CH670764A5

CH670764A5 -

Info

Publication number: CH670764A5
Application number: CH727/85A
Authority: CH
Inventors: Paul A Cornelius; Robin M Hochstrasser; Neville R Kallenbach; Harvey Rubin; George J Todaro
Original assignee: Molecular Biophysics Tech
Priority date: 1984-02-16
Filing date: 1985-02-15
Publication date: 1989-07-14
Also published as: IL74322A; DE3505728A1; EP0152072A2; IL74322A0; EP0152072A3; DE3505728C2; AU3849685A; CA1262700A

Description

BESCHREIBUNG Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur mindestens teilweisen Desaktivierung der in einem biologischen Medium wie Blut oder Blutbestandteilen (beispielswei-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

670 764

4

se Blutplasma, Blutserum, Blutfaktor VIII, usw.) enthaltenen Nucleinsäuren sowie Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes bzw. eines Proteinpräparates. Der hier verwendete Ausdruck Inaktivierung bedeutet die gesteuerte Veränderung von Nukleinsäurestrukturen in Gegenwart von Proteinen vermittels durch Lichtimpulse bewirkter Photolyse, um deren Virulenz und Infektionsfähigkeit weitgehend bzw. praktisch vollkommen zu unterbinden, während die Funktionsfähigkeit der anwesenden Proteine im wesentlichen bzw. weitgehend erhalten bleibt.

Es ist Aufgabe der Erfindung, alle oder zumindest im wesentlichen alle im zu behandelnden Medium vorhandenen, bekannten ebenso wie bislang unbekannten, auf DNA oder RNA aufgebauten Agentien in deutlichem Ausmass bzw. praktisch vollständig zu zerstören einschliesslich der infektiösen Nukleinsäure-Moleküle, die in der Lage sind, sich in Viroide oder Viren oder Bakterien zu transformieren, während im Medium ebenfalls vorhandene Proteine in hohem Masse oder praktisch vollständig intakt bleiben. Bis zur vorliegenden Erfindung war es nicht möglich, wirkungsvoll und gezielt Nukleinsäurestrukturen durch Photolyse zu zerstören, ohne gleichzeitig anwesende Proteine in hohem Masse bzw. weitgehend funktionsunfähig zu machen. Das Verfahren nach der Erfindung eignet sich für eine Vielzahl von biologischen Medien. Es soll nachstehend an drei Beispielen näher erläutert werden.

Blutsterilisation

Obwohl in der Vergangenheit bereits eine Vielzahl unterschiedlicher Verfahren vorgeschlagen wurde, war es bisher nicht möglich, eine wirksame Behandlung vor der Bluttransfusion sicherzustellen, weshalb ein bedeutender Prozentsatz von Blutempfängern Hepatitis bzw. Aids entwickelte. (Vgl. New England Journal of Medicine, Vol. 310, Seiten 69 bis 75,1984).

Bereits vorgeschlagene Verfahren beinhalten beispielsweise die Filterung von Blut durch Bakterien- und/oder Vi-ral-Filter sowie den Zusatz von Antibiotika. Beide Verfahren haben sich in der Praxis als unzuverlässig und ineffizient erwiesen. Insbesondere war es schwierig, eine ausreichend hohe Blutdurchflussgeschwindigkeit durch Filter aufrechtzuerhalten; der Zusatz von potentiell toxisch wirkenden Stoffen ist nicht wünschenswert.

Es ist allgemein üblich, Transfusionslösungen vor der Anwendung auf die Anwesenheit bestimmter Pathogene hin zu untersuchen. Solche Untersuchungen sind jedoch nicht 100%ig verlässlich und ausserdem zeitraubend und kostspielig. Darüber hinaus sind für zahlreiche Pathogene bisher keine Testmethoden bekannt.

Gentechnologisch aus Säugetierzellkulturen hergestellte proteinhaltige Produkte:

In der DNA Rekombinationstechnik wird bislang oftmals für die Herstellung proteinhaltiger Produkte von manipulierten Bakterienstämmen, wie beispielsweise E. Coli, ausgegangen. Während gewisse Produkte, wie z.B. Insulin, so erfolgreich ohne die Verwendung von Säugetier-Zellkulturen hergestellt werden können, lassen sich andere Proteine nicht einfach von derartigen Stämmen ableiten, da diese nicht in der Lage sind, das gewünschte Protein-Endprodukt als Komplex mit anderen Molekülen, beispielsweise Kohlehydratmolekülen, zu bilden. Es besteht die Auffassung, dass eine grosse Anzahl erwünschter Protein-Produkte auf genetischem Wege nicht ohne den Einsatz von Säugetier-Zellkulturen hergestellt werden können.

Allerdings sind bei der Verwendung derartiger Zellkulturen gewisse Probleme zu erwarten. (Vgl. «Injectable Monoclonal Antibody Products: Regulatory Concerns» von Bruce

Merchant, vorgetragen beim Regulatory Affairs Professional Society Meeting am 9. Nov. 1983; «Points to Consider in the Production and Testing of New Drugs and Biologicals Produced by Recombinant DNA Technology», Department of Health and Human Services, 18. Nov. 1983).

In der Regel sekretieren tierische Zellen ihre Protein-Produkte nicht direkt in das umgebende Medium. Um diese Produkte zu ernten, wird man in der Regel die Zellwandmembranen zerstören müssen, um so den Austritt der Protein-Produkte in das Medium und die nachträgliche Isolierung und Reinigung zu ermöglichen. Als Folge der zerstörten Zellwände wird gleichzeitig auch Zell-DNA und/oder -RNA freigegeben. Da viele der leicht zu kultivierenden Zellkulturen Krebszellstämme sind, muss sichergestellt werden, dass die erzeugten Protein-Endprodukte kein aktives DNA und/oder RNA enthalten. Diese Notwendigkeit besteht auch dann, wenn verbesserte Trenn- und Reinigungsmethoden angewendet werden sollten. Unabdingbare Voraussetzung zur sicheren Anwendung der Endprodukte ist deren Freiheit von jeglichem aktiven DNA/RNA. (Vgl. «Engineering To-morrows Vaccines» von T. Wilson, Biotechnology 2(1), S. 29—40, Januar 1984).

Herstellung von Impfstoffen:

Für die Herstellung von Impfstoffen bedarf es ebenfalls «getöteter» bzw. abgeschwächter Viren. Im letzteren Fall ist es häufig wünschenswert, ein Verfahren vorzusehen, bei dem einerseits die Infektivität der Viren abgeschwächt, andererseits aber diese so weit intakt bleiben, um die gewünschte Immunreaktion hervorzurufen.

Die genauen Vorgänge, die zu einer viralen Abschwä-chung unter gleichzeitigem Aufrechterhalten der immunoge-nen Wirksamkeit führen, sind nicht bekannt. Als Theorie wurde vorgeschlagen, dass bestimmte Abschwächungs- bzw. Abtötungsverfahren für Viren zu einer Veränderung der Struktur der einzelnen oder aller Proteinhüllen bzw. der Nukleinsäuren oder beider führen, so dass diese einerseits nicht mehr in der Lage sind, ernsthafte Infektionen auszulösen, andererseits aber zumindest einen Teil der Proteinhülle des Virus und möglicherweise auch der Nukleinsäuren so weit intakt lassen, um als antigene Determinanten zu wirken und so zur Antikörper-Bildung als Reaktion auf den Impfstoff zu führen.

Es sind verschiedene Verfahren bekannt geworden, um Viren abzutöten bzw. abzuschwächen, wie beispielsweise chemische Verfahren und Techniken der Zellkultivierung. In der Literatur wird zwar beschrieben, dass bestimmte Viren gegen ultraviolettes Licht nicht tolerant sind; andererseits wird berichtet, dass UV Strahlung benutzt werden kann, um Viren zu desaktivieren, ohne ihre Wirksamkeit zum Auslösen der Immunreaktion zu zerstören. (Vgl. US Patent 4 021 364 «Mikroverkapselung des Virus möglich, wenn UV Licht gut toleriert wird» und US Patent 4 071 619 «gereinigte und konzentrierte lebende Vaccine werden mit UV von 5.000 bis 200.000 erg/cm2 bestrahlt, um den Virus abzutöten, ohne jedoch dessen immunogene Eigenschaften zu zerstören»).

Darüberhinaus besteht ein Bedürfnis nach verbesserten Verfahren zur gezielten Desaktivierung, die es gestatten, einerseits die Proteinhüllen weitgehend zu erhalten, während andererseits die Nukleinsäure-Strukturen möglichst vollständig zerstört werden.

UV Bestrahlung zum Desaktivieren:

Es ist bekannt, bestimmte Materialien mit UV Bestrahlung zu desaktivieren. Hierzu werden die zu behandelnden Materialien der Strahlung üblicher UV Quellen im Bereich

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

5

670 764

von 50 bis 1000 Watt und einer Zeitspanne von einigen Minuten bis zu einigen Stunden ausgesetzt.

Erhöhte Aufmerksamkeit wurde in der Vergangenheit der Wirkung von UV Strahlung auf biologische Systeme zuteil, insbesondere wegen möglicher mutagener, zellularer, molekularer und/oder abtötender Wirkung auf Bakterien und Viren. Es ist beispielsweise bekannt, dass bestimmte DNA bei Bestrahlung in einem Wellenlängenbereich von 230 bis 470 nm inaktiviert werden, und dass die Empfindlichkeit der DNA abhängig von der Wellenlänge ist. Diese Wirkung wurde bei der Verwendung üblicher Strahlungsquellen wie Quecksilber-Xenon- oder Metalldampflampen beobachtet. Die Wirkung kontinuierlicher UV Bestrahlung zum Zerstören von DNA wird beschrieben in «Oxygen-Independent Inactivation of Haemophilus Influenzae Transforming DNA by Monochromatic Radiation: Action Spectrum, Effect of Histidine and Repair», Cabrera Juarez et al, Photochemistry and Photobiology, 23, S. 309-313 (1976).

Wirkung der UV Strahlung im Molekularbereich:

Es ist der Fachwelt bekannt, dass ausgewählte organische Verbindungen unter UV Bestrahlung besonders reagieren. So weiss man beispielsweise, dass verschiedene organische Verbindungen unterschiedliche Absorptions-Koeffizienten haben, also die Fähigkeit, Energie zu absorbieren, sich von Verbindung zu Verbindung ebenso wie mit der Wellenlänge der Strahlung ändert. Es ist ferner bekannt, dass das von einem organischen Molekül absorbierte Licht dieses von seinem Grundzustand auf ein höheres Energieniveau bringen kann, und dass das Molekül in diesem Zustand in der Regel nur sehr kurze Zeit verbleibt («Lebensdauer» des Energiezustandes); und weiterhin, dass im Molekül in diesem Zustand eine Reaktion ablaufen kann, die zur dauerhaften Änderung seiner Struktur führt; oder aber, dass das Molekül spontan in seinen Grundzustand zurückkehrt, oder in einem Zwischenzustand auf dem Weg dorthin verharrt. Zur allgemeinen Beschreibung des Verhaltens organischer Moleküle bei UV Bestrahlung wird die folgende Literaturstelle genannt: «Some Principles Governing the Luminescence of Or-ganic Molecules», R.M. Hochstrasser, erschienen in «Exci-ted States of Biopolymers», herausgegeben von Robert F. Steiner, Plenum Publishing Corp. (1983).

Das Verhalten von Proteinen und deren Aminosäuren unter der Einwirkung von UV Bestrahlung wurde bereits ausführlich untersucht. Im Unterschied zu den meisten Aminosäuren, die Bestandteile der Proteine sind und UV Licht von mehr als 220 nm Wellenlänge nicht wesentlich absorbieren, wird von einigen Aminosäuren, wie beispielsweise Tryptophan und, in geringerem Ausmass, Phenylalanin und Ty-rosin, UV Strahlung in bedeutendem Umfang absorbiert. Als Folge davon werden bei den genannten Aminosäuren strukturverändernde chemische Reaktionen eingeleitet, ein Vorgang, der als «Photolyse» bezeichnet wird.

Es ist bekannt, dass der photochemische Zerfall von Tryptophan im wässrigen Medium durch Bestrahlung im Wellenlängenbereich zwischen 240 und 310 nm erfolgt, und dass die Ausbeute dieser photochemischen Reaktion, als Quantenausbeute ausgedrückt, ihren Maximalwert bei einer Bestrahlung im Wellenlängenbereich von 240 bis 250 nm erreicht. (Vgl. «Ultraviolet Action Spectrum for Tryptophan Destruction in Aqueous Solution» von Raymond F. Bork-man, Photochemistry and Photobiology, 26, S. 16 —166 (1977).

Bestimmte Wirkungen ultrakurzer Bestrahlung von Pico-sekunden-Dauer auf das Verhalten von Tryptophan wurden unter verschiedenen Gesichtspunkten in einer Anzahl von Studien untersucht. So ist beispielsweise bekannt, dass die Zeitspanne der Fluoreszenz von angeregtem Tryptophan in wässriger Lösung von einer Vielzahl von Faktoren abhängig ist, wie beispielsweise pH, Temperatur etc.; die durchschnittliche Fluoreszenzdauer beträgt um 3 Nanosekunden.

Bei als Proteinbaustein vorliegendem Tryptophan sind die Verhältnisse wesentlich komplexer und sind bisher Gegenstand einer Vielzahl von zum Teil widersprüchlichen Diskussionen. So wurde beispielsweise festgestellt, dass die Fluoreszenzdauer bei den Tryptophan enthaltenden Hämo-proteinen (die in roten Blutkörperchen vorkommen) unter einer Nanosekunde liegt. (Vgl. «Non-Exponential Fluorescence Decay of Aqueous Tryptophan and Two Related Peptides by Picosecond Spectroscopy» von G. R. Fleming et al, Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 75(10), S. 4652-4656,1978; und «The Rates of Photodestruction of Tryptophan Resi-dues in Human and Bovine Ocular Lens Proteins» von Borkman et al, Exp. Eye Res., 32, S. 747—754,1981; und «Fluorescence Lifetimes of Chromophores in Intact Human Lenses and Lens Proteins» von Borkman et al, Exp. Eye Res., 32, S. 313—322 und 314, 1980; und «The Destruction of Tryptophanyl Residues in Trypsin by 280 nm Radiation» by Volkert et al, Photochemistry and Photobiology, 17, S. 9-16,1973).

Tryptophan ist die am wenigsten in den menschlichen Proteinen verbreitete Aminosäure; es ist gleichzeitig auch die am stärksten durch UV im Bereich von 240 bis 310 nm zerstörbare Aminosäure und dient dann als Pfad für die Proteinschädigung in diesem Wellenlängenbereich. Tryptophan enthaltende Proteine können durch UV Bestrahlung desakti-viert werden entweder als Folge der Photolyse des Tryptophans oder als Folge der Photolyse anderer aromatischer Reste. Obwohl sich die vorliegende Erfindung mit der Erhaltung der Proteine allgemein befasst, wird in der Folge Tryptophan häufig beispielhaft verwendet.

In «klassischen» photochemischen Reaktionen veranlasst ein einzelnes Photon ein Molekül, sich chemisch zu verändern. Werden Moleküle ausreichend intensiver Strahlung ausgesetzt, so können dadurch andere, photochemische Reaktionswege eröffnet werden, wobei ein Molekül mehr als ein Photon absorbiert. In der Literatur der letzten 30 Jahre wurden zahlreiche Beispiele für chemische Veränderungen durch Aufnahme von mehr als einem Photon pro Molekül beschrieben.

Das bekannteste Beispiel ist die Photosynthese in grünen Pflanzen durch aufeinanderfolgende Absorption von «gelben» und «roten» Photonen. Ein anderes Beispiel sind die Moleküle mit metastabilen Tripletzuständen. Der Übergang in den langlebigen Tripletzustand erfolgt häufig als Folge der Absorption eines Photons durch das Molekül. Die Mole- • küle im Tripletzustand können ein weiteres Photon gleicher oder anderer Farbe absorbieren, wodurch ein chemischer Vorgang eingeleitet wird. Dieses Konzept bildet die Grundlage einer Monographie von V. S. Letokhov «Non-linear Laser Chemistry», Springer Verlag New York, 1983.

Derartige Phänomene wurden an Peptid-Molekülen untersucht, die aus einer Kette von Aminosäure-Molekülen einschliesslich Tryptophan, Alanin und Glyzin bestanden. (Vgl. «Multiple Photon Processes in Molecules Induced by Picosecond UV Laser Pulses», Antonov et al, S. 310—314; «Picosecond Phenomena I», Springer Verlag, New York, 1979). Nach dieser Untersuchung ist bei Bestrahlung eines Peptids mit Picosekunden-Impulsen die Wahrscheinlichkeit der Absorption eines oder mehrerer Photonen durch ein Molekül in angeregtem Zustand sehr viel grösser als bei Bestrahlung mit Nanosekunden-Impulsen.

Die Nukleinsäurebestandteile von DNA und RNA und intakte DNA und ihr Verhalten bei ultrakurzer, hochintensiver UV Bestrahlung war Gegenstand mehrerer Untersuchungen. Über diese Untersuchungen berichtet Stanley

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

670 764

L. Shapiro in «Ultrafast Techniques Applied to DNA Stu-dies», Biological Events Probed by Ultrafast Laser Spectro-scopy, herausgegeben von R. R. Alfano, S. 361 — 383, Académie Press, New York, 1982. Darin werden ultrakurze Lichtimpulse vorgeschlagen zur gezielten Veränderung oder auch zur völligen Zerstörung komplexer Moleküle. Weiterhin wurde die selektive, photochemische Reaktion in Nukleinsäuren und ihren Komponenten untersucht, wobei das Absorptionsband von DNA sehr breit ist, mit einer Absorptionsspitze bei 265 nm. (Vgl. «Selective Action on Nucleic Acids Components by Picosecond Light Pulses», Angelov et al, Applied Physics, 21, S. 391—395,1980). Wegen der nichtspezifischen Natur der Absorptionsspektren von DNA-und RNA-Strukturen und wegen deren Ähnlichkeit mit den Absorptionsspektren der Proteine war es bis zur vorliegenden Erfindung nicht möglich, DNA/RNA einer effizienten, selektiven Photolyse zu unterziehen, ohne die im gleichen Medium anwesenden Proteine photolytischer Reaktion zu unterwerfen.

Es ist bekannt, dass DNA und seine Komponenten beim Einwirken hochintensiver, ultrakurzer UV Laserstrahlung nacheinander zwei UV Quanten und damit eine Energiemenge absorbieren können, die die Ionisationsgrenze überschreitet. Als Folge davon entstehen einige Photoprodukte, die in ihrer Struktur von den bei kontinuierlicher (cw) UV Strahlung auftretenden abweichen. Es wurde weiterhin vorgeschlagen, dass bei Ultrakurz-UV-Bestrahlung im Pico-sekundenbereich die Effizienz des photochemischen Abbaus von DNA-Komponenten um den Faktor 10 grösser ist als bei Bestrahlung im Nanosekunden-Bereich, und weiterhin, dass die Zweistufen-Erregung der Moleküle durch Laserbestrahlung von zahlreichen Parametern der Laserstrahlen abhängt, wie den Wellenlängen der für die erste bzw. die zweite Stufe benutzten Strahlung sowie der zeitlichen Aufeinanderfolge der betreffenden Laserlicht-Impulse und von deren Intensität usw. Es wurde auch bereits beschrieben, dass durch die geeignete Auswahl dieser Parameter die Zweistufen photochemische Reaktion und Zerstörung für einen bestimmten Nukleinsäuretypus in ihrem Wirkungsgrad gesteigert werden kann. Danach können Viren durch UV Bestrahlung mit Intensitäten von 107 bis 109 W/cm2 durch Einzelstrangbruch in der DNA desaktiviert werden, während UV Bestrahlung mit niedrigeren Intensitäten zur Inaktivierung als Folge der Bildung von Pyrimidin-Dimeren des Cyclobutantyps führt. Vgl. «High-Power UV Ultrashort Laser Action on DNA and its Components» by Angelov et al, Picosecond Pheno-mena III, herausgegeben von Hochstrasser et al, S. 336 bis 339 Springer Verlag, New York, 1980.

Es wurde weiterhin beschrieben, dass Mehrstufen, durch eine Vielzahl von Photonen erzeugte Erregungen von Atomen und Molekülen eine Basis für nicht lineare Photochemie bilden. Vgl. Antonov et al, Picosecond Phenomena I, Springer Verlag, New York, 1979, und «Optical Detection of the Triplet State of Uracil», D.H. Williams et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, 36(b), S. 912-918,1969.

Weitere Ausführungen zur Quantenmechanik der Nukleinsäuren und der Proteine:

Die Wechselwirkung zwischen Licht einer konventionellen Strahlungsquelle und einem Beispiel von Molekülen lässt sich unter Berücksichtigung einiger einfacher, physikalischer Grundprinzipien leicht ableiten. Eine Quelle für monochromatisches Licht kann durch ihre Wellenlänge des ausgestrahlten Lichtes und ihre Intensität, ausgedrückt als Energie/Einheit der beleuchteten Fläche pro Zeiteinheit, beschrieben werden. In der Quantenmechanik wird die Lichtenergie nach der Planck sehen Gleichung E = Hv dargestellt, wobei

E die Energie eines Photons, h das Plancksche Wirkungsquantum und v die Frequenz des Lichtes ist. Die Lichtintensität kann dann als Photonen pro cm2 pro Sekunde oder Quanten, cm""2, s~' ausgedrückt werden. Die Konzentration der im Beispiel ausgewählten Moleküle im Zielgebiet der bestrahlten Probe kann in Mol/1 ausgedrückt werden (Molari-tät, M). Wenn das Licht die Probe durchstrahlt, wird es wenigstens teilweise von den Molekülen absorbiert. Die Absorption ist ein charakteristisches Datum für die betreffende Molekülart und variiert in ihrer Effizienz mit der Wellenlänge der Strahlung. Der Extinktionskoeffizient, e, ist ein Mass für die Absorption und hat die Dimension M " 'cm-1. Eine graphische Darstellung, in der der Extinktionskoeffizient gegen die Wellenlänge aufgetragen ist, stellt das Absorptionsspektrum der betreffenden Moleküle dar.

Quantenmechanisch ist die Absorption eines Photons durch ein Molekül von einem Übergang oder einem Wechsel im Quantenzustand des Moleküls begleitet. In einem typischen Fall kann angenommen werden, dass vor Einstrahlung des Lichtes sich alle Moleküle im Grundzustand befinden. Bei der Bestrahlung mit Licht gehen einige Moleküle vom Grundzustand in einen angeregten Zustand (höherer Energie) über. Ein Molekül kann nicht unbegrenzt in einem angeregten Zustand verbleiben und muss seine überschüssige Energie in irgendeiner Weise wieder abgeben. Das Schicksal eines einzelnen Moleküls ist nicht vorhersehbar; es kann nur in Form der quantenmechanischen Wahrscheinlichkeiten bzw. als Quantenausbeute (Q) ausgedrückt werden. Ein wichtiger Parameter eines jeden angeregten Zustandes ist dessen Lebensdauer (T), definiert als die mittlere Zeitdauer, in der ein ungestörtes Molekül in seinem angeregten Zustand verbleibt.

Die Anregung eines Moleküls mit Licht kann verschiedene Folgen haben. Das Molekül kann spontan in den Grundzustand zurückkehren, und zwar entweder direkt oder über einen Zwischenzustand. Es kann stattdessen ein weiteres Photon absorbieren und in einen noch höheren Energiezustand übergehen. Eine weitere Möglichkeit besteht im Ablauf einer photochemischen Reaktion, die zur Veränderung seiner chemischen Struktur führt. In vielen Fällen ist die eingetretene Veränderung permanent; das Molekül kann damit nicht mehr in seinen ursprünglichen Grundzustand zurückkehren. Wird eine solche Photolyse verwendet, um eine chemische Veränderung in einer DNA oder einem Protein hervorzurufen, dann kann damit deren biologische Funktionsfähigkeit verringert oder völlig zerstört werden. Absorptionskoeffizient, Lebensdauer des angeregten Zustandes und Quantenausbeute sind spezifische Molekülcharakteristika und wurden, wie oben beschrieben, für eine Zahl von Molekülen experimentell bestimmt. Aufgrund der charakteristischen Daten für ein Molekül und der Parameter der Strahlungsquelle kann der Ablauf der photochemisch bewirkten chemischen Reaktion berechnet werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft die Bestrahlung eines Mediums, das Nukleinsäuren, beispielsweise in Form von DNA Molekülen, und Proteine enthält. Die folgende Berechnung zeigt, dass bei Bestrahlung eines solchen Mediums mit einer konventionellen UV Lichtquelle, wie beispielsweise einer Entladungsröhre, sowohl die DNA als auch die Proteine zerstört werden, da in beiden Fällen die absorbierte UV Strahlung zur Photolyse führt. Die nachfolgenden Berechnungen gehen vom Lambert-Beerschen Absorptionsgesetz aus, das die Strahlungsumwandlungrate pro Molekül (r) als das Produkt aus Absorptionsquerschnitt und Lichtintensität bestimmt:

r = I x s

6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

670 764

wobei I die Lichtintensität, in Photonen cm-2 S-1, und s der Absorptionsquerschnitt, in cm2, ist. Der Absorptionsquerschnitt (s) ergibt sich aus dem Extinktionskoeffizienten nach s = 3,82 x IO-21 x e, wobei der Extinktionskoeffizient in der Einheit M-1cm-1 und s in cm2 ausgedrückt ist. Die Über-Alles Rate der photochemischen Reaktion pro Molekül, R, ist das Produkt aus Strahlungsumwandlungsrate und photochemischer Quantenausbeute:

R = I x s x Q

Wenn R bekannt ist, kann die Wahrscheinlichkeit (P), dass ein bestimmtes Molekül während eines bestimmten Zeitraumes von t Sekunden nicht reagiert, wie folgt berechnet werden:

p _ [Q-(R x t) 2.303

In dieser Berechnung wird die Abschwächung des Lichtstrahles beim Durchgang durch die Probe vernachlässigt. Diese Annäherung gilt, wenn die Probe in genügend dünner Schicht vorliegt oder der Extinktionskoeffizient genügend klein ist, so dass die Intensitätsabschwächung der Strahlung beim Durchgang durch die Probenschicht gering bleibt. Beispielsweise enthält Blutplasma eine Anzahl von verschiedenen Proteinmolekülen. Die meisten Aminosäuren, die die einzelnen Bausteine der Proteine darstellen, absorbieren keine nennenswerten Mengen an Strahlung im Nah- sowie im Mittel-UV Lichtbereich und werden durch UV Bestrahlung nicht beeinflusst. Wie oben dargelegt, bildet Tryptophan eine bemerkenswerte Aufnahme. Ein typisches Plasma-Pro-tein enthält nur wenige (0 bis 15) Tryptophanbausteine, aber schon eine kleine Anzahl reicht aus, um das Protein für photochemische Schädigung empfindlich zu machen. Vgl. «Atlas of Protein Sequence and Structure», Vol. 5, Ergänzung 3. M.O. Dayhoffed. (National Biochemical Research Foundation, Silver Spring, MD., 1976).

Wie oben beschrieben, wurden sowohl der Extinktionskoeffizient als auch die photochemische Quantenausbeute für Tryptophan bestimmt, wodurch es möglich ist, die Rate zu schätzen, mit der eine bestimmte Lichtquelle ein bestimmtes Protein zerstört. Vgl. «Handbook of Biochemistry and Molecular Biology», 3. Ausgabe. Band 2 (Chemical Rubber Co., Cleveland, 1976); G.R. Fleming et al, Chemistry, 75, S. 4652 (1978) und die darin angezogenen Literaturstellen; und Raymond F. Borkman, Photochemistry and Photobiology, 26, S. 163 (1977) supra.

Wird Blutplasma von einem Spender mit einer Virus-Infektion entnommen, so kann ein Kubikzentimeter Plasma bis zu einer Million Viren enthalten. Ein Virus besteht aus einer oder mehreren von einer Hülle umgebenen DNA (oder RNA) Molekülen. Die Hülle besteht in der Regel aus Proteinen oder einem Protein-Lipid-Komplex. Andere infektiöse Erreger, Viroide genannt, bestehen nur aus einem RNA Molekül. Die Viralhülle ist UV durchlässig, während die nu-kleotide Basis der DNA- oder RNA-Moleküle alle stark UV absorbierend sind. Eine ausreichend grosse Dosis UV Strahlung bewirkt die photochemische Schädigung in der viralen DNA und als deren Ergebnis einen irreversiblen Verlust der Infektiosität. Wie Wirkung der UV Bestrahlung bzw. die Desaktivierungsrate von Viren unter verschiedenen experimentellen Bedingungen ist Gegenstand zahlreicher Untersuchungen. Für eine definierte Strahlungsquelle gestatten diese Daten, die Quantenausbeute der viralen Desaktivierung zu bestimmen, und des weiteren einen Vergleich zwischen Schädigung von Viren und von Proteinen anzustellen. Vgl. Photochemistry and Photobiology, 26, S. 163 (1977) supra.

Tabelle I

Extinktionskoeffizienten und Absorptionsquerschnitt bei einer Wellenlänge von 266 nm.

Art e(M_1cm~') s(10l7cm2)

Tryptophan 4.000 1,5

Nukleinsäure (Durchschnitt) 10.000 3,8

Virales DNA Molekül 1 x 109 3,8 x 105

Plasma-Protein 40.000 15,0

Anmerkung: Die Zahlen in Tabelle I beziehen sich auf ein Protein mit 10 Tryptophan und auf eine virale DNA aus 50.000 Nuklein-säure-Basenpaaren. Der oben angeführte Extinktionskoeffizient ist ein Durchschnittswert der vier verschiedenen Basenpaare in der DNA, deren Absorptionsspektren sehr ähnlich sind. Einige Viren enthalten RNA statt DNA; die spektralen Eigenschaften der beiden Polymere sind sehr ähnlich. Tyrosin und Phenylalanin sind zwei weitere Aminosäuren, die eine bemerkenswerte UV Absorption aufweisen. Ihre Extinktionskoeffizienten bei 266 nm sind 700 bzw. 100. Konzentration der Viren in infizierten menschlichen Organismen ca. 106/ml

Konzentration der Proteine im menschlichen Plasma ca. 10_3M.

Strahlungsfluss (Produkt aus Strahlungsintensität und Bestrahlungszeit, Ixt) bei 254 nm,

erforderlich zur Reduzierung der Aktivität der

DNA um 90% ca. 1,3 x 1017 Photonen/cm2

Quantenausbeute für die virale

Zerstörung 2 x 10 6

Tabelle I zeigt die Quantenausbeute und die Querschnitte für ein Modellvirus und ein ein Tryptophan enthaltendes Modellprotein im nahen UV Bereich des Spektrums. Da die Standardmenge von 450 ml infizierten Blutes 4,5 x 108 Viren enthalten kann, sollte die virale Aktivität mindestens um einen Faktor 108 reduziert werden, um eine erfolgreiche Sterilisation zu erreichen. Mit anderen Worten: die Wahrscheinlichkeit, dass ein individueller Virus unreagiert verbleibt, soll geringer als 10 ~8 sein. Aus diesen Daten lässt sich errechnen, dass eine kontinuierliche Strahlungsquelle von 260 nm, die einen Strahlungsfluss von 2 x 1018 Photonen pro cm2 liefert, erforderlich ist, um die Bedingung zu erfüllen, unreagierte Viren mit grosser Wahrscheinlichkeit unter 10~8 zu halten. Eine solche Strahlung bedingt gleichzeitig die massive Zerstörung der ebenfalls vorhandenen Proteine (P = 10"11 für das Musterprotein aus Tabelle I). Hieraus ergibt sich, dass eine derartige Strahlungsbehandlung zur Sterilisation biologischer Flüssigkeiten vollkommen unbrauchbar ist.

Es soll angemerkt werden, dass das Lambert-Beer Gesetz nicht in allen Fällen eine exakte Beschreibung der Wahrscheinlichkeit des photochemischen Vorganges gibt, da dieses nur für relativ geringe Lichtintensitäten zutrifft. Moderne, gepulste Laser sind in der Lage, Pikosekunden (10-12 Sek.) Lichtpulse extrem hoher Intensität zu liefern. Ein einziger Laserpuls kann eine Energie von mehr als einem Gigawatt (109 Watt) liefern, während kontinuierliche Laser oder klassische UV Quellen, wie Entladungslampen, in einem Bereich zwischen 10 bis 1000 Watt arbeiten. Die Wirkung derartiger, intensiver Strahlungspulse auf gegenständliche Moleküle wird verständlich bei einem Vergleich der Figuren 1 und 2. Ist die Intensität der einfallenden Photonen vergleichsweise gering, so ist die Wahrscheinlichkeit, dass ein durch diese angeregtes Molekül in diesem Zustand ein weiteres Photon absorbiert, sehr gering. Wie in Fig. 1 dargestellt, besteht vielmehr eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass ein durch ein einziges Photon vom Grundzustand A in den angeregten Zustand B angehobenes Molekül spontan der Photolyse unterworfen wird bzw. in einen niedrigeren Energiezustand übergeht und/oder in den Grundzustand zurückkehrt.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

670 764

8

ohne ein weiteres Photon zu absorbieren. Auf der anderen Seite ist die Energie eines Pikosekunden-Impulses sehr hoch; in diesem Fall besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass während der Dauer des Anregungszustandes ein zweites Photon absorbiert wird und das Molekül so einen Energiezustand erreicht, der beim einfachen «Einphoton» Vorgang entsprechend Lambert-Beer nicht erzielbar ist.

In letzter Zeit sind auch Untersuchungen zur Desaktivierung unter Anwendung quantenmechanischer Prinzipien bekannt geworden. Vgl. A. Andreoni et al, «Two-Step Laser Photobiology: Application For Cancer Treatment», 13. Int. Quantum Electronics Conference, S. 142; A. Anders «Laser Fluorescence Spectroscopy of Biomolecules: Nucleic Acids», Optical Engineering, 22(5), S. 592—595 (1983). Bisher war es jedoch nicht möglich, die vorzugsweise Photolyse von DNA-und RNA-Nukleinsäuren in Gegenwart von Proteinen durchzuführen und damit eine effiziente Sterilisierung zu erzielen. Dieses Ziel wird nach der vorliegenden Erfindung in wirtschaftlicher und verlässlicher Weise erreicht. Die besondere Leistung der Erfindung und deren Vorteile ergeben sich besonders klar im Lichte der US Patentschriften 4 395 397,

3 837 373, 3 941 670, 3 817 703, 3 955 921,4 042 325 und

4 265 747; keine der genannten Patentschriften gibt eine Lehre für die selektive und wirksame Photolyse von Nukleinsäuren in biologischen Medien, ohne darin ebenfalls vorhandene Proteine oder anderes biologisches Material in unzulässiger oder störender Weise anzugreifen. In diesem Zusammenhang sei insbesondere auf US-PS 4 395 397 hingewiesen. Ziel der dort beschriebenen Erfindung ist es, unerwünschte Zellen, beispielsweise Krebszellen, in einer Suspension lebender Zellen abzutöten. Nach dem dort beschriebenen Verfahren werden zunächst die Krebszellen identifiziert und markiert mit Hilfe fluoreszierender Antikörper. Sodann werden die derart markierten Zellen einzeln nacheinander mittels Laserstrahlung abgetötet. Im Gegensatz dazu benötigt das Verfahren nach der Erfindung, wie in der weiteren Beschreibung verdeutlicht, zu seiner Durchführung weder eine Identifizierung noch eine Markierung der zu desakti-vierenden Nukleinsäuren bzw. zum Sterilisieren des diese enthaltenden Mediums. Vielmehr können nach dem Verfahren nach der Erfindung sterilisierte Produkte wie beispielsweise Blut hergestellt werden, ohne die darin vorhandenen, auf Nukleinsäuren basierenden Pathogene wie Krebszellen oder Viren zu kennen. Das erfindungsgemässe Verfahren bedarf keiner Markierung und keiner Auslösung durch das Signal eines fluoreszierenden Farbstoffes oder ein anderes Signal. Die nach der Erfindung behandelte biologische Lösung bleibt damit frei von allen chemischen oder sonstigen Zusätzen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, biologische Medien nach einem Verfahren zu behandeln, das es ermöglicht, Nukleinsäuren selektiv bzw. gegenüber in solchen Medien gleichzeitig vorhandenen Proteinen durch photolytische Reaktion abzuschwächen bzw. zu zerstören, sowie die Herstellung von Produkten nach dem Verfahren.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist in Patentanspruch 1 definiert und besondere Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen festgehalten.

Bei Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens wird die virale Aktivität wesentlich, beispielsweise mindestens um einen Faktor von 104, reduziert, während die Funktionsfähigkeit der Proteine höchstens um 40% reduziert wird.

Solche Ergebnisse konnten bis zur vorliegenden Erfindung nicht erzielt werden. Im Hinblick auf den beschriebenen Stand der Technik und auch grundsätzlich ist es überraschend und unerwartet, dass die Nukleinsäuren in ihrem angeregten Zustand eine wirksame Photolyse erfahren, während die gleichzeitig im gleichen Medium vorhandenen Proteine unter identischen Bedingungen im wesentlichen intakt bleiben.

Vorzugsweise ist das biologische Medium eine Lösung ausgewählt aus Blut, Blutbestandteilen bzw. aus solchen, die aus tierischen Zellen genetisch aufgebaute Proteine enthalten, sowie Impfstoffe, die virale DNA oder RNA in einer Proteinhülle enthalten. Alle genannten Medien haben ein gemeinsames Kennzeichen: sie enthalten Nukleinsäuren (beispielsweise in Form von DNA oder RNA) und Proteine.

Nach den verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung werden in einer Lösung, die Proteine, beispielsweise Tryptophan-haltige Eiweisskörper, und Nukleinsäuren enthält, die Nukleinsäuren selektiv photolysiert bzw. desakti-viert. Nach einer Ausführungsform wird die Lösung mit einem bzw. einer Folge von ersten Lichtpuls(en) einer ersten Wellenlänge bestrahlt, deren Intensität ausreicht, um einen Teil der Nukleinsäuren von ihrem Grundzustand in einen angeregten Zustand anzuheben; und weiterhin mit einem bzw. einer Folge von zweiten Lichtpuls(en), der bzw. die vorzugsweise von den Nukleinsäuren im angeregten Zustand absorbiert wird bzw. werden unter Überführung derselben in einen höheren Energiezustand, in welchem eine spontane Photolyse eintritt. Bei der Durchführung dieser Verfahrensformen werden die Intensitäten und die Wellenlängen für den ersten und zweiten Lichtpulse derart gewählt, dass eine möglichst geringe Photolyse der Aminosäuren der Proteine, so des Tryptophan, erfolgt. Dies kann beispielsweise mit ersten und zweiten Lichtpulsen bzw. Pulsfolgen erzielt werden, die praktisch von gleicher Wellenlänge und Intensität sind, oder mit Lichtpulsen praktisch gleicher Wellenlänge, jedoch verschiedener Flussdichte (Intensität), oder mit solchen, die sowohl unterschiedliche Wellenlängen als auch Flussdichten aufweisen. Die Lichtpulse können entweder wiederholt oder in Sequenzen appliziert werden, wie nachfolgend beschrieben.

Allgemein ausgedrückt, wird nach der Erfindung eine Folge von Lichtpulsen benutzt, die nach Fluss, Dauer, Sequenz, zeitlicher Aufeinanderfolge und Wellenlänge entsprechend ausgewählt sind, um das gewünschte Resultat der Strahleneinwirkung zu erzielen, nämlich in Gegenwart von Proteinen selektiv DNA/RNA photolytisch zur Reaktion zu bringen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist es, biologische Medien mittels Strahlungspulsen zu sterilisieren.

Gegenstand der Erfindung sind auch biologische Medien, die nach dem erfindungsgemässen Verfahren behandelt sind.

Fig. 1 stellt gewisse Energiezustände von DNA und Tryptophan sowie bestimmte photochemische Vorgänge als Ergebnis der Bestrahlung dieser Stoffe nach konventionellen Methoden dar, die überwiegend als «Ein-Photon» photochemische Prozesse ablaufen.

Fig. 2 gibt in ähnlicher Darstellung wie in Fig. 1 die sich zusätzlich abspielenden photochemischen Vorgänge an DNA und Tryptophan wieder, wie sie nach einer der erfindungsgemässen Ausführungsformen bei Bestrahlung mit zwei ultrakurzen Laserstrahlpulsen bzw. Pulsfolgen verschiedener Wellenlängen hervorgerufen werden.

Nach einer vorzugsweisen Ausgestaltungsform der vorliegenden Erfindung durchfliesst das biologische Medium in einer dünnen Schicht den Zielbereich der Laserstrahlung. Der Ausdruck «dünne Schicht» heisst, dass mindestens 10% der eingestrahlten Lichtenergie von der Schicht durchgelassen wird. Abhängig von der Art des Mediums entspricht dies Schichtdicken von 0,1 bis mehreren Millimetern; vorzugsweise werden Schichten von unter 0.5 mm, und beispielsweise von 0,2 mm Dicke verwendet.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9

670 764

Die Durchflussgeschwindigkeit der Flüssigkeit durch den Zielbereich hängt von der Grösse der vom auftreffenden Laserstrahl überdeckten Fläche sowie von Intensität und Wiederholungsrate der Pulse, wie nachfolgend beschrieben, ab.

Es kann beispielsweise angenommen werden, dass in der Regel die Durchflusszeit in Bezug auf jeden Millimeter Zielraumfläche etwa 5 ml/Sek. beträgt. Der Querschnitt eines verwendeten Quarzkanals kann entweder quadratisch oder rechteckig sein, wobei die Grösse der Oberfläche im Zielbereich der Weite des einfallenden Lichtstrahls entspricht oder etwas kleiner ist.

Das erfindungsgemäss verwendete pulsierende Licht stammt vorzugsweise von einem gepulsten Laser. Die Zeitfolge, in der Pulse erzeugt und ausgesendet werden, hängt vom Laser selbst ab und wird mit «Wiederholungsrate» oder «Wiederholungsfrequenz» bezeichnet. Bei der Behandlung biologischer Medien werden Lichtpulse vorzugsweise auf eine kleine Fläche gerichtet, die kreisförmig sein oder jede andere beliebige Form aufweisen kann und als «Zielbereich» bezeichnet wird. Dieser Bereich ist in der Regel zu klein, um die gesamte Probenmenge gleichzeitig dem Lichtstrahl auszusetzen. Um die vollständige Bestrahlung sicherzustellen, kann wahlweise entweder die Probe so lange den Durchflusszyklus durch den Zielbereich wiederholen, bis diese vollständig bestrahlt ist, oder es kann dafür gesorgt werden, dass der Strahl die Probenfläche rasterförmig überstreicht; oder aber die gesamte Probe kann in ausreichend kleine Mengen geteilt werden, die jeweils im Zielbereich untergebracht werden können.

Um im letzteren Fall sicherzustellen, dass alle Teilproben die volle Strahlendosis erhalten, ist es zweckmässig, den Bestrahlungszyklus mehrfach zu wiederholen.

Nach einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung kann Blutplasma oder Blutserum in Gegenwart unbeschädigter roter Blutzellen sterilisiert werden. Rote Blutzellen enthalten keine DNA und sind gegen Bestrahlung mit Wellenlängen und Lichtströmen nach dem erfindungsgemässen Verfahren relativ widerstandsfähig. Rote Blutzellen weisen jedoch eine optische Dichte auf, die ausreicht, um den grössten Teil der auf sie auftreffenden Strahlung zu absorbieren und hinter ihnen befindliche Teile des Mediums gegen die Strahlung abzuschirmen. Zur Behandlung von Gesamt-Blut wird daher vorgeschlagen, im Zielbereich einen oder mehrere dünne Durchflusskanäle anzuordnen, deren Durchmesser so gering bemessen wird, dass die roten Blutzellen im Gänsemarsch in der Mitte des Kanals durch den Zielbereich wandern. Das die roten Blutzellen umgebende Plasma wird aus entgegengesetzten bzw. einer Mehrzahl von Richtungen bestrahlt, um sicherzustellen, dass dieses die erwünschte Strahlungsmenge erhält.

Die Quantenausbeute des photochemischen Zwei-Photon-Verfahrens, wie es nach der vorliegenden Erfindung benutzt wird, hängt von der Intensität der einfallenden Lichtstrahlung ab. Für eine Laservorrichtung wird der Energiegehalt und die Zeitdauer der Pulse zunächst durch den Laserstrahl selbst bestimmt. Die Intensität im Zielbereich kann praktisch auf jeden beliebigen Wert gebracht werden, und zwar mit Hilfe einer Linsenvorrichtung, die den Querschnitt des Laserstrahls im Zielbereich bestimmt. Aus diesem Grund kann eine grosse Zahl verschiedener Laser im erfindungsgemässen Verfahren benutzt werden. Die Auswahl wird damit im wesentlichen von den Kosten, der Zuverlässigkeit und dem erwähnten Durchsatz bestimmt.

Gepulste Laser sind zur Zeit mit Pulswiederholungsraten zwischen 0,1 Hz (Pulse/s) bis 108 Hz lieferbar. Laser mit hoher Wiederholungsrate liefern in der Regel schwache Strahlungspulse. Dies erfordert in der Regel, den Strahl im Zielbereich auf eine sehr kleine Fläche zu fokussieren, um so die für das erfindungsgemässe Verfahren erforderliche Intensität zu erreichen. Laser mit sehr geringen Wiederholungsraten erzeugen typisch Strahlungspulse von enormer Energie, sind derzeit jedoch noch recht unzuverlässig. Zur Lieferung von sowohl hoher Spitzenleistung, wie sie für den erfindungsgemäss vorgeschlagenen «Zwei-Photon»-Prozess erforderlich ist, als auch hoher Leistung über der Zielbereichfläche, wie dies zum Erzielen eines ausreichenden Durchsatzes an bestrahltem Medium erforderlich ist, haben sich Laser als geeignet erwiesen, die eine Puls-Wiederholungsrate zwischen 10 und 1 000 000 Hz aufweisen, vorzugsweise zwischen 100 und 10 000 Hz, und die in der Lage sind, Strahlungspulse von einer Zeitdauer unter 2 x 10"8 s, vorzugsweise zwischen 1 x 10"10 und 1 x 10~12 s von extrem hoher Intensität zu liefern. Der Laser kann ein konventioneller, beispielsweise ein YAG-Laser mit zugeordneten optischen Komponenten sein, der so dimensioniert ist, dass er die entsprechende Wellenlänge, Intensität und Pulsfrequenz zu liefern in der Lage ist.

Gepulste Laser arbeiten in der Regel bei einer bestimmten, unveränderlichen Wellenlänge. Es sind eine Anzahl von Verfahren bekannt, um zusätzliche Wellenlängen vom ursprünglichen Strahlungspuls abzuleiten, beispielsweise durch Erzeugen von harmonischen Lichtschwingungen, mittels synchronem Farbstofflaserbetrieb bzw. optischer, parametrischer Oszillation. Bei Ausgestaltungsformen der vorhegenden Erfindung, bei denen Pulse verschiedener Wellenlängen angewendet werden, können diese aus einer einzigen Pulsquelle unter Verwendung eines der oben genannten, zum Stand der Technik zählenden, Verfahren erzeugt werden.

Während bei der weiteren Beschreibung verschiedener er-findungsgemässer Ausführungsformen im allgemeinen von Pulsdauer und Lichtstrom (Fluss) gesprochen wird, ist es für den Durchschnittsfachmann offen, diese Grössen in Bezug zu Intensität, Grösse des Zielbereichs, Durchsatzgeschwindigkeit und Auswahl einer geeigneten Laservorrichtung zu setzen.

Obgleich Blutserumproteine gegenüber nicht-linearer Desaktivierung empfindlich sind, ist es entsprechend der vorliegenden Erfindung möglich, diese Proteine praktisch unversehrt zu erhalten bei entsprechender Wahl der Wellenlängen und Intensitäten des ersten und zweiten Pulses, um so die Photolyse von Nukleinsäuren zu bevorzugen.

Beispielsweise kann nach dem erfindungsgemässen Verfahren erreicht werden, dass die Effizienz der Tryptophan-Photolyse nur etwa um einen Faktor von 3 ansteigt, während gleichzeitig jene der DNA/RNA Photolyse um einen Faktor von etwa 5000 gesteigert wird. Es soll betont werden, dass die Erhöhung des Effizienzunterschiedes der Photolyse von Nukleinsäuren und Proteinen, wie sie nach dem erfindungsgemässen Verfahren erzielt wird, für die Desaktivierung von Viruskörpern unter weitestgehendem Aufrechterhalten der Funktionalität von anwesenden Proteinen von grösster Bedeutung ist. Die Zahlenwerte «3» und «5000» sollen nur beispielhaften Charakter haben und werden nicht auf jeden Fall zutreffen.

Als Beispiel zur Beschreibung eines Verfahrens nach der Erfindung soll der in Fig. 2 dargestellte Zwei-Photon-Prozess dienen. Der erste Lichtpuls ist in seiner Intensität verhältnismässig niedrig gewählt, so dass nur ein Teil der Moleküle in den Zustand B angehoben wird, entsprechend dem Lambert-Beerschen Gesetz. Von diesen angeregten Molekülen erreichen beim Tryptophan ca. 13% und bei den Nukleinsäuren ca. 1% den Zustand C als Folge innermolekularer Eigenvorgänge. Ein zweiter Strahlungspuls von extrem hoher Intensität wird nun benutzt, um weitere Absorptionsvorgänge zu bewirken, nämlich das Erreichen von höheren Energiezuständen D, E und F, die in Demonstrationsversuchen nachgewiesen wurden und zur sehr hohen Wahrschein5

10

IS

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

670 764

10

lichkeit des Eintretens photochemischer Reaktionen führen. Vgl. D.H. William et al, supra, und D. V. Bent et al, Journal of the American Chemical Society, 97, S. 2612 (1975). Es ist von Bedeutung, dass der Grundzustand A im allgemeinen keine Photonen in effizienter Weise vom zweiten Puls absorbiert, weil kein passender Quantenzustand zur Verfügung steht. Die Folge dieses «Zwei-Puls»-Bestrahlungsverfahrens ist, dass praktisch jedes Molekül, das den Triplet-Zustand C erreicht, unter dem Einfluss des zweiten Lichtpulses gezwungen wird, photochemisch zu reagieren. Die Zahl der photochemischen Reaktionen hängt in diesem Fall von der Zahl der produzierten Triplets ab. Dies bedingt, dass die Ausbeute der Photolyse beim Tryptophan um den Faktor 3 erhöht wird, während gleichzeitig die Ausbeute der DNA Photolyse um den Faktor 5000 vergrössert ist. Diese Wirkung des «Zwei-Puls»-Verfahrens ist in Fig. 2 dargestellt. Nach diesem Beispiel kann die Voraussetzung für die Sterilisation (P geringer als 10~8) erreicht werden unter Verwendung eines Strahlungsflusses von nur 4,6 x 1014 Photonen pro cm2 bei 260 nm. Dies ergibt einen Wert von P für die Proteine von 0,99, gleichbedeutend damit, dass 99% der Proteinfunktionalität des behandelten Mediums erhalten bleibt.

In einer beispielhaften allgemeinen Ausführung beinhaltet die Erfindung ein Verfahren zum Behandeln einer Lösung von Proteinen und Nukleinsäuren wie DNA und RNA, zur selektiven Desaktivierung der Nukleinsäuren, das die folgenden Schritte enthält: (a) Bestrahlen der Lösung mit einem ersten Lichtpuls von einer ersten Wellenlänge und ausreichendem Lichtstrom, um einen Teil der Nukleinsäure-Moleküle aus dem Grundzustand in den angeregten Zustand anzuheben, der aber nicht ausreicht, um die Proteine zu desaktivieren; (b) Bestrahlen mit einem zweiten Lichtpuls, während sich die Nukleinsäure-Moleküle im angeregten Zustand befinden, wobei dieser zweite Lichtpuls vorzugsweise von Nukleinsäure-Molekülen im angeregten Zustand absorbiert wird, nicht aber in bemerkenswertem Ausmass von Proteinen in ihrem Grundzustand oder einem angeregten Zustand, wobei die von den Nukleinsäuren absorbierten zweiten Photonen diese in einen noch höheren Energiezustand anheben, der zur Photolyse derselben führt, während durch den Gesamtprozess nur eine minimnale Anzahl von Proteinmolekülen photolytisch zersetzt wird. Bedingungen für diese Ausführungsform sind: der angeregte Zustand der Nukleinsäure-Moleküle ist ein Singlet- oder Triplet-Zustand; der zweite Strahlungspuls wird während der Lebensdauer dieses angeregten Zustandes zugeführt; dies kann sichergestellt werden, wenn beispielsweise der zweite Strahlungspuls innerhalb einer Pikosekunde auf den ersten Strahlungspuls folgt; es können auch beide Pulse gleichzeitig erfolgen. Die Wellenlänge des ersten Pulses liegt zwischen 220 und 280 nm; die Zeitdauer eines jeden ersten Pulses ist geringer als 2 x 10~8 s, und Hegt vorzugsweise zwischen 1 x 10""12 und 9 x 10~10 s; der Strahlungsfluss des ersten Pulses beträgt weniger als 5 x 1014 Photonen pro cm2, und vorzugsweise zwischen 1 x 1013 und 5 x 1014. Der zweite Puls hat eine Wellenlänge von etwa 350 nm, vorzugsweise eine solche zwischen 350 und 410 nm oder zwischen 500 und 560 nm; seine Länge oder Zeitdauer beträgt weniger als 2 x 10""8 s, vorzugsweise zwischen 9 x 10-10 und 1 x 10~12 s; der Strahlungsfluss des zweiten Pulses beträgt 1 x IO15 bis 1 x 1018, und vorzugsweise 1 x 1017 Photonen/cm2.

Die genannten Lichtpulse sind gepulste Laserstrahlen; sie werden vorzugsweise von der Emission eines gepulsten Lasers abgeleitet; die zu bestrahlende Flüssigkeit wird der Strahlung im Zielbereich in einer sehr dünnen Schicht ausgesetzt, die eine Dicke von weniger als 0,5 mm, vorzugsweise von 0,2 mm aufweist; die Lösung fliesst durch den Zielbereich mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/s; die genannte Lösung ist beispielsweise Blut oder ein Blutbestandteil, der Plasma-Proteine enthält; sie kann weiterhin Blutzellen enthalten; die Bestrahlung erfolgt aus verschiedenen Richtungen, um sicherzustellen, dass auch bei Anwesenheit von Blutzellen das gesamte Plasma und Serum, das die Zellen umgibt, der Strahlung ausgesetzt wird.

Wie sich aus den vorstehenden Ausführungen ergibt, führt das erfindungsgemässe Verfahren zu einem völlig neuartigen Konzept für Sterilisationsverfahren. Danach werden Pulse intensiven Laserlichtes verwendet, um in Gegenwart von Proteinen, beispielsweise Tryptophan-haltiger Proteine, bevorzugt und gezielt eine Photolyse der DNA/RNA zu bewirken.

Nach einer Ausführungsform werden Aufeinanderfolgen von Strahlungspulsen bzw. Pulsreihen benutzt, deren Wellenlänge, Zeitdauer und Aufeinanderfolge bewirken, dass die Strahlung der zweiten Pulse oder der Pulsfolgen im wesentlichen oder überhaupt nur von den Molekülen absorbiert werden können, die bereits unter der Wirkung eines ersten Pulses bzw. einer ersten Pulsfolge in einen angeregten Zustand versetzt sind. Damit können die Zweitpulse von extrem hoher Intensität sein, ohne unerwünschte Reaktionen im biologischen Medium in wesentlichem oder nennenswertem Umfang hervorzurufen.

Der Erstpuls bzw. Pulsfolgen werden danach so gewählt, dass die Wellenlänge(n) zwischen 220 und 280 nm und der Strahlungsfluss im Zielbereich (Target) 5 x 1014 Photonen/ cm2 oder etwas weniger beträgt. Dieser erste Puls bzw. die Pulsfolge überführt DNA oder RNA aus dem Grundzustand in einen angeregten Zustand. Ein zweiter Puls höherer Intensität bzw. eine Folge solcher Pulse mit einer Wellenlänge von etwa 300 nm und einem Strahlungsfluss im Zielbereich zwischen 1 x 1015und 1 x 1018 Photonen/cm2 wird appliziert, während sich DNA- und RNA-Moleküle im angeregten Zustand befinden. Als Folge werden diese in einem nicht-linearen Vorgang in einen noch höheren Energiezustand überführt, worauf Photolyse und damit die Desaktivierung von DNA und/oder RNA eintritt.

In einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens werden zur Sterilisation die ersten und zweiten Lichtpulse bzw. Pulsfolgen gleichzeitig oder, beispielsweise, innerhalb der Triplet Lebensdauer (etwa 1 Mikrose-kunde) aufeinanderfolgend appliziert. Wie oben beschrieben, werden die ersten und zweiten Lichtpulse bzw. Pulsfolgen wieder so gewählt, dass die Aminosäuren der Proteine praktisch intakt bleiben, und nur ein minimaler Prozentsatz durch Photolyse zerstört wird, beispielsweise weniger als 1 %. Bei dieser Ausführungsform beträgt die Zeitdauer des ersten Pulses weniger als 2 x 10-8 s, vorzugsweise etwa 1 x 10~'° bis 1 x 10~12 s, bei einem Strahlungsfluss von 1 x IO14 bis 1 x 1016, und vorzugsweise von weniger als 5 x 1014 Photonen/cm2.

Ein niederiger Strahlungsfluss des ersten Pulses bedingt einen verringerten Angriff auf die Proteine; gleichzeitig bedingt dieser jedoch auch eine Reduktion der Anzahl der angeregten DNA oder RNA Moleküle. Der Strahlungsfluss des ersten Pulses bzw. der ersten Pulsfolge wird erfmdungs-gemäss vorzugsweise im Bereich von 1 x 10!3 und 5 x 1014 bzw. 1 x 1014und 5 x 1014 Photonen/cm2 gewählt. Der zweite Puls hat eine bevorzugte Wellenlänge von über 350 nm, und vorzugsweise eine solche im Bereich zwischen 350 und 410 bzw. 500 und 560 nm, während seine Zeitdauer bevorzugt weniger als 2 x 10~8 s beträgt und vorzugsweise im Bereich zwischen 1x10 und 1 x 10_ 12 s liegt. Zur Erhöhung der Wahrscheinlichkeit der Photolyse der sich im angeregten Zustand (Triplet) befindlichen DNA/RNA Moleküle hat jeder der zweiten Pulse bzw. Pulsfolgen eine höhere Intensität als der erste Puls, beispielsweise einen Strahlungsfluss von

5

10

15,

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

11

670 764

1 x IO13 bis 1 x IO18, vorzugsweise von etwa 1 x 1017 Photonen/cm2.

Zur Vereinfachung der Darstellung wurde vorstehend der angeregte (Zwischen-) Zustand als Triplet Zustand bezeichnet; ebenso können andere Anregungszustände, so beispielsweise der erste, angeregte Singlet Zustand als Zwischenzustand dienen. In anderen Ausführungsformen kann das Verfahren nach der Erfindung mit Strahlungspulsen bzw. Pulsfolgen gleicher Wellenlänge durchgeführt werden.

Entsprechend einer Ausführung wird das im Zielbereich in dünner Schicht angeordnete biologische Medium, beispielsweise eine Blutfraktion, zur Sterilisation wie beschrieben einer Folge erster Pulse ausgesetzt mit einer Wellenlänge im Bereich von 220 bis 280 nm, wobei jeder dieser «ersten» Laserpulse eine Zeitdauer von weniger als 2 x 10~8 s, und die Folge der «ersten» Laserpulse einen Strahlungsstrom von 1 x IO13 bis 1 x 1016 Photonen/cm2 im Zielbereich aufweist. Folgen «zweiter» Laserpulse höherer Intensität werden simultan oder sequentiell mit einer Zeitspanne von höchstens

1 Mikrosekunde, vorzugsweise einer Pikosekunde, nach dem Ende jedes ersten Pulses appliziert, wobei die Wellenlänge grösser/gleich 350 nm ist, und die Pulsdauer weniger als

2 x 10 - 8 s beträgt, und der Strahlungsfluss der Pulsfolge zwischen 1 x 1015 und 1 x 1018 Photonen/cm2 ist. Wie oben ausgeführt, beträgt die Wellenlänge der zweiten Pulse 350 bis 410 bzw. 500 bis 560 nm. Die Pulsfolgefrequenz der ersten Lichtpulse liegt im Bereich von 10 und 1 000 000 Pulsen/s. Werden Strahlungspulse der gleichen Wellenlänge benutzt, liegt diese bevorzugt im Bereich zwischen 180 bis 295 nm, vorteilhaft zwischen 220 und 290 nm, und vorzugsweise zwischen 220 und 280 nm. Die Zeitdauer eines jeden Pulses beträgt vorteilhaft wieder weniger als 1 x 10-5 s, vorzugsweise weniger als 1 x 10~8 s, und liegt bevorzugt im Bereich von

5 x 10~9 bis 1 x KT12 s bzw. von 1 x IO-10 bis 1 x 10~12 s. Wird eine Pulsdauer von 1 x 10~5 bis 1 x 10"""10 s benutzt, kann angenommen werden, dass der Triplet Zustand den Zwischenzustand darstellt, während für eine Pulsdauer von 1 x 10 "'° bis 1 x 10"14 s angenommen wird, dass dies für den Singlet Zustand der Fall ist.

Bei Verwendung von Pulsen gleicher Wellenlängen werden vorteilhaft die Bedingungen so gewählt, dass der Singlet Zustand als Zwischenzustand auftritt, d.h., die Dauer der Pulse wird im oben genannten Bereich ausgewählt. Werden Pulse gleicher Wellenlängen benutzt, so beträgt der Strahlungsfluss jeden Pulses im Zielgebiet mehr als 1 x 1015 Photonen/cm2, und liegt bevorzugt im Bereich von 1 x IO15 bis 1 x 1018; als besonders vorteilhafter Wert hat sich ein solcher von 1 x 1017 Photonen/cm2 erwiesen. Der Gesamtstrah-lungsfluss der Pulse ist vorzugsweise um eine Grössenord-nung grösser als der eines jeden einzelnen Pulses. Weiterhin hat es sich als vorteilhaft herausgestellt, 10 Wiederholungen eines jeden der Einzelpulse per Volumeneinheit des zu behandelnden Mediums anzuwenden.

Werden Pulse verschiedener Wellenlängen verwendet, so wird die Dauer des ersten Pulses vorzugsweise wie oben beschrieben gewählt. Die ersten Strahlungspulse haben vorteilhafterweise eine Wellenlänge von 180 bis 350 nm, und vorzugsweise eine solche von 220 bis 290 nm, wobei sich ein Bereich zwischen 220 und 280 nm als besonders günstig erwiesen hat. Die ersten Pulse haben vorteilhafterweise einen Strahlungsfluss von weniger als 1 x 1018 Photonen/cm2, wobei sich ein Wert von weniger als 5 x 1014, und insbesondere ein solcher von Ixl0l3bis5xl014 Photonen/cm2 als besonders zweckmässig ergeben hat.

Der gesamte Strahlungsfluss der Folge von ersten Pulsen liegt zwischen 1 x 1013 und 1 x 1018 Photonen/cm2, und vorteilhaft zwischen 1 x 1013 und 5 x 1016. Besonders ausgezeichnete Ergebnisse werden bei einem Strahlungsfluss von 1 x 1014bis5 x 1014 Photonen/cm2 erzielt.

Jeder der Strahlenpulse der zweiten Pulsfolge besitzt einen Fluss von über 1 x 1015, und zweckmässig zwischen 1 x 1015 und 1 x 1018, wobei besonders gute Resultate mit Werten von 1 x 1017 Photonen/cm2 erzielt wurden. Die Summe der Strahlungsflüsse dieser Pulsfolge liegt vorteilhaft aus den bereits erörterten Gründen etwa um eine Zehnerpotenz über jenem der einzelnen Lichtpulse. Die Wahl der Wellenlänge für den zweiten Puls hängt von der Zeitdauer ab, die für die ersten Pulse gewählt wird.

Wird für den ersten Puls eine Dauer gewählt, die, wie oben ausgeführt, den Triplet Übergang bevorzugt bewirkt (1 x IO-5 bis 1 x 10"10 s), so wird die Wellenlänge für die zweiten Pulse zweckmässig grösser als 300 nm, vorzugsweise im Bereich zwischen 300 und 700 nm, gewählt. Als besonders geeignet hat sich der Bereich von 300 bis 450 nm, und vorzugsweise jener von 350 bis 410 nm, erwiesen. Die Dauer eines jeden zweiten Pulses beträgt dann in der Regel weniger als 1 x 10~5, zweckmässig weniger als 1 x 10-6 s. Besonders zweckentsprechend hat sich eine Pulsdauer von weniger als 1 x 10-8, etwa im Bereich von 5 x 10-9 bis 1 x 10~12 s, und vorzugsweise von 1 x 10"10 bis 1 x 10"12 s erwiesen. Jeder dieser Zweitpulse wird vorzugsweise innerhalb von 1 x 10~6s nach dem Erstpuls bzw. gleichzeitig mit einem solchen appliziert.

Wird für den Erstpuls eine Dauer gewählt, die bevorzugt den Übergang in den Singlet Zustand bewirkt (1 x 10"10 bis 1 x 10~14 s), so beträgt die Wellenlänge der Zweitpulse vorzugsweise über 300 nm, und liegt vorzugsweise zwischen 300 und 700 nm und bevorzugt zwischen 500 und 560 nm. Besonders vorteilhafte Ergebnisse werden mit Wellenlängen zwischen 520 und 540 nm erzielt. Die Dauer jedes Zweitpulses beträgt vorzugsweise 1 x 10"10 bis 1 x 10"12 s, bzw. weniger als 3 x 10"11 bzw. 3 x 10"12 s, wobei sich der Bereich von 1 x 10~n bis 1 x 10"12 s als besonders günstig erwiesen hat. Jeder Zweitpuls folgt dem Erstpuls, beispielsweise, im Abstand von 3 x 10"12 s, vorteilhafterweise von 1 x 10~12 s, oder wird zugleich mit diesem appliziert.

Wie aus den oben stehenden Ausführungen ersichtlich, betrifft die vorliegende Erfindung im weitesten Sinne ein Verfahren zum Behandeln biologischer Medien vermittels gepulster Strahlung, die aufgrund der gewählten Wellenlän-ge(n) und Intensität(en) Pulse bevorzugt, die die Aktivität der im Medium vorhandenen Nukleinsäuren im Vergleich zur Funktionsfähigkeit der ebenfalls in diesem vorhandenen Proteine durch photolytische Reaktion verringert bzw. unter weitgehendem Aufrechterhalten der Proteinfunktionsfahig-keit praktisch völlig zerstört.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen mit abgeschwächten oder abgetöteten Viren, wie in Patentanspruch 31 definiert. Die Strahlungsbehandlung wird wieder mit Hilfe ultrakurzer Laserpulse verschiedener Wellenlänge und hoher Intensität durchgeführt, die die nicht-lineare Photolyse der Nuklein-säure-Komponenten bewirkt und gleichzeitig die Proteinhülle weitgehend unversehrt belässt.

Das Verfahren enthält vorzugsweise die folgenden Verfahrensschritte:

(a) Herstellen einer Lösung, die Viren mit einem Nu-kleinsäureanteil und einer tryptophanhaltigen Hülle enthält;

(b) Bestrahlen der genannten Lösung in Form einer im Strahlungszielbereich angeordneten dünnen Schicht mit einem bzw. einer Anzahl von Lichtpuls(en) einer ersten Wellenlänge im Bereich von 220 bis 280 nm und einer Pulsdauer von weniger als 2 x 10"8 s, sowie mit einem Gesamtstrahlungsstrom von 1 x 1013 bis 1 x 1016 Photonen/cm2; und

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

670 764

12

(c) Bestrahlen der Lösung im Zielbereich mit einem bzw. einer Anzahl von Lichtpuls(en) einer zweiten Wellenlänge im Bereich von etwa 350 nm, wobei jeder Zweitpuls eine Dauer von weniger als 2 x 10"18 s aufweist und der Strahlungsstrom jedes Zweitpulses wenigstens 1 x 1015 Photonen/cm2 beträgt, wobei der Zweitpuls innerhalb höchstens einer Mi-krosekunde auf den Erstpuls folgt, so dass der Nukleinsäure-anteil des Virus weitgehend desaktiviert bzw. praktisch vollkommen unschädlich gemacht wird, während die Veränderungen der Proteinhülle gering bleiben.

Vorzugsweise Bedingungen hierfür wie folgt: Der Ge-samtstromfluss der Strahlungspulse des ersten Wellenlängenbereiches liegt zwischen 1 x 1014und 5 x 1014 Photonen/ cm2J jeder der genannten Zweitpulse besitzt einen Strahlungsstrom zwischen 1 x 1017bis 1 x 1018 Photonen/cm2; jeder der ersten und zweiten Strahlungspulse besitzt eine Dauer von etwa zwischen 9 x IO-10 und 1 x 10"12 s. Die Zweitpulse liegen entweder im Wellenlängenbereich zwischen 360 und 410 oder zwischen 500 und 560 nm. Die genannten Erstpulse werden in einer Frequenz zwischen 10 und 1 000 000 Pulsen/Sekunde appliziert. Die Erst- und Zweitpulse werden kurz aufeinanderfolgend oder praktisch gleichzeitig appliziert. Die Dicke der dünnen Schichten im Zielbereich beträgt weniger als 0,5 mm und vorzugsweise 0,2 mm.

Die genannte Lösung fliesst durch jeden mm des Zielbereiches mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/s und die Lichtpulse sind Laserpulse.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zum Herstellen von tryptophanhaltigen Proteinpräparaten mit desaktivierter Nukleinsäure-Komponente wie in Patentanspruch 33 definiert. Zur Herstellung derartiger Proteine werden Säugetier-Zellkulturen verwendet. Dann werden die erzeugten Proteine in einem Auffangmedium (Erntemedium) freigesetzt und anschliessend die so in das Medium gelangten Nukleinsäure-Bestandteile durch erfindungsgemässe Strahlungseinwirkung weitgehend bzw. praktisch vollständig desaktiviert bzw. abgetötet.

Da Impfstoffe, die auf abgeschwächten bzw. abgetöteten Viren beruhen, eine bestimmte Maximalmenge ungeschädig-ter Viren enthalten dürfen, und da weiterhin für die Wirksamkeit solcher Impfstoffe eine vollkommen intakte Proteinhülle nicht erforderlich ist, kann davon ausgegangen werden, dass in diesem Anwendungsbereich eine Reduktion der viralen Aktivität von 104, vorzugsweise eine solche von 106, ausreicht, und die photolytische Reaktion der viralèn Proteinhülle bis zu etwa 20 bis 40% zulässig ist. Anders liegen die Verhältnisse bei Blut und dessen Fraktionen und bei Medien mit Säugetierzellkulturen oder vermittels solcher hergestellten Produkten. In solchen Fällen ist eine Reduzierung der viralen Aktivität von mindestens 106, vorzugsweise 108, erforderlich, wobei die Protein-Desaktivierung 20 bis 35% nicht überschreiten, vorzugsweise jedoch bei 2 bis 5% oder darunter liegen sollte.

In Fällen, wo Protein-Produkte für andere als pharmazeutische Anwendungen bestimmt sind, kann in der Regel eine geringere Ausbeute an unversehrten Proteinen in Kauf genommen werden, um andere Verfahrensparameter zu optimieren.

Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in den folgenden Beispielen dargestellt.

BEISPIEL 1

Dieses Beispiel betrifft die Anwendung des Verfahrens entsprechend der vorliegenden Erfindung für die Sterilisation eines menschliches Plasma enthaltenden biologischen Mediums. Die Proteinaktivität des Plasmas kann nach Standard-Methoden, wie beispielsweise dem «Partial Thrombo-

plastin Time» (PTT)-Verfahren bestimmt werden. Bei dem genannten Verfahren wird die Koagulationszeit als Mass benutzt: ein Anstieg von 2 Sekunden bedeutet eine 10%ige Abnahme der Aktivität der Plasma-Proteine. Für das vorliegende Beispiel wird das Plasma mit einem Säugetier-Virus, Si-mian Virus 40 (SV 40), infiziert, einem leicht zu bestimmenden Virus von etwa der gleichen Grösse wie der Hepatitis A Virus. Die Plasma-Probe fliesst durch eine Quarzküvette von 0,55 mm2 Querschnitt. Die Durchflussgeschwindigkeit wird mit Hilfe einer Pumpe auf 3 x 10~4 ml/s eingestellt, was einer Fliessgeschwindigkeit durch den Zielbereich von 1,2 x 10_1 cm/s entspricht. Ein Q-gesteuerter Nd:YAG Laser wird mit einer Wiederholungsrate von 20 Hz betrieben und erzeugt Strahlungspulse von 5 x 10~9 s Dauer. Mit Hilfe der harmonischen Frequenzvervielfachung werden aus dem ursprünglichen Strahlungspuls zwei Pulse hergeleitet, und zwar ein Erstpuls mit einer Wellenlänge von 266 nm und ein Zweitpuls mit einer Wellenlänge von 353 nm. Der Erstpuls von 266 nm wird so eingerichtet, dass er 2 x 10!1 Photonen enthält, während der Zweitpuls von 353 nm 1,2 x 1015 Photonen enthält.

Die Strahlungspulse werden mit Hilfe einer Optik auf einen quadratischen Zielbereich von 4 x 10~3 cm2 Fläche fo-kussiert. Dies bewirkt einen Strahlungsfluss von 5 x 1013 Photonen/cm2 bei 266 nm und 3 x 1017 Photonen/cm2 bei 353 nm. Die Pulse treffen im Zielbereich praktisch gleichzeitig ein. Unter diesen Bedingungen ist die Probenverweilzeit im Zielbereich pro mittlerem Volumen-Element etwa 0,5 Sek., was der Bestrahlung mit einer Puls-Wiederholungsrate von 10 entspricht. Der von der Pulsfolge bewirkte Fluss beträgt damit 1 x 1014 Photonen/cm2.

Anschliessend wurde die Probe auf ihre Virus- und Protein-Aktivität hin untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass die Virus-Aktivität, gemessen als Titer von SV 40, um einen Faktor von 106 verringert ist, während die Protein-Aktivität bei 90% ihres ursprünglichen Wertes verbleibt.

BEISPIEL 2

Dieses Beispiel betrifft das Verfahren nach der Erfindung in einer Variante, bei der mit Strahlungspulsen gleicher Wellenlänge gearbeitet wird, um ein menschliches Plasma enthaltendes biologisches Medium zu sterilisieren.

Für dieses Beispiel wurde das Plasma gezielt mit Bakteriophage T4 versetzt und dessen Titer bestimmt mittels Pla-que-Bildung auf einer E. Coli Gastkultur. Die Protein-Akti-vität wird nach der PTT Methode bestimmt, wie im Beispiel 1 beschrieben. Die zu behandelnde Plasma-Probe fliesst durch eine Quarzküvette von 2 x 0,05 cm Querschnitt. Der Laserstrahl tritt durch die 2 cm Frontseite ein und legt in dem in der Küvette befindlichen Medium einen optischen Weg von 0,05 cm zurück. Eine Pumpe hält die Durchflussgeschwindigkeit auf 1 ml/Sek., was einer Fliessgeschwindigkeit durch den Zielbereich von 10 cm/Sek. entspricht. Ein Exci-mer-Laser wird so betrieben, dass er Pulse einer Wellenlänge von 258 nm mit einer Wiederholungsrate von 200 Hz erzeugt. Jeder Puls hat eine Zeitdauer von 1 x 10-8 s und enthält 1 x 1017 Photonen. Die Pulse werden durch eine Zylinderlinse auf den Zielbereich der Küvette gerichtet. Bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/s braucht ein durchschnittliches Volumenelement des Mediums 0,05 s, um den Zielbereich zu durchfliessen und erhält somit 10 Laserpulse. Der von jedem Puls gelieferte Strahlungsfluss beträgt 1 x 1017 Photonen/cm2 und der Gesamtstrahlungsfluss pro Volumenelement damit 1 x 1018 Photonen/cm2.

Unter diesen Bedingungen wurde die Nukleinsäure-Akti-vität, wie anhand des T4 Titers festgestellt werden konnte, um einen Faktor von 106 reduziert, während die Protein-Aktivität 65% ihres ursprünglichen Wertes behielt.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

13

670764

BEISPIEL 3

Das Beispiel 2 wird wiederholt mit dem Unterschied,

dass der Excimer-Laser Pulse von 5 x 10 2 Sekunden und 5 x 1015 Photonen/Puls bei einer Wellenlänge von 258 nm und einer Wiederholungsrate von 200 Hz liefert. Die gleiche Probe von mit T4 infiziertem menschlichem Plasma (wie im Beispiel 2) fliesst durch eine Quarzküvette mit 0,5 x 0,05 cm Querschnitt; die Durchflussmenge liegt bei 0,5 ml/s, was einer Fliessgeschwindigkeit von 20 cm/s durch den Zielbereich entspricht. Die Laserpulse werden mit Hilfe einer Zylinderlinse auf einen Zielbereich der Küvette von 0,1 x 0,5 cm gerichtet. Bei einem Durchfluss von 0,5 ml/s beträgt die Verweilzeit im Zielbereich für die mittlere Volumeneinheit 5 x lü-3 s; diese erhält demnach nur einen einzigen Laserpuls. Der Strahlungsfluss im Zielbereich beträgt damit 1 x 10n Photonen/cm2.

Unter diesen Bedingungen wurde die Nukleinsäure-Akti-vität um den Faktor 106 reduziert, während die Protein-Aktivität mindestens 90% des ursprünglichen Wertes behielt.

BEISPIEL 4

Dieses Beispiel betrifft die Sterilisation der menschlichen Blutfraktion Faktor VIII. Die Aktivität des Faktors VIII kann nach bekannten kolorimetrischen Methoden genau bestimmt werden; Messvorrichtungen sind im Handel erhältlich.

Eine Probe des handelsüblichen, gefriergetrockneten Faktor VIII Präparats wird nach den Beipackzettel-Angaben aufbereitet und sodann gezielt mit Bakteriophage T7 infiziert und dessen Titer mittels Plaque-Bildung auf einer E. Coli Gastkultur bestimmt. Die rekonstituierte, infizierte Lösung durchfliesst eine Quarzküvette von 0,1 x 0,05 cm Querschnitt. Die Laserpulse treffen auf der 0,1 cm Frontseite der Küvette auf, so dass der optische Weg im Medium 0,05 cm beträgt. Eine Pumpe hält die Fliessgeschwindigkeit auf 2 x 10~3 ml/s. Ein Passiv-Phasengekoppelter Nd:YAG Laser wird mit einer Wiederholungsrate von 20 Hz betrieben und liefert Pulse von 20 x 10"12 s Dauer, wobei Strahlungspulse von 532 und 266 nm Wellenlänge mittels harmonischer Frequenzvervielfachung aus der Originalstrahlung abgeleitet werden. Die Pulse von 532 nm Wellenlänge werden so eingestellt, dass jeder 5 x 1015 Photonen enthält, während jeder 266 nm Puls 1 x 10" Photonen enthält. Mittels einer optischen Anordnung aus Spiegeln und Linsen wird bewirkt,

dass die 266 nm Pulse mit ihrem Spitzenwert im 1 x 10"12 s vor den Spitzenwerten der 532 nm Pulse im Zielbereich eintreffen, dessen Querschnitt eine Grösse von 5 x 10-3 cm2 aufweist. Ein mittleres Volumenelement des aus rekonstituiertem und mit T7 infiziertem Falctor VIII bestehenden Mediums wird von je 5 Pulsfolgen mit 266 bzw. 532 nm Wellenlänge getroffen. Der Strahlungsfluss jedes 266 nm Pulses beträgt 2 x 1013 Photonen/em2, und jedes 532 nm Pulses 1 x 1018 Photonen/cm2. Das mittlere Volumenelement erhält damit einen Gesamtfluss von 1 x 1014 Photonen/cm2 bei 266 nm und 5 x 101S Photonen/cm2 bei 532 nm Wellenlänge.

Die nachfolgende Analyse zeigt, dass die Nukleinsäure-Aktivität um einen Faktor von 106 reduziert wurde, während die Protein-Aktivität zu 98% erhalten bleibt.

BEISPIELE 5-11

Das Verfahren nach Beispiel 4 wird mit den gleichen Parametern (d.h., Fliessgeschwindigkeit des Mediums, Zielbereich, Querschnitt der Quarzküvette) wiederholt, wobei jedoch der Nd:YAG Laser benutzt wird, um Farbstofflaser zur Abgabe von Strahlungspulsen veränderbarer bzw. unterschiedlicher Wellenlänge anzuregen. Jedes Mal, wenn der Nd:YAG Laser feuert, werden zwei Farbstofflaserpulse von je 5 x 10""12 s Dauer gleichzeitig erzeugt. Die Ergebnisse entsprechender Versuchsreihen sind nachstehend tabellarisch zusammengestellt:

Beispiel Wellenl. d. Erstpulse Wellenl. d. Zweitpulse Nr. (Strahlenfluss = 2 x 1013 (Strahlenfluss = 2 x 1018

Photonen/cm2 pro Puls Photonen/cm2 pro Puls)

5

260

530

6

270

530

7

290

530

8

240

530

9

260

400

10

260

600

11

260

700

Beispiel Bruchteil d. ursprüngl. %-Satz d. ursprüngl.

Aktivität (Titer von T7) Protein-Aktivität (%)

5

X

io-7

98

6

1

X

io-6

98

7

1

X

io-1

98

8

1

X

io-3

99

9

1

X

KT5

98

10

1

X

io-4

98

11

1

X

IO""3

98

BEISPIEL 12

Dieses Beispiel betrifft ein Verfahren zum Behandeln von biologischen Medien, die menschliches Gesamtblut enthalten. Für die Untersuchung wird Blut gezielt mit Bakteriophagen T4 nach der PTT Methode infiziert und die Aktivität des Koagulations-Proteins (Gerinnungsfaktor) bestimmt. Die Sauerstoff-Affinität der Hämoglobin-Proteine wird nach Standard-Verfahren gemessen. Es wird eine Laservorachtung verwendet, die Pulse von 1 x 10"13 Sekunden Dauer liefert, wobei jeder Puls einen Strahlungsfluss von 5 x 1015 Photonen bei einer Wellenlänge von 260 nm aufweist. Die Puls-Wiederholungsrate beträgt 200 Hz. Das Probenmedium fliesst durch eine Quarzküvette mit einem Querschnitt von 0,5 x 0,5 cm in einer Menge von 0,5 ml/cm; das entspricht einer Fliessgeschwindigkeit durch den Strahlenzielbereich von 20 cm/Sekunde. Die Laserpulse werden mittels einer Zylinderlinse auf den Zielbereich von 0,1 x 0,5 cm gerichtet. Der Strahlungsfluss jeden Pulses im Zielbereich beträgt so 1 x 1017 Photonen/cm2. Laserpulse der genannten Zeitdauer und Intensität durchdringen («bleichen») rote Blutzellen. Das Ergebnis zeigt, dass die Nukleinsäure-Aklivität, bestimmt vom Titer von T4, um den Faktor 106 verringert ist, während 90% der ursprünglichen Aktivität des Gerinnungsfaktors erhalten blieben. Die Sauerstoff-Affinität der Hämo-globin-Proteine zeigt keine merkliche Veränderung.

5

io

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

S

1 Blatt Zeichnungen

Claims

670 764

2

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur mindestens teilweisen Desaktivierung der in einem biologischen Medium enthaltenen Nucleinsäu-ren, welches Medium daneben gleichzeitig ein oder mehrere Proteine enthält, dadurch gekennzeichnet, dass das biologische Medium Lichtpulsen ausgewählter Wellenlänge und Intensität ausgesetzt wird, deren Strahlung von den Nukleinsäuren sowohl im Grundzustand unter Uberführung in einen angeregten Zustand, als auch im angeregten Zustand unter Übertragung in einen noch höheren, eine photolytische Reaktion herrvorrufenden Energiezustand, absorbiert wird, wobei die Absorption der ausgewählten Strahlung durch die Proteine weder im Grundzustand noch im angeregten Zustand ausreicht, um eine photolytische Reaktion derselben herbeizuführen, die eine wesentliche Verringerung der Funktionsfähigkeit der Proteine zur Folge hat, so dass die Nu-cleinsäuren wesentlich stärker durch Photolyse zerstört werden als die Proteine.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das biologische Medium Blut, Blutbestandteile, aus Säugetierzellen genetisch aufgebaute proteinartige Produkte oder ein Impfstoff ist, der virale DNA und RNA mit deren Proteinhülle enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität der Nukleinsäuren durch die photolytische Reaktion mindestens um einen Faktor 104 reduziert und die Funktionsfähigkeit der Proteine höchstens um 40% herabgesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das biologische Medium ausgewählt ist aus Nukleinsäuren in Form von pathogenen DNA und RNA enthaltendem Blut, Blutplasma, Blutserum, Blutfaktor VIII und Blutfaktor XI, bzw. aus der Hilfe von Säugetierzellen genetisch hergestellten proteinartigen Produkten, die Nukleinsäuren in Form von Säugetier-DNA oder -RNA enthalten, und Impfstoffe, die Nukleinsäuren in Form viraler DNA und RNA in einer Proteinhülle enthalten, und dass die virale Aktivität der Nukleinsäuren mindestens um einen Faktor von 104, vorzugsweise von 106, reduziert wird und gleichzeitig die Funktionsfähigkeit der Proteine bzw. der Proteinhülle mindestens zu 60%, vorzugsweise mindestens zu 65%, erhalten bleibt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das biologische Medium Nukleinsäure und tryptophan-haltiges Protein in wässriger Lösung enthält und die virale Aktivität der Nukleinsäure in dieser Lösung wesentlich verringert wird, ohne dass die Proteinfunktionsfähigkeit wesentlich beeinträchtigt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das biologische Medium der Bestrahlung mit einer Vielzahl von Laserstrahlpulsen ausgewählter Wellenlänge und Intensität ausgesetzt wird, so dass die Nukleinsäuren wesentlich stärker durch Photolyse zerstört werden als die Proteine.
7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Laserstrahlpulse alle annähernd die gleiche Wellenlänge aufweisen.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass jeder der genannten Pulse eine Wellenlänge in einem Bereich von 220 bis 280 nm aufweist und eine Dauer von weniger als 1 x 10-5 s hat, wobei die Dauer vorzugsweise im Bereich von 5 x 10~9 bis 1 x 10"15 s liegt, und bevorzugt

1 x 10"12 s beträgt, und dass der Strahlungsfluss grösser als 1 x 1015 Photonen/cm2 ist, und vorzugsweise im Bereich zwischen 1 x IO15 bis 1 x 10'8 und bevorzugt zwischen 1 x 1017 und 1 x 1018 liegt.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das gepulste Licht aus Laserstrahlung unterschiedlicher Wellenlängen besteht.
10. Verfahren nach Anspruch 1 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Laserstrahlung erste Pulse bzw. Pulsfolgen einer ersten Wellenlänge aufweist mit einer Intensität, die ausreicht, um einen erheblichen Prozentsatz der im Medium vorhandenen Nukleinsäuren aus dem Grundzustand in einen höheren Energiezustand zu überführen, jedoch unzureichend, um bei den ebenfalls vorhandenen Proteinen zu einer photolytischen Reaktion zu führen.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Laserstrahlung zweite Pulse bzw. Pulsfolgen aufweist, die vorzugsweise von den im angeregten Zustand befindlichen Nukleinsäuren absorbiert werden, jedoch nicht oder nicht in beträchtlichem Ausmass von den Proteinen, und damit zur photolytischen Reaktion der Nukleinsäuren führen unter Minimierung einer Protein-Photo-lyse.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9, 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Laserstrahlung einen oder mehrere Erstpulse enthält, deren Wellenlänge und Intensität so gewählt werden, dass ihre Strahlung von den Nukleinsäuren im Grundzustand unter Überführung in einen angeregten Zustand absorbiert wird; sowie einen oder mehrere Zweitpulse einer Wellenlänge und Intensität, die so gewählt werden, dass die Strahlung von Nukleinsäuren im angeregten Zustand unter Überführung in einen noch höheren, eine photolytische Reaktion auslösenden Energiezustand, absorbiert wird, während die vorhandenen Proteine für ihre photolytische Reaktion in nennenswertem Umfang nicht ausreichend Strahlung absorbieren.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte angeregte Zustand der Nukleinsäuren ein Singlet oder Triplet Zustand ist, und dass die genannten zusätzlichen Zweitpulse bzw. Pulsfolgen während der Lebensdauer der Nukleinsäuren im angeregten Zustand appliziert werden.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten Erst- und Zweitpulse bzw. Pulsfolgen gleichzeitig appliziert werden.
15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass jeder der genannten Zweitpulse innerhalb einer Mi-krosekunde auf den Erstpuls folgt, und dass die Erst- und Zweitpulse entweder als Einzelpulse oder als eine Vielzahl von Pulsen abwechselnd appliziert werden.
16. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass jeder der genannten Erstpulse im Wellenlängenbereich von 180 bis 350 nm liegt, vorzugsweise im Bereich von 180 bis 295 nm, und eine Dauer von weniger als 1 x 10~5 s aufweist, vorzugsweise eine solche im Bereich von 1 x 10~5 bis 1 x 10"l4, und besonders vorteilhaft im Bereich von

1 x 10"10 bis 1 x 10"14 s; und dass deren Intensität weniger als 1 x 1018 Photonen/cm2 beträgt, und vorzugsweise in einem Bereich von 1 x IO13 bis 1 x 1014 liegt; und dass jeder Zweitpuls im Wellenlängenbereich zwischen 300 bis 700 nm liegt, vorzugsweise im Bereich von 300 bis 450 bzw. 500 bis 560 nm; und eine Dauer von weniger als 1 x 10~5 aufweist, vorzugsweise eine solche von 1 x 10~10 bis 1 x 10-12 s, und besonders vorteilhaft von 5 x 10~9 bis 1 x 10"12 s; und dass die Intensität grösser als 1 x 1015 Photonen/cm2 ist und vorzugsweise 1 x 1018 nicht übersteigt.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Zweitpuls innerhalb von 3 x 10~12 s auf den Erstpuls folgt.
18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Zweitpuls innerhalb von 1 x 10~6 s auf den Erstpuls folgt.
19. Verfahren nach Anspruch 1 zur Desaktivierung der in einer biologischen Flüssigkeit enthaltenem pathogenen DNA und RNA, welche Flüssigkeit gleichzeitig Proteine

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

670764

enthält, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte: (a) Bestrahlen der Flüssigkeit mit einem oder einer Folge von Erstpulsen einer Wellenlänge von 220 bis 280 nm, wobei jeder der Erstpulse eine Dauer von weniger als 2 x 10~8 s und vorzugsweise eine solche zwischen 9 x 10~9 und 1 x 10~'2 s aufweist und die Gesamtintensität des Pulses oder der Pulsfolge in diesem Wellenlängenbereich 1 x 1013 bis 1 x 1016 und vorzugsweise 1 x 1014 bis 5 x 1014 Photonen/ cm2 beträgt, und (b) Bestrahlen der Flüssigkeit mit einer oder einer Folge von Zweitpulsen einer Wellenlänge von 300 nm oder grösser, vorzugsweise von 350 bis 410 nm bzw. von 510 bis 560 nm und einer Zeitdauer von weniger als 1 x 10"8 s, vorzugsweise von 9 x 10"10 und 1 x 10-12 s und einer Intensität pro Puls von wenigstens 1 x 1015 und vorzugsweise von 1 x IO17 bis 1 x 1018 Photonen/cm2, wobei die Zeitpulse innerhalb einer Mikrosekunde jedem Erstpuls folgen, so dass die DNA und RNA enthaltenden Pathogene praktisch vollständig desaktiviert werden und die Funktionsfähigkeit von in der Flüssigkeit vorhandenen Proteinen im wesentlichen unverändert erhalten bleibt.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Erstpuls mit einer Folgefrequenz von 10 bis

1 000 000 Pulsen/s appliziert wird.
21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass Erst- und Zweitpulse praktisch gleichzeitig appliziert werden.
22. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass Erst- und Zweitpulse bzw. Pulsfolgen abwechselnd appliziert werden.
23. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit in einer Schicht, welche mindestens 10% der eingestrahlten Lichtenergie durchlässt, im Zielbereich der Bestrahlung angeordnet wird.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Dicke der Schicht weniger als 0,5 mm und vorzugsweise weniger als 0,2 mm beträgt.
25. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit den Zielbereich mit einer solchen Geschwindigkeit durchfliesst, dass jede Teilmenge derselben dem Gesamtstrahlungsstrom aus Erst- und Zweitpulsen bzw. der Folge solcher Pulse ausgesetzt wird.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit den Zielbereich mit einer Geschwindigkeit von 5 mm/s passiert.
27. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtpulse Laserstrahlpulse sind.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtpulse von einem einzigen Laser ausgesandt werden.
29. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit aus den folgenden biologischen Medien ausgewählt ist: Blut, Blutbestandteilen wie Blutplasma, Blutfaktoren oder Blutserum, genetisch aufgebauten proteinartigen Produkten einschliesslich solcher, die mittels Säugetierzellkulturen hergestellt sind, sowie Impfstoffe, die virale DNA oder RNA in einer Proteinhülle enthalten.
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten Pulse aus mehreren Richtungen auf die Flüssigkeit im Zielbereich einwirken.
31. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes mit abgeschwächten oder abgetöteten Viren, die eine weitgehend des-aktivierte Nucleinsäure-Komponente und eine weitgehend unversehrte tryptophanhaltige Proteinhülle aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte enthält:

(a) Herstellen einer Viren enthaltenden Lösung, deren Viren Nucleinsäuren in tryptophanhaltigen Proteinhüllen aufweisen.

(b) mindestens teilweise Desaktivierung der Nucleinsäu-re-Komponente unter gleichzeitiger Schonung der Proteinhülle nach dem Verfahren nach Anspruch 1.
32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte enthält:

(a) Herstellen einer Viren enthaltenden Lösung, deren Viren Nukleinsäuren in tryptophanhaltigen Hüllen aufweisen;

(b) Bestrahlen der Lösung in dünner Schicht im Zielbereich der Strahlung mit einem oder einer Folge von Erstpulsen einer Wellenlänge in einem ersten Wellenbereich zwischen 220 und 280 nm, einer Einzelpulsdauer von weniger als 2 x 10"8 s und einer Gesamtintensität des Pulses bzw. der Pulsfolge im ersten Wellenlängenbereich von 1 x 1013 bis

1 x 1016 Photonen/cm2; und

(c) Bestrahlen der genannten Schicht im Zielbereich mit einem oder einer Folge von Zweitpulsen höherer Intensität und einer Wellenlänge in einem zweiten Wellenlängenbereich von 350 nm oder mehr, einer Dauer von weniger als

2 x 10_s s und einer Gesamtintensität des Pulses bzw. der Pulsfolge im genannten zweiten Wellenlängenbereich von wenigstens 1 x 1015 Photonen/cm2, wobei jeder der Zweitpulse bzw. Pulsfolgen den Zielbereich in weniger als 1 Mikrosekunde nach dem Erstpuls bzw. der Erstpulsfolge erreicht, um so den Nukleinsäureanteil des genannten Virus zu desaktivieren, während die Proteinhülle in ihrer Funktionsfähigkeit weitgehend erhalten bleibt.
33. Verfahren zur Herstellung eines tryptophanhaltigen Protein-Präparates mit desaktivierter Nucleinsäure-Komponente, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte:

(a) Herstellen tryptophanhaltiger Proteine mittels Säugetierzellkulturen,

(b) Ernten der genannten Proteine durch Einbringen in ein geeignetes Medium,

(c) mindestens teilweise Desaktivierung der in das Medium gelangten Nucleinsäuren nach dem Verfahren nach Anspruch 1,
34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass der zur Desaktivierung der Nukleinsäuren dienende Verfahrensschritt darin besteht, dass das Medium mit einem Erstpuls bzw. einer Folge von Erstpulsen mit einer ersten Wellenlänge bestrahlt wird, dessen bzw. deren Intensität ausreicht, um einen Teil der Nukleinsäuren aus dem Grundzustand in einen angeregten Zustand anzuheben, die jedoch nicht ausreicht, um die Funktionsfähigkeit der anwesenden Proteine wesentlich einzuschränken.
35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium während des Anregungszustandes der Nukleinsäuren mit einem Zweitpuls bzw. einer Folge von Zweitpulsen bestrahlt wird, der bzw. die von den Nukleinsäuren im angeregten Zustand absorbiert wird bzw. werden, wobei diese in einen noch höheren, eine photolytische Reaktion auslösenden Energiezustand angehoben werden, während die Zweitpulsstrahlung von den Proteinen in keinem Energiezustand wesentlich absorbiert wird, so dass keine nennenswerten photolytischen Reaktionen der Proteine eintreten.
36. Ein biologisches Medium erhalten nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 35.