CH652743A5

CH652743A5 - Laminarstroemungsreaktor fuer reaktionen mit enzym oder kofaktoren, bei welchen das enzym bzw. der kofaktor auf einer matrix mit einer ebenen oberflaeche immobilisiert ist.

Info

Publication number: CH652743A5
Application number: CH3434/80A
Authority: CH
Inventors: Pietro Cremonesi
Original assignee: Italfarmaco Spa
Priority date: 1979-05-08
Filing date: 1980-05-02
Publication date: 1985-11-29
Also published as: NL8002658A; FI801413A; ATA228680A; ES491239A0; IT7922448A0; AT372974B; AU523433B2; DE3011334A1; FR2456138B1; JPS5722551B2; NO801248L; IT1113361B; ES8104398A1; US4292409A; GB2048711A; CA1141314A; AU5808080A; GB2048711B; BE883161A; DE3011334C2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf einen Laminarströmungsreaktor für Reaktionen mit Enzym oder Kofaktoren, bei welchem das Enzym bzw. der Kofaktor auf einer Matrix mit einer ebenen Oberfläche immobilisiert ist.

Bekanntlich weisen Enzyme eine sehr hohe Spezifität hinsichtlich der jeweiligen Substrate auf. Diese Spezifität ist die Basis für die Verwendung der Enzyme zur Herstellung sowie zu analytischen Zwecken auf einer Vielfalt von Gebieten, wie Verschmutzungsregelung, Nahrangsmittelerzeugung sowie klinische Chemie.

Die Beschränkungen in der Anwendbarkeit der Enzyme sind im wesentlichen durch zwei Faktoren bedingt:

a) Die relative Unstabilität des Enzyms in einer wässrigen Lösung und b) die Kosten dieser enzymatischen Reaktionen, die häufig sehr hoch sind und die wesentlich verringert werden können, wenn das Enzym in einer kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Weise wiederverwendet werden könnte.

Das allgemein bekannte Prinzip der Immobilisierung von Enzymen auf einer festen Matrix, das durch klinische Reaktion oder durch Adsorption überwindet die vorerwähnten Probleme weitgehend, da es die Wiedergewinnung der kata-lytischen Fähigkeit des Enzyms ermöglicht. Aus diesem Prinzip und in Anbetracht der Notwendigkeit der Wiedergewinnung der katalytischen Aktivität des Enzyms in kontinuierlicher Weise wurden drei Methoden entwickelt, die auf der Verwendung von Reaktoren mit kontinuierlicher Strömung beruhen, wobei die Enzyme immobilisiert sind, zur Herstellung sowie für analytische Zwecke. Die drei Methoden beruhen auf der Verwendung von

1) einer Säule, wobei das Enzym fest auf Perlen aus geeigneten Polymeren ist;

2) eines Rohres, bei welchem das Enzym fest an der Wand des Rohres ist, das aus geeignetem Material hergestellt ist;

3) einer Membran, bei welcher das Enzym fest auf einer geeigneten semipermeablen Membran oder innerhalb von zwei semipermeablen Membranen immobilisiert ist.

Ein gemeinsames Merkmal jeder Art von Strömungsreaktor ist der Kontakt zwischen dem Enzym, das immobilisiert ist, und dem Substrat und in manchen Fällen auch die Kofaktoren, welches Substrat in einer kontinuierlich strömenden Lösung aufgelöst ist.

Bei der Darstellung des Kontakts zwischen dem Substrat und dem Enzym in Form des Zeitaufwandes, wird dieser Zeitaufwand der Haupt- wenn nicht der einzige Faktor, der die biochemische Umwandlung des Substrats beeinflusst, auch als Ertrag der Substratumwandlung bezeichnet. Um hohe Substratumwandlungen zu erzielen, ist es bei einem Verfahren, welches häufig das Signal bestimmt, das bei der analytischen Bestimmung des Substrats selbst verwendet werden soll, vorteilhaft, dass die Kontaktperiode zwischen dem Enzym und dem Substrat so hoch wie möglich ist, solange es vereinbar ist mit 1) den Abmessungen sowie den Herstellungserfordernissen des Strömungsreaktors und 2) der Gesamtzeitperiode, die bei der Analyse aufgewendet wird, so dass die enzymatische Methode im Routinemassstab nützlich ist. Dies ist beabsichtigt, um einen solchen Umwandlungsvertrag zu erhalten, dass es möglich ist, eine Nachweisempfindlichkeit zu erzielen, die für analytische Zwecke nützlich ist.

Die kontinuierlichen Strömungsreaktoren, die ein dünnes Rohr verwenden, haben sich als wertvoll für die Anwendung zu analytischen Zwecken erwiesen trotz des Umstandes, dass sie wesentliche Schwierigkeiten bei der Immobilisierung des Enzyms an der Innenwand des Rohres aufweisen, welche Immobilisierung nur durch chemische Mittel erreicht werden kann und nicht durch Adsorption erzielt werden kann.

Ferner erfordert diese Art von Reaktorflüssigkeitvolumen, die nicht vernachlässigbar sind, mit einem beträchtlichen Verbrauch an Reagenzien.

Ferner wurden die Strömungsreaktoren, die mit Perlen bepackte Säulen aufweisen, verwendet, jedoch bestehen ernste Schwierigkeiten hinsichtlich der mechanischen Festigkeit in Abhängigkeit von der Strömung und ihrer Standardisierung bei einer kontinuierlichen Fahrweise.

Ferner sind die Herstellungskosten, obwohl sie von einem Modell zu einem anderen verschieden sind und von einem Enzym zu einem anderen veränderlich sind, im allgemeinen ziemlich hoch, besonders wenn der Umstand berücksichtigt wird-, dass die Lebensdauer des Reaktors von der Aktivitätsperiode des immobilisierten Enzyms abhängt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Laminarströmungsreaktor für Reaktionen mit Enzym oder Kofaktoren, bei welchem das Enzym bzw. der Kofaktor auf einer Matrix mit einer ebenen Oberfläche immobilisiert ist, zu schaffen, der sich vor allen Dingen durch kleines Reaktions-flüssigkeitsvolumen und geringe Herstellungskosten auszeichnet und bei dem auch eine Immobilisierung durch Adsorption möglich ist.

Erfindungsgemäss wird das mit einem Laminarströmungsreaktor der eingangs genannten Art erreicht, der gekennzeichnet ist durch zwei aneinander befestigte Halbblöcke, die an ihrer Berührungsseite ebene Oberflächen aufweisen,

wobei sich zwischen diesen oder zumindest auf einer der Oberflächen ein Kanal mit aufliegender Matrix befindet, die zusammen eine Reaktionskammer bilden.

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Der vorliegende Laminarströmungsreaktor hat folgende Vorteile:

1. Das Flüssigkeitsvolumen im Reaktor ist sehr klein;

2. der Reaktor ist sehr einfach im Aufbau und damit verhältnismässig billig herstellbar;

3. er ermöglicht die Verwendung von Enzymen, die leicht durch chemische Mittel auf festen Matrizen immobilisiert werden sowie die Verwendung von Enzymen, die einfacher auf festen Matrizen adsorbiert werden;

4. durch die Arbeitsweise mit einer laminaren Strömung, die flach statt zylindrisch ist, ergibt sich eine Zunahme im Kontakt zwischen dem Enzym und der Substratlösung und in manchen Fällen auch der Kofaktoren;

5. er ermöglicht die Verwendung von tragenden Matrizen, die hydrophob und in ihrer Art eiweissähnlich sein können;

6. er ermöglicht die Verwendung von Matrizen aus Filterpapier, wodurch ein Strömungsreaktor erhalten wird, dessen Eigenschaften denen von Reaktoren sehr ähnlich sind,

welche aus einer gepackten Säule bestehen, bei einer wesentlichen Verbesserung der Strömungseigenschaften;

7. es werden Diffusionserscheinungen, die in Reaktoren mit einer semipermeablen Membran während der enzymati-schen Reaktion auftreten, beseitigt, wie sie beispielsweise in Reaktoren üblich sind, die eine Membran in einer spiraligen Anordnung haben, oder in Reaktoren, bei welchen das Enzym zwischen zwei semipermeablen Membranen immobilisiert ist. Diese Diffusionsphänomene verursachen eine Wiedervermischung mit dem Ergebnis, so dass die eigentliche Konzentration des Substrats in der Reaktionskammer abnimmt und sich ferner die Rate der enzymatischen Reaktion verringert. Das endgültige Ergebnis ist eine Verminderung des Ertrages der Umwandlung und daher eine Abnahme der Intensität des Nachweissignals der enzymatischen Reaktion selbst;

8. die Möglichkeit, dass sich die Materialien wiedervermischen, nachdem die enzymatische Reaktion eingetreten ist, wird auf ein sehr geringes Mass herabgesetzt; dieses erneute Vermischen verursacht eine wesentliche Herabsetzung in der Empfindlichkeit, da es die Konzentration des Produkts der enzymatischen Reaktion verringert, was eine Herabsetzung in der Intensität des Nachweissignales zur Folge hat;

Alle diese Vorteile werden ohne Verlust der Vorteile anderer Arten von Reaktoren, die gewöhnlich verwendet werden, erzielt, da das einfache Auswechseln der Matrix mit dem auf ihr immobilisierten Enzym statt das Auswechseln des ganzen Reaktors die Betriebsfähigkeit des Reaktors wiederherstellt. Der erfindungsgemässe Reaktor ermöglicht das Kombinieren der Einfachheit der Methoden zum Immobilisieren des Enzyms auf einer Fläche, die in stabiler Weise mit Hilfe von kovalenten Bindungen oder einfacher durch Adsorption geschehen kann, wobei eine laminare Strömung auf der Fläche erhalten wird, auf welcher das Enzym immobilisiert ist, welche laminare Strömung flach ist und eine Mindestdicke hat, so dass die Möglichkeit der Wiedervermischung, die bei Membranreaktoren typisch ist, nicht eintritt. Es wird ein maximaler Kontaktwirkungsgrad zwischen den beiden physikalischen Phasen erzielt und daher eine optimale katalytische Wirkung trotz einer kürzeren Kontaktzeit erhalten. Diese Ergebnisse werden erreicht, wenn man die Lösung einer Bewegung folgen lässt, welche mit Bezug auf die Fläche tangential sein muss, die gleichmässig und längs irgendeiner Laufbahn ist, mit dem Ziel, Kontakt zwischen dem Fluid mit der maximalen Menge der tragenden Fläche von der gleichen enzymatischen Aktivität herbeizuführen.

Bei dem erfindungsgemässen Reaktor wird diese Bewegung durch einen dünnen Kanal von beliebiger Form auf einer der Flächen eines Halbblockes einer Strömungszelle mit zwei entgegengesetzten Flächen erzielt, der aus einem chemisch inerten Material hergestellt ist, beispielsweise aus Tetrafluoräthylen, Polyvinylchlorid, Polyäthylen, Polyamid, rostbeständiger Stahl unterscheiden, während der andere Halbblock das immobilisierte Enzym trägt.

Wahlweise kann der erwähnte dünne Kanal in beiden Hohlblöcken vorgesehen werden. Dieser Kanal kann erhalten werden entweder direkt mit Hilfe eines Einschnitts an der Oberfläche eines der Blöcke oder beider Blöcke des Reaktors oder indirekt, beispielsweise unter Verwendung einer Lamelle oder eines Drahtes aus rostbeständigem Stahl oder Tetrafluorpolyäthylen oder aus einem anderen inerten Material, auf welchem oder mittels welchem der Strömungsweg erhalten wird, welcher Kanal zwischen den beiden Halbblöcken der Zelle mit einer ebenen Fläche eingesetzt ist.

Ein wesentliches Erfordernis besteht darin, dass die Wände zwischen den beiden Kanälen dünn und schmäler als die maximalen Abmessungen des Strömungskanals sein müssen. Abgesehen von diesem Erfordernis befindet sich im wesentlichen die ganze Menge des auf der festen Matrix mit einer ebenen Fläche aufgelagerten Enzyms in Kontakt mit der Lösung des Substrats und befindet sich daher in einem Zustand, der zur Ausführung katalytischer Aktivität geeignet ist.

Der Eintritt und der Auslass der umlaufenden Lösung kann an irgendwelchen zwei Stellen jedes der beiden Halbblöcke vorgesehen werden, unabhängig von der Umlaufrich-tung der Lösung. Auf diese Weise wird der Reaktor im wesentlichen durch einen dünnen Kanal von verschiedenen Formen gebildet.

Vorausgesetzt, dass die laminare Strömung so dünn wie möglich ist, ist die enzymatische Aktivität ausreichend, um eine gute Umwandlungsrate des Substrats zu dem Produkt zu erhalten, wobei eine Verringerung der Kontaktflächen sowie der Volumen, die verwendet werden müssen, erreicht wird.

Wenn es vorteilhaft zu sein scheint, das gleiche Substrat einer Reihe von zwei oder mehr aufeinanderfolgenden Reaktionen zu unterziehen, ist es möglich, den erfindungsgemässen Reaktor in der Form eines Modulreaktors zu bauen, der zwei oder mehr erfindungsgemässe Reaktionskammern von der vorangehend beschriebenen Art enthält, die voneinander durch Halbblöcke von geeigneter Form getrennt sind und miteinander durch Öffnungen von einer solchen Form verbunden sind, dass die das Substrat enthaltende Lösung aufeinanderfolgend durch die gleichen Kammern hindurchtreten kann.

Zur Erläuterung der Erfindung wird nachfolgend ein Beispiel eines Strömungsreaktors mit dem immobilisierten Enzym auf festen Matrizen, die eine ebene Fläche aufweisen, beschrieben. Zwei Beispiele betreffen die Anwendung des gleichen Reaktors. In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung eines Strömungsmikroreaktors im Querschnitt;

Fig. 2 eine Draufsicht des Halbblockes Hl von Fig. 1;

Fig. 3 eine Draufsicht des Halbblockes H2;

Fig. 4 in schematischer Darstellung den in Beispiel 1 beschriebenen Strömungsmikroreaktor in freier Anordnung auf dem Gerät.

Fig. 5 und 6 die registrierten Signale des Geräts nach Fig. 4.

Beispiel 1

Bauform und Zusammenbau eines Strömungsmikroreaktors

In Fig. 1 bezeichnet der Buchstabe Hl einen der Halbblöcke, der beispielsweise aus einem Kunststoff, wie aus dem

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unter dem Namen Sicodur im Handel erhältlichen Material hergestellt ist. Auf diesem Halbblock wird ein dünner kontinuierlicher Kanal 1 durch einen Einschnitt erhalten, der in diesem besonderen Fall die Form einer Spirale hat. In diesem Fall hat der Kanal 1 einen dreieckigen Querschnitt mit einer maximalen Tiefe von 0,5 mm, einer Basis von 1 mm, einer Länge von 180 mm und einem Volumen von 45 Mikroliter.

Das Enzym wird auf einer festen Matrix 2 mit einer ebenen Fläche in Form einer Folie oder eines Films, bei dem vorliegenden besonderen Beispiel aus Filterpapier immobilisiert. Hierbei ist jedoch zu erwähnen, dass irgendein anderes Material, sowohl hydrophob als auch hydrophil, in Form einer Folie, eines Films oder einer Membran verwendet werden kann. Die Folie oder der Film wird mit dem Halbblock H2 haftend angebracht, der so ausgebildet ist, dass die Cellulose-matrix gegen die Spiralen des Haiblocks Hl gepresst werden. Bei dem in der Figur dargestellten besonderen Beispiel sind die beiden Halbblöcke Hl und H2 mit Hilfe von Befestigungsschrauben S hermetisch geschlossen.

Die Mittel für den Einlass und den Auslass der Lösung sind in dem gleichen Halbblock Hl mit Hilfe von Öffnungen 4,5 von geeigneten Abmessungen vorgesehen, beispielsweise 0,2 mm Durchmesser, die in Fig. 1 mit den Buchstaben C und D bezeichnet sind und die Aufgabe haben, das Auftreten einer Wiedervermischung zu vermeiden. Fittings aus geeignetem Material, beispielsweise aus einem Polyamid oder aus Tetrafluorpolyäthylen oder Stahl sind an diesen Öffnungen 4,5 angeordnet, welche einen analogen Durchmesser von 0,2 mm haben. Die Fittings sind jeweils mit einem System für das Einleiten des Fluids sowie mit einem System für den Nachweis des Signals der enzymatischen Reaktion verbunden. Bei dem besonderen Beispiel wird ein spektroskopischer Detektor verwendet, es ist jedoch auch möglich, elektrochemische oder spektrofluorimetrische oder andere Detektoren zu verwenden.

Wie in Fig. 2 gezeigt, ist der Halbblock Hl nach Fig. 1 mit Öffnungen 4 und 5 für den Einlass bzw. Auslass vorgesehen.

In dem bei diesem Beispiel dargestellten Reaktor beträgt der Prozentsatz der aktiven Fläche des Enzyms, die mit der Lösung in Kontakt kommt, mit Bezug auf die Gesamtmenge der Lösung 90%.

Bei diesem Apparat wird das Enzym immobilisiert, jedoch ist es leicht, ein Enzym durch ein anderes Enzym zu ersetzen, entweder weil das erste Enzym verbraucht ist oder weil mit einem Enzym gearbeitet werden soll, das eine andere Aktivität hat. Das Ersetzen lässt sich einfach dadurch ausführen, dass die Matrix ersetzt wird, während der ganze Reaktor wiederverwendet wird. Dies stellt einen wesentlichen Unterschied zwischen dem erfmdungsgemässen Reaktor und anderen Strömungsreaktoren mit enzymatischer Aktivität dar, die ein vollständiges Ersetzen erfordern, wenn die enzymatische Aktivität wesentlich verringert ist.

Beispiel 2

Anwendung des Mikroreaktors mit einer diskontinuierlichen Einleitung des Substrats

Der in Beispiel 1 beschriebene Strömungsmikroreaktor R ist in Ausfluchtung in dem ganzen in Fig. 4 schematisch gezeigten Apparat angeordnet. Der Buchstabe A bezeichnet eine Pumpe mit veränderlicher Förderung. Der Buchstabe B bezeichnet den Behälter der Pufferlösung. Der Buchstabe C ist ein Injektor mit einer Trennwand, während der Buchstabe R den Strömungsreaktor bezeichnet. Der spektrophotome-trische Detektor ist mit D bezeichnet, während der Buchstabe E ein System zum Registrieren des vom Detektor D abgegebenen Signals bezeichnet.

Im tatsächlichen Betrieb wird eine geeignete Pufferlösung, beispielsweise mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,25 ml/min., durch den Reaktor zum Fliessen gebracht, in welchem ein Film oder eine Rolle oder eine Membran von enzymatischer Aktivität, beispielsweise Peroxydase, angeordnet ist. Das Enzym wird durch kovalente Bindungen immobilisiert oder kann auf der Matrix adsorbiert werden.

Sobald Bedingungen konstanter Strömung erreicht sind, wird eine geeignete Menge der Substratlösung in die Strömung mittels des Injektors eingespritzt, der eine mit C bezeichnete Trennwand C besitzt. Während der Wanderung mit einer laminaren Strömung durch den Innenkanal, der im Reaktor ausgebildet ist, wird das Substrat unter der Wirkung des Enzyms umgewandelt. Diese Umwandlung verursacht im Nachweissystem bzw. Detektor D eine Veränderung des Signals, die in E registriert wird.

Wie in Fig. 5 gezeigt, sind die registrierten Signale proportional der Menge des eingeleiteten Substrats.

Beispiel 3

Anwendung des Mikroreaktors auf eine kontinuierliche Einleitung des Substrats, d.h. «stationär»

Das vorangehend beschriebene Beispiel 2 betrifft eine Anwendung des Strömungsreaktors auf den Fall, bei welchem es sich um geringe Mengen Substrat handelt. Wenn Lösungen mit einer niedrigen Substratkonzentration analysiert werden sollen, ist es möglich, den gleichen Apparat für das Substrat in einer kontinuierlichen Weise mit Hilfe eines geeigneten Sechswegeventils, beispielsweise vom Schleifentyp, zu verwenden, welches Ventil mit der Substratlösung beschickt wird, die der enzymatischen Reaktion unterzogen werden soll.

Die gleiche in Fig. 4 dargestellte Anordnung wird mit der einzigen Abänderung verwendet, dass das Einspritzsystem mit einem Septum, bezeichnet mit dem Buchstaben C, durch ein Einspritzsystem mit einem Ventil ersetzt ist. Unter den Bedingungen konstanter Strömung wird eine geeignete Menge der Lösung des Substrats mit Hilfe des Ventils eingeleitet, so dass das Substrat die enzymatische Reaktion unter Bedingungen stationären Zustandes erfährt. Die enzymatische Reaktion erzeugt in dem Nachweissystem D eine Veränderung des Signals, das bei E registriert wird. Wie in Fig. 6 gezeigt, ist das registrierte Signal proportional der Nähe des in der strömenden Lösung vorhandenen Substrats.

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2 Blatt Zeichnungen

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PATENTANSPRÜCHE

1. Laminarströmungsreaktor für Reaktionen mit Enzym oder Kofaktoren, bei welchem das Enzym bzw. der Kofaktor auf einer Matrix mit einer ebenen Oberfläche immobilisiert ist, gekennzeichnet durch zwei aneinander befestigte Halbblöcke (Hl, H2), die an ihrer Berührungsseite ebene Oberflächen aufweisen, wobei sich zwischen diesen oder zumindest auf einer der Oberflächen ein Kanal (1) mit aufliegender Matrix (2) befindet, die zusammen eine Reaktionskammer bilden.
2. Reaktor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Kanal (1) durch einen Einschnitt auf der Fläche eines der Halbblöcke (Hl oder H2) geformt worden ist.
3. Reaktor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Kanal durch einen die Kanalwandung bildenden Draht oder Faden oder eine Lamelle aus chemisch inertem Material mit einer Dicke zwischen 0,1 und 2 mm gestaltet ist.
4. Reaktor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Kanal (1) in beiden Halbblöcken (Hl und H2) vorgesehen ist.
5. Reaktor nach Ansprach 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Kanal (1) in Form einer Spirale ausgebildet ist.
6. Reaktor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Öffnungen (4,5) in mindestens einem der Halbblöcke (Hl, H2) vorgesehen sind, welche den Einlass bzw. Auslass der Reaktionslösung bilden.
7. Reaktor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die tragende Matrix (1) des Enzyms oder Kofaktors die Form eines Films oder einer Folie oder einer Membran hat.
8. Reaktor nach Ansprach 1, dadurch gekennzeichnet, dass die das Enzym tragende Matrix oder das Substrat aus Papier hergestellt ist.