NO801248L - Reaktor for enzymatiske reaksjoner. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører én reaktor egnet for ut-førelse av enzymatiske reaksjoner. Mere spesielt vedrører oppfinnelsen en strømningsreaktor i hvilken enzymene som anvendes immobiliseres på en fast matrise med en plan overflate.

Det er velkjent at enzymer utviser meget høy spesifisitet med hensyn til de respektive substrater. Denne spesifisitet danner basis for anvendelse av enzymer for produksjon så vel som for analytiske formål innen forskjellige felter så som forurensningskontroll, fremstilling av matvarer så vel som innen den kliniske kjemi.

Anvendelse, av enzymer begrenses i det vesentlige av to faktorer: a) Den relative ustabilitet av enzymene, i en vandig opp-løsning, og b) omkostningene ved disse enzymatiske reaksjoner som ofte er meget høye og som kunne reduseres vesentlig hvis enzymene kunne anvendes på nytt på en kontinuerlig eller diskontinuerlig måte. Det velkjente prinsipp med hensyn til immobilisering av enzymer på en fast matrise, hvilket kan oppnås ved en kjemisk reaksjon eller adsorpsjon minimaliserer de ovenfor nevnte problemer for det muliggjør gjenvinning av enzymenes katalytiske aktivitet. Fra. dette prinsipp og i lys av nødvendigheten av å gjenvinne den katalytiske aktivitet for enzymene på kontinuerlig måte er tre metoder utviklet. Disse.metoder er basert på anvendelse av kontinuerlige strømningsreaktprer hvor enzymene immobiliseres for fremstillig så vel som for analytiske formål. Disse tre.metoder er basert på anvendelse av : 1) En kolonne hvori enzymene fikseres på perler av egnede polymerer, 2) Et rør hvor enzymene fikseres på veggen i røret, som er -j fremstilt av et egnet materiale, 3) en membran hvor enzymene er fiksert på en semipermeabel. membran eller er immobilisert mellom to semipermeable membraner.

Et felles trekk for hver type strømningsreaktor er kontakten mellom enzymet som er immobilisert og substratet, samt også i visse tilfeller kofaktorer og hvor substratet er oppløst i en kontinuerlig strømmende oppløsning.

Hvis man representerer kontakten mellom substratet og enzymet med hensyn .til kontakttid så vil denne tidslengde være den alt vesentlige, hvis ikke den eneste faktor som.influ-erer på den biokjemiske omdannelse av substratet, også betegnet utbytte av substratomdannelse. For å oppnå en høy substratomdannelse, en prosess som ofte bestemmer det signal som skal anvendes i den analytiske bestemmelse av selve substratet, er det fordelaktig at kontakttiden mellom enzymet og substratet er lengst mulig, i den grad det er foren-lig med 1) dimensjonsegenskapene så vel som fremstillings-behovene for strømningsreaktoren og 2) den totale tidsperi-ode for analysen slik at den enzymatiske metode kan utnytt-es rutinemessig. Det er hensikten å oppnå et slikt omdannelsesutbytte at det er mulig å oppnå en påvisningsfølsomhet som er nyttig ved analytiske anvendeler.

De kontinuerlige strømningsreaktorer hvori anvendes et

tynt rør. er funnet å være avnytte ved analytiske formål,

til tross for det faktum at det byr på vesentlige vanskeligheter med hensyn til å immobilisere enzymet på den indre vegg av røret, denne immobilisering kan kun oppnås ad kjemisk veg og kan ikke oppnås ved adsorpsjon. Ytterligere for denne type reaktorer er de involverte væskevol-umer ikke ubetydelige og med et betydelig forbruk av rea-genser.

Selv om strømningsreaktorer forsynt med kolonner pakket i med perler har vært anvendt så representerer de betydelige vanskeligheter med hensyn til mekanisk strømningsresistens i tillegg til problemene vedrørende standardisering av strømmen når de anvendes på en kontinuerlig måte.

Ytterligere vil produksjonsomkostningene, selv om disse åpenbart varierer fra modell til modell og varierer fra et enzym til et annet enzym, generelt være ganske høye, spesielt hvis man tar hensyn til det faktum at reaktorens liv er avhengig av aktivitetsperioden. for enzymet som immobiliseres..

Ved hjelp av foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt en ny reaktortype for å utføre enzymatiske reaksjoner med enzymer som er immobilisert på en matrise med en plan over- . flate og ved hjelp av reaktoren unngås de ovenfor nevnte ulemper, idet reaktoren frembyr de følgende fordeler: 1) Anvendelse av enzymer som lett immobiliseres ad kjemisk veg på en fast matrise så vel som anvendelse av enzymer som enklere kan adsorberes på en fast matrise, 2) Anvendelse av reaksjonsvolumer som totalt sett er små, 3) Laminær strømningspperasjon hvor kontaktflaten er flat i stedet for sylindrisk med derav følgende forøkt kontakt mellom enzymet og substratoppløsningen og i visse tilfeller også kofaktorene, 4) Anvendelse av bærende matriser som kan være hydrofobe så vel som av proteinaktig natur, 5) Anvendelse av matriser av typen filterpapir som tillater at det oppnås en strømningsreaktor med egenskaper meget lik egenskapene for reaktorer bestående av en pakket kolonne, samt med forbedrede strømningsegenskaper, 6) Eliminering av diffusjonsfenomenet under den enzymatiske reaksjon hvilket kan finne sted i reaktorer forsynt med' en semipermeabel membran, slike fenomen er felles eksempelvis for reaktorer som er forsynt med en spiralan-ordnet membran eller i i reaktorer hvor enzymet er immobilisert mellom to semipermeable membraner. Disse diffusjonsfenomener forårsaker en fornyet blanding hvilket resulterer i at den aktuelle konsentrasjon av substratet i reaksjonskammeret avtar samt også at den enzymatiske reaksjonshastighet avtar. Det endelige resul-tat er et nedsatt omdannelsesutbytte og derfor en nedsettelse av intensiteten.av påvisningssignalet for selve den enzymatiske reaksjon, 7) Mulighetén for at materialene blandes på nytt etter at den enzymatiske reaksjon har funnet sted nedsettes' til et minimum. Denne gjenblanding forårsaker en betydelig nedsettelse av følsomheten fordi den nedsetter konsen-trasjonen av produktet av den.enzymatiske reaksjon hvilket fører til nedsettelse av intensiteten av påvisningssignalet, 8) Lett fremstilling som er ennå mer signifikant hvis man tar hensyn til de betydelige vanskeligheter forbundet med de andre apparater og da særlig mémbranreaktorer,

og

9) Betydelig reduksjon av produksjonsomkostningene.

Alle disse fordeler oppnås uten tap av fordelene til de andre reaktortyper som vanligvis anvendes fordi kun en enkel erstatning av matrisen hvorpå er immobilisert enzymet vil gjenopprette driften av reaktoren, i stedet for å erstatte hele reaktoren som ellers er vanlig. Reaktoren i henhold til oppfinnelsen gjør det mulig å kombinere de enkle metoder for immobilisering av enzymet på en overflate, hvilket kan oppnås på en stabil måte ved hjelp av kovalente bindinger eller mere enkelt ved adsorpsjon med oppnåelse av en laminær strøm på overflaten hvorpå enzymet er immobilisert, hvilken laminær strøm er flat og representerer en minimal tykkelse slik at muligheten for gjenblanding, som ér typisk j ,for membranreaktorer, ikke finner sted. Maksimal kontakt-effektivitet mellom de to fysiske faser oppnås og derfor oppnås optimal katalytisk effekt til tross for en kortere kontakttid. Disse resultater oppnås ved å la oppløsningen følge, en bevegelse som må være tangential i forhold til overflaten og som er jevn langs enhver bane, i den hensikt å oppnå kontakt mellom væsken med det maksimale areal av den . bærende overflate med den samme enzymatiske aktivitet.

I reaktoren i henhold til foreliggende oppfinnelse oppnås denne bevegelse ved hjelp av en tynn kanal av en hvilken som helst form på en av flatene av en semi-blokk av en strømningscelle med to motsatte flater, fremstilt av et inert materiale så som tetrafluorpolyetylen, polyvinyl-klorid, polyetylen, polyamid, rustfritt stål, etc. mens den andre halvblokk bærer det immobiliserte enzym.

Alternativt kan denne tynne kanal som nevnt ovenfor være innebygget i begge halvblokkene.„ Denne kanal.kan oppnås enten direkte ved hjelp av et innsnitt i overflaten på den ene eller begge blokker av reaktoren eller indirekte eksempelvis ved å utnytte en lamelle eller et filament som kan være av rustfritt stål eller tetrafluorpolyetylen eller annet inert materiale på hvilken eller ved hjelp av strøm-ningsbanen erholdes, hvilken kanal innføres mellom de to halvblokker i cellen som er forsynt med en plan overflate.

Et vesentlig krav er at veggene mellom de to kanaler må være tynne og mindre enn de maksimale dimensjoner av strømnings-kanalen. Bortsett fra dette krav vil i det vesentlige hele mengden av enzymer båret på en faste matrisen med en plan overflate være i kontakt med substratoppløsningen og vil derfor være i en tilstand egnet for utøvelse av katalytisk aktivitet.

Innføringen og utføringen av. den sirkulerende oppløsning

kan være plassert på et hvilket som helst av to punkter i hver av de to halvblokker, uavhengig av strømningsretningen for den sirkulerende oppløsning. På denne måte kan reaktoren ,

i det vesentlige bestå av en tynn kanal med varierende former.!-

Forutsatt at den laminære strøm er så tynn som mulig vil den enzymatiske aktivitet være tilstrekkelig til å oppnå en god omdannelseshastighet for substratet til produktet, med derav følgende mulighet for å nedsette kontaktoverflaten så vel som de anvendte volumer.

Hvis det viser seg å være fordelaktig å utsette det.samme substrat for en serie av to eller flere på hverandre følgende reaksjoner er det mulig å bygge reaktorer i henhold til foreliggende oppfinnelse i form av en modulreaktor inneholdende to eller flere reaksjonskamre, i henhold til oppfinnelsen som ovenfor beskrevet, adskilt fra hverandre ved hjelp av halvblokker av egnet form og forbundet med hverandre ved hjelp av åpninger av en slik form at oppløsningen inneholdende substratet i rekkefølge kan passere de samme kamre.

For å illustrere foreliggende oppfinnelse skal i det etter-følgende beskrives et eksempel på en mikrostrømningsreaktor hvor enzymet er immobilisert på en fast matrise med plan overflate samt omtales to anvendelser av den samme reaktor. Oppfinnelsen skal ytterligere illustreres under henvisning til de vedlagte tegninger, hvor: Fig. 1 er et skjematisk tverrsnitt av en strømningsmikro-reaktor,

Fig. 2 er et grunnriss av halvblokk A i fig. 1,

Fig. 3 er et grunnriss av halvblokk B,

Fig. 4 viser skjematisk strømningsmlkroreaktoren beskrevet i eksempel 1 når denne er innmontret i apparatet.

EKSEMPEL 1

Konstruksjon og sammensetning av en strømningsmikroreaktor.

Under henvisning til fig. 1 så angir bokstaven A en av halv-blokkéne som eksempelvis er fremstilt av et plastmateriale, så som materiale som er kommersielt tilgjengelig under navnet "Sicodur". I denne halvblokk er en tynn kontinuerlig kanal oppnådd ved en innstikning som i dette spesielle tilfellet har spiralform. I dette tilfellet har"kanalen et triangu-lært tverrsnitt med en maksimal dybde på 0,5 mm med en grunn-linje på 1 mm og en lengde på 100 mm og et volum på 4 5 ul.

Enzymet er immobilisert på en fast matrise M med plan overflate i form av et ark eller en film, eksempelvis et filtrer-papir. Det bør bemerkes at et hvilket , som helst annet materiale, både hydrofobe og hydroflle, i form av et ark eller en film eller en membran kan anvendes. Arket eller filmen bringes til vedheftning til halvblokk B som er slik konstru-ert at cellulosematrisén presses mot spiralene i halvblokk A. I det spesielle viste eksempel i figuren blir de to halvblokker hermetisk .lukket ved hjelp av festeskruer S.

Midler for innføring og utføring av oppløsningen er anordnet i den samme halvblokk A ved hjelp av åpninger med passende dimensjoner, eksempelvis med en diameter på 0,2 mm som er betegnet med henholdsvis bokstavene C og D i fig. 1 for å. unngå at det oppstår fornyet blanding.. Rørtilkoplinger av et egnet materiale, eksempelvis et polyamid eller tetrafluorpolyetylen eller stål er montert på disse åpninger som også har en diameter på ca. 0,2 mm. Rørtilkoplingene er henholdsvis forbundet med et system for innføring av væsken qg også et system for påvisning av signaler fra den enzymatiske reaksjon. , I det spesifikke eksempel er en spektro-skopisk detektor anvendt mén det er også mulig å anvende elektrokjemiske eller spektrofluorometriske detektorer eller andre.

Som vist i fig. 2 er halvblokken A ifølge fig. 1 forsynt med åpningene C og D for henholdsvis innløpet og utløpet.

i

I

I reaktoren som er vist i dette eksempel er prosentandelen av den aktive overflate av enzymet som kommer i kontakt med oppløsningen i forhold til den totale mengden av oppløsning 90%.

Med dette apparat er enzymet, immobilisert, men det er lett

å erstatte et enzym med et annet enzym, enten fordi det første enzym er utarmet eller fordi det er ønsket å arbeide med et enzym med en annen aktivitet. Erstatningen kan enkelt utføres ved å erstatte matrisen mens hele reaktoren anvendes på nytt. Dette utgjør en betydelig forskjell mellom reaktoren i henhold til foreliggende oppfinnelse og andre reaktorer med enzymatisk aktivitet hvor hele reaktoren må erstattes når den enzymatiske aktivitet har avtatt.

EKSEMPEL- 2

Anvendelse av mikroreaktoren med diskontinuerlig innføring a v substratet.

Strømningsreaktoren beskrevet i eksempel 1 monteres opp forbundet med hele apparaturen som skjematisk er vist i fig. 4. Bokstaven A angir en pumpe med variabel kapasitet. Bokstaven B angir et reservoar av en pufferoppløsning. Bokstaven C

er en injektor med en skillevegg og bokstaven R angir strøm-ningsreaktoren. Detektoren er av spektrofotometrisk type og er betegnet med bokstaven D og bokstaven E angir, et system for å registrere signalet som avgives at detektoren D.

Ved drift bringes en egnet pufferoppløsning til å strømme, eksempelvis med en strømningshastighet på 0,2 5 ml/min. gjennom reaktoren i hvilken er montert en film eller et ark eller en membran med enzymatisk aktivitet, eksempelvis peroksidase. Dette enzym er immobilisert ved hjelp av kovalente bindinger eller kan være adsorbert på matrisen.

Straks betingelsene for konstant strømning er oppnådd inji-seres en passende mengde av substratoppløsningen i strømmen ved hjelp av injektorén forsynt med en skillevegg og betegnet med bokstaven C. Når substratet beveges i laminær strøm gjennom den tynne kanal som er anordnet i reaktoren vil sub- stråtet omdannes under påvirkning av enzymet. ' Denne omdannelse forårsaker i påvisningssystemet D en variasjon i signalet som registreres i E.

Som vist i fig. 5 er de registrerte signaler proporsjonale med'mengden av innført substrat.

EKSEMPEL 3

Anvendelse av mikroreaktoren ved en kontinuerlig innføring av substratet, d. v. s. under " steady state"- betingelser..

I eksempel 2 overfor er beskrevet, anvendelse av strømnings-reaktoren i det tilfellet hvor en liten substratmengde er involvert. Når det er nødvendig å analysere oppløsninger med en lav konsentrasjon av substrater er. det mulig å anvende apparatet på en kontinuerlig måte ved hjelp av en seksvegsventil, f.eks. av løkketypen, hvilken ventil til-føres substratoppløsningen som skal underkastes en enzymatisk reaksjon.

Den samme oppkopling som vist i fig. 4 anvendes med den ene forandring at injeksjonssystemet med en skillevegg og betegnet med C erstattes med et injeksjonssystem med en ventil. Under konstante strømningsbetingelser innføres en passende mengde av substratoppløsningen ved hjelp av ventilen og substratet underkastes den enzymatiske reaksjon under stasjon-ære betingelser. Den enzymatiske reaksjon forårsaker i påvisningssystemet D en variasjon i signalet, hvilket registreres på E..Som det fremgår av fig. 6 er det registrerte signal proporsjonalt med mengden av substratet som er til-stede i den strømmende oppløsning.

Claims (10)

1. Laminær strømningsreaktor for reaksjoner med enzymer eller kofaktorer hvori enzymet eller kofaktoren er immobilisert, karakterisert ved en matrise med plan overflate anordnet i en celle omfattende to halvblokker forsynt med en plan overflate, idet en av halvblokkene er forsynt med en kanal som utgjør reaksjonskammeret med en laminær strø mning, hvilke to halvblokker er hermetisk forenet.

2. Reaktor ifølge krav 1, karakterisert ved. at reaksjonskammeret er formet ved utsparing av en tynn kanal i den ene flate av halvblokkene og den andre halvblokk tjener til å lukke reaksjonskammeret.

3. Reaktor ifølge krav 1, karakterisert ved at reaksjonskammeret er utformet som en. kontinuerlig kanal oppnådd ved innføring av en lamelle eller et filament av et kjemisk inert materiale med en tykkelse på .0,1 - 2 ,mm for å danne kanalens vegger og lukking av reaktorkammeret skjer under trykk og tilveiebringes av to halvblokker med plane overflater som presser mot lamellen som danner den tynne .kanal.

4. Reaktor ifølge krav 1, . karakterisert ved at banen som tilveiebringer den laminære strøm har forskjellige former og som tillater maksimal kontaktover-flate.

5. Reaktor ifølge krav 4, karakterisert ved at substratoppløsningen beveges langs banen og at banen har spiralform.

6. Reaktor ifølge krav 1, karakterisert ved at det er anordnet åpninger i minst en av halvblokkene, hvilke åpninger utgjør henholdsvis innløp og ut-løp for reaksjonsoppløsningen. i i

7. Reaktor ifølge krav 1, karakterisert v ed at enzymet eller kofaktoren er immobilisert på en fast matrise med plan overflate og at midler er anordnet for å erstatte denne matrise med en annen matrise.

8. Reaktor ifølge krav 7, karakterisert ved at bærematrisen for enzymet eller kofaktoren har form av en film, et ark eller en membran.

9. Reaktor ifølge krav 1, karakterisert v e d at matrisen som bærer enzymet eller substratet er fremstilt av papir.

10. Reaktor ifølge krav 1, kar a <*> k terisert ved at kanalen er anordnet i begge halvblokker.