CH666189A5 - Procedimento per l'eliminazione totale o parziale di acido aspartico e acido glutammico da idrolisati proteici e miscele di aminoacidi. - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

Scopo primario dell'invenzione è quello di fornire un procedimento industriale facile e poco costoso per ottenere, da idro-lisati proteici o miscele di aminoacidi derivati da vari processi (idrolisi chimica e/o enzimatica; fermentazione, ecc.) prodotti per vari usi (farmaceutici — in modo particolare per nutrizione parenterale, orale ed enterale — veterinari, zootecnici ed industriali), totalmente esenti da acido aspartico e da acido glutammico, o con contenuto di questi due aminoacidi inferiore a quello presente nel prodotto iniziale e tale da soddisfare le esigenze a cui il prodotto può essere destinato.

L'esigenza di eliminare acido aspartico e acido glutammico dagli idrolisati proteici o da miscele di aminoacidi, o di ridurne il contenuto, è particolarmente sentita nel campo farmaceutico, soprattutto nel settore dell'alimentazione parenterale ed enterale dell'ammalato critico, del post-operato e in tutti quei casi in cui siano presenti stati catabolico o di denutrizione nei quali è necessario un apporto azotato con sostanze facilmente assimilabili.

Alcuni ricercatori attribuirono agli acidi aspartico e glutammico fenomeni di nausea e vomito che venivano notati in pazienti a cui erano stati somministrati idrolisati proteici per via endovenosa (Levey, S., Marroun, J.E. e Smyth, C.J., J. Lab. Clin. Med., 34, 1238-1249 (1949); Mayer-Gross, W., e Walker,-J.W., Biochem. J., 44, 92-97 (1949).

In studi più recenti si sono evidenziati danni cerebrali su neonati di alcune specie animali a seguito di somministrazione orale e parenterale di acido aspartico e di acido glutammico (J. W. OLney e O. L. Ho, Nature, 227 (1970) 609-611; J. W. Olney, J. Neurophatol. Exp. Neural., 30 (1971) 75-90; R.M. Bürde,

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B. Schainker e J. Kayes, Nature, 233, 58-60 (1971); L. D. Ste-gink, J. Tox. and Envir. Health, 2, 215 (1976); V. J. Perez e J. W. Olney,». J. Neurochem. 19, 1777 (1972).

Studi condotti da J. E. Fischer e collaboratori hanno anche evidenziato livelli plasmatici elevati di acido aspartico e acido glutammico in pazienti affetti da gravi alterazioni epatiche [Surgery, 80, 77-91 (1976); J.A.M.A. 242, 347-349 (1979)].

Un numero sempre maggiore di soluzioni di aminoacidi per uso parenterale commercializzate in Europa, Stati Uniti e Giappone tende ad allinearsi ai requisiti scientifici sopracitati, in modo particolare in patologie epatiche e in neonatologia. Per la preparazione di tali soluzioni vengono utilizzati i singoli aminoacidi, ottenuti con processi fermentativi, enzimatici, sintetici, ed estrattivi, opportunamente dosati.

È ovvio che formulando soluzioni per uso infusionale ottenute con aminoacidi cristallini si ha ampia possibilità di scelta sia del tipo di aminoacidi sia del loro rapporto molare.

Sempre più spesso si notano però formulazioni che solo in parte rispondono a requisiti scentifici, mentre per altra parte obbediscono a requisiti economici, dato il continuo aumento dei costi degli aminoacidi cristallini. Così si tende spesso a incrementare il contenuto di aminoacidi a basso costo, come glicina, e con alto contenuto percentuale di azoto, come glicina e alanina, in modo da far aumentare il contenuto di azoto globale somministrato con tale soluzione.

Partendo invece da proteine di origine, sia animale sia vegetale, il tipo e il rapporto molare dei singoli aminoacidi è predeterminato. Da tali proteine è possibile ottenere, con un procedimento di idrolisi chimica (brevetto italiano n. 904 830), una miscela di aminoacidi che dopo successive purificazioni (brevetto italiano n. 942 580) risulta di elevata purezza. Alla fine di tale processo si ottiene una miscela di aminoacidi che rispecchia la composizione della proteina di partenza, salvo le perdite dovute alle drastiche condizioni di reazione. Come è noto, per esempio, il triptofano è completamente distrutto in tale trattamento acido.

Nelle proteine di origine naturale, gli acidi aspartico e glutammico sono sempre presenti in diversa quantità. Nella tabella che segue si riportano le concentrazioni percentuali dei due aminoacidi, rispetto al contenuto totale di aminoacidi, ottenute per idrolisi chimica classica (cioè con HCl 6 N per 48 ore a riflusso) di alcune proteine di origine animale e vegetale, scelte solo a ulteriore scopo esemplificativo e non certamente limitativo.

TABELLA

Ca- Al- Farina Farina Torula seina bume di pesce di soja

Acido aspartico* 6,8 10,8 10,4 12,7 9,7 Acido glutammico* 22,4 14,9 15,6 21,4 17,4

* in percentuale rispetto al contenuto di aminoacidi.

Infatti, ulteriore scopo dell'invenzione è anche quello di ottenere, attraverso un procedimento economico semplice realizzabile industrialmente, un prodotto finale costituito da più miscele di L-aminoacidi nelle quali siano conservati il più possibile, ove desiderato, i rapporti tra i singoli aminoacidi presenti nel materiale proteico originale, a parte l'eliminazione completa o parziale di acido aspartico e glutammico. Tali miscele, eventualmente grazie a piccole aggiunte di altri aminoacidi (o di altre miscele di aminoacidi a partire da proteine differenti, ottenute nel modo succesivamente descritto (devono essere in gradi di soddisfare le esigenze alle quali possono essere destinate. In particolare, nel campo della nutrizione clinica, sia parenterale periferica sia centrale, orale e/o enterale, lo scopo dell'invenzione è di ottenete miscele di L-aminoacidi che mantengano un opportuno bilanciamento tra i vari aminoacidi essenziali e non essenziali.

In tal modo, poiché la quantità e la sequenza dei vari aminoacidi sono predeterminate dalle proteine di partenza, si ha la-possibilità di ottenere diverse formulazioni, terapeuticamente valide, con aminoacidi ad alto valore nutritivo, e nello stesso tempo a un costo inferiore a quello di miscele analoghe, preparate con aminoacidi singoli di origine cosiddetta «sintetica».

Un altro scopo dell'invenzione è quello di ottenere miscele di aminoacidi esenti da acido aspartico e da acido glutammico, o a livelli controllati di questi due aminoacidi, il cui contenuto di ammoniaca e di elettroliti sia consono ai requisiti richiesti dall'uso di queste miscele. Il problema è molto importante nel settore della nutrizione clinica, in particolare in alimentazione parenterale.

All'alto contenuto di ammoniaca presente negli idrolisati di proteine ottenuti sia per idrolisi acida che per idrolisi enzimatica [Ghadimi, H., Kumar, J. Biochem. Med. 5, 548 (1971)] è stata attribuita l'iperammonemia riscontrata in pazienti a cui questi prodotti venivano somministrati. -nDudrick, S.J., Mac-Fady, B.V., Van Buren, C.T., Ruberg, R.L., and Maynard, A.T., Ann. Surg. 176, 259 (1972); Ghadimi, H., Abali, F., Kumar, S. and Rathi, M., Pediatrics 48, 955 (1971); Johnson, J.D., Albutton, W.L., and Sunshine, P., J, Pediatr. 81, 151 (1972)].

Per abbassare il contenuto di ammoniaca degli idrolisati di proteine e renderli idonei all'uso in alimentazione parenterale, pur con gli effetti sopra riportati, si usa normalmente aggiungere a essi basi inorganiche forti (ad esempio NaOH, KOH) per cui, dopo evaporazione, si ha diminuita presenza di ioni ammonio nel prodotto. Come conseguenza di queste aggiunte, negli idrolisati di proteine, oltre a presenza ancora di ammoniaca, si ha elevato contenuto, particolarmente di sodio, che ne limita gli usi in alimentazione parenterale solo a quei pazienti in cui il fabbisogno di tale catione è aumentato [Shenkin, A. Wretlind, A., Wld Rew. Nutr. Diet., 28, 1 (1978); Total parenteral nutrition Edit. Josef E. Fischer pag. 31-32 (1976)].

In letteratura sono noti metodi di isolamento di acido aspartico e glutammico, e loro successiva separazione, da idrolizzati proteici, sia sfruttando precipitazioni frazionate, di valore oggi puramente storico, sia metodi cromatografici più recenti.

Per i primi metodi ci si può riferire a quanto descritto in «Chemistry of the Amino Acids», J.P. Greenstein e M. Winitz, voi. 3, J. Wiley and Sons, ed., 1961, pag. 1856-1865 e 1930-1940.

Come metodi cromatografici di valore attuale, ci si può riferire sia ai metodi di Cannan [J. biol. Chem. 152, 401 (1944)] che ha usato Amberlite IR 4 in batch e di Martin e coli. [Biochem. J. 42, 443 (1948)] che ha invece usato resine tipo IRA 400, lavorando su colonna sull'idrolizzato proteico, però in ambiente acido.

Separazioni in colonna degli aminoacidi sono state descritte sia in lavori scientifici [S.M. Partdrige e coll., Biochem. J., 44, 418 (1949); ibidem, 44, 513 (1949); ibidem, 44, 521 (1949)] usando resine a scambio cationico (Zeo-Karb 215) o anionico (Wofatit M, Amberlite IR 4, De Acidite B) che in brevetti (E.G. Donahue, assegnato a Hercules Powder Co., USP 2 937 199; A.A. Eisenbraun, assegnato a Ogilvie Fluor Mills Co., USP 3 045 026). In questi due ultimi casi sono state usate di nuovo resine a scambio cationico. Tutti questi lavori hanno però portato alla separazione di uno o più aminoacidi o di frazionamento in diversi gruppi, con rese di dubbio valore pratico, senza portare all'ottenimento di miscele di aminoacidi con lo

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scopo di usare tali miscele per materiale di partenza per ottenere formulazioni atte, per esempio, alla nutrizione clinica umana. Il procedimento oggetto di questa invenzione permette di separare totalmente acido aspartico e glutammico, quando voluto, o di pilotare la diminuzione dei due aminoacidi fino a raggiungere la percentuale desiderata con lo scopo di ottenere miscele di aminoacidi, chiamati intermedi, da cui per aggiunta di aminoacidi sintetici si possono ottenere miscele adatte alla nutrizione per uso umano, zootecnico, vario.

Il procedimento industriale qui descritto utilizza resine scambiataci di ioni (tipo Amberlite IRA 400, Relite, Dowex) con caratteristiche anioniche fortemente basiche, in forma OH", poste in contatto di scambio ionico con soluzioni acquose ammoniacali di idrolizzati proteici o miscele di aminoacidi di varia natura, contenenti acido aspartico e acido glutammico, provenienti per esempio da fermentazioni. Queste soluzioni di amminoacidi possono essere ottenute per idrolisi di proteine, di origine animale o vegetale, come ad esempio farina di soja, farina di sangue, farina di pesce, piume, gelatina, caseina, residuo proteico da estratto epatico, albumina, estratti d'organo, pelle bovina, torula, lana, micelio residuo di fermentazione, o prodotti, contenenti proteine, derivati da isolamento o arricchimento della parte proteica mediante trattamento di materiali di origine naturale sia animale sia vegetale; come esempi non limitativi si possono citare concentrati di proteine da glutine di granoturco, concentrati di proteine da siero di latte, ecc.

Dopo opportune lavorazioni, quali passaggio su colonne de resine a scambio cationico per eliminare sostanze estranee, e successiva aluizione, e/o passaggio su colonne di carbone in cui alcuni aminoacidi (per esempio aromatici) sono assorbiti fortemente, la soluzione ammoniacale, in cui sono solubilizzati gli aminoacidi di partenza, deve avere un pH non inferiore a 7, mentre nessun limite è posto per pH superiori a 7. Considerati i pK dell'acido aspartico (pKi = 2,09 - pKj = 3,86) e dell'acido glutammico (pKi = 2,19 - pK2 = 4,25), nelle condizioni operative sopra citate, i due aminoacidi presentano un equilibrio di ionizzazione tendente principalmente alla forma anionica, mentre gli altri aminoacidi possono avere equilibri di ionizzazione influenzati notevolmente dal pH della soluzione ammoniacale in cui si sono sciolti i materiali di partenza. Acido aspartico e acido glutammico sono assorbiti dalla resina insieme agli altri aminoacidi; si può successivamente eluire mediante soluzioni di ammoniaca, tamponi ammoniaca/cloruro di ammonio e ammoniaca/acetato di ammonio, sfruttando la competitività di affinità tra l'anione contenuto nella soluzione ammoniacale eluente e la resina, rispetto agli aminoacidi su di essa fissati. L'opportuna scelta di eluente è fatta per mantenere i volumi di eluizione in quantità industrialmente lavorabili.

Il pH della soluzione ammoniacale di cloruro d'ammonio o acetato d'ammonio non deve essere inferiore a 7, mentre nessun limite è posto per pH superiori. La concentrazione in ioni Cl" o CH3COO" può variare da valori molto bassi a valori alti. La quantità di ioni Cl" o CH3COO" influenza il volume di eluente necessario per il recupero degli aminoacidi e la concentrazione di acido aspartico e glutammico desiderata nella miscela finale.

Acido aspartico e acido glutammico, tra gli aminoacidi, presentano la maggiore affinità con la resina e sono quindi eluiti totalmente, o in parte, dalla resina con tempi di ritenzione diversi rispetto agli altri aminoacidi.

L'eluato ammoniacale viene privato dell'ammoniaca e di parte dell'acqua mediante evaporazione a pressione ridotta. Gli aminoacidi ottenuti, 0 in forma di sospensione al 50%, 0 in polvere se essiccati mediante l'uso di «spray-drier» o con altri sistemi, possono essere successivamente elaborati a seconda della destinazione a cui la miscela così ottenuta è destinata.

Un'importante caratteristica del procedimento oggetto di questa invenzione è il notevole recupero degli aminoacidi non acidi nell'eluato ammoniacale compreso tra 85 e 90% rispetto agli aminoacidi presenti nel materiale di partenza; questo rendimento, pur variando in funzione delle condizioni operative, rimane assai elevato. Questi recuperi si intendono per miscela di aminoacidi completamente esenti da acido aspartico e acido glutammico.

Qualora nelle miscele di aminoacidi sia desiderata o tollerata una presenza di acido aspartico e di acido glutammico marcatamente inferiore a quella del materiale di partenza, il rendimento del processo è superiore al 95%.

In tal caso può non essere necessaria l'eluizione con tampone ammoniaca-cloruro di ammonio od ammoniaca-acetato di ammonio, ma è sufficiente un carico appropriato di aminoacidi per cui acido aspartico e acido glutammico, per maggior affinità ionica con la resina nelle condizioni operative, spostano essi stessi quegli aminoacidi che sono più labilmente assorbiti dalla stessa.

Un ulteriore notevole vantaggio del processo riguardante la presente invenzione è dato dall'utilizzo di un ambiente ammoniacale diluito in tutte le fasi del processo stesso. Ciò comporta l'uso di impianti molto meno costosi e deperibili rispetto all'utilizzazione di ambienti acidi. In secondo luogo, l'ambiente basico per ammoniaca è notevolmente utile ad evitare formazioni di cariche batteriche che possono verificarsi invece in situazioni di pH moderatamente acido e che sono particolarmente dannose per prodotti usati in campo farmaceutico, veterinario , zootecnico e dietetico.

Infine, l'uso dell'ammoniaca per eluire gli aminoacidi dalla colonna di resine permette di ottenere, per successiva concentrazione sotto vuoto, una soluzione o una polvere direttamente utilizzabile nella preparazione di soluzioni per uso infusionale.

Un vantaggio assai positivo per il processo descritto nell'invenzione è il fattore costo. Infatti, con questo procedimento che è assai semplice dal punto di vista tecnologico, veloce, privo di manipolazioni, per cui può essere automatizzato completamente, si ottengono miscele di aminoacidi, che, senza alcuna aggiunta o con piccole aggiunte di aminoacidi sintetici per opportuni aggiustamenti di composizione, hanno un costo molto più basso rispetto alla stessa formulazione ricostruita con aminoacidi sintetici. Ciò comporta una notevole riduzione della spesa ospedaliera quando queste soluzioni di aminoacidi sono usate — come spesso accade — in terapia nutrizionale.

Gli esempi che seguono illustrano il procedimento secondo l'invenzione senza avere alcun carattere limitativo. I parametri operativi fondamentali seguiti negli esempi di realizzazione del procedimento sono riassunti qui di seguito e — salvo indicazioni contrarie — rimangono costanti negli esempi stessi.

È opportuno sottolineare che anche questi parametri non devono intendersi limitativi del procedimento rivendicativo.

COLONNA:

diametro interno = 10 cm altezza = 250 cm resina = 11 litri

Tipo = IRA 400 in forma OH".

SOLUZIONE DI ALIMENTAZIONE: miscela di aminoaci-ci sciolta in ammoniaca diluita, e portata a pH circa 10. I valori attuali della quantità totale di aminoacidi e della loro percentuale relativa sono riportati in ciascun esempio.

VELOCITÀ DI PERCOLAZIONE: la velocità di percolazione della soluzione di alimentazione è compresa tra 1 volume di soluzione/ora/volume di resina e 2 volumi di soluzione/ora/ volume di resina (pari alle rispettivamente 221/h) per la colonna descritta in precedenza. I valori reali sono forniti nell'esempio specifico.

SOLUZIONE ELUENTE: A) Tampone ammoniaca-cloruro di ammonio. La soluzione è preparata aggiungendo a 1001 di ammoniaca 3 N 1,4 1 di acido cloridrico concentrato. Il pH della soluzione è circa 11.

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B) Tampone ammoniaca-acetato di ammonio. La soluzione è preparata aggiungendo 100 1 di ammoniaca 3 N 0,850 1 di acido acetico glaciale; il pH risultante è circa 11,2.

C) Tampone ammoniaca-acetato di ammonio. La soluzione è preparata aggiungendo a 100 1 di ammoniaca 0,3 N 0,850 1 di acido acetico glaciale; il pH è circa 9,2.

Il tempo di alimentazione della soluzione inziale e di raccolta della soluzione eluita sono specificati nei singoli esempi.

In base al tempo di alimentazione e alla concentrazione di aminoacidi, si determina il carico dei medesimi sulla colonna e in particolare la quantità di acido aspartico e glutammico. I valori sono riportati nei singoli esempi.

Durante la fase di carico non si ha presenza di aminoacidi nella soluzione passata attraverso la colonna, salvo ove espressamente detto. Costantemente, negli esempi sotto descritti, l'eluato ammoniacale è concentrato a pressione ridotta e ha fornito un prodotto esente da pirogeni e da sostanze istaminosi-mili. Nello stesso tempo il contenuto di ammoniaca nella miscela risulta essere inferiore a 0,02 g per 100 g di aminoacidi allo stato secco e si ha assenza di cationi di basi forti nelle formulazioni prive di acido aspartico e acido glutammico. Nelle formulazioni con parziale presenza di acido aspartico e glutammico il contenuto di cationi è idoneo al loro uso in nutrizione parenterale (vedere esempi 12, 13, 14) e assai inferiore a quello di formulazioni attualmente usate in terapia, derivate da idrolizzati proteici.

Esempio 1

La soluzione di alimentazione ha la composizione riportata nella tabella seguente.

TABELLA 1 (es. 1)

g AA/1 di soluzione ammoniacale

% dei singoli AA in 100 g di miscela

Acido aspartico g

2,71

7,08

Treonina g

1,64

4,28

Serina g

2,11

5,51

Acido glutammico g

9,81

25,63

Prolina g

5,33

13,92

Glicina g

1,05

2,74

Alanina g

1,70

4,44

Valina g

2,77

7,24

Metionina g

1,02

2,66

Isoleucina g

1,79

4,59

Leucina g

3,95

10,32

Tirosina g

—

—

Fenilalanina g

—

—

Lisina g

3,54

9,25

Istidina g

0,86

2,26

Arginina

G

—

Totale aminoacidi g

38,28.

La velocità di percolazione è (nel caso specifico, senza tuttavia alcun carattere limitante) di 11 1/h, corrispondente a un volume di soluzione/ora/volume di resina. Dopo 140 minuti di alimentazione non si nota, se non in quantità irrilevante, la presenza di aminoacidi nella soluzione ammoniacale percolata attraverso la colonna di resina. Nei successivi 60 minuti di alimentazione con la soluzione ammoniacale contenente aminoacidi nelle concentrazione sopra riportate, si ottengono g 420 di aminoacidi nella soluzione all'uscita della colonna di resina. In questa frazione il contenuto di acido aspartico è pressoché nullo, mentre l'acido glutammico è presente nella proporzione di 0,085 g/1 di soluzione passata attraverso la resina, corrispondente a 0,935 g totali su 420 g di aminoacidi eluiti in 60 minuti. La percentuale di acido glutammico è dello 0,22% rispetto alla miscela di aminoacidi. In ulteriori 160 minuti di alimentazione con soluzione ammoniacale contenente aminoacidi nella proporzione riportata sopra, nella soluzione percolata attraver-5 so le resina si hanno g 52,31 di acido aspartico e g 99,25 di acido glutammico su 984 g di miscela totale di aminoacidi, corrispondenti a g. 1,78 di acido aspartico/1 e g 3,38 di acido glutammico/1 di soluzione passata attraverso la resina.

In questa frazione (da 160 minuti) i contenuti percentuali di io acido aspartico e di acido glutammico sono rispettivamente 5,32% e 10,09%.

In conclusione, nelle due frazioni per un totale di 220 minuti di percolazione sono contenuti globalmente 52,31 g di acido aspartico e 100,18 g di acido glutammico in 1404 g di miscela di i5 aminoacidi, corrispondenti al 3,73% di acido aspartico (in lt)0 g di aminoacidi) e al 7,14% di acido glutammico (in 100 g di aminoacidi).

Si ha quindi un assorbimento di notevole quantità di questi due aminoacidi acidi nella sopraddetta resina.

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Esempio 2

La soluzione di alimentazione è costituita da una miscela di aminoacidi con le caratteristiche riportate in tabella 2. Concentrazione e quantità relativa degli aminoacidi rimangono costanti 25 negli esempi 3-6.

TABELLA 2

30

g AA/1 di soluzione ammoniacale

% dei singoli AA in 100 g di miscela

40

45

Acido aspartico g

2,65

7,07

Treonina g

1,50

4,00

Serina g

2,03

5,42

Acido glutammico g

9,49

25,33

Prolina g

5,57

14,87

Glicina g

0,86

2,30

Alanina g

1,58

4,22

Valina g

2,78

7,42

Metionina g

0,93

2,48

Isoleucina g

1,76

4,70

Leucina g

3,94

10,52

Tirosina g

—

—

Fenilalanina g

—

—

Lisina g

3,61

9,63

Istidina g

0,77

2,05

Arginina g

—

Totale aminoacidi g 37,47

so VELOCITA DI PERCOLAZIONE

TEMPO DI ALIMENTAZIONE QUANTITÀ DI AMINOACIDI ss CARICATA SULLA COLONNA ACIDO ASPARTICO CARICATO ACIDO GLUTAMMICO CARICATO SOLUZIONE ELUENTE TEMPO DI ELUIZIONE 60 VOLUME RACCOLTO

1 volume di soluzione/ora/volume di resina 120 minuti

824,3 g 58,3 g 208,8 g Tampone A) 240 minuti 44 litri.

Nella tabella 3 si evidenziano recuperi e bilanci rispetto agli aminoacidi caricati in colonna.

Il recupero degli aminoacidi dopo eluizione è di g 472,1 su 557,3 g (che rappresenta il recupero teorico se si sottraggono le quantità di acido aspartico e di acido glutammico dalla quantità di aminoacidi caricati in colonna), corrispondente all'84,7%

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del teorico. Il contenuto di cloro nella miscela finale, esente da acidi aspartico e glutammico, è dello 0,7%.

TABELLA 3 (es. 2)

AA cari

AA

% di

% dei singoli

cati in recupe recu

AA in 100 g

colonna rati pero di miscela

g g

Acido

aspartico

58,3

0

0

/

Treonina

33,0

31,1

94,2

6,6

Serina

44,7

39,1

87,5

8,3

Acido

glutammico

208,8

0

0

/

Prolina

122,5

109,9

89,7

23,3

Glicina

18,9

17,8

94,2

3,8

Alanina

34,8

33,8

97,1

7,1

Valina

61,2

53,4

87,3

11,3

Metionina

20,5

8,7

42,4

1,8

Isoleucina

38,7

27,7

71,6

5,8

Leucina

86,7

60,2

69,4

12,7

Tirosina

/

/

Fenilalanina

/

/

Lisina

79,4

80,0

100,8

17,0

Istidina

16,9

10,4

61,5

2,2

Arginina

/

/

Totale

824,4

472,1

Esempio 3

Soluzione di alimentazione, flusso della medesima, tempi di carico, tampone usato (tipo A) sono identici a quelli dell'esempio 2.

TEMPO DI ELUIZIONE = 300 minuti VOLUME RACCOLTO = 55 litri

Nella tabella 4 si riportano recuperi e bilanci rispetto agli aminoacidi caricati in colonna.

I dati riportati in tabella 4 evidenziano un recupero di tutti gli aminoacidi superiore al 93%, tranne la metionina, di cui si ha un recupero dell'84,4%.

La quantità di acido aspartico, in composizione centesimale, è circa '/^ di quella presente nella miscela iniziale, mentre l'acido glutammico è circa V4 di quello presente inizialmente. Il contenuto di cloro nella miscela è del 2,6%, rispetto agli aminoacidi presenti.

TABELLA 4 /es. 3)

AA cari

AA

% di

% dei singoli

cati in recupe recu

AA in 100 g

colonna g rati g

pero di miscela

Acido

aspartico

58,3

7,7

13,2

1,3

Treonina

33,0

33,9

102,7

5,7

Serina

44,7

46,0

102,9

7,7

Acido

glutammico

208,8

44,8

21,5

7,5

Prolina

122,5

114,7

93,6

19,3

Glicina

18,9

19,4

102,6

3,3

TABELLA 4 (continuazione)

AA cari

AA

% di

% dei singoli

cati in recu recu

AA in 100 g

colonna g perati g pero di miscela

Alanina

34,8

35,4

101,7

6,0

Valina

61,2

61,2

100,0

10,3

Metionina

20,5

17,3

84,4

2,9

Isoleucina

38,7

36,1

93,3

6,1

Leucina

86,7

81,0

93,4

13,6

Tirosina

/

Fenilalanina

/

Lisina

79,4

80,6

101,5

13,6

Istidina

16,9

16,1

95,3

2,7

Arginina

/

Totale

824,4

594,2

Esempio 4

VELOCITÀ DI PERCOLAZIONE = 1,74 volumi soluzione/ora/volume di resina

TEMPO DI ALIMENTAZIONE = 120 minuti QUANTITÀ DI AMINOACIDI CARICATI SULLA COLONNA = 876,8 g ACIDO ASPARTICO CARICATO = 62 g ACIDO GLUTAMMICO CARICATO = 222,1 g TEMPO DI ELUIZIONE = 140 minuti

VOLUME RACCOLTO = circa 44,6 litri

SOLUZIONE ELUENTE = tampone A.

Nella tabella 5 si evidenziano recuperi e bilanci rispetto agli aminoacidi caricati in colonna.

Il recupero degli aminoacidi dopo eluizione è di g 511,6 su g 592,7 (che rappresenta il recupero teorico sottraendo acido aspartico e acido glutammico dalla quantità di aminoacidi caricati in colonna), corrispondente all'86,3% del teorico. Il contenuto di cloro nella miscela finale, esente da acido aspartico e acido glutammico, è dell' 1,4% sugli aminoacidi.

TABELLA 5 (es.4)

AA cari- AA % di % dei singoli cati in reçu- reçu- AA in 100 g colonna g perati g pero di miscela

Acido

aspartico

62,0

0

0

/

Treonina

35,1

33,1

94,3

6,5

Serina

47,6

43,5

91,4

8,5

Acido

glutammico

222,1

0

0

/

Prolina

130,5

112,4

86,1

22,0

Glicina

20,2

19,8

98,0

3,9

Alanina

37,1

35,7

96,2

7,0

Valina

65,0

56,0

86,2

10,9

Metionina

21,7

12,3

56,7

2,4

Isoleucina

41,1

32,4

78,8

6,3

Leucina

92,1

69,9

75,9

13,7

Tirosina

/

Fenilalanina

/

Lisina

84,4

85,0

100,8

16,6

Istidina

17,9

11,5

64,4

2,2

Arginina

Totale

876,8

511,6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

666 189

8

Esempio 5

Si procede come nell'esempio 4, con l'unica variazione della durata del tempo di eluizione (180 minuti) e di conseguenza del volume raccolto (57,5 litri). Nella tabella 6 sono riassunti recuperi e bilanci rispetto agli aminoacidi caricati in colonna.

I dati riportati in tabella 6 evidenziano recuperi di tutti gli aminoacidi superiori al 90%, tranne per metionina e istidina che hanno un recupero superiore all'80%. La quantità di acido aspartico, in composizione centesimale, è circa '/6 di quella presente inizialmente. Questi risultati sono in accordo con quelli riportati nell'esempio 3, che utilizzava flussi di alimentazione inferiori. II contenuto di cloro nella miscela finale è del 3,1%.

TABELLA 6 (es. 5)

AA cari- AA % di % dei singoli cati in recupe- reçu- AA in 100 g colonna g rati g pero di miscela

Acido

aspartico

62,0

6,7

10,8

1,1

Treonina

35,1

35,6

101,4

5,7

Serina

47,6

48,8

102,5

7,9

Acido

glutammico

222,1

42,5

19,1

6,8

Prolina

130,5

124,6

95,5

20,1

Glicima

20,2

20,8

103,0

3,4

Alanina

37,1

37,45

100,9

6,0

Valina

65,0

64,8

99,7

10,4

Metionina

21,7

17,45

80,4

2,8

Isoleucina

41,1

37,7

91,7

6,1

Leucina

92,2

83,0

90,0

13,4

Tirosina

/

/

Fenilalanina

/

/

Lisina

84,4

86,0

101,9

13,9

Istidina

17,9

15,2

84,9

2,4

Arginina

/

/

Totale

876,8

620,6

Esempio 6

Si opera come negli esempi 4 e 5 per condizioni di colonna, carico di aminoacidi, flussi di alimentazione, tipo di soluzione utilizzata nell'eluizione. La durara della fase di eluizione è di 150 minuti, corrispondenti a un passaggio di circa 48 1 di soluzione ammoniacale di cloruro ammonico. Nella tabella 7 si evidenziano recuperi e bilanci rispetto agli aminoacidi caricati in colonna.

Il contenuto di cloro nella miscela finale è dell'I,8%.

Gli esempi 4-5-6 evidenziano come sia possibile ottenere miscele di aminoacidi a contenuto variabile di acido aspartico e di acido glutammico variando in maniera opportuna la durata del tempo di eluizione.

TABELLA 7 (es. 6)

AA cari- AA % di % dei singoli cati in recupe- reçu- AA in 100 g colonna g rati g pero di miscela

Acido

aspartico

62,0

0,20

0,3

0,04

Treonina

35,1

33,4

95,2

6,3

Serina

47,6

44,6

93,9

8,4

Acido

glutammico

222,1

4,1

1,8

0,8

TABELLA 7 (continuazione)

AA cari

AA

% di

% dei singoli

cati in recu recu

AA in 100 g

colonna g perati g pero di miscela

Prolina

130,5

118,9

91,2

22,4

Glicina

20,2

20,4

101,1

3,8

Alanina

37,1

37,3

100,6

7,0

Valina

65,0

61,2

94,2

11,5

Metionina

21,7

12,4

57,20

2,3

Isoleucina

41,1

32,1

78,1

6,0

Leucina

92,2

69,6

75,5

13,1

Tirosina

/

Fenilalanina

/

Lisina

84,4

85,0

100,8

16,0

Istidina

17,9

11,5

64,4

2,2

Arginina

/

Totale

876,8

530,7

Esempio 7

Si procede come nell'esempio 5, con l'unica variazione di usare tampone B (ammoniaca - acetato d'ammonio) rispetto al tampone A.

La quantità di aminoacidi caricati sulla colonna è di g 886,5 e i contenuti di acido aspartico e di acido glutammico rispettivamente di g 61,7 e g 221,4.

I dati di concentrazione e composizione centesimali della soluzione di alimentazione nella fase di carico non variano in maniera sostanziale rispetto a quelli riportati per gli esempi precedenti, come pure non varia il pH.

Nella tabella 8 si riportano recuperi e bilanci rispetto agli aminoacidi caricati in colonna.

II recupero di aminoacidi dopo eluizione è di g 539,4 su g 603 (che rappresenta il recupero teorico sottraendo acido aspartico e acido glutammico dalla quantità di aminoacidi caricati in colonna) corrispondente all'89,4% del teorico. Il contenuto di acetato nella miscela finale, esente da acidi aspartico e glutammico, è dell'I%.

TABELLA 8 (es. 7)

AA cari- AA % di % dei singoli cati in reçu- reçu- AA in 100 g colonna g perati g pero di miscela

Acido

aspartico

61,7

0

0

/

Treonina

35,7

34,9

97,9

6,5

Serina

47,5

45,9

96,7

8,5

Acido

glutammico

221,4

0

0

/

Prolina

126,0

118,9

94,4

22,0

Glicina

21,2

20,4

96,4

3,8

Alanina

37,6

37,9

100,7

7,0

Valina

65,7

60,1

91,5

11,1

Metionina

23,4

13,2

56,5

2,45

Isoleucina

43,8

34,4

78,6

6,4

Leucina

96,2

73,6

76,5

13,6

Tirosina

/

Fenilalanina

/

Lisina

87,1

86,2

99,0

16,0

Istidina

19,2

13,9

72,6

2,6

Arginina

/

Totale

886,5

539,4

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9

666 189

Esempio 8

Si procede come nell'esempio 7 con la stessa soluzione di carico e stessi parametri operativi, usando tampone C (ammoniaca-acetato d'ammonio più diluito). La fase di eluizione con soluzione ammoniacale di acetato ammonico ha la durata di 195 minuti, corrispondenti a un passaggio di circa 1 62 di soluzione ammoniacale di acetato ammonico.

Nella tabella 9 si evidenziano recuperi e bilanci rispetto agli aminoacidi caricati in colonna.

Il recupero di aminoacidi dopo eluizione è di 526,9 su g 603 (che rappresenta il recupero teorico calcolato sottraendo le quantità di acido aspartico e di acido glutammico dalla quantità di aminoacidi caricati in colonna), corrispondente all'87,4% del teorico.

Il contenuto di acetato nella miscela finale è 1:1,1%.

TABELLA 9 (es. 8)

AA cari

AA

% di

% dei singoli

cati ih recupe recu

AA in 100 g

colonna g rati g pero di miscela

Acido

aspartico

61,7

0

0

/

Treonina

35,7

33,2

93,0

6,3

Serina

47,5

44,1

92,8

8,4

Acido

glutammico

221,4

0 •

0

/

Prolina

126,0

115,0

91,3

21,8

Glicina

21,2

20,2

95,3

3,8

Alanina

37,6

36,0

95,7

6,8

Valina

65,7

59,3

90,3

11,3

Metionina

23,4

12,9

55,1

2,4

Isoleucina

43,8

34,0

77,6

6,5

Leucina

96,2

72,8

75,7

13,8

Tirosina

/

Fenilalanina

/

Lisina

87,1

86,0

98,7

16,3

Istidina

19,2

13,4

69,8

2,5

Arginina

/

Totale

886,5

526,9

Gli studi condotti da Fischer e Collaboratori [«Pathogenesis and therapy of Hepatic Coma» - Progress in liver disease - Volume V - 1975; «The role of plasma amino acids in hepatic en-cephalopathy», Surgery Voi. 80 n. 1 pag. 77-91 (1976); «Chronic hepatic encepalopathy - Long term therapy with a branched-chain amino acids enriched dementai diet» - JAMA - Voi. 242 n. 4 pag. 347-349 (1979)] hanno evidenziato che pazienti con malattie epatiche croniche e cirrosi mostravano un pattern ami-noacidemico nel plasma notevolmente diverso dai soggetti normali: fenilalanina, tirosina, acido glutammico, acido aspartico e metionina aumentavano notevolmente, mentre isoleucina, leucina, valina dimunuivano sensibilmente.

Val + Isoleuc + Leuc ...

Inoltre, il rapporto degli amino-

Fenilal + Tiros acidi plasmatici mostra una notevole correlazione con il grado di encefalopatia. Infatti quando questo rapporto, circa 1 in presenza di encefalopatia, ritorna ai valori normali, circa 3-3,5 si ha un notevole miglioramento nell'encefalopatia. Miglioramenti nello stato generale e neurologico di questi pazienti sono stati riscontrati utilizzando, nel corso dell'alimentazione parenterale di questi soggetti, soluzioni di aminoacidi ad alto contenuto di isoleucina-leucina-valina (branched-chain amino acids), a basso contenuto di metionina-fenilalanina-triptofano, e a contenuto nullo di acido aspartico-acido glutammico-tirosina.

Questo tipo di formulazione è raggiungibile facilmente con i processi evidenziati nei vari esempi prima descritti, e soprattut-5 to è economicamente assai conveniente rispetto a formulazione analoga ricostruita con aminoacidi di origine «sintetica». Infatti, utilizzando come materia prima caseina, dopo idrolisi acida completa, si ottiene una miscela di aminoacidi che, per opportuni trattamenti e per successivo passaggio su resine del tipo io descritto negli esempi 2, 4, 7 e 8 presenta una composizione percentuale media in aminoacidi, evidenziata nei vari esempi riportati in precedenza, del tipo illustrato nella tabella 10.

(In parentesi sono riportati i limiti di oscillazione ammessi 15 in miscele derivanti da idrolizzati proteici).

TABELLA 10

Treonina

6,5

( 5,8-

■ 7,1)

Serina

8,3

( 7,5 -

■ 9,1)

Prolina

22,3

(20,1 -

■ 24,5)

Glicina

3,8

( 3,4-

• 4,2)

Alanina

7,0

( 6,3-

■ 7,7)

Valina

10,9

( 9,8-

12,0)

Metionina

2,2

( 2 -

2,4)

Isoleucina

6,2

( 5,6-

6,8)

Leucina

13,2

(11,9-

14,5)

Lisina

17,2

(15,5 -

18,9)

Istidina

2,4

( 2,2-

2,6)

Tale composizione può essere portata a valori ottimali, nel senso testé accennato, mediante semplice integrazione con quantità relativamente piccole di alcuni aminoacidi: si ottengono «miscele elaborate», come dimostrano i seguenti esempi, anch'essi non limitativi.

40 Esempio 9

A 100 g di una miscela avente la composizione illustrata in tabella 10, ottenuta con il procedimento descritto negli esempi 2, 4, 7 e 8, si aggiungono g 1,5 di fenilalanina, g 8,5 di arginina e g 1,0 di triptofano (quindi soltanto 1' 11% di aminoacidi «in-

45 tegranti»); si ottiene una miscela elaborata avente la composizione % in aminoacidi riportata in tabella 11.

(In parentesi sono riportati i valori di oscillazione ammessi in formulazioni analoghe provenienti da idrolizzati proteici).

50

TABELLA 11 (es. 9)

Treonina

5,8

( 5,2-

6,4)

Serina

7,5

( 6,7-

8,2)

Prolina

20,0

(18,0-

22,0)

Glicina

3,4

( 3,1 -

3,7)

Alanina

6,3

( 5,7-

6,9)

Valina

9,8

( 8,8 -

10,8)

Metionina

2,0

( 1,8-

2,2)

Isoleucina

5,6

( 5,0-

6,2)

Leucina

11,9

(10,7 -

13,1)

Fenilalanina

1,4

( 1,3 -

1,5)

Lisina

15,5

(14,0 -

17,0)

Istidina

2,2

( 2,0-

2,4)

Arginina

7,7

( 6,9-

8,5)

Triptofano

0,9

( 0,8-

1,0)

666 189

10

L'aggiunta di fenilalanina e triptofano ò motivata dal fatto che entrambi sono aminoacidi essenziali, mancanti nella formulazione precedente; l'aggiunta deve essere però minima per rispondere ai requisiti riportati nella letteratura sopra citata. L'arginina è aggiunta per la sua capacità detossificante nei confronti dell'ammoniaca endogena formatasi per deaminazione degli aminoacidi [Meister, A. «Biochemistry of the Amino Acids», 2nd Ed., Ac. Press, N.Y., 1965; «Arginine, Ornithine and Citrulline - Urea Synthesis», pag. 685-707; Najarian, J.S., Harper, H.A., Am. J. Med. 21, 832 (1956)].

La presenza di elettroliti in 100 g di miscela elaborata di aminoacidi è la seguente, riferita alle miscele ottenute negli esempi 2-4-7-8 della presente invenzione:

Esempio 2: Cl" g 0,65% g di miscela elaborata

Esempio 4: Cl" g 1,30% g di miscela elaborata Esempio 7: CH3COO" g 0,90% g di miscela elaborata

Esempio 8: CH3COO" g 1,00% g di miscela elaborata.

Sia la composizione aminoacida elaborata sia il contenuto di elettroliti (per esempio assenza di cationi; NH3 < 0,02%) presenti sono perfettamente idonei all'impiego di questa formulazione in tutti i casi in cui la formulazione stessa può apportare miglioramenti allo stato generale dei pazienti, in particolare a pazienti con gravi danni epatici.

La tabella 12 riporta i parametri nutrizionali fondamentali della miscela di aminoacidi elaborata dell'esempio n. 9.

TABELLA 12

Comp. % dopo in-integraz.

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

Acido

aspartico

Treonina

5,8

0,681

5,8

381

110

Serina

7,5

0,99?

Acido

glutammico

Prolina

20,0

2,434

Glicina

3,4

0,634

Alanina

6,3

0,990

Valina

9,8

1,173

9,8

9,8

644

185

Metionina

2,0

0,188

2,0

131

38

Isoleucina

5,6

0,598

5,6

5,6

368

106

Leucina

11,9

1,271

11,9

11,9

782

225

Tirosina

Fenilalanina

1,4

0,093

92

26

Lisina

15,5

2,970

15,5

1018

293

Istidina

2,2

0,596

Arginina

7,7

2,476

Triptofano

0,9

0,123

0,9

59

17

15,226

52,9

27,3

3475

(1) = g di azoto totale in 100 g di AA

(2) = g di AAE (aminoacidi essenziali) in 100 g di A A

(3) = g di BCAA (branched chain amino acids) in 100 g di AA

(4) = mg di ciascun AAE/g di N totale

(5) = mg di ciascun AAE/g di AAE totali.

Studi recenti hanno evidenziato l'importanza del contenuto di valina, isoleucina, leucina (branched chain amino acids, BCAA) nelle soluzioni di aminoacidi utilizzate in alimentazione parenterale.

Le oesservazioni riportate da vari autori hanno attribuito, a questi tre aminoacidi, speciali effetti anticatabolici [Buse, M.G., Reid, M., J. Clan. Invest., 58, 1251 (1975); Fulks, R.M., Li, J.B., Golberg, A.L., J. Biol. Chem. 250, 280 (1975)].

Studi in vivo su ratti hanno evidenziato un miglior utilizzo dell'azoto contenuto nelle soluzioni di aminoacidi, durante il periodo post-operatorio, quando queste soluzioni erano modificate incrementando il loro contenuto in BCAA. [Freund, H., Yoshimura, N., Lunetta, L., Fischer, J.E., Surgey 83, 611 (1978); Tetsuya Kishi, Yasuo Iwasawa, Hiroshi Itoh, Ichiro Chibata, J. Nutrit. 110, 710 (1980); Erich Vinars, P. Fürst, S.O. Liljedahl, J. Larson, B. Schild, J. Parent. Enter. Nutrit., Vol. 4 n° 2, pp. 184 (1980)] dimostrano l'effetto inadeguato di due soluzioni di aminoacidi, basata una sui fabbisogni secondo Rose [J. Biol. Chem. 217, 987 (1955)] e l'altra sul pattern ami-noacidico dell'uomo (Energy and Protein Requirements, report of a joint FAO-WHO Experts Group, 1973), durante il periodo post-operatorio, riscontrando un notevole catabolismo con notevole aumento di leucina, valina e isoleucina nel liquido intracellulare del muscolo.

Come si è detto dagli esempi 2, 4, 7 e 8 si ottiene una miscela di aminoacidi con la composizione centesimale riportata in tabella 10.

Il contenuto di valina + isoleucina+leucina di questa miscela è del 30,3% rispetto agli altri aminoacidi ed è quindi idonea a costituire la base per ottenere una miscela ad alto contenuto in BCAA. La convenienza economica di utilizzare questa miscela è analoga a quanto già evidenziato nell'esempio 9.

Anche in questo caso, si può pervenire facilmente a una «miscela elaborata» mediante integrazione con una percentuale relativamente limitata degli aminoacidi carenti. Gli esempi 10 e 11 che seguono costituiscono una dimostrazione non limitativa.

Esempio 10

A 100 g di miscela avente la composizione riportata nella tabella 10, ottenuta secondo gli esempi 2, 4, 7 e 8, si aggiungono 1,0 g di metionina, 6 g di fenilalanina, 5,0 g di arginina e 2,0 g di triptofano (l'integrazione è pertanto limitata al 14% rispetto alla miscela iniziale). La miscela elaborata presenta la composizione percentuale precisata nella tabella 13.

TABELLA 13 (es. 10)

Treonina

5,7

( 5,1 -

6,3)

Serina

7,3

( 6,6-

8,0)

Prolina

19,6

(17,6 -

21,6)

Glicina

3,3

( 3,0-

3,6)

Alanina

6,1

( 5,5-

6,7)

Valina

9,6

( 8,6-

10,6)

Metionina

2,8

( 2,5-

3,1)

Isoleucina

5,4

( 4,9-

5,9)

Leucina

11,6

(10,4 -

12,8)

Fenilalanina

5,3

( 4,8-

5,8)

Lisina

15,1

(13,6 -

16,6)

Istidina

2,1

( 1,9-

2,3)

Arginina

4,4

( 4,0-

4,8)

Triptofano

1,7

( 1,5-

1,9)

La presenza di elettroliti in 100 g di miscela elaborata di aminoacidi è la seguente, riferita alle miscele ottenute negli esempi 2-4-7-8:

Esempio 2: Cl" g 0,6% g di miscela elaborata

Esempio 4: Cl" g 1,23% g di miscela elaborata

Esempio 7: CH3COO" g 0,88% di miscela elaborata Esempio 8: CH3COO" g 0,95% di mescela elaborata.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

11

666 189

La composizione in aminoacidi della miscela elaborata, il contenuto in BCAA (27,3"% rispetto al globale), il contenuto di elettroliti (per esempio assenza di cationi; NH3 < 0,02%) sono perfettamente idonei agli impieghi di questa formulazione in tutti i casi in cui questo tipo di formula può apportare miglioramenti allo stato generale dei pazienti, in particolare a pazienti con traumi e sepsi.

La tabella 14 riassume i parametri nutrizionali fondamentali della formulazione riportata in tabella 13.

TABELLA 14 (es. 10)

Comp. % dopo in-tegraz.

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

Acido

aspartico

Treonina

5,7

0,600

5,7

401

98

Serina

7,3

0,858

Acido

glutammico

Prolina

19,6

2,385

Glicina

3,3

0,616

Alanina

6,1

0,959

Valina

9,6

1,148

9,6

9,6

676

166

Metionina

2,8

0,263

2,8

197

48

Isoleucina

5,4

0,577

5,4

5,4

380

93

Leucina

11,6

1,239

11,6

11,6

817

200

Tirosina

Fenilalanina

5,3

0,449

6,0

422

104

Lisina

15,1

2,893

15,1

1063

261

Istidina

2,1

0,569

Arginina

4,4

1,415

Triptofano

1,7

0,233

1,7

120

29

14,200

57,9

27,6

4076

Per i significati di (1) (2) (3) (4) e 5 vedi tabella N. 12.

Esempio li

Aggiungendo ad esempio, ma non limitativamente, a 100 g della miscela avente la composizione riportata nella tabella 10, g 1 di metionina, g 0,8 di tirosina, g 3,4 di fenilalanina, g 5 di arginina e g 1,9 di triptofano di ottiene la seguente composizione in aminoacidi della miscela rielaborata:

TABELLA 15 (es. 11)

Treonina

5,8%

( 5,2-

6,4)

Serina

7,4%

( 6,6-

8,2)

Prolina

19,9%

(17,9 -

21,9)

Glicina

3,4

( 3,0-

3,7)

Alanina

6,2

( 5,5-

6,9)

Valina

9,7%

( 8,7-

10,7)

Metionina

2,8%

( 2,5-

3,1)

Isoleucina

5,5%

( 4,9-

6,1)

Leucina

11,8%

(10,6 -

13,0)

Tirosina

0,7%

( 0,6-

0,8)

Fenilalanina

3,0%

( 2,7 -

3,3)

Triptofano

1,7%

( 1,5 -

1,9)

Lisina

15,3%

(13,7-

16,9)

Istidina

2,1%

( 1,8 -

2,3)

Arginina

4,5%

( 4,0-

5,0)

La presenza di elettroliti in 100 g di miscela elaborata di aminoacidi è la seguente, riferita alle miscele ottenute negli esempi 2, 4, 7 e 8:

Esempio 2: Cl" ~ g 0,6% g di miscela elaborata

Esempio 4: Cl" ~ g 1,2% di miscela elaborata

Esempio 7: CH3COO" ~ g 0,9% di miscela elaborata Esempio 8: CH3CO0" — g 1,0% di miscela elaborata.

La composizione in aminoacidi della miscela elaborata, il contenuto di branched-chain amino acids (27,0% rispetto al globale), il contenuto di aminoacidi essenziali (55,6% rispetto al globale), e il basso contenuto in anioni, rendono questa formulazione idonea in tutti quei casi un cui essa può apportare miglioramenti allo stato generale dei pazienti, in particolare a pazienti con traumi e sepsi.

La tabella seguente riassume i parametri fondamentali di questa formulazione:

TABELLA 16 (es. 11)

Comp.% dopo inte-graz.

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

Acido

aspartico

/

Treonina

5,8

0,682

5,8

401

104

Serina

7,4

0,986

Acido

glutammico

/

Prolina

19.9

2,422

Glicina

3,4

0,634

Alanina

6,2

0,975

Valina

9,7

1,160

9,7

9,7

671

174

Metionina

2,8

0,263

2,8

194

50

Isoleucina

5,5

0,587

5,5

5,5

380

99

Leucina

11,8

1,260

11,8

11,8

816

212

Tirosina

0,7

0,054

Fenilalanina

3,0

0,254

3,0

208

54

Triptofano

1,7

0,233

1,7

118

31

Lisina

15,3

2,931

15,3

1058

275

Istidina

2,1

0,569

Arginina

4,5

1,447)

14,457

55,6

27,0

3846

Per i significati di (1), (2), (3), (4) e (5) devi la tabella n. 12.

Esempio 12

Si impiega una colonna con le stesse caratteristiche riportate prima degli esempi.

La velocità di percolazione è, nel caso specifico ma non limitante, di 1,74 volumi di soluzione per ora per volume di resina. La soluzione di alimentazione è costituita da una miscela di aminoacidi con le caratteristiche sotto riportate, sciolta in ammoniaca diluita con pH finale — 10.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

666 189

12

TABELLA 17 (es.

12)

g AA/lt gAA/100 g di miscela di aminoacidi

Acido aspartico

2,92

7,29

Treonina

1,63

4,07

Serina

2,09

5,22

Acido glutammico

10,29

25,71

Prolina

5,17

12,92

Glicina

0,93

2,32

Alanina

1,61

4,02

Valina

2,97

7,42

Metionina

1,17

2,92

Isoleucina

1,91

4,77

Leucina

4,01

10,02

Tirosina

0,10

0,25

Fenilalanina

0,06

0,15

Lisina

3,98

9,94

Istidina

1,10

2,75

Arginina

0,09

0,22

Totale aminoacidi g

40,03

Si alimenta per 210 minuti la colonna con la soluzione ammoniacale avente le caratteristiche riportate sopra. Al termine dell'alimentazione con la soluzione ammoniacale di aminoacidi viene percolata H20 per 60 minuti.

Per i primi 90 minuti la soluzione passata attraverso la colonna non contiene aminoacidi. Dopo tale tempo si inizia la fase di raccolta che perdura sino al termine del passaggio di H2O. La fase di raccolta ha quindi una durata di 180 minuti.

Nella tabella 18 si evidenziano recuperi e bilanci rispetto agli aminoacidi caricati in colonna.

Il recupero degli aminoacidi è di g 1,869 su g 2,009 (che rappresenta il recupero teorico sottraendo dalla quantità di aminoacidi caricati in colonna, g 142 di acido aspartico e g 455 di acido glutammico che sono assorbiti dalla resina) corrispondente al 93% rispetto al teorico.

La miscela di aminoacidi ottenuta presenta un bilancio tra aminoacidi con caratteristiche acide ed aminoacidi con caratteristiche basiche pressoché in pareggio per cui l'aggiunta di piccole quantità di basi inorganiche od organiche permette di ottenere, dopo concentrazione a pressione ridotta, un prodotto il cui contenuto in ammoniaca è inferiore a 0,02 g % di aminoacidi e con bassa quantità di cationi presenti, se viene utilizzata una base inorganica, o addirittura esente da cationi ed anioni qualora si utilizzi una base organica. La scelta delle basi inorganiche od organiche è dettata dal tipo di utilizzo a cui il prodotto è destinato.

Per una miscela destinata ad uso parenterale od enterale le basi inorganiche utilizzabili possono contenere cationi in quantità fisiologicamente utili o non dannosi agli stati patologici a cui il prodotto è destinato, come ad esempio, ma non limitativamente, NaOH-KOH-Mg(OH)2-Ca(OH)2 ecc. Per quanto riguarda le basi organiche si può citare, ma non limitativamente, l'arginina che è un aminoacido esso stesso e la cui presenza nelle miscele di aminoacidi destinate agli usi sopra citati è utile, in quanto rientra nel ciclo di Krebs-Henseleit della formazione di urea (Meister, A. «Biochemistry of the amino acids» 2nd Ed., Ac press, N.Y., 1965 «Arginine, Ornithine and Citrulline; Urea Synthesis», pg. 685-707; Najaran, J.S., Harpey, H.A., Am., J. Med. 21, 832 (1956). A titolo esemplificativo si riporta che l'aggiunta di 5 meq di NaOH o di 5 mmoli di arginina per ogni litro di eluato raccolto dopo passaggio su resina, secondo il procedimento sopra descritto, permette di ottenere, dopo concentrazione a pressione ridotta, un prodotto in cui l'ammoniaca è

inferiore a 0,02 g % g di aminoacidi e con un contenuto rispettivamente di sodio di ~ 0,3 g % g di aminoacidi acidi (con l'uso di NaOH) o di — g 3 di arginina % g di aminoacidi (utilizzando come base organica l'arginina).

TABELLA 18 (es. 12)

AA cari- g AA % Comp. %

cati in recupe- reçu- g AA in 100 g colonna perati pero di miscela g

Acido

aspartico

190

48

25,3

2,6

Treonina

106

98

92,5

5,3

Serina

136

126

92,6

6,7

Acido

glutammico

670

215

32,1

11,5

Prolina

337

327

97,0

17,5

Glicina

61

56

91,8

3,0

Alanina

105

102

97,1

5,5

Valina

193

177

91,7

9,5

Metionina

76

56

73,7

3,0

Isoleucina

124

114

91,9

6,1

Leucina

261

234

89,7

12,5

Tirosina

6

/

Fenilalanina

4

/

Lisina

259

252

97,3

13,5

Istidina

72

58

80,6

3,1

Arginina

6

6

100,0

0,3

Totale

2606

1869

Esempio 13

Dall'esempio 12 si può ottenere una miscela di aminoacidi con la seguente composizione centesimale dopo passaggio su IRA 400:

TABELLA 19 (es. 13)

Acido aspartico

2,55%

( 2,2-

2,8)

Treonina

5,26%

( 4,7-

5,8)

Serina

6,72%

( 6,0 -

7,4)

Acido glutammico

11,50%

(10,3 -

12,7)

Prolina

17,50%

(15,7-

19,3)

Glicina

2,99%

( 2,6-

3,3)

Alanina

5,48%

( 4,9 -

6,1)

Valina

9,49%

( 8,5-

10,5)

Metionina

3,01%

( 2,7 -

3,3)

Isoleucina

6,11%

( 5,4-

6,7)

Leucina

12,55%

(11,2 -

13,8)

Lisina

13,49%

(12,1 -

14,8)

Istidina

3,10%

( 2,7-

3,4)

Arginina

—

( 0 -

8,3)

Il contenuto di Valina + Isoleucina + leucina di questa miscela è del 28,15% rispetto agli altri aminoacidi ed è quindi idonea a costituire la base per ottenere miscele a elevato contenuto di branched-chain amino acids, secondo gli studi e le esperienze già segnalate negli esempi 10-11. La convenienza economica di utilizzare questa miscela è analoga a quanto già evidenziato nell'esempio 9.

Aggiungendo ad esempio, ma non limitativamente, a 100 grammi della miscela sopra riportata, g 3 di metionina, g 6 di

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

13

666 189

fenilalanina, g 9 di arginina, e g 1,8 di triptofano, si ottiene la seguente composizione in aminoacidi della miscela rielaborata:

TABELLA 20 (es. 13)

Acido aspartico

2,1%

( 1,8-

2,3)

Treonina

4,4%

( 3,9--

4,9)

Serina

5,6%

( 5,0-

6,2)

Acido glutammico

9,6%

( 8,6-

10,6)

Prolina

14,6%

(13,1 -

16,1)

Glicina

2,5%

( 2,2-

2,8)

Alanina

4,6%

( 4,1 -

5,1)

Valina

7,9%

( 7,1 -

8,7)

Metionina

5,0%

( 4,5-

5,5)

Isoleucina

5,1%

( 4,5-

5,6)

Leucina

10,5%

( 9,4-

11,6)

Fenilalanina

5,0%

( 4,5-

5,5)

Lisina

11,3%

(10,1 -

12,5)

Istidina

2,6%

(2,3-

2,9)

Arginina

7,5%

( 6,7-

8,2)

Triptofano

1,5%

( 1,3-

1,6)

Il contenuto di elettroliti in 100 g della miscela elaborata può essere nullo qualora nella preparazione della miscela base si abbia presenza di quantità di arginina superiori al 3% in composizione centesimale aminoacida, o inferiore a 15 meq di cationi/g di aminoacidi se nella miscela vi è assenza di arginina. La composizione in aminoacidi della miscela elaborata, il contenuto di branched chain amino acids (23,5% rispetto al globale), l'eventuale presenza di piccole quantità di cationi sono perfettamente idonei agli utilizzi di questa formulazione in tutti i casi in cui questo tipo di formula può apportare miglioramenti allo stato generale dei pazienti, in particolare a pazienti con traumi e sepsi.

La tabella seguente riassume i parametri fondamentali di questa formulazione:

TABELLA 21 (es. 13)

Comp. % dopo inte-graz.

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

Acido

aspartico

2,1

0,221

Treonina

4,4

0,517

4,4

307

87

Serina

5,6

0,746

Acido

glutammico

9,6

0,914

Prolina

14,6

1,777

Glicina

2,5

0,466

Alanina

4,6

0,723

Valina

7,9

0,945

7,9

7,9

550

156

Metionina

5,0

0,469

5,0

348

99

Isoleucina

5,1

0,545

5,1

5,1

355

101

Leucina

10,5

1,121

10,5

10,5

731

207

Tirosina

—

—

—

—

—

—

Fenilalanina

5,0

0,424

5,0

348

99

Triptofano

1,5

0,206

1,5

104

29

Lisina

11,3

2,165

11,3

787

223

Istidina

2,6

0,704

Arginina

7,5

2,412

14,355

50,7

23,5

3530

Per i significati di (1), (2), (3), (4) e (5) vedere tabella n. 12.

Esempio 14

Dall'esempio 12 si può ottenere una miscela di aminoacidi con la seguente composizione centesimale dopo passaggio su IRA 400:

TABELLA 22 (es. 14)

Acido aspartico

2,55%

( 2,2-

2,8)

Treonina

5,26%

( 4,7-

5,8)

Serina

6,72%

( 6,0-

7,4)

Acido glutammico

11,50%

(10,3 -

12,7)

Prolina

17,50%

(15,7 -

19,3)

Glicina

2,99%

( 2,6-

3,3)

Alanina

5,48%

( 4,9-

6,1)

Valina

9,49%

( 8,5-

10,5)

Metionina

3,01%

( 2,7-

3,3)

Isoleucina

6,11%

( 5,4-

6,7)

Leucina

12,55%

(11,2-

13,8)

Lisina

13,49%

(12,1 -

14,8)

Istidina

3,10%

( 2,7-

3,4)

Arginina

—

(0 -

5,0)

Valgono, per quanto riguarda il contenuto di branched-chain amino acids e convenienza economica, le stesse considerazioni riportate nell'esempio 13.

Aggiungendo, ad esempio, ma non limitativamente, a 100 g della miscela sopra riportata, g 1 di metionina, g 0,8 di tirosina, g 3,4 di fenilalanina, g 5 di arginina e g 1,9 di triptofano, si ottiene la seguente composizione in aminoacidi della miscela rielaborata:

TABELLA 23 (es. 14)

Acido aspartico

2,3%

( 2,0-

2,5)

Treonina

4,7%

( 4,2-

5,2)

Serina

6,0%

( 5,4-

6,6)

Acido glutammico

10,3%

( 9,2-

11,4)

Prolina

15,6%

(14,0 -

17,2)

Glicina

2,7%

( 2,4-

3,0)

Alanina

4,9%

( 4,4-

5,4)

Valina

8,5%

( 7,6-

9,4)

Metionina

3,6%

( 3,2-

4,0)

Isoleucina

5,5%

( 4,9-

6,1)

Leucina

11,2%

(10,0 -

12,3)

Tirosina

0,7%

( 0,6-

0,8)

Fenilalanina

3,0%

( 2,7-

3,3)

Lisina

12,0%

(10,8 -

13,2)

Istidina

2,8%

( 2,5-

3,1)

Arginina

4,5%

( 4,0-

5,0)

Triptofano

1,7%

( 1,5-

1,9)

Il contenuto di elettroliti in 100 g della miscela elaborata può essere nullo qualora nella preparazione della miscela base si abbia presenza di quantità di arginina superiori al 3% in composizione centesimale aminoacidica, o inferiori a 15 meq di cationi/g di aminoacidi se nella miscela finale vi è assenza di arginina. La composizione in aminoacidi della miscela elaborata, il contenuto di branched-chain amino acids (25,2% rispetto al globale), l'eventuale presenza di piccole quantità di cationi sono perfettamente idonei agli utilizzi di questa formulazione in tutti i casi in cui questo tipo di formula può apportare miglioramenti allo stato generale dei pazienti, in particolare a pazienti con traumi e sepsi. La tabella 24 riassume i parametri fondamentali di questa formulazione:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

666 189

14

TABELLA 24 (es. 14)

Comp. % dopo in-tegraz.

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

Acido

aspartico

2,3

0,242

Treonina

4,7

0,552

4,7

337

94

Serina

6,0

0,779

Acido

glutammico

10,3

0,981

Prolina

15,6

1,899

Glicina

2,7

0,504

Alanina

4,9

0,770

Valina

8,5

1,017

8,5

8,5

610

169

Metionina

3,6

0,338

3,6

258

72

Isoleucina

5,5

0,587

5,5

5,5

395

110

Leucina

11,2

1,196

11,2

11,2

804

'223

Tirosina

0,7

0,054

Fenilalanina

3,0

0,254

3,0

215

60

Triptofano

1,7

0,233

1,7

122

34

Lisina

12,0

2,299

12,0

861

239

Istidina

2,8

0,759

Arginina

4,5

1,447

13,931

50,2

25,2

3702

Per i significati di (1), (2), (3), (4) e (5) si veda tabella n. 12.

Esempio 15

Le condizioni operative sono identiche a quanto riportato nell'esempio 8, con la sola eccezione della concentrazione e composizione degli aminoacidi della soluzione di carico (vedere tabella n. 25). La quantità di aminoacidi caricata in colonna è g 1271,3 e i contenuti di acido aspartico e di acido glutammico rispettivamente 79,4 g e 275,0 g. Come si può notare in tabella 25, in questo esempio la soluzione di alimentazione, pur essendo sempre derivata dalla purificazione di aminoacidi provenienti da caseina, contiene tirosina, fenilalanina, arginina che non sono presenti nelle soluzioni utilizzate negli altri esempi, in quanto è possibile l'eliminazione di questi tre aminoacidi mediante altri sistemi.

Nella tabella n. 26 si riportano i recuperi e i bilanci rispetto agli aminoacidi caricati in colonna.

Nelle condizioni operative utilizzate nell'esempio 15, tirosina e fenilalanina sono completamente adsorbite al pari di acido aspartico e acido glutammico, mentre l'arginina viene eluita dalla resina insieme agli altri aminoacidi. Nello stesso modo seguito negli esempi 9, 10, 11, 13 e 14 si possono ottenere formulazioni adatte in nutrizione parenterale ed enterale.

TABELLA 25 (es. 15)

g di AA/1 g di AA/100 g soluzione di miscela ammoniacale di aminoacidi

Acido aspartico g

3,2

6,24

Treonina g

1,74

3,39

Serina g

2,06

4,02

Acido glutammico g

11,09

21,63

TABELLA 25 (continuazione)

g di AA/1 g di AA/100 g soluzione di miscela ammoniacale aminoacidi

Prolina g

6,12

11,94

Glicina g

1,20

2,34

Alanina g

2,05

4,00

Valina g

3,66

7,14

Metionina g

1,46

2,85

Isoleucina g

2,67

5,21

Leucina g

5,22

10,18

Tirosina g

1,5

2,93'

Fenilalanina g

1,5

2,93

Lisina g

5,03

9,81

Istidina g

1,51

2,95

Arginina g

1,25

2,44

Totale aminoacidi g

51,26

TABELLA 26 (es. 15)

AA caricati in colonna g

AA recuperati g

% di recupero

% dei singoli AA in 100 g di miscela

Acido

aspartico

79,4

0

0

Treonina

43,2

41,6

96,2

5,6

Serina

51,1

48,8

95,5

6,5

Acido

glutammico

275,0

0

0

Prolina

151,8

144,2

95,0

19,4

Glicina

29,8

28,5

95,7

3,8

Alanina

50,8

50,4

99,2

6,8

Valina

90,8

81,7

90,0

11,0

Metionina

36,2

20,5

56^5

2,7

Isoleucina

66,2

49,8

75,2

6,7

Leucina

129,5

96,9

74,8

13,0

Tirosina

37,2

0

0

—

Fenilalanina

37,2

0

0

—

Lisina

124,7

123,8

99,3

16,6

Istidina

37,4

27,7

74 '

3,7

Arginina

31,0

30,7

99,0

4,1

Totale

1271,3

744,6

Esempio 16

Colonna, tipo di resina, volume e forma ionica sono identici a quelli riportati nell'esempio 1.

La velocità di percolazione è mantenuta a 1 volume di soluzione/ora/volume di resina. La soluzione di alimentazione è costituita da una miscela di aminoacidi con le caratteristiche riportate in tabella 27, derivata da un'idrolisi di farina di soja, dopo opportuni trattamenti purificanti.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

TABELLA 27 (es. 16)

15

666 189

TABELLA 28 (continuazione)

g AA/1 di g AA/100 g

AA ca

AA re

% di

% dei singoli

soluzione di miscela

ricati in cuperati recu

AA in 100 g

ammoniacale di aminoacidi

5

colonna

pero di miscela

Acido aspartico

5,25

13,8

g g

g

Treonina g

1,43

3,76

Alanina

60,1

58,6

97,5

12,7

Serina g

2,15

5,65

Valina

55,2

50,3

91,1

10,9

Acido glutammico g

9,31

24,48

io Metionina

8,3

3,6

43,3

0,78

Prolina g

2,75

7,23

Isoleucina

38,72

31,2

80,6

6,78

Glicina g

2,35

6,1

Leucina

68,6

52,3

76,2

11,4

Alanina g

2,73

7,81

Tirosina

—

—

—

—

Valina g

2,51

6,6

Fenilalanina

—

—

—

—

Metionina g

0,38

0,99

15 Lisina

77,2

76,5

99,1

16,6

Isoleucina g

1,76

4,63

Istidina

16,9

10,4

61,5

2,26

Leucina g

3,12

8,2

Arginina

—

—

—

—

Tirosina Fenilalanina g g

Totale

836,44

460,2

Lisina g

3,51

9,23

20

Istidina g

0,77

2,02

Arginina g

—

—

Esempio 17

Le condizioni di colonna sono identiche a quelle utilizzate

Totale aminoacidi g 38,02

negli esempi precedenti. La fase di carico degli aminoacidi è

Si alimenta per 120 minuti la colonna con la soluzione ammoniacale avente le caratteristiche riportate sopra. La quantità di aminoacidi caricata sulla colonna è g 836,44'e i contenuti di acido aspartico e di acido glutammico rispettivamente 115,4 g e 204,7 g.

Al termine della fase di carico inizia la fase di eluizione utilizzando una soluzione diluita di tampone ammoniacale-cloruro di ammonio (tampone A).

La fase di eluizione è di minuti 240, corrispondenti ad un passaggio di 441 di soluzione ammoniacale di cloruro ammoni-co. Tutto l'eluato viene riunito. Nella tabella 28 si evidenziano i recuperi e i bilanci rispetto agli aminoacidi caricati in colonna.

Il recupero degli aminoacidi dopo eluizione è di 460,2 g su 516,14 g (quest'ultimo è il recupero teorico calcolato sottraendo la quantità degli acici aspartico e glutammico dalla quantità degli aminoacidi caricati in colonna), corrispondente all'89,2% del teorico.

Il contenuto di cloro nella miscela finale, esente da acido aspartico e glutammico, è dello 0,7%.

Nello stesso modo degli esempi 9, 10, 11, 13 e 14, riportati in precedenza, si possono ottenere formulazioni adatte all'uso, in nutrizione clinica o anche in uso zootecnico o veterinario, mediante opportune aggiunte di aminoacidi carenti nella formulazione intermedia.

TABELLA 28 (es. 16)

25 eseguita con una soluzione di concentrazione e composizione riportata in tabella 29.

TABELLA 29 (es. 17)

g AA/1 di soluzione ammoniacale g AA/100 g di miscela di aminoacidi

35 Acido aspartico g

3,15

8,34

Treonina g

1,47

3,89

Serina g

1,33

3,52

Acido glutammico g

6,12

16,2

Prolina g

2,71

7,17

40 Glicina g

3,56

9,43

Alanina g

3,40

9,00

Valina g

2,72

7,2

Metionina g

1,46

3,86

Isoleucina g

1,76

4,66

45 Leucina g

3,88

10,27

Tirosina g

—

—

Fenilalanina g

—

—

Lisina g

5,43

14,3

Istidina g

0,77

2,04

so Arginina g

—

—

Totale aminoacidi g

37,76

AA ca

AA re

% di

% dei singoli

55 La miscela di aminoacidi è ottenuta per idrolisi da farina di

ricati in cuperati recu

AA in 100 g pesce, dopo i consueti passaggi di purificazione e decolora

colonna

pero di miscela zione.

S

g

La quantità di aminoacidi caricata sulla colonna è 883,6 g e

i contenuti di acido aspartico e di acido glutammico sono ri-

Acido

60 spettivamente 73,7 g e 143,2 g. La velocità di percolazione è au aspartico

115,5

0

0

—

mentata a 1,74 volumi di soluzione/ora/volume di resina. Du

Treonina

31,5

31,1

98,7

6,75

rante la fase di carico non si ha presenza di aminoacidi nella so

Serina

47,3

42

88,8

9,13

luzione passata attraverso la colonna.

Acido

L'eluizione viene eseguita con una soluzione ammoniacale glutammico

204,8

0

0

—

65 di cloruro ammonico (tampone A). La fase di eluizione ha una

Prolina

60,5

55

90,9

11,95

durata di 140 minuti, corrispondente a ~ 144,6 di soluzione

Glicina

51,7

49,2

95,1

10,7

ammoniacale di cloruro ammonico. Tutto l'eluato viene riu-

nito.

666 189

16

Nella tabella 30 si evidenziano recuperi e bilanci rispetto agli aminoacidi caricati in colonna.

Il recupero degli aminoacidi dopo eluizione è di 585 g su 666,7 g (che rappresenta il recupero teorico calcolato sottraendo, dalla quantità di aminoacidi caricati in colonna, gli acidi aspartico e glutammico) corrispondente all'87,7% del teorico. Il contenuto di cloro nella miscela finale, esente da acido aspartico e da acido glutammico, è dell' 1,4%.

Nello stesso modo degli esempi 9, 10, 11, 13 e 14 riportati in precedenza, si possono ottenere formulazioni adatte all'uso zootecnico, veterinario e in nutrizione clinica, per opportune aggiunte di aminoacidi carenti nella formulazione intermedia.

TABELLA 30 (es. 17)

AA cari

AA re

% di

% dei singoli

cati in cuperati recu

AA in 100 g

colonna g

g pero di miscela

Acido

aspartico

73.7

0

0

—

Treonina

34,4

32,2

93,6

5,5

Serina

31,1

28,3

90,9

4,83

Acido

glutammico

143,2

0

0

—

Prolina

63,4

55,1

86,9

9,41

Glicina

83,3

80,2

96,2

13,7

Alanina

79,6

77,3

97,1

13,2

Valina

63,6

56

88

9,57

Metionina

34,2

15,9

46,5

2,72

Isoleucina

41,2

32,4

78,6

5,54

Leucina

90,8

69,9

76,9

11,9

Tirosina

—

—

—

—

Fenilalanina

—

—

—

—

Lisina

127,1

125,8

98,9

21,5

Istidina

18,0

11,9

66,1

2,03

Arginina

—

—

—

Totale

883,6

585,0

Esempio 18

Le condizioni di colonna sono identiche a quelle utilizzate negli esempi precedenti. La velocità di percolazione è 1,74 volumi di soluzione/ora/volume di resina. La quantità di aminoacidi caricata in colonna è g 871,0 e i contenuti di acido aspartico e di acido glutammico rispettivamente 107,6 g e 147,2 g. I dati di concentrazione e composizione centesimale della soluzione di alimentazione nella fase di carico sono riportati nella successiva tabella 31.

La soluzione utilizzata per l'eluizioner è il tampone C.

La fase di eluizione con soluzione ammoniacale di acetato ammonico ha la durata di 195 minuti, corrispondenti a un passaggio di circa 1 60 di soluzione ammoniacale di acetato ammonico.

Nella tabella 32 si evidenziano recuperi e bilanci rispetto agli aminoacidi in colonna.

La composizione in aminoacidi riportata in tabella 31 deriva dall'idrolisi completa, e successiva purificazione, di albume d'uovo. Nello stesso modo degli esempi riportati in precedenza, 9, 10, 11, 13 e 14, si possono ottenere formulazioni adatte in nutrizione clinica.

TABELLA 31 (es. 18)

g AA/1 g AA/100 g di soluzione di miscela ammoniacale di aminoacidi

Àcido aspartico g

4,60

12,36

Treonina g

1,87

5,02

Serina g

2,69

7,23

Acido glutammico g

6,29

16,90

Prolina g

1,69

4,54

Glicina g

1,78

4,78

Alanina g

3,06

8,22

Valina g

2,83

7,60

Metionina g

1,87

5,02

Isoleucina g

2,28

6,13

Leucina g

3,83

10,29

Tirosina g

—

—

Fenilalanina g

—

—

Lisina g

3,29

8,84

Istidina g

1,14

3,06

Arginina g

—

Totale aminoacidi g 37,22

TABELLA 32 (es. 18)

AA ca

AA re

% di

% dei singoli

ricati in cuperati recu

AA in 100 g

colonna

pero di miscela

g g

Àcido

aspartico

107,6

0

0

—

Treonina

43,8

42,1

96,1

7,8

Serina

62,9

59,6

94,8

11,0

Acido

glutammico

147,2

0

0

—

Prolina

39,5

37,7

95,5

6,9

Glicina

41,7

40,0

95,9

7,4

Alanina

71,6

71,0

99,1

13,1

Valina

66,2

60,9

92,0

11,2

Metionina

43,8

23,8

54,3

4,4

Isoleucina

53,4

41,6

77,9

7,7

Leucina

89,6

69,7

77,8

12,8

Tirosina

—

—

—

—

Fenilalanina

—

—

—

—

Lisina

77,0

76,6

99,5

14,1

Istidina

26,7

19,6

73,4

3,6

Arginina

—

—

—

—

Totale

871,0

542,6

Esempio 19

Le condizioni di colonna sono identiche a quelle utilizzate negli esempi precedenti pur non essendo esse limitanti.

La fase di carico è eseguita con una soluzione ammoniacale di aminoacidi a concentrazione e composizione riportate qui di seguito.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

17

666 189

TABELLA 33 (es. 19)

g AA/lt soluzione g AA/100 g di miscela di aminoacidi

Acido aspartico

5,56

13,9

Treonina

2,44

6,1

Serina

1,96

4,9

Acido glutammico

5,52

13,8

Prolina

2,76

6,9

Glicina

2,68

6,7

Alanina

2,88

7,2

Valina

3,32

8,3

Metionina

1,12

2,8

Isoleucina

2,28

5,7

Leucina

4,08

10,2

Tirosina

0,04

0,1

Fenilalanina

0,04

0,1

Lisina

4,32

10,8

Istidina

0,92

2,3

Arginina

0,08

0,2

Totale aminoacidi

40,00

La miscela di aminoacidi è ottenuta per idrolisi di un concentrato di proteine derivate da patate dopo i consueti passaggi di purificazione e decolorazione, I valori riportati in tabella n. 33 sono indicativi e non limitativi e possono avere oscillazioni che comunque permettono sempre l'identificazione della fonte proteica originale. La velocità di percolazione, il tempo di carico della soluzione, i tempi di processo e la soluzione eluente sono simili a quelli riportati nell'esempio 8.

Nella tabella n. 34 si evidenziano recuperi e bilanci rispetto agli aminoacidi caricati in colonna.

Nello stesso modo degli esempi riportati in precedenza, si possono ottenere formulazioni adatte in nutrizione clinica o altri usi, per aggiunte opportune di altri aminoacidi (arginina, triptofano, fenilalanina, tirosina).

TABELLA 34 (es. 19)

AA ca- g AA % re- comp. % ricati in reçu- cupero g AA in 100 g colonna perati di miscela

Acido aspartico

139

0

Treonina

61

56,7

93,0

8,9

Serina

49

45,6

93,0

7,2

Acido

glutammico

138

0

0

Prolina

69

63,5

92,0

10,0

Glicina

67

64,2

95,8

10,1

Alanina

72

69,2

96,1

10,9

Valina

83

74,8

90,1

11,7

Metionina

28

15,4

54,9

2,4

Isoleucina

57

44,6

78,2

7,0

Leucina

102

78,6

77,1

12,3

Tirosina 1

TABELLA 34 (continuazione)

AA ca g AA re

% re comp. %

ricati in cuperati cupero g AAinlOOg

colonna

di miscela

Fenilalanina

1

Lisina

108

107

99,0

16,7

Istidina

23

16,1

70,1

2,5

Arginina

2

1,9

95,0

0,3

Totale

1000

637,6

Esempio 20

Le condizioni di processo sono identiche a quelle relative all'esempio 12, pur non essendo esse limitative. La fase di carico è eseguita con una soluzione ammoniacale di aminoacidi a concentrazione e composizione identica a quella dell'esempio precedente.

La miscela di aminoacidi è ottenuta per idrolisi di un concentrato di proteine derivate da patate dopo i consueti passaggi di purificazione e decolorazione.

I valori riportati in tabella 35 sono indicativi e non limitativi e possono avere oscillazioni che comunque permettono sempre l'identificazione della fonte proteica originale.

La velocità di percolazione, il tempo di carico della soluzione, i tempi di processo sono simili a quelli riportati nell'esempio 12.

Nella tabella 35 si evidenziano recuperi e bilanci rispetto agli aminoacidi caricati in colonna.

Nello stesso modo degli esempi riportati in precedenza, si possono ottenere formulazioni adatte in nutrizione clinica o altri usi per aggiunte opportune di altri aminoacidi (arginina, triptofano, fenilalanina, tirosina).

TABELLA 35 (es. 20)

AA cari g AA

<7o re comp. %

cati in recupe cupero g AA in 100 g

colonna rati

di miscela

Acido

aspartico

417

108,8

26,1

4,8

Treonina

183

170,7

93,0

7,5

Serina

147

162,0

93,1

7,1

Acido

glutammico

414

137,4

33,2

6,0

Pròlina

207

202,8

98,0

8,9

Glicina

201

185,0

92,1

8,1

Alanina

216

209,7

97,1

9,2

Valina

249

228,8

91,9

10,1

Metionina

84

61,1

72,8

2,7

Isoleucina

171

159

93,0

7,0

Leucina

306

281,8

92,1

12,3

Tirosina

0,3

Fenilalanina

0,3

Lisina

324

314,3

97,0

13,8

Istidina

69

54,5

79,1

2,4

Arginina

6

.6

100,0

0,03

Totale

3000

2282,5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

V

Claims (2)

666 189 2 RIVENDICAZIONI

1,92-

1,92 -

2,88%

»

Isoleucina

5,6 -

8,4 %

»

Leucina

9,84-

14,76%

»

Lisina

13,36 -

20,04%

»

Istidina

2,0 -

3 %

»

Arginina

0 -

0,4 %

»

24. Uso secondo la rivendicazione 23, caratterizzato dal fatto che si aggiungono altri aminoacidi e che la composizione media è:

Acido aspartico

3,84-

• 5,76%

in

Treonina

6,0 -

• 9,0 %

»

Serina

5,7 -

• 8,52%

»

Acido glutammico

4,8 -

■ 7,2 %

»

Prolina

7,12-

■ 10,7 %

»

Glicina

6,5 -

■ 9,72%

»

Alanina

7,36-

■ 11,0 %

»

Valina

8,1 -

■ 12,1 %

»

Metionina

2,16 -

■ 3,24%

»

Isoleucina

5,6 -

■ 8,4 %

»

Leucina

9,84-

14,8 %

»

Lisina

11,04 -

16,6 %

»

Istidina

1,9).

23. Uso del prodotto ottenuto secondo la rivendicazione 11

per ottenere formulazioni di aminoacidi, caratterizzato dal fat to che la composizione media é:

Treonina

7,12-

10,68%

in

Serina

5,76-

8,64%

»

Prolina

8,0 -

12,0 %

»

Glicina

8,1 -

12,1 %

»

Alanina

8,72 -

13,1 %

»

Valina

9,36 -

14,04%

»

Metionina

( 1,5 -

1,7%

»

»

1,6).

22. Uso secondo la rivendicazione 15, caratterizzato dal fatto che si aggiungono altri aminoacidi e che la composizione media è:

Acido aspartico

2,3%

in peso

( 2,0-

2,5)

Treonina

4,7%

»

»

( 4,2-

5,2)

Serina

6,0%

»

»

( 5,4-

6,6)

Acido glutammico

10,3%

»

»

( 9,2-

11,4)

Prolina

15,6%

»

»

(14,0-

17,2)

Glicina

2,7 %

»

»

( 2,4-

3,0)

Alanina

4,9%

»

»

( 4,4-

5,4)

Valina

8,5%

»

»

( 7,6-

9,4)

Metionina

3,6%

»

»

( 3,2-

4,0)

Isoleucina

5,5%

»

»

( 4,9 -

6,1)

Leucina

11,2%

»

»

(10,0 -

12,3)

Tirosina

0,7%

»

»

( 0,6 -

0,8)

Fenilalanina

3,0%

»

»

( 2,7-

3,3)

Lisina

12,0%

»

»

(10,8 -

13,2)

Istidina

2,8%

»

»

( 2,5-

3,1)

Arginina

4,5%

»

»

( 4,0-

5,0)

Triptofano

( 1,3 -

1,5%

»

»

( 1,8-

2,3)

Treonina

4,4%

»

»

( 3,9-

4,9)

Serina

5,6%

»

»

( 5,0-

6,2)

Acido glutammico

9,6%

»

»

( 8,6-

10,6)

Prolina

14,6%

»

»

(13,1 -

16,1)

Glicina

2,5%

»

»

( 2,2-

2,8)

Alanina

4,6%

»

»

( 4,1 -

5,1)

Valina

7,9 %

»

»

( 7,1 -

8,7)

Metionina

5,0%

»

»

( 4,5 ■

• 5,5)

Isoleucina

5,1%

»

»

( 4,5-

5,6)

Leucina

10,5%

»

»

( 9,4 -

11,6)

Fenilalanina

5,0%

»

»

( 4,5-

5,5)

Lisina

11,3%

»

»

(10,1 -

12,5)

Istidina

2,6%

»

»

( 2,3-

2,9)

Arginina

7,5%

»

»

( 6,7-

8,2)

Triptofano

1,9).

19. Uso secondo la rivendicazione 15, caratterizzato dal fatto che si aggiungono altri aminoacidi e che la composizione media:

Treonina

5,8%

in peso

( 5,2-

6,4)

Serina

7,4%

»

»

( 6,6-

8,2)

Prolina

19,9%

»

»

(17,9 -

21,9)

Glicina

3,4%

»

»

( 3,0-

3,7)

Alanina

6,2%

»

»

( 5,5-

6,9)

Valina

9,7 %

»

»

( 8,7-

10,7)

Metionina

2,8%

»

»

( 2,5-

3,1)

Isoleucina

5,5%

»

»

( 4,9-

6,1)

Leucina

11,8%

»

»

(10,6 -

13,0)

Tirosina

0,7%

»

»

( 0,6-

0,8)

Fenilalanina

3,0%

»

»

( 2,7-

3,3)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

666 189

Triptofano 1,7% in peso ( 1,5- 1,9)

Lisina 15,3% » » (13,7 -16,9)

Istidina 2,1% » » ( 1,8 - 2,3)

Arginina 4,5% » » ( 4,0 - 5,0).

20. Uso secondo la rivendicazione 15, caratterizzato dal fatto che si aggiungono altri aminoacidi e che la composizione media è:

Acido aspartico

2,55% in peso

( 2,2-

2,8)

Treonina

5,26% » »

( 4,7 -

5,8)

Serina

6,72% » »

( 6,0-

7,4)

Acido glutammico

11,50% » »

(10,3

12,7)

Prolina

17,50% » »

(15,7

19,3)

Glicina

2,99% » »

( 2,6-

3,3)

Alanina

5,48% » »

( 4,9-

6,1)

Valina

9,49% » »

( 8,5-

10,5)

Metionina

3,01% » »

( 2,7-

3,3)

Isoleucina

6,11% » »

( 5,4-

6,7)

Leucina

12,55% » »

(11,2-

13,8)

Lisina

13,49% » »

(12,1

14,8)

Istidina

3,10% » »

( 2,7-

3,4)

Arginina

— » »

( o -

8,3)

21. Uso secondo la rivendicazione 15, caratterizzato dal fatto che si aggiungono altri aminoacidi e che la composizione media è:

Acido aspartico

2,1%

in peso

( 1,5-

1,7%

» »

( 1,9-

2,3)

Arginina

4,4%

» »

( 4,0-

4,8)

Triptofano

1,0)

18. Uso secondo la rivendicazione 15, caratterizzato dal fatto che si aggiungono altri aminoacidi e che la composizione media è:

Treonina

5,7%

in peso

( 5,1 -

6,3)

Serina

7,3%

» »

( 6,6-

8,0)

Prolina

19,6%

» »

(17,6 -

21,6)

Glicina

3,3%

» »

( 3,0-

3,6)

Alanina

6,1%

» »

( 5,5-

6,7)

Valina

9,6%

» »

( 8,6-

10,6)

Metionina

2,8%

» »

( 2,5-

3,1)

Isoleucina

5,4%

» »

( 4,9-

5,9)

Leucina

11,6%

» »

(10,4 -

12,8)

Fenilalanina

5,3%

» »

( 4,8 -

5,8)

Lisina

15,1%

» »

(13,6 -

16,6)

Istidina

2,1%

» »

1.5)

Lisina

15,5%

» »

(14,0 -

17,0)

Istidina

2,2 %

» »

( 2,0-

2,4)

Arginina

7,7%

» »

( 6,9-

8,5)

Triptofano

0,9%

» »

( 0,8-

( 1,3-

1,4%

» »

( 1,8 -

2,2)

Isoleucina

5,6%

» »

( 5,0-

6,2)

Leucina

11,9%

» »

(10,7 -

13,1)

Fenilalanina

1. Procedimento per l'eliminazione totale o parziale di acido aspartico e glutammico da idrolisati proteici o miscele di aminoacidi, caratterizzato dal fatto che una soluzione di aminoacidi è fatta assorbire su resina a scambio ionico di tipo anio-nico e successivamente eluita.

2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la soluzione di aminoacidi è sciolta in ambiente ammoniacale con valore di pH superiore a 7.

3. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-2, caratterizzato dal fatto che la resina a scambio ionico utilizzata per l'assorbimento è una resina di tipo anionico forte.

4. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-3, caratterizzato dal fatto che la soluzione eluente gli aminoacidi è costituita da una soluzione ammoniacale.

5. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-3, caratterizzato dal fatto che la soluzione eluente è costituita da un tampone ammoniaca-cloruro ammonico.

6. Procedimento secondo le rivendicazoni 1-3, caratterizzato dal fatto che la soluzione eluente è costituita da un tampone ammoniaca-acetato d'ammonio.

7. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l'eluizione avviene con acqua.

8. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-7, caratterizzato dal fatto che la soluzione eluita contenente gli aminoacidi è concentrata a sospensione mediante evaporazione della soluzione acquosa o a secco mediante spray-drier.

9. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-8, caratterizzato dal fatto che il materiale di partenza è costituito da una miscela di aminoacidi ottenuta per idrolisi, chimica e/o enzimatica, da proteine di origine naturale, animale o vegetale.

10. Procedimento secondo la rivendicazione 9, caratterizzato dal fatto che la proteina di origine naturale è caseina.

11. Procedimento secondo la rivendicazione 9, caratterizzato dal fatto che la proteina di origine naturale è: farina di pesce, farina di soja, farina di sangue, piume, gelatina, pelle bovina, torula, lana, residuo proteico da estratto epatico, albume, estratti d'organo, prodotti contenenti proteine derivati da isolamento o arricchimento della parte proteica per trattamenti di materiali di origine naturale sia animale che vegetale, come concentrati di proteine da patate, concentrati di proteine da glutine di granoturco, concentrati di proteine da siero di latte.

12. Procedimento secondo la rivendicazione 9, caratterizzato dal fatto che la proteina utilizzata è costituita da scarti di origine industriale e/o agricola con contenuto opportuno di proteine.

13. Procedimento secondo la rivendicazione 9, caratterizzato dal fatto che la miscela di aminoacidi proviene da fermentazioni industriali.

14. Uso del prodotto ottenuto secondo una delle rivendicazioni 1-13 per ottenere formulazioni di aminoacidi adatte all'impiego nella nutrizione clinica, caratterizzate dal fatto che si aggiungono altri aminoacidi.

15. Uso del prodotto ottenuto secondo la rivendicazione, 10 per ottenere formulazioni di aminoacidi caratterizzato dal fatto che la composizione media è:

Treonina

5,8-

7,1%

in

Serina

7,5-

9,1%

»

Prolina

20,1 -

24,5%

»

Glicina

3,4-

4,2%

»

Alanina

6,3-

7,7%

»

Valina

9,8-

12,0%

»

Metionina

2 -

2,4%

»

Isoleucina

5,6-

6,8%

»

Leucina

11,9 -

14,5%

»

Lisina

15,5 -

18,9%

»

Istidina

2,2 -

2,6%

»

16. Uso secondo la rivendicazione 15, caratterizzato dal fat to che la composizione media è:

Treonina

6,5%

in

Serina

8,3%

»

Prolina

22,3 %

»

Glicina

3,8%

»

Alanina

7,0%

»

Valina

10,9%

»

Metionina

2,2%

»

Isoleucina

6,2%

»

Leucina

13,2%

»

Lisina

17,2%

»

Istidina

2,4%

»

17. Uso secondo la rivendicazione 15, caratterizzato dal fatto che si aggiungono altri aminoacidi, e che la composizione media è:

Treonina

5,8%

in peso

( 5,2-

6,4)

Serina

7,5%

» »

( 6,7-

8,2)

Prolina

20,0%

» »

(18,0 -

22,0)

Glicina

3,4%

» »

( 3,1 -

3,7)

Alanina

6,3%

» »

( 5,7-

6,9)

Valina

9,8%

» »

( 8,8-

10,8)

Metionina

2,0%

» »

2,88%

»

Arginina

0 -

0,4 %

»