CH640567A5

CH640567A5 - Procedimento per la produzione di una biomassa microbica.

Info

Publication number: CH640567A5
Application number: CH1027378A
Authority: CH
Inventors: Pasquale Zaffaroni; Antonio Senni; Lamberto Formiconi
Original assignee: Anic Spa
Priority date: 1977-10-05
Filing date: 1978-10-03
Publication date: 1984-01-13
Also published as: CA1108073A; LU80325A1; DE2843567C2; JPS5467086A; NL7810071A; US4317884A; BE871048A; DE2843567A1; FR2405296B1; FR2405296A1; GB2005301A; GB2005301B

Description

640567

RIVENDICAZIONE Procedimento per la produzione di una biomassa microbica consistente nell'inoculare un terreno colturale contenente etanolo come fonte di carbonio e di energia con il ceppo di lievito del genere Candida valida designato' dal numero di deposito ufficiale NRR-Y 11119.

La presente invenzione ha per oggetto un1 procedimento per la produzione di una biomassa microbica mediante colL tivazione di un lievito capace di utilizzare etanolo come unica fonte di carbonio e di energia, con elevata efficienza e ad alta temperatura.

A causa dell'elevata velocità di riproduzione dei microorganismi ed il loro elevato contenuto in proteine, la produzione di biomasse microbiche è un. metodo assai rapido per la produzione di proteine.

Per la produzione di biomasse sono stati utilizzati nel passato dei carboidrati di scarto come melassi di zuccherifici o liscive solfitiche di cartiera.

In tempi più recenti, in base alle notevoli disponibilità ed al basso prezzo del petrolio, sono stati messi a punto dei processi di produzione di biomasse, usando come substrato sia frazioni grezze del petrolio che miscele di n-paraffine altamente purificate.

L'uso di questi substrati petroliferi presenta alcuni svantaggi di ordine tecnologico dovuti alla loro insolubilità in acqua, alla grande quantità di ossigeno necessaria per la loro assimilazione da parte dei microorganismi, ed alla grande quantità di calore svolto durante la fermentazione.

Inoltre i costi di produzione della biomassa sono aggravati dalla necessità di purificare a fondo il substrato e/o di lavare accuratamente la biomassa prodotta per allontanare i componenti del petrolio potenzialmente pericolosi.

Queste difficoltà non sussistono se la produzione di biomasse viene realizzata utilizzando come substrati alcoli inferiori, come il metanolo o l'etanolo. Infatti la loro completa solubilità in acqua, la volatilità ed il fatto di essere disponibili ad un elevato grado di purezza rendono possibile l'ottenimento di una biomassa esente da residui indesiderati. La loro miscibilità con l'acqua evita i problemi di mescolamento che si riscontrano con le frazioni petrolifere, mentre per il fatto di contenere già ossigeno nella molecola, ne richiedono di meno per la loro assimilazione: da ciò consegue l'ulteriore vantaggio che la produzione di biomassa è accompagnata dallo svolgimento di una minore quantità di calore, con conseguente riduzione dei costi di raffreddamento.

L'etanolo viene utilizzato da un gran numero di microorganismi e sarebbe il substrato ideale per la produzione di biomasse, ma il suo prezzo è alquanto elevato.

L'uso di etanolo per la produzione di biomasse può diventare competitivo, qualora i vantaggi che esso presenta siano tali da compensare gli svantaggi del suo maggior costo rispetto agli altri substrati.

C'è da notare innanzitutto che l'etanolo entra nella dieta umana, per cui non si pone nessun problema per l'eventuale presenza di residui di etanolo nella biomassa.

Il procedimento per la produzione di una biomassa microbica secondo l'invenzione è caratterizzato nella rivendicazione 1 precedente.

Il ceppo di lievito usato è stato isolato da un preparato usato da lungo tempo come un ingrediente essenziale nella produzione di un cibo tradizionale, di cui non costituiva un contaminante occasionale, per cui si dovrebbe escludere ogni tossicità o patogenicità del ceppo, anche nel caso di un uso umano diretto.

Detto ceppo è stato identificato tassonomicamente come Candida valida, secondo classificazione proposta nel volume J. Lodder ed. - The Yeast: A Taxonomic Study (1970). A pag. 106 del volume citato è scritto: «C. valida has the same morphologycal and physiological properties as Pichia membranaefaciens and may be regarded as its imperfect form».

Le fonti da cui sono stati isolati i ceppi ivi descritti di C. valida (pag. 1068) e di P .membranaefaciens (pagg. 505-6) indicano che queste due specie sono molto diffuse in cibi e bevande di uso comune, d'andò una ulteriore conferma all'ipotesi che il nostro ceppo non dovrebbe presentare problemi di tossicità anche nel caso di un consumo umano diretto.

A questi vantaggi di ordine tossicologico, il nostro ceppo unisce notevoli vantaggi di ordine tecnologico: esso infatti è caratterizzato da una elevata velocità di crescita (tempo di duplicazione: Ih 6 min), da una buona tolleranza per l'etanolo, da una elevata temperatura di crescita (fino a 40°C), e soprattutto da una resa sull'etanolo molto elevata (fino all'80%), fattori questi che contribuiscono notevolmente alla elevata produttività e quindi alla economicità del nostro processo di lievito da etanolo a paragone di altri processi industriali di produzione di biomassa.

Il ceppo è stato depositato il 20. 4. 1977 presso' la collezione di colture dell'ARS (Agricoltural Research Service) — United States Department of Agricolture — Peoria, IH., dove gli è stato assegnato il numero NRRL-L 11119.

Il ceppo può essere coltivato in colture discontinue o continue, ma le sue proprietà sono meglio sfruttate in coltura continua.

In pratica, il processo consiste nell'inoculare con il ceppo SP 1296 un terreno colturale, contenente gli elementi essenziali (N, P, K, Mg, Fe, Ca, Zn), i fattori di crescita (estratto di lievito e biotina), oligoelementi minerali e, come fonte di C e di energia, etanolo. Il brodo viene incubato sotto agitazione ad una temperatura compresa tra i 30-41°C, preferibilmente tra 37 e 4'0°C, mantenendo il pH tra 2,5 e 6,5, preferibilmente tra 4 e 5, assicurando una costante fornitura di ossigeno, ad esempio come aria.

Le cellule di lievito che si moltiplicano a spese dei nutrienti forniti, vengono raccolte per sedimentazione o filtrazione, lavate con acqua e seccate mediante riscaldamento.

La biomassa ottenuta può essere usata tale quale come supplemento proteico in cibi e mangimi, oppure da essa possono essere estratti prodotti nobili come proteine, aminoacidi, acidi nucleici, ecc. utiilzzabili in formulazioni alimentari.

L'invenzione è illustrata ma non limitata dagli esempi che seguono.

Esempio 1

Due giare da 201, contenenti 12 1 del seguente terreno di coltura:

kh2po4

1,5

g/1

NaH2P04. H20

0,5

»

(NH4)2S04

5,0

»

NH4C1

5,0

»

MgSO,. 7H20

0,5

FeS04. 7H20

4,0

mg/1

ZnS04. 7H20

4,0

»

CaCl2

4,0

»

Estratto di lievito

■ 0,5

g/1

Soluzione

oligoelementi

2,0

ml/1

2

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

640 567

La soluzione di oligoelementi aveva la seguente composizione:

H3B03

CuS04. 5H20 KJ

MnS04. 7HaO CoCL. 6H20 Mo03

H20 a pH 2 (Hcl)

500 200 10 500 10 10 1

mg

Le giare con il terreno, avente pH 5,5, vennero sterilizzate a 116° per 30 minuti, vennero inoculate con il 5% v/v di una precedente coltura del ceppo SP 1296 contenente 29 g/1 di biomassa. Alle giare venne aggiunto rispettivamente il 2% ed il 4% v/v di etanolo, e vennero incubate a 39°, 800 giri/min., aumentando man mano l'aerazione da 0,30 a 0,75 v/v/min. Il pH venne controllato a 4,5 con KOH.

La biomassa prodotta quando l'etanolo presente era stato tutto consumato è riportata in tabella, assieme ad altri dati:

Etanolo

Tempo

Biomassa

Resa iniziale

d'incubazione finale

ore g/1

g/100 g

2% v/v =

16 g/1

10

12,40

77,5

4% v/v =

32 g/1

16

16,56

51,8

Esempio 2

Ad un fermentatore della capacità utile di 6,5 1, contenente una coltura ben sviluppata del ceppo SP 1296 nel seguente terreno colturale:

H20

. 7h20 7h20

kh2po4

NaH2P04. (NH4)2S04

nh4 . ci

MgSO,

FeS04.

CaCl2

ZnS04. 7H20 Soluzione di oligoelementi (Es. 1)

Estratto di lievito Etanolo

1,5 0,5 10,0 10,0 0,5 10,0 10,0 10,0

5,0 0,5 40

g/1

mg/1

ml/1

g/1

veniva continuamente aggiunto terreno colturale sterile (pH 5,0, sterilizzato a 116° per 30', eccetto l'etanolo, che veniva sterilizzato a parte mediante filtrazione) e contemporaneamente veniva prelevata una identica quantità di brodocoltura. Il fermentatore veniva mantenuto ad una temperatura di 39°C; esso era munito di 4 frangiflutti e di 2 giranti a turbina che ruotano alla velocità di 2800 giri/min. Il pH della brodocoltura veniva mantenuto a 5,0 mediante aggiunta automatica di KOH. Invece che con KOH, il pH può

essere mantenuto con ammoniaca, con l'eliminazione di buona parte di sali di ammonio nella formulazione del terreno di coltura.

La schiuma veniva controllata mediante l'aggiunta di 5 antischiuma, come il Polipropilenglicol.

Quando la velocità di diluizione (D), cioè il rapporto tra il flusso del terreno sterile in entrata (identico a quello della brodocoltura in uscita) ed il volume statico della coltura aveva raggiunto il valore di 0,34, la concentrazione della 10 biomassa nella brodocoltura in uscita era di 32,3 g/1 mentre la concentrazione dell'etanolo residuo era di 20 mg/1: la resa di conversione dell'etanolo in biomassa era quindi del-l'80% e la produttività oraria era di 10,98 g/1.

15 La biomassa, lavata e seccata, aveva la seguente composizione:

20

25

30

Ceneri

5,90 %

Carboidrati totali

25,67 %

Fibra grezza

3,18 %

RNA

5,50 %

DNA

1,00 %

Proteine grezze (N Kjeldhalx 6,25)

52,29 %

Proteine (biureto)

49,60 %

Lipidi totali

6,78 %

Acidi grassi

5,50 %

La distribuzione percentuale degli acidi grassi era !

guente:

c14

2,81 %

s15

0,90 %

Ci6

14,45 %

Cl6:i

5,15 %

C17

1,14 %

Ci8

2,97 %

Cl8 ; 1

23,15 %

C-18 :2

21,26 %

Ql8 : 3

23,61 %

Altri

4,56 %

35

40 II contenuto in amminoacidi della biomassa secca (g/ 100 g di secco) era la seguente:

45

50

55

Lisina

Istidina

Arginina

Ac Aspartico

Treonina

Serina

Ac. Glutamico

Prolina

Glicina

Alanina

Cisterna

Valina

Metionina

Isoleucina

Leucina

Tirosina

Fenilalanina

Triptofano

2.84 0,83 1,87 2,90 1,72 1,16 5,09 1,08 1,31 1,75

non determinato

2.85 0,76 1,59 2,63 1.38 1,57

non determinato.

v