger på att man dels pumpar ett prov av något ämne inom vätskemikrokolonnkromatografi är även känt, med en eluentström genom en kromatografs mikrokolonn, dels vid mikrokolonnens utlopp utför kvantitativ och kvalitativ analys av den lösning, som innehåller eluent och det analyserade provets andra komponenter, dels åstadkommer en kvantitativ och kvalitativ analys av kontrollösningen och jämför resultaten av den första och den andra analysen samt i enlighet med de jämförande resultaten bedömer det analyserade ämnets sam- mansättning. Själva analysen av' den lösning, som innehåller både eluent och det analyserade provets komponenter, utför man vid utloppet ur kromatografens mikrokolonn genom att mata denna detektorns av lösning via genomströmningskyvett. Analysen kontrollösningen utför man genom att mata den via detektorns jämförande genomströmningskyvett. Kontrollösningen matar man in i jämförelsekyvetten efter dess matning via en extra kromato- grafs mikrokolonn, som är jämförbar med arbetsmikrokolonnen och som innehåller både eluent och komponenter av ett referensprov, vilket används för jämförelse (US, A, 3847550).Another method for determining the composition of substances, which method is based on pumping a sample of a substance in liquid microcolumn chromatography is also known, with an eluent flow through a chromatograph microcolumn, and at the outlet of the microcolumn performs quantitative and qualitative analysis of the solution containing eluent and the other components of the analyzed sample, on the one hand, performs a quantitative and qualitative analysis of the control solution and compares the results of the first and the second analysis and, in accordance with the comparative results, assesses the composition of the analyzed substance. The actual analysis of the solution, which contains both the eluent and the components of the analyzed sample, is carried out at the outlet of the chromatograph of the chromatograph by feeding this solution of this detector via flow-through cuvette. The analysis control solution is performed by feeding it via the detector's comparative flow cuvette. The control solution is fed into the comparative cuvette after its feeding via an additional chromatograph microcolumn, which is comparable to the working microcolumn and which contains both eluent and components of a reference sample, which is used for comparison (US, A, 3847550).

Detta förfarande kännetecknas även av låg känslighet, eftersom det är omöjligt att åstadkomma absolut identiska Analoga prov måste alltid utföras i två skilda kolonner och hänsyn måste dessutom, tagas till historia hos dessa kolonner eftersom man genom dem har matat olika prover. kolonner.This method is also characterized by low sensitivity, since it is impossible to obtain absolutely identical Analog tests must always be performed in two different columns and, in addition, the history of these columns must be taken into account because different samples have been fed through them. columns.

För att detektorer med hög känslighet skall kunna registrera vilka lämnar arbets- och jämförelsekolonnerna på grund av dessas skillnader inom sammansättningar hos rörliga faser, olikartade föregående historia. Ännu ett förfarande för bestämning av ämnessammansättning inom vätskemikrokolonnkromatografi är känt, vilket förfarande bygger på att man pumpar ett ämnesprov med en eluentström genom en kromatografs mikrokolonn och vid mikrokolonnens utlopp utför kvantitativ och kvalitativ analys av den lösning, som in- nehåller både eluent och det analyserade provets komponenter, 462 661% 3 genom att man matar lösningen genom detektorns mätkyvett. Man åstadkommer dessutom kvantitativ och kvalitativ analys av kontrollösningen genom att man matar den genom detektorns jämförelsekyvett. Den första och den andra analysens resultat jämförs och i enlighet med jämförelseresultat bedömer man det analyserande ämnets sammansättning. Vid detta förfarande använder man såsom kontrollösning, som matas in i jämförel- sekyvetten, den lösning, vilken lämnar densamma och vilken matats genom en utspädningsbehâllare, vars volym 10.000- 100.000 ggr överstiger provets volym, vilken behållare är fylld med ren eluent. Utspädningsbehållarens utlopp kom- municerar med inloppet till jämförelsekyvetten (US, A, 3981179).In order for detectors with high sensitivity to be able to register which leaves the working and comparison columns due to their differences in compositions of moving phases, different previous history. Yet another method for determining the composition of substances in liquid microcolumn chromatography is known, which method is based on pumping a substance sample with an eluent stream through a chromatograph microcolumn and at the outlet of the microcolumn performing quantitative and qualitative analysis of the solution containing both eluent and the analyzed eluent. components of the sample, 462 661% 3 by feeding the solution through the measuring cuvette of the detector. In addition, quantitative and qualitative analysis of the control solution is achieved by feeding it through the detector's comparison cuvette. The results of the first and the second analysis are compared and in accordance with the comparison results, the composition of the analyte is assessed. In this process, the control solution fed into the comparative cuvette is the solution which leaves it and which is fed through a dilution container, the volume of which exceeds 10,000 to 100,000 times the volume of the sample, which container is filled with pure eluent. The outlet of the dilution container communicates with the inlet of the comparison cuvette (US, A, 3981179).

Den eluentvolym, som är nödvändig för att åstadkomma en analys, är lika med 1-2% av utspädningsbehållarens volym. Som resultat därav kommer den eluent, som lämnar kolonnen, i alla fall att utöva en nándre inverkan på vätskesammansättningen inom utspädningsbehållaren. Ändringar av sammansättningen sker dock långsamt, och den eluent, som passerar genom jämförelse- kyvetten, kan inte återspegla den verkliga sammansättningen av eluenten, vilken lämnar kromatografens kolonner vid genomför- ande av någon konkret analys. Sammansättningen hos den genom kolonnen matade eluenten kan väsentligt skilja sig från den eluent, vilken icke matats genom kolonnen. Eluenten kan föra med sig de ämnen, vilka är resultatet av utlösning av sorbent eller rester av dåligt uttvättade ämnen från de föregående analysserierna. Dessutom kan eluenten själv ändra sina egen- skaper med tiden på grund av uppdelning i skikt inom behållar- na, oxidation, gasuppsugning, förändringar i omgivningsmiljöns temperatur. Vid varje konkret analys med användande av högkäns- liga detektorer kan den uppmätta signalens baslinje befinna sig på olika nivåer av de registrerande instrumentens skala. Om kompensatíonen av förändringar hos eluentens sammansättning och egenskaper icke görs tillräckligt noggrant, kan det vid det differentierade mätningsförfarandet uppkomma falska signaler, vilka förvränger bilden av de kromatografiska toppar, som återspeglar ämnessammansättningens analysresultat.The volume of eluent required to perform an assay is equal to 1-2% of the volume of the dilution container. As a result, the eluent leaving the column will in any case exert a closer effect on the liquid composition within the dilution vessel. However, changes in composition occur slowly, and the eluent passing through the comparative cuvette cannot reflect the actual composition of the eluent, which leaves the chromatograph columns when performing any concrete analysis. The composition of the eluent fed through the column may differ substantially from the eluent which is not fed through the column. The eluent may carry the substances which are the result of the release of sorbent or residues of poorly washed substances from the previous series of analyzes. In addition, the eluent itself can change its properties over time due to division into layers within the containers, oxidation, gas absorption, changes in the ambient temperature. In any concrete analysis using highly sensitive detectors, the baseline of the measured signal may be at different levels of the scale of the recording instruments. If the compensation of changes in the composition and properties of the eluent is not made sufficiently accurately, false signals may arise in the differentiated measurement process, which distorts the image of the chromatographic peaks, which reflect the analytical results of the substance composition.

Liksom de ovan beskrivna förfarandena kännetecknas detta 462 664 4 förfarande av låg känslighet eftersom vid praktiskt taget varje konkret efterföljande analys för jämförelse användes en kontrollösning, som använts långt tidigare för en analys.Like the methods described above, this method is characterized by low sensitivity because in virtually every concrete subsequent analysis for comparison, a control solution was used, which was used much earlier for an analysis.

Det huvudsakliga syftet med den föreliggande uppfinningen är att åstadkomma ett förfarande för bestämning av ämnessam- mansättning inom vätskemikrokolonnkromatografi, vilket förfar- ande bygger på att den kontrollösning, som används såsom jämförelselösning, är till sina egenskaper maximalt lika sammansättningen av den i den konkreta analysen använda eluer- ingslösningen, vilket gör det möjligt att fullständigt reali- sera den höga känsligheten hos högkänsliga detektorer, vilka utnyttjas inom mikrokolonnkromatografi, och därvid höja den kromatografiska analysens noggranhet och dess pålitlighet.The main object of the present invention is to provide a method for determining the composition of substances in liquid microcolumn column chromatography, which method is based on the control solution used as a comparative solution being at its properties at most equal to the composition of the one used in the concrete analysis. the elution solution, which makes it possible to fully realize the high sensitivity of highly sensitive detectors, which are used in microcolumn chromatography, thereby increasing the accuracy of the chromatographic analysis and its reliability.

Detta syfte uppnås enligt uppfinningen genom ett förfar- ande för bestämning av ämnessammansättning inom vätskemikro- kolonnkromatografi, vilket förfarande bygger på att man pumpar ett prov att ett ämne med en eluentström genom en kromatografs mikrokolonn, att man vid mikrokolonnens utlopp utför kvan- titativ och kvalitativ analys av den lösning, vilken innehåller både eluent och det analyserade provets komponenter, att man utför kvantitativ och kvalitativ analys av kontrollösningen och jämför resultat av den första och den andra analysen och att man i enlighet med resultaten av jämförelsen bedömer det analyserade ämnets sammansättning, och det utmärkande för uppfinningen är att såsom kontrollösning användes den eluent, som pumpas igenom kromatografens mikrokolonn omedelbart före införingen av det analyserade provet.This object is achieved according to the invention by a method for determining the composition of substances in liquid micro-column chromatography, which method is based on pumping a sample of a substance with an eluent stream through a microcolumn of a chromatograph, performing quantitative and qualitative at the outlet of the microcolumn analysis of the solution containing both eluent and the components of the analyzed sample, performing quantitative and qualitative analysis of the control solution and comparing the results of the first and second analyzes and assessing the composition of the analyzed substance in accordance with the results of the comparison; and the characteristic of the invention is that the eluent pumped through the microcolumn of the chromatograph immediately before the introduction of the analyzed sample is used as the control solution.

Det enligt den föreliggande uppfinningen föreslagna förfarandet möjliggör höjning av noggrannheten och pålit- ligheten av ämnessammansättningens bestämning genom att man väsentligt höjer känsligheten. hos detekteringsprocessen tack vare möjligheten att ta hänsyn till förändringar hos eluent- och sorbentegenskaper i tiden.The method proposed according to the present invention enables an increase in the accuracy and reliability of the determination of the composition of matter by substantially increasing the sensitivity. in the detection process due to the ability to take into account changes in eluent and sorbent properties over time.

Uppfinningen beskrives närmare nedan under hänvisning till bifogade ritning, på vilken schematiskt visas en anordning för genomförande av förfarandet enligt uppfinningen.The invention is described in more detail below with reference to the accompanying drawing, in which a device for carrying out the method according to the invention is schematically shown.

Det väsentliga i förfarandet enligt uppfinningen bygger på följande: 462 664 5 Ett prov av ett ämne pumpas med en eluentström igenom en kromatografs mikrokolonn och vid mikrokolonnens utlopp utför man kvantitativ och kvalitativ analys av den lösning, som innefattar både eluent och det analyserade provets komponenter, och man utför även en kvantitativ' och. kvalitativ' analys av kontrolllösningen, och resultaten av den första och den andra analysen jämförs samt i enlighet med jämförelseresultatet bedömer man det analyserade ämnets sammansättning. Såsom kontrollösning använder man den eluent, som pumpats igenom kromatografens mikrokolonn omedelbart före införingen av det analyserade provet.The essence of the process according to the invention is based on the following: 462 664 A sample of a substance is pumped with an eluent stream through a microcolumn of a chromatograph and at the outlet of the microcolumn a quantitative and qualitative analysis of the solution comprising both eluent and the analyzed sample components is performed. and one also performs a quantitative 'and. qualitative analysis of the control solution, and the results of the first and the second analysis are compared and in accordance with the comparison result the composition of the analyzed substance is assessed. As the control solution, the eluent pumped through the microcolumn of the chromatograph immediately before the introduction of the analyzed sample is used.

En anordning för genomförande av förfarandet enligt upp- finningen innefattar en tryckkälla 1, vars hålighet via en dosator 2 kommunicerar med ett inlopp till en. kromatografs mikrokolonn 3, vilken är fylld med sorbent. Vid sitt utlopp uppbär mikrokolonnen 3 ett s k kyvettblock 4, som omfattar dels en genomströmningskyvett 5 för mätning, vilken omedelbart kommunicerar med mikrokolonnens 3 utlopp, och dels en till mätkyvetten 5 :i sin botten ansluten och analogt utförd jäm- förelsekyvett 6. Utloppet hos mätkyvett 5 kan med hjälp av en omkopplingskran 7 knmmunicera antingen med en avtappningsbe- hållare 8 (denna förbindelse visas med en heldragen linje) eller med inloppet till jämförelsekyvetten (denna förbindelse visas med en streckad linje. En laserljuskälla 9 är anordnad mitt för kyvettblocket 4 på sådant sätt, att dess två parall- ella strålar 10 var för sig passerar genom den motsvarande kyvetten 5, 6 och träffar en ingång till en fotomottagare 11, som är anordnad bakom kyvettblocket 4. Till fotomottagarens 11 utgångar är en jämförande enhets 12 ingångar kopplade (varje ingång till motsvarande utgång), till vars utgång är kopplat en registreringsenhet 13.A device for carrying out the method according to the invention comprises a pressure source 1, the cavity of which communicates via a dispenser 2 with an inlet to one. chromatograph microcolumn 3, which is filled with sorbent. At its outlet, the microcolumn 3 carries a so-called cuvette block 4, which comprises partly a flow-through cuvette 5 for measurement, which immediately communicates with the outlet of the microcolumn 3, and partly a comparison cuvette 6 connected to its bottom and analogously made. 5 can by means of a switching tap 7 communicate either with a drain container 8 (this connection is shown by a solid line) or with the inlet to the comparison cuvette (this connection is shown with a dashed line. A laser light source 9 is arranged in the middle of the cuvette block 4 on such such that its two parallel beams 10 each pass through the corresponding cuvette 5, 6 and strike an input of a photoreceiver 11, which is arranged behind the cuvette block 4. To the outputs of the photoreceiver 11 are connected the inputs of a comparating unit 12 (each input to the corresponding output), to the output of which is connected a registration unit 13.

Den på ritningen visade anordningen fungerar pâ följande sätt: Med hjälp av tryckkällan 1 åstadkommer man en eluentström genom dosatorn 2 och en sorbentpelare inuti kromatografens mikrokolonn 3. Med hjälp av dosatorn 2 inför man i denna eluentström ett prov av de analyserade ämnenas blandning vid mikrokolonnens 3 inlopp. Eluentströmmen med provet pumpas genom 462 664 6 mätkyvetten 5 :i det genomskinliga kyvettblocket 4 och vidare genom omkopplingskranen 7 in i behållaren 8 med en stor volym.The device shown in the drawing works as follows: By means of the pressure source 1 an eluent stream is obtained through the dosing 2 and a sorbent column inside the chromatograph microcolumn 3. Using the dosing medium 2 a sample of the mixture of the analyzed substances is introduced into the microcolumn 3 in the eluent stream. inlet. The eluent stream with the sample is pumped through the measuring cuvette 5: in the transparent cuvette block 4 and further through the switching tap 7 into the container 8 with a large volume.

Från ljuskällan 9 leds två laserstrålar 10 genom mätkyvetten 5 respektive jämförelsekyvetten 6 och mottas vid fotomottagarens 11 ingång. Två optiska signaler omvandlas till elektriska sådana och jämföres sinsemellan med hjälp av jämförelseenheten 12. Den resulterande signalen matas till registreringsenheten 13 och registreras.From the light source 9, two laser beams 10 are guided through the measuring cuvette 5 and the comparison cuvette 6, respectively, and are received at the input of the photoreceiver 11. Two optical signals are converted into electrical ones and are compared with each other by means of the comparison unit 12. The resulting signal is fed to the recording unit 13 and recorded.

Då man avslutar analysen omkopplar man omkopplingskranen 7 till det läge där mätkyvetten 5 respektive jämförelsekyvetten 6 är seriekopplade sinsemellan och. med, behållaren 8 (såsom visas på ritningen med streckad linje). Man kopplar in kromato- grafens mikrokolonn 3 och pumpar eluenten igenom kromatografens vätskepelare. Först övertygar man sig om att detektorns bassignal (registreringsnivån på enheten 13) har stabiliserats på en bestämd nivå, sedan återställer man omkopplingskranen 7 till dess föregående läge, i vilket kolonnen 3 kommunicerar med behållaren 8 genom mätkyvetten 5 (jämförelsekyvetten är därvid tillsluten i bägge ändar). Man inför det följande provet av de analyserade ämnenas blandning in i eluentströmmen och genomför dess analys. Efter analysens avslutning tvättar man igen jämförelsekyvetten med eluent, vilken till sin sammansättning motsvarar nästföljande analysmoment. På bassignalen skall verka den reella sammansättningen hos sorbenten i kromatografens kolonn vid den givna tidpunkten. Detta tas hänsyn till vid mätningar genom att man subtraherar signalen från mätkyvetten från signalen från jämförelsekyvetten.When the analysis is completed, the switching tap 7 is switched to the position where the measuring cuvette 5 and the comparison cuvette 6, respectively, are connected in series with each other and. with, container 8 (as shown in the dashed line drawing). The chromatograph microcolumn 3 is connected and the eluent is pumped through the chromatograph's liquid column. First it is ensured that the base signal of the detector (the registration level of the unit 13) has been stabilized at a certain level, then the switching tap 7 is reset to its previous position, in which the column 3 communicates with the container 8 through the measuring cuvette 5. ). The following sample of the mixture of the analyzed substances is introduced into the eluent stream and its analysis is carried out. After completion of the analysis, the comparative cuvette is washed again with eluent, which in its composition corresponds to the next analysis step. The actual composition of the sorbent in the column of the chromatograph at the given time must act on the base signal. This is taken into account in measurements by subtracting the signal from the measuring cuvette from the signal from the comparison cuvette.

Det enligt uppfinningen föreslagna förfarandet säker- ställer högre mätnoggrannhet eftersom i detta hänsyn tas till förändringar i eluentsammansättningen, som reellt passerar ur kromatografens mikrokolonn 3 efter den konkreta analysen och före nästföljande analys, på grund av närvaro av sorbenttill- satser, rester av de analyserade ämnena och förändringar i eluentens sammansättning beroende på tiden.The process proposed according to the invention ensures higher measurement accuracy because in this respect changes in the eluent composition, which actually passes from the chromatograph microcolumn 3 after the concrete analysis and before the next analysis, due to the presence of sorbent additives, residues of the analyzed substances are taken into account. and changes in the composition of the eluent over time.

Det föreliggande förfarandet beskrives närmare nedan i utföringsexempel under hänvisning till ritningen.The present method is described in more detail below in exemplary embodiments with reference to the drawing.

Exempel 1.Example 1.

För detektering använder man en differentialrefraktometer- 462 664 detektor.For detection, a differential refractometer 462 664 detector is used.

Man har genomfört avskiljning av polystyrener (med molekylvikter av 2-103-2-106) och äggviteämnen.Separation of polystyrenes (with molecular weights of 2-103-2-106) and egg whites has been carried out.

För analys av polystyrener använder man en mikrokolonn av fluorplast med en längd av 300 mm och en inre diameter av 0,5 mm. Såsom fyllningsmedel användes en blandning av makroporösa glas med olika porstorlekar. Sorbenpartiklarnas medelstorlek var lika med 6:1 pm. Vid mikrokolonnens 3 ändar var filter av poröst titan av fy/ 0,2 mm tjocklek anordnade.For analysis of polystyrenes, a microcolumn of fluoroplastic with a length of 300 mm and an inner diameter of 0.5 mm is used. As the filler, a mixture of macroporous glasses with different pore sizes was used. The average size of the sorbent particles was equal to 6: 1 μm. At the ends of the microcolumn 3, porous titanium filters of fy / 0.2 mm thickness were provided.

Såsom eluent använde man metyletylketon (kemisk ren).Methyl ethyl ketone (chemically pure) was used as the eluent.

Hastigheten för eluentgenompumpningen var lika med 4-6 pl/min. provvolymer översteg inte 0,03 ul vid en polystyrenenkoncentra- tion av 0,5 mg/ml. Man hade åstadkommit fem kalibrerade polystyrenlösningar med ett koncentrationsförhållande 0,8.The rate of eluent genome pumping was equal to 4-6 pl / min. sample volumes did not exceed 0.03 μl at a polystyrene concentration of 0.5 mg / ml. Five calibrated polystyrene solutions with a concentration ratio of 0.8 had been obtained.

Kolonnens effektivitet var lika med 10.000 teoretiska bottnar.The efficiency of the column was equal to 10,000 theoretical bottoms.

Efter varje analys regenererade man mikrokolonnen medelst eluenttvättning tills man erhöll en stabil bassignal. Detek- torns båda kyvetter (mät- och respektive jämförelsekyvett) var därvid seriekopplade mellan kyvettens 3 utgång och avtapp- ningsbehållaren 8.After each analysis, the microcolumn was regenerated by eluent washing until a stable base signal was obtained. The detector's two cuvettes (measuring and comparison cuvettes) were connected in series between the output of the cuvette 3 and the drain container 8.

Med hjälp av omkopplingskranen 7 förbikopplade man därefter både in- respektive utloppet för jämförelsekyvetten 6 och ledde den ut ur kromatografens vätskeområde för dess samverkan med analyserande anordningar hos detektorns jämför- ande område. Omkopplingskranen 7 förbinder därvid utloppet hos mätkyvetten 5 med avtappningsbehållaren 8.By means of the switching tap 7, both the inlet and the outlet of the comparison cuvette 6 were then bypassed and led out of the liquid area of the chromatograph for its cooperation with analyzing devices of the comparating area of the detector. The switching tap 7 then connects the outlet of the measuring cuvette 5 to the draining container 8.

Den under processen av kromatografens förberedande till analysen erhållna konkreta nivån av den optiska bassignalen vid givna tiden var betingad av den rena eluentens sammansättning, vilken dock redan har passerat genom kromatografens mikrokolonn 3, i vilken sedan infördes ett nästföljande prov för analys.The concrete level of the optical base signal obtained during the process of the chromatograph's preparation for the analysis at any given time was due to the composition of the pure eluent, which, however, has already passed through the chromatograph's microcolumn 3, into which a subsequent sample was then introduced for analysis.

Den på ett sådant sätt erhållna bassignalens nivå är närmast betingelserna för nästföljande mätning i jämförelse med alla de andra jämförande (differentiella) mätningar, erhållna medelst andra förfaranden.The level of the base signal thus obtained is closest to the conditions for the next measurement in comparison with all the other comparative (differential) measurements obtained by other methods.

Förfarandet enligt uppfinningen gjorde det möjligt att realisera en hög känslighet hos differentiallaserrefraktometer- detektorn. 462 664 Exempel 2.The method according to the invention made it possible to realize a high sensitivity of the differential laser refractometer detector. 462 664 Example 2.

Man har åstadkommit avskiljning av äggviteämnen. ur en blandning av mioglobin, äggalbumin, serum- och ferridinalbumin.Separation of egg whites has been achieved. from a mixture of myoglobin, egg albumin, serum and ferridinal albumin.

I egenskap av eluent tjänstgjorde trifluorättiksyra med 5 volym% vattentillsats.As eluent, trifluoroacetic acid with 5% by volume of water was added.

För avskiljning använde man en mikrokolonn 3 av samma storlek som i exemplet 1 och fyllt med ett markoporöst glas.For separation, a microcolumn 3 of the same size as in Example 1 was used and filled with a markoporous glass.

Sorbentkornens medelstorlek var lika med 5-6 um.The average size of the sorbent grains was equal to 5-6 μm.

Före analysen förberedde man en blandning av äggviteämnen med en koncentration av 1 mg/ml och provets volym var 0,03 ul.Prior to analysis, a mixture of egg whites with a concentration of 1 mg / ml was prepared and the volume of the sample was 0.03 μl.

Topparna hos varje blandningskomponent hade därvid en storhet av 0,8 skaldelar. Efter varje analys ändrades den optiska nollinjen väsentligt och det krävdes en noggrann tvätt av både mikrokolonnen 3 och kyvetterna 5, 6 med ren eluent. Den på mätningsskalan inställda nollinjen motsvarade de mest exakta betingelserna vid nästföljande analys. Tvättlösningen behöll man efter nollinställning inom den jämförande kyvetten 6 omedelbart före början av nästföljande analys och använde den i egenskap av kontrollösning.The peaks of each mixing component then had a size of 0.8 shell parts. After each analysis, the optical zero line was substantially changed and a thorough washing of both the microcolumn 3 and the cuvettes 5, 6 with pure eluent was required. The zero line set on the measurement scale corresponded to the most exact conditions in the next analysis. The wash solution was kept after zero setting within the comparative cuvette 6 immediately before the start of the next analysis and used as a control solution.

Under ovannämnda exempel har man fått följande data: 1. Tiden för en typisk analys av polymer med molekyl- Viktsfördelning från 2-103-2-105 är lika med ca 7 min. 2. Lösningsmedlets kvantitet för en typisk analys är lika med 0,1 ml. 3. Ämnets minimidetekteringsmängd ära/2 ng. 4. Nedre gräns för detektering - 0,5 ng. 5. Kvadratiska medelvärdet av utgångssignalernas avvikel- ser i förhållande till topparnas nivå är högst 2%. Med tiden ändras topparna högst 1%. 6. Kyvettens effektiva volym är 0,1 ul. 7. Arbetstrycket vid inloppet till kolonnen - 120 atm.Under the above examples, the following data have been obtained: 1. The time for a typical analysis of polymer with molecular weight distribution from 2-103-2-105 is equal to about 7 minutes. 2. The quantity of solvent for a typical assay is equal to 0.1 ml. 3. The substance's minimum detection amount is / 2 ng. 4. Lower limit for detection - 0.5 ng. 5. The square mean value of the deviations of the output signals in relation to the level of the peaks is at most 2%. Over time, the peaks change by a maximum of 1%. The effective volume of the cuvette is 0.1 ul. 7. Working pressure at the inlet to the column - 120 atm.

I jämförelse 'med de kända förfarandena har förfarandet enligt uppfinningen möjliggjort höjning av detekteringskänslig- heten med ca två tiopotenser tack vare möjligheten att ta hänsyn till förändringar i eluent- och sorbentegenskaperna med tiden.In comparison with the known methods, the method according to the invention has made it possible to increase the detection sensitivity by about two tens of powers due to the possibility of taking into account changes in the eluent and sorbent properties over time.

Det enligt uppfinningen föreslagna förfarandet kan få sin tillämpning för snabbanalyser av mikroprov av komplicerade 462 664 9 ämnessammansättningar, vilka kan lösas upp i vätskor, samt för forskningsarbeten inom bioteknologi, medicin, jordbruk och kemi.The process proposed according to the invention can be used for rapid analyzes of microsamples of complex substance compositions, which can be dissolved in liquids, as well as for research work in biotechnology, medicine, agriculture and chemistry.

Claims

A method for determining the composition of a substance by liquid microcolumn chromatography, which method is based on pumping a sample of a substance with an eluent stream through a microcolumn of a chromatograph, performing quantitative and qualitative analysis of the solution at the outlet of the microcolumn, which contains both eluent and the components of the analyzed sample, that a quantitative and qualitative analysis of a control solution is performed and the results of the first and the second analysis are compared, and that in accordance with the results of the comparison the composition of the analyzed substance is assessed. control solution, the eluent which is pumped through the microcolumn of the chromatograph immediately before the introduction of the analyzed sample is used.