Technisches Gebiet
Die Erfindung bezieht sich auf die analytische Chemie - Schnellmethoden zur Analyse zusammengesetzter Gemische von in flüssigem Medium aufgelösten Stoffen - und betrifft insbesondere ein Verfahren zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Stoffes in der Mikrosäulen-Flüssigkeitschromatografie.
Stand der Technik
Es ist ein Verfahren zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Stoffes in der Mikrosäulen-Flüssigkeitschromatografie bekannt, bei welchem eine Probe des Stoffes mit einem Eluentenstrom durch eine Chromatografie-Mikrosäule durchgepumpt, am Austritt der Chromatografiesäule eine quantitative und qualitative Analyse einer einen Eluenten und Komponenten der zu analysierenden Probe enthaltenden Lösung, eine quantitative und qualitative Analyse einer Kontrollösung durchgeführt, die Ergebnisse der ersten und zweiten Analyse miteinander verglichen und nach den Ergebnissen des Vergleiches die Zusammensetzung des zu analysierenden Stoffes bewertet werden. Die Analyse der einen Eluenten und Komponenten der zu analysierenden Probe enthaltenden Lösung wird vorgenommen, indem sie durch eine am Austritt der Mikrosäule angeordnete Durchlauf-Messküvette eines Detektors durchgelassen wird.
Die Analyse der Kontrollösung wird durchgeführt, indem diese Lösung mit der gleichen Geschwindigkeit wie auch für die Lösung mit der Probe durch eine der Messküvette ähnliche Vergleichsküvette des Detektors durchgelassen wird. Als Kontrollösung wird ein reiner Eluent benutzt. Die Signale der beiden Küvetten werden verglichen, vom Signal der Messküvette wird das Signal der Ver gleichsküvette abgezogen und das daraus erhaltene Differenzsignal registriert, nach dem die Zusammensetzung der Probe (Dzh. Kirklend, "Sovremennoe sostoyanie zhidkostnoi khromatografii" ("Heutiger Stand der Flüssigkeitschromatografie"), 1974, Mir (Moskau), S. 82 bis 84) beurteilt wird.
Das bekannte Verfahren wird durch eine niedrige Empfindlichkeit wegen einer Temperaturdifferenz der zwei Ströme der Lösung sowie wegen einer Nichtübereinstimmung der Zusammensetzungen der beweglichen Phase in der Vergleichs- und Messküvette gekennzeichnet. In der Messküvette trägt die bewegliche Phase Reste der vorhergehenden Proben, Spuren des aufgelösten Sorbens und andere Beimischungen, die für die empfindlichen Detektoren den Verlauf der Änderungen und Pegel eines Hintergrundsignals bestimmen, das veränderlich sein und nach seinem Pegel vom Hintergrundsignal der Vergleichsküvette wesentlich abweichen kann. Ausserdem wird das bekannte Verfahren durch hohe Kosten der Analysen wegen einer doppelten Menge des für die Durchführung der Analyse benötigten Eluenten und des Vorhandenseins einer zweiten Druckquelle gekennzeichnet.
Es ist auch ein Verfahren zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Stoffes in der Mikrosäulen-Flüssigkeitschromatografie bekannt, bestehend darin, dass eine Probe des Stoffes mit einem Eluentenstrom durch eine Chromatografie-Mikrosäule durchgepumpt, am Austritt der Chromatografiesäule eine quantitative und qualitative Analyse einer einen Eluenten und Komponenten der zu analysierenden Probe enthaltenden Lösung, eine quantitative und qualitative Analyse einer Kontrollösung durchgeführt, die Ergebnisse der ersten und zweiten Analyse miteinander vergleichen und nach den Ergebnissen des Vergleiches die Zusammensetzung des zu analysierenden Stoffes bewertet werden.
Die Analyse der einen Eluenten und Komponenten der zu analysierenden Probe enthaltenden Lösung wird am Austritt der Chromatografie-Mikrosäule vorgenommen, indem diese Lösung durch eine Durchlauf-Messküvette eines Detektors durchgelassen wird. Die Analyse der Kontrollösung wird durchgeführt, indem die letztere durch eine Durchlauf-Vergleichsküvette des Detektors durchgelassen wird. Der Vergleichsküvette wird die einen Eluenten und Komponenten einer zum Vergleich ausgenutzten Vergleichsprobe enthaltende Kontrollösung zugeführt, nachdem sie durch eine der Betriebssäule ähnliche zusätzliche Chromatografie-Mikrosäule durchgelassen worden ist (US-A 3 847 550).
Dieses Verfahren wird auch durch eine niedrige Empfindlichkeit auf Grund dessen gekennzeichnet, dass es nicht möglich ist, absolut identische Säulen zu schaffen. Die Bedingungen für die Trennung der ähnlichen Proben werden sich in den zwei Säulen stets unterscheiden. Ausserdem haben diese Säulen verschiedene Vorgeschichten, da durch sie verschiedene Proben durchgelassen werden. Bei Detektoren mit einer hohen Empfindlichkeit werden die Unterschiede in der Zusammensetzung der die Betriebs- und die Vergleichssäule verlassenden beweglichen Phasen wegen deren unterschiedlicher Vorgeschichte registriert werden.
Es ist schliesslich ein Verfahren zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Stoffes in der Mikrosäulen-Flüssigkeitschromatografie bekannt, bei welchem Verfahren eine Probe des Stoffes mit einem Eluentenstrom durch eine Chromatografie-Mikrosäule durchgepumpt, am Austritt der Chromatografiesäule eine quantitative und qualitative Analyse einer einen Eluenten und Komponenten der zu analysierenden Probe enthaltenen Lösung durchgeführt, indem sie durch eine Messküvette eines Detek tors durchgelassen wird. Darüber hinaus wird eine quantitative und qualitative Analyse einer Kontrollösung durchgeführt, indem diese durch eine Vergleichsküvette des Detektors durchgelassen wird. Die Ergebnisse der ersten und der zweiten Analyse werden verglichen, und nach den Ergebnissen des Vergleiches wird die Zusammensetzung des zu analysierenden Stoffes beurteilt.
In diesem Verfahren wird als in die Vergleichsküvette einströmende Kontrollösung eine die Messküvette verlassende und durch einen Verdünnungsbehälter mit einem durch einen reinen Eluenten gefüllten Volumen von 10 000- bis 100 000mal grösser als das Volumen der Probe durchgelassene Lösung ausgenutzt. Der Austritt des Verdünnungsbehälters ist mit dem Eintritt der Vergleichsküvette verbunden (US-A 3 981 179).
Das Volumen des für die Durchführung einer Analyse benötigten Eluenten beträgt 1 bis 2% des Volumens des Verdünnungsbehälters. Im Ergebnis wird die Zusammensetzung der Flüssigkeit im Verdünnungsbehälter durch den die Säule verlassenden Eluenten jedoch geringfügig beeinflusst. Der Gehalt der Flüssigkeit wird aber langsam ausgewechselt, und der die Vergleichsküvette passierende Eluent kann nicht eine wahre Zusammensetzung des die Chromatografiesäule bei der Durchführung einer konkreten Analyse verlassenden Eluenten widerspiegeln. Die Zusammensetzung des die Säule passierenden Eluenten kann von der des Eluenten, der durch die Säule nicht durchgelassen worden ist, wesentlich abweichen. Der Eluent kann in sich Stoffe tragen, die in diesen durch Auflösung des Sorbens oder der Reste von sich schwer auswaschen lassenden Stoffen der vorherigen Serie der Analysen hineingelangen.
Darüber hinaus kann der Eluent selbst seine Eigenschaften in der Zeit wegen einer Abtrennung in den Behältern, einer Oxydation, Gasaufnahme, Änderung der Umgebungstemperatur ändern.
Bei jeder konkreten Analyse kann die Hintergrund-Messignallinie bei Verwendung der hochempfindlichen Detektoren in verschiedenen Höhen der Skale der Registriergeräte liegen. Werden die Änderungen der Zusammensetzung und der Eigenschaften des Eluenten nicht genau genug kompensiert, können bei einem differentialen Messverfahren Scheinsignale auftreten, die das Bild der Verteilung der chromatografischen Zacken, welches das Ergebnis der Analyse des Stoffgemisches anzeigt, verzerren.
Das bekannte Verfahren wird ebenso wie die obenbeschriebenen durch eine niedrige Empfindlichkeit gekennzeichnet, denn praktisch wird bei jeder konkreten Analyse mit ihrer eigenen laufenden Nummer zum Vergleich eine Kontrollösung ausgenutzt, die einer Analyse entspricht, welche eine von der zur Zeit durchgeführten Analyse weit entfernte Nummer besitzt.
Darstellung der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Stoffes in der Mikrosäulen-Flüssigkeitschromatografie zu schaffen, bei dem die als Vergleichslösung benutzte Kontrollösung nach ihren Eigenschaften an die Zusammensetzung einer in der konkreten Analyse verwendeten eluierenden Lösung maximal angenähert ist, was es gestattete, die hohe Empfindlichkeit der in der Mikrosäulen-Chromatografie angewendeten hochempfindlichen Detektoren vollständig zu realisieren sowie die Genauigkeitkeit und die Sicherheit der Durchführung der chromatografischen Analyse zu erhöhen.
Das Erfindungswesen besteht darin, dass in dem Verfahren zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Stoffes in der Mikrosäulen-Flüssigkeitschromatografie, dahin gehend, dass eine Probe des Stoffes mit einem Eluentenstrom durch eine Chromatografie-Mikrosäule durch gepumpt, am Austritt der Chromatografie-Mikrosäule eine quantitative und qualitative Analyse einer einen Eluenten und Komponenten der zu analysierenden Probe enthaltenden Lösung, eine quantitative und qualitatitve Analyse einer Kontrollösung durchgeführt, die Ergebnisse drer ersten und zweiten Analyse verglichen und nach den Ergebnissen des Vergleiches die Zusammensetzung des zu analysierenden Stoffes bewertet werden, gemäss der Erfindung als Kontrollösung ein Eluent benutzt wird, der durch die Chromatografie-Mikrosäule unmittelbar vor der Einführung der zu analysierenden Probe in diese durchgepumpt wird.
Das erfindungsgemäss durchgeführte Verfahren zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Stoffes in der Mikrosäulen-Flüssigkeitschromatografie gestattet es, die Genauigkeit und Sicherheit der Bestimmung der Zusammensetzung des Stoffes durch eine wesentliche Erhöhung der Empfindlichkeit der Detektion durch Ermöglichung der Berücksichtigung der Änderungen der Eigenschaften des Eluenten und des Sorbens in der Zeit zu erhöhen.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
Die Erfindung wird durch die nachstehende Beschreibung einer konkreten Ausführungsform anhand der beiliegenden Zeichnung näher erläutert, in der eine Einrichtung für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Stoffes in der Mikrosäulen-Flüssigkeitschromatografie schematisch dargestellt ist.
Bester Weg zur Ausführung der Erfindung
Das Wesen des erfindungsgemässen Verfahrens zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Stoffes in der Mikrosäulen-Flüssigkeitschromatografie besteht in folgendem.
Eine Probe des Stoffes wird mit dem Strom eines Eluenten durch eine Chromatografie-Mikrosäule durchgepumpt, am Austritt der Chromatografie-Mikrosäule wird eine quantitative und qualitative Analyse einer einen Eluenten und Komponenten der zu analysierenden Probe enthaltenden Lösung vorgenommen, es wird eine quantitative und qualitative Analyse einer Kontrollösung durchgeführt, es werden die Ergebnisse der ersten und der zweiten Analyse verglichen und nach den Ergebnissen des Vergleiches die Zusammensetzung des zu analysierenden Stoffes bewertet. Als Kontrollösung wird ein Eluent benutzt, der durch die Chromatografie-Mikrosäule unmittelbar vor der Einführung der zu analysierenden Probe in diese durchgepumpt wird.
Die in der Zeichnung dargestellte Einrichtung für die Durchführung des Verfahrens zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Stoffes in der Mikrosäulen-Flüssigkeitschromatografie enthält eine Druckquelle 1, deren Hohlraum über einen Dosierer 2 mit dem Eintritt einer Chromatografie-Mikrosäule 3 verbunden ist, die mit einem Sorbens gefüllt ist. Am Austritt der Mikrosäule 3 ist eine Küvetteneinheit 4 angeordnet, die eine mit dem Austritt der Mikrosäule 3 unmittelbar verbundene Durchlauf-Messküvette 5 und eine an dieser mit der Seitenwand anliegende und ihr ähnliche Vergleichsküvette 6 umfasst. Der Austritt der Messküvette 5 kann mit Hilfe eines Umschalthahns 7 entweder mit einem Abflussbehälter 8 oder mit dem Eintritt der Vergleichsküvette 6 verbunden werden (die Verbindungen sind durch eine ausgezogene bzw. gestrichelte Linie angedeutet).
Eine Laserlichtquelle 9 ist gegenüber der Küvetteneinheit 4 derart angeordnet, dass die zwei durch diese ausgestrahlten Parallelstrahlen die jeweiligen Küvetten 5, 6 passieren und auf den Eingang eines hinter der Küvetteneinheit 4 angeordneten Fotoempfän gers 11 auftreffen. An die Ausgänge des Fotoempfängers 11 sind die Eingänge einer Vergleichseinheit 12 (jeder Eingang an den zugeordneten Ausgang) angeschlossen, an deren Ausgang ein Registriergerät 13 gelegt ist.
Die in der Zeichnung dargestellte Einrichtung arbeitet nach dem erfindungsgemässen Verfahren wie folgt.
Durch die Druckquelle 1 wird ein Eluentenstrom durch den Dosierer 2 und die Säule des Sorbens in der Chromatografie-Mikrosäule 3 erzeugt. Mit Hilfe des Dosierers 2 wird diesem Eluentenstrom am Eintritt der Mikrosäule 3 eine Probe eines Gemisches der zu analysierenden Stoffe zugesetzt. Der Eluentenstrom mit der Probe wird durch die Messküvette 5 der transparenten Küvetteneinheit 4 und im weiteren durch den Umschalthahn 7 in einen Behälter 8 mit einem grossen Volumen durchgepumpt. Die zwei Laserstrahlen 10 von der Lichtquelle 9 werden durch die Mess- und Vergleichsküvette 5 bzw. 6 durchgelassen und am Eingang des Fotoempfängers 11 empfangen. Die zwei optischen Signale werden in elektrische umgewandelt und miteinander mit Hilfe der Vergleichseinheit 12 verglichen. Das Summensignal wird dem Registriergerät 13 zugeführt und registriert.
Nach Abschluss der Analyse wird der Umschalthahn 7 in die Stellung umgelegt, wo sich die Mess- und die Vergleichsküvette 5 bzw. 6 als hintereinander- und ferner in Reihe mit dem Behälter 8 geschaltet erweisen (wie in der Zeichnung gestrichelt angedeutet). Der Eluent wird durch den Flüssigkeitskanal des Chromatografen, einschliesslich der Mikrosäule 3, durchgepumpt. Man vergewissert sich darüber, dass sich das Hintergrundsignal des Detektors (der Aufnahmepegel am Registriergerät 13) auf einem bestimmten Niveau stabilisiert hat, worauf der Umschalthahn 7 in die vorherige Stellung zurückgebracht wird, wo die Säule 3 mit dem Behälter 8 über die Messküvette 5 verbunden ist (wobei sich die Vergleichsküvette 6 als beidseitig überdeckt erweist). Dem Eluentenstrom wird eine weitere Probe des Gemisches der zu analysierenden Stoffe zugesetzt, und es wird eine Analyse durchgeführt.
Nach Beendigung der Analyse wird die Vergleichsküvette erneut durch einen Eluenten gepült, der nach seiner Zusammensetzung dem Zeitpunkt der nächsten Analyse entspricht. Das Hintergrundsignal wird durch den realen Zustand des Sorbens der Chromatografiesäule zum gegebenen Zeitpunkt beeinflusst. Dies wird bei Messungen durch Subtraktion des Signals der Vergleichsküvette vom Signal der Messküvette berücksichtigt.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Stoffes sichert eine höhere Messgenauigkeit, da Änderungen der Zusammensetzung des die Chromatographie-Mikrosäule 3 nach einer konkreten Analyse und vor der nachfolgenden Analyse real verlassenden Eluenten, verursacht durch Beimischungen des Sorbens, Reste der zu analysierenden Stoffe, zeitliche Änderungen der Zusammensetzung des Eluenten selbst, in Betracht gezogen werden.
Zum besseren Verständnis des Wesens des erfindungsgemässen Verfahrens werden nachfolgend konkrete Ausführungsbeispiele aufgeführt.
Beispiel 1
Dür die Detektion wurde ein differentialer refraktometrischer Detektor eingesetzt.
Es wurden Polystyrole mit einem Molekulargewicht von 2 . 10<3> bis 2 . 10<6> und Eiweissstoffe getrennt.
Zur Analyse der Polystyrole wurde eine Mikrosäule aus Fluorkunststoff mit einer Länge von 300 mm und mit einem Innendurchmesser von 0,5 mm angewendet. Als Füllstoff wurde ein Gemisch von makroporigen Gläsern mit Poren verschiedener Grösse benützt. Die mittlere Grösse der Teilchen des Sorbens beträgt 6 +/- 1 mu m. An den Enden der Mikrosäule 3 wurden Filter aus porigen Titan mit einer Dicke von ca. 0,2 mm angeordnet.
Als Eluent wurde (chemisch reines) Methyläthylketon eingesetzt. Die Durchpumpgeschwindigkeit des Eluenten belief sich auf 4 bis 6 mu l/min. Das Volumen der Probe übertraf 0,03 mu l bei einer Konzentration der Polystyrole von ca. 0,5 mg/ml nicht. Es wurden fünf geeichte Polystyrollösungen mit einem Trennfaktor von 0,8 getrennt. Die Wirksamkeit der Säule betrug 10 000 theoretische Böden.
Nach jeder Analyse wurde die Mikrosäule 3 durch Spülung mit dem Eluenten regeneriert, bis ein stabiles Hintergrundsignal erhalten ist. Hierbei lagen die beiden Küvetten 5, 6 (die Mess- und Vergleichsküvette) des Detektors in Reihe zwischen dem Austritt der Säule 3 und dem Abflussbehälter 8.
Danach wurde mit Hilfe des Umschalthahns 7 der Ein- und der Austritt der Vergleichsküvette 6 überdeckt und sie selbst aus dem Flüssigkeitskanal des Chromatografen herausgeführt, wobei diese in Wechselwirkung mit den Analysiergeräten des Vergleichsweges des Detektors gebracht wurde. Hierbei verband der gleiche Umschalthahn 7 den Austritt der Messküvette 5 mit dem Abflussbehälter 8.
Der im Verlauf der Operation der Vorbereitung des Chromatografen zur Analyse erhaltene konkrete Pegel des optischen Hintergrundsignals wurde zum gegebenen Zeitpunkt durch die Zusammensetzung des reinen, jedoch durch die Chromatografie-Mikrosäule 3 durchgelaufenen Eluenten bedingt, wobei es um die konkrete Chromatografie-Mikrosäule geht, in die nachher die nächste Probe zur Analyse eingeführt wird. Der auf diese Weise erreichte Pegel des Hintergrundsignals trug den Bedingungen der nachfolgenden Trennung von allen in anderen Verfahren erhaltenen (differentialen) Vergleichsmessungen am besten Rechnung.
Das erfindungsgemässe Verfahren gestattet es, eine hohe Empfindlichkeit des refraktometrischen differentialen Laserdetektors zu realisieren.
Beispiel 2
Es wurden einer Trennung Eiweissstoffe aus einem Gemisch von Myoglobin, Eier-, Blutalbumin und Ferritin unterzogen. Als Eluent diente die Trifluoressigsäure mit einem Wasserzusatz von 5 Vol.-%.
Zur Trennung wurde eine Mikrosäule 3 der gleichen Abmessungen wie auch im Beispiel 1 eingesetzt, die mit einem makroporigen Glas gefüllt war. Die mittlere Korngrösse des Sorbens betrug 5 bis 6 mu m.
Zur Analyse wurde ein Gemisch von Eiweissstoffen mit einer Konzentration von 1 mg/ml vorbereitet, während das Volumen der Probe 0,03 ml ausmachte. Hierbei wiesen die Zacken von jeder der Komponenten des Gemisches einen Wert von 0,8 der Skale auf. Die optische Null änderte sich nach jeder Analyse beträchtlich, und es wurde eine sorgfältige Spülung der Mikrosäule 3 und der Küvetten 5, 6 mit einem reinen Eluenten benötigt. Die auf der Messskale eingestellte Null entsprach den Bedingungen der nachfolgenden Analyse am genauesten. Die Portion der Waschmittellösung wurde nach der Nulleinstellung in der Vergleichsküvette 6 unmittelbar vor Beginn der nächsten Analyse belassen und als Kontrollösung benutzt.
An Hand der angeführten Beispiele für die Durchführung des Verfahrens wurden folgende Angaben ermittelt.
1. Zeit für die typische Analyse eines Polymers mit einem Bereich der Molekularmassen von 2 . 10<3> bis 2 . 10<6> ca. 7 min.
2. Menge des Lösungsmittels für eine typische Analyse 0,1 ml.
3. Minimale nachweisbare Stoffmenge ca. 2 mg.
4. Untere Nachweisbarkeitsgrenze 0,5 mg.
5. Mittlere quadratische Abweichung der Ausgangssignale nach der Abweichung der Höhen der Zacken maximal 2%, nach der Haltezeit für die Zacken maximal 1%.
6. Wirksames Volumen der Küvette 0,1 mu l.
7. Betriebsdruck am Eintritt der Säule 12 MPa.
Im Vergleich zu den bekannten Verfahren zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Stoffes in der Mikrosäulen-Flüssigkeitschromatografie gestattete das erfindungsgemässe Verfahren, die Nachweisempfindlichkeit um zwei Grössenordnungen durch Ermöglichung der Berücksichtigung der zeitlichen Änderungen des Eluenten und des Sorbens zu erhöhen.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Stoffes kann für Schnellanalysen von Mikroproben zusammengesetzter Gemische von in Flüssigkeiten lösbaren Stoffen, für Untersuchungen auf dem Gebiet der Biotechnologie, Medizin, Landwirtschaft, Chemie Anwendung finden.