CH639767A5 - Procede et appareil pour l'observation de particules. - Google Patents

Description

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REVENDICATIONS gnal de longueur (t) pour corriger une mesure de dimension

1. Procédé d'observation de particules selon lequel des basée sur le premier signal d'impédance pour la détermina-particules individuelles suspendues dans un courant de li- tion de la forme de la particule, de façon à fournir une mesure quide sont focalisées hydrodynamiquement de façon à passer du volume effectif, (vp) pour chaque particule.

par un orifice pour la mesure de l'impédance électrique, un s 8. Appareil suivant l'une quelconque des revendications 3

courant à basse fréquence traversant ledit orifice pour pro- à 7, caractérisé par le fait qu'il comprend des moyens de calcul duire une mesure d'impédance électrique, caractérisé par le (60) pour calculer le rapport (a/b) de la longueur et de la lar-

fait qu'on mesure la longueur de chaque particule alors que geur de la particule, ce rapport fournissant une indication de celle-ci est focalisée hydrodynamiquement et que l'on fait un la forme de la particule.

rapport de la mesure d'impédance et de la mesure de longueur io pour chaque particule, de façon à recevoir une information

relative à la forme de chaque particule.

2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le La présente invention a pour objet, d'une façon générale, fait qu'on mesure la longueur de chaque particule en procé- un procédé et un appareil d'analyse de particules en particu-dant à la mesure optique ou électronique de la longueur de 15 lier dans lesquels des études peuvent être faites sur un système chaque particule, qu'on produit, en faisant passer un courant particulaire utilisant le principe de détection par impédance, électrique à haute fréquence dans l'orifice, une seconde me- Depuis sa conception, qui remonte à 25 ans, le principe du sure d'impédance électrique, dont on fait le rapport avec la comptage et du dimensionnement des particules inventé par première mesure d'impédance, avec la seconde mesure d'im- Wallace H. COULTER a résulté en de nombreuses méthodes pédance et avec la mesure de longueur, pour chaque particule, 2° et appareils pour le comptage électronique, la détermination ce qui permet de calculer la résistivité interne de chaque par- des dimensions et l'analyse des particules microscopiques qui ticule. sont observées dans une suspension liquide, comme l'a indi-

3. Appareil d'observation de particules (10), pour la mise qué le brevet américain pionnier de COULTER No en oeuvre du procédé suivant la revendication 1, comprenant 2 656 508. Dans les dispositions antérieures, un courant élec-

un orifice (16) pour des mesures d'impédance de particules in- 25 trique continu est établi entre deux récipients par des électro-

dividuelles suspendues dans un courant de liquide, des des en suspension dans les masses respectives du fluide de sus-

moyens de focalisation (14) pour focaliser hydrodynamique- pension. La seule liaison entre les deux masses de fluide se fait ment le courant de particules de telle manière que les particu- à travers un orifice; de ce fait, un flux de courant électrique et les suivent une trajectoire prédéterminée (74) et passent à tra- un champ sont établis dans cet orifice. Celui-ci et le champ vers ledit orifice, et des premiers moyens de production d'un 30 électrique résultant dans ledit orifice et autour de celui-ci courant électrique (46,58) pour produire un courant électri- constituent une zone de détection. Lorsque chaque particule que à basse fréquence traversant ledit orifice, pour réaliser un traverse la zone de détection, pendant la durée de son passage,

premier signal d'impédance électrique (SLF), caractérisé par l'impédance de la zone de détection change, ce qui module le des moyens de production d'un signal pour produire un signal flux de courant et le champ électrique dans la zone de détec-

de longueur (t) représentatif de la longueur de chaque parti- 35 tion, produisant ainsi un signal à appliquer à un détecteur cule, et des moyens (44) pour faire le rapport dudit signal de agencé de façon à répondre à un tel changement. (La marque longueur avec ledit premier signal d'impédance correspon- «COULTER» est une marque déposée, enregistrée aux USA

dant, pour chaque particule. sous No 995 825, appartenant à COULTER ELECTRO-

4. Appareil suivant la revendication 3, caractérisé par le NICS, INC., à Hialeah, en Floride).

fait que lesdits moyens générateurs de signaux comprennent 40 II a été démontré que le changement d'impédance de la des moyens générateurs de signaux optiques (30,34,39,40, zone de détection, lorsqu'une particule la traverse, est sensi-

42,43) pour réaliser un faisceau étroit (36) de radiation pour blement proportionnel au volume de la particule lorsque la intercepter chaque particule alors qu'elle est focalisée section droite de la particule est sensiblement plus petite que hydrodynamiquement et pour réaliser ledit signal de longueur la section droite de l'orifice et que la particule est plus petite,

(t) représentatif de la durée du passage de la particule dans le- 45 en diamètre, que la longueur axiale de l'orifice. En consé-

dit faisceau étroit. quence, de nombreuses formes d'exécution d'analyseurs de

5. Appareil suivant la revendication 3, caractérisé par le particules mis sur le marché ont été développées qui mesurent fait que lesdits moyens générateurs de signaux comprennent l'amplitude d'un signal de sortie d'un dispositif de détection des moyens générateurs de signaux optiques (30,34,39,40, d'impédance, afin de mesurer le volume de particules ou la di-42,43) ou des moyens générateurs d'un signal détecteur d'im- 50 mension des particules. Une telle disposition mesure la di-pédance, caractérisé par des seconds moyens de production mension électrique de la particule qui est ensuite désignée d'un courant électrique (48, 56) pour produire un courant comme étant une «dimension de particule» ou «dimension électrique à haute fréquence traversant ledit orifice (16) et réa- mesurée».

liser un second signal d'impédance électrique (SLF) et des On a également démontré que la forme de la particule af-

moyens (44) pour faire le rapport avec ledit premier signal 55 fecte la dimension mesurée de sorte qu'elle ne correspond pas d'impédance (SLF), avec ledit second signal d'impédance (SLF) exactement avec le volume réel ou exact de la particule. D'une et avec ledit signal de longueur (t), pour chaque particule, façon générale, en raison de la focalisation hydrodynamique pour la détermination de la résistivité interne (pj) de chaque dans la plupart des appareils, les particules allongées sont ali-

particule. gnées sur leur plus grand axe qui se trouve être sensiblement

6. Appareil suivant l'une quelconque des revendications 3,60 parallèle à l'axe central de l'orifice. Avec deux particules de

4 ou 5, caractérisé par le fait qu'il comprend des moyens de volume égal, l'une étant sphérique et l'autre étant allongée, la calcul (60) pour calculer un facteur de forme (f) à partir dudit particule sphérique, lorsqu'elle traverse l'orifice, aura une sec-

premier signal d'impédance (SLF) et dudit signal de longueur tion droite, perpendiculaire au flux de courant, supérieure à

(t) pour chaque particule. celle de la particule allongée. En conséquence, la particule

65 sphérique produira une distorsion du champ telle qu'elle don-

7. Appareil suivant l'une quelconque des revendications 3 nera un signal de dimension mesurée plus élevé que la parti-à 6, caractérisé par le fait qu'il comprend des moyens de calcul cule allongée, en dépit de leur volume égal. Pour compenser (60) utilisant ledit premier signal d'impédance (SLF) et ledit si- cela, les particules ont été classifïées selon leur forme par un

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terme appelé «facteur de forme». Par exemple, on donne à une particule extrêmement allongée le facteur de forme de 1,0, alors la particule sphérique de même volume a un facteur de forme de 1,5. Un appareil utilisant deux orifices de détection capables de déterminer le facteur de forme est décrit dans le brevet USA No 3 793 587 de THOM et al. Dans ce dispositif, la longueur d'un des orifices est du même ordre que les longueurs de particules ou est plus petit que celles-ci. En conséquence, avec cet orifice, une particule allongée produit une impulsion qui, après être apparue, reste à son maximum pendant un certain temps puis retombe. Une particule sphérique produit, au contraire, une impulsion qui tombe immédiatement après avoir atteint son maximum. Dans ce brevet, on propose que la dimension mesurée puisse être corrigée en divisant des changements d'impédance, pour une particule, par son facteur de forme. En raison des complications des champs électriques, ces corrections demandent à être fortement améliorées.

La déformabilité des particules causée par les pressions hydrodynamiques lorsque les particules traversent l'orifice de détection ou la forme des particules peut varier de façon importante, les deux choses constituant un facteur qui affecte la dimension mesurée et constituent un paramètre distinct pour les particules à examiner. Tout d'abord, la déformation ou la forme des particules affecte leur facteur de forme qui, à son tour, affecte la dimension mesurée. Secondement, l'état déformé d'une cellule biologique ne dépend pas seulement du type de cellule mais aussi de l'âge de celle-ci. Par exemple, des érytrocytes mammaires n'ont pas de noyau. Au contraire des leucocytes, les érytrocytes sont facilement déformables en raison de leur faible viscosité interne. De même, dans un type de cellule donnée, la membrane cellulaire devient plus rigide avec l'âge et, par conséquent, moins déformable. Il faut également tenir compte de l'état patholoqique des cellules qui affecte leur déformabilité ou leur forme naturelle.

Dans l'appareil commercial construit selon le brevet USA susmentionné No 2 656 508, une excitation de champ a été appliquée par un courant continu ou une source à basse fréquence. Comme indiqué précédemment, les changements électriques causés par le passage d'une particule dans le champ électrique de petite dimension excité par un courant continu ou à basse fréquence sont approximativement proportionnels à la dimension de la particule. Un courant continu est considéré comme étant de fréquence zéro dans ce brevet. Cependant, le principe de détection par impédance a été matériellement développé pour produire une information concernant les particules à étudier qui ne soit pas limitée seulement aux caractéristiques dues à la dimension des particules mais qui tienne compte des caractéristiques dues à la composition et à la nature de la matière constituant les particules, comme décrit dans les brevets USA Nos 3 502 973 et 3 502 974, tous deux au nom de COULTER et al. Ces appareils connus utilisent généralement au moins deux sources de courant, qui sont toutes deux appliquées simultanément à la zone de détection, l'une ayant un courant continu à fréquence radio et l'autre à «fréquence zéro» ou, alternativement, ayant une fréquence suffisamment faible pour que les parties réactives de l'impédance de particule aient un effet négligeable sur la réponse de l'appareil. Un descripteur de particules utilisable qui peut être obtenu de cet agencement à deux sources est connu des gens du métier sous le nom de particule «d'opacité». Dans un sens général, l'opacité indique la différence dans la dimension mesurée à fréquence radio comparée à la dimension mesurée à basse fréquence ou à fréquence zéro.

Comme cela est apprécité dans le domaine de la cytologie, tout nouveau descripteur de particules est utile dans l'identification, l'analyse et le classement des particules. Par exemple, des cellules ont une membrane de très haute résistivité qui se trouve dans la plage des diélectriques. Cependant, la partie interne de la cellule est largement conductive, avec différents types de particules ayant des résistivités internes variables. De même il est entendu que l'état pathologique de la cellule af-5 fecte sa résistivité interne. En conséquence, il est désirable de pouvoir mesurer cette résistivité interne sur une cellule.

Le brevet USA No 3 890 568, de COULTER et al., est intéressant en ce sens qu'il décrti la configuration d'un champ électrique pour un orifice de détection illustratif. En outre, ce io brevet indique la mesure d'une longueur de particule dans le but de corriger des mesures de correction inexactes causées par les particules allongées qui excèdent la longueur de la zone de détection. Cependant, le processus décrit dans ce brevet ne permet de déterminer de façon précise la longueur des 15 particules que lorsque celle-ci excède la zone d'observation effective ou, en d'autres termes, la plage dans laquelle la particule peut effectivement être détectée. Cette situation se produit généralement seulement dans les cas où les particules sont des fibres qui doivent être classées. Avec la plupart des 20 particules, telles que les particules biologiques, la longueur de l'orifice est plusieurs fois supérieure à la longueur des particules même lorsque celles-ci sont étirées par les forces hydrodynamiques qui entrent enjeu.

Le dispositif décrit dans un article intitulé «Fast Imaging 25 in Flow: A Means of Combining Flow-Cytometry and Image Analysis», de V. KACHEL et al, dans THE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY, vol. 27, No 1 (1979), pages 335 à 341, est intéressant en ce sens qu'il décrit un schéma antérieur qui est capable de fournir un exa-30 men subséquent de la forme des particules après que les particules ont passé dans un orifice de détection. Dans ce dispositif, une unité électronique associée avec l'orifice de détection, pour une sous-population limitée, présélectionnée, de cellules, actionne une lampe flash pour projeter des images des cellules 35 sélectionnées sur un film, pour un stockage et une examina-tion subséquente. Cependant, cet agencement ne permet pas de faire une corrélation de la forme des particules d'après le volume mesuré d'une particule, sur une base particule par particule. Des informations de forme ne peuvent pas être rapido dement quantifiées pour être traitées par ordinateur du fait que la forme finale n'est rien d'autre qu'une image sur le film. En outre, les vitesses de flux sont limitées à 5 m/s avec un maximum de seulement 150 images à la seconde et cela seulement pour des particules qui sont très sélectionnées. Des vitesses « d'écoulement typiques sont de 5 à 10 m/s avec une vitesse de comptage de particules de 1000 à 5000 particules à la seconde.

Un orifice de détection par impédance a été utilisé en combinaison avec une détection d'absorbance de lumière à l'aval, une détection de lumière dispersée et une détection de lumière 50 fluorescente, comme décrit dans le brevet USA No 3 710 933 de FULWYLER et al. Cependant, des types de mesure optique faites à l'aval à partir de l'orifice ne fournissent pas l'information requise pour l'invention décrite ci-après. D'autres dispositions connues ont mesuré simultanément l'impédance 55 et les signaux optiques mentionnés ci-dessus dans des flux de cellules optiquement claires. Cependant, les motifs de lumière dispersée sont affectés par la forme des particules, cet effet étant détectable et discernable seulement à l'aide d'appareils extrêmement complexes, avec une précision marginale, du fait 60 qu'il est masqué par la lumière dispersée créée par la lumière réfléchie, qui dépend tout d'abord de la dimension des particules, et par la lumière réfractée, qui dépend tout d'abord des caractéristiques de transmission de lumière des particules, à savoir l'index d'absorption et de réfraction et leur dimension. 65 De nombreuses techniques d'observation par fente pour l'analyse de particules au moyen d'un faisceau étroit de lumière sont connues telles qu'illustrées par un articule intitulé «Imaging in Flow», de D.B. KAY et al., publié par THE

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JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHE-MISTRY, Vol. 27, No 1 (1979), pages 329 à 334.

Le procédé auquel a trait l'invention est un procédé selon lequel des particules individuelles suspendues dans un courant de liquide sont focalisées hydrodynamiquement de façon à passer par un orifice pour la mesure de l'impédance électrique, un courant à basse fréquence traversant ledit orifice pour produire une mesure d'impédance électrique. Ce procédé est caractérisé par le fait qu'on mesure la longueur de chaque particule alors que celle-ci est focalisée hydrodynamiquement et que l'on fait un rapport de la mesure d'impédance et de la mesure de longueur pour chaque particule, de façon à recevoir une information relative à la forme de chaque particule.

Suivant un second aspect de l'invention, on réalise un appareil d'observation de particules mettant en oeuvre ledit procédé comprenant un orifice pour des mesures d'impédance de particules individuelles suspendues dans un courant de liquide, des moyens de focalisation pour focaliser hydrodynamiquement le courant de particules de telle manière que les particules suivent une trajectoire prédéterminée et passent à travers ledit orifice, et des premiers moyens de production d'un courant électrique pour produire un courant électrique à basse fréquence traversant ledit orifice, pour réaliser un premier signal d'impédance électrique, caractérisé par des moyens de production d'un signal pour produire un signal de longueur représentatif de la longueur de chaque particule, et des moyens pour faire le rapport dudit signal de longueur avec ledit premier signal d'impédance correspondant, pour chaque particule. _

Dans une forme d'exécution particulière de l'invention celle ci se rapporte à un procédé et un appareil d'observation de particules dans lequel les particules en suspension dans un courant de liquide sont focalisées hydrodynamiquement pour passer par un orifice de détection par impédance. Une source de courant à basse fréquence produit un courant qui traverse l'orifice pour produire un premier signal d'impédance qui est approximativement représentatif de la dimension des particules. Une source de courant à haute fréquence produit un courant qui traverse l'orifice pour produire un second signal d'impédance qui est essentiellement représentatif de la résistance interne des particules qui, à son tour, dépend de la dimension des particules, de leur forme, de leur orientation et de leur résistivité interne. Des moyens de détection fournissent un signal électrique de durée de passage représentatif de la longueur de chaque particule qui est utilisé pour corriger la mesure de dimension inhérant au premier signal d'impédance pour donner des mesures précises de forme et de volume qui sont de par nature indépendantes de la forme des particules. Avec des mesures précises de forme et de volume, une détermination précise de la résistivité des particules peut être extraite des mesures de résistance interne inhérente au second signal d'impédance. La détermination de la résistivité des particules sur une base particule par particule est de grande valeur comme nouveau descripteur d'analyse et d'identification de cellules biologiques.

Dans les dispositifs connus, il était possible d'utiliser le second signal d'impédance pour mesurer la résistance interne des particules mais cette mesure n'a pas de signification en soi. Cela est dû au fait que les mesures de résistance interne varient non seulement avec la résistance interne des particules mais également avec leur dimension, leur forme et leur orientation. De même, dans les dispositifs connus, il était possible d'utiliser les premier et second signaux d'impédance pour mesurer l'opacité des particules, mais cette mesure n'a pas d'interprétation directe par elle-même. Cela est dû au fait que la mesure d'opacité varie sensiblement avec la forme, l'orientation et la résistivité interne de la particule. L'appareil et le procédé de l'invention amènent les particules allongées a suivre une trajectoire prédéterminée dans la même orientation pendant toute la production du signal. Ainsi, la nouvelle combinaison des trois signaux produits permet une extraction précise de la résistivité interne des particules qui, jusqu'à présent, n'était pas obtenable par les systèmes à flux connus. De ce fait, un nouveau descripteur de particules valable a été rendu disponible'dans le domaine de la cytologie grâce à l'invention.

Une modalité d'exécution particulière du procédé et de l'appareil de l'invention utilise un détecteur optique pour déterminer la durée de passage de la particule et, de ce fait, la longueur de la particule. Cette nouvelle sous-combinaison a son utilité pour mesurer le facteur de forme, de volume réel, et la forme déformée ou naturelle des particules sur une base particule par particule en utilisant seulement le premier signal d'impédance et le signal de durée de passage.

Le dessin représente, à titre d'exemple, une forme d'exécution de l'objet de l'invention.

La fig. I est en partie une coupe latérale d'un appareil d'observation de particules avec partie schématique, et

La fig. 2 est un schéma des caractéristiques électriques de cellules biologiques et d'un liquide de suspension de ces cellules.

La fig. 1 illustre un appareil d'observation de particules 10 ayant un tube d'introduction d'échantillon 12, un manchon protecteur 14 entourant le tube 12, auquel il est coaxial, et un orifice microscopique 16 placé à l'extrémité du manchon 14. Un courant de liquide de particules individuelles en suspension, provenant d'un réservoir sous pression non représenté, traverse le tube 12. Un liquide laminaire de protection, provenant d'un autre réservoir sous pression, non représenté, traverse le manchon 14 de façon à entourer le courant de particules. Lorsque le courant de particules sort du tube 12, les pressions hydrodynamiques réduisent le diamètre de ce flux de particules lorsque la vitesse de celui-ci atteint la vitesse du liquide d'entourage. Ce dernier agit également pour centrer le courant de particules de manière que les particules traversent l'orifice 16 le long de l'axe central 18 de celui-ci, les particules allongées, s'il y en a, ayant leur grand axe aligné sur l'axe central 18. Après avoir quitté l'orifice 16, les particules entrent dans une chambre remplie de liquide 20 qui est définie en partie par une cuvette optiquement claire 22. La cuvette optiquement claire 22 est entourée par un boîtier métallique 24. De préférence, la chambre de flux 20 contient un second liquide protecteur produit par un tube d'entrée métallique 26. En raison de la chute de pression associée à l'orifice 16, il est désirable d'avoir un second liquide de protection pour produire des pressions hydrodynamiques suffisantes pour maintenir le grand axe des particules, si elles en ont un, aligné avec l'axe central 18 et pour amener les particules à traverser la chambre de flux 20 et à sortir par une buse de sortie 27. Si les particules sont déformées lorsqu'elles traversent l'orifice 16, le second liquide de protection ou d'entourage aide à fournir les forces hydrodynamiques nécessaires pour maintenir les particules à un degré de déformation pendant la mesure optique subséquente qui doit être décrite ci-après. Ce dispositif d'observation de particules tel que décrit ci-dessus est usuel et est décrit en détail dans le brevet USA No 3 710 933, au nom de FULWYLER et al. Cette disposition est légèrement modifiée par l'inclusion d'une cloison de retardement du courant 28, qui sépare la chambre remplie de liquide 20 d'une chambre remplie d'air 29. Bien que les particules soient représentées comme suivant l'axe central 18, d'autres trajectoires sont possibles. Par exemple, le courant des particules peut être introduit le long d'une trajectoire prédéterminée qui passe par l'orifice 16 et forme un angle avec l'axe central 18. Le caractère commun important de toutes les trajectoires possibles est que la pression hydrodynamique maintienne le grand axe des par-

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ticules pratiquement aligné sur la trajectoire prédéterminée, d'une détection séparée lorsque les particules traversent Torique cette trajectoire soit ou non l'axe central 18. fice 16, un des signaux étant à basse fréquence (LF), qui est dû Une source de lumière 30, de préférence un laser rouge, presque complètement à la dimension des particules, et l'autre produit un faisceau lumineux colimaté 32 atteignant une pre- étant un signal à fréquence radio (RF), défini ci-dessus mière lentille cylindrique 34. La lentille cylindrique 34 redi- s comme étant supérieur à 1 NHz, qui est dû non seulement à la rige la lumière en un faisceau 36 de forme aplatie qui vient sur dimension mais aux effets combinés de dimension, de forme, une ligne focale 38 alignée horizontalement sur l'axe central de résistivité et de réactance des particules. Ces signaux de 18. La lumière, après avoir traversé la ligne focale 3 8, est stop- sortie sont appliqués par les conducteurs 50 et 52 à des pée par un amortisseur de faisceau 39. La lumière dispersée, moyens de détection usuels 54. Les moyens de détection 54 représentée par les rayons lumineux 41, est interceptée par un io comportent un détecteur 56 pour les signaux RF et un détec-détecteur 42, de préférence un dispositif photoélectrique. En teur 58 pour les signaux LF, chacun de ces détecteurs 56 et 58 vertu de cet arrangement, le temps de parcours de chaque par- recevant les signaux par les conducteurs 50 et 52. Un premier ticule individuelle peut être déterminé. Plus précisément, la li- signal d'impédance S(LF), produit par le détecteur 58, est de gne d'attaque des particules disperse initialement la lumière et nature telle qu'il se rapporte directement à la dimension des la particule continue de disperser la lumière jusqu'à ce que 15partiCules. Le détecteur 58 comportera des amplificateurs, des son bord de fuite passe par le faisceau lumineux. La ligne de filtres et d'autres éléments de circuitene bien connus qui se focalisation 38 est placée juste sous l'orifice 16 de sorte que, si trouvent habituellement dans les compteurs de COULTER des particules sont déformées ou sont naturellement allon- (Marque déposée) du marché avec, en plus, des moyens tels gées, les forces hydrodynamiques sont suffisantes pour main- qu'un filtre passe-basse pour empêcher les signaux RF de s'at-tenir l'alignement et la déformation, s'il y en a, de la cellule au 20 tirer le circuit. Si la basse fréquence n'est pas nulle, un circuit cours de son passage par la ligne de focalisation 38. La dis- de démodulation est inclus. Le détecteur 56 comporte des mo-tance entre l'orifice 16 et la buse de sortie 27 a été quelque peu yens de détection de modulation d'amplitude pour démoduler exagérée à la ig. 1 de façon à mieux illustrer les mesures opti- ie signal RF et produire une impulsion type, un second signal ques. Quoique la détection d'impédance et la détection opti- d'impédance S(RF). Le détecteur 56 peut comporter des fil-que soient entreprises dans des positions différentes le long de 25 ^reS) (jes amplificateurs, des démodulateurs ou autres élé-l'axe central 18, elles peuvent être mesurées simultanément en ments de circuitene connus. La construction des sources de utilisant un flux de cellules transparentes à la lumière connu. courant 46 et 48 et des moyens de détection 54 est bien connue Le signal électrique provenant du détecteur 42 est traité par le des gens du métier et figure, en particulier, de façon détaillée, circuit de durée d'impulsion 43 de construction usuelle qui dans les brevets USA Nos 3 502 973 et 3 502 974 de COUL-fournit un signal désiré représentatif de la durée pendant la- sa TER et aj La Cambre remplie d'air 29 assure un espace d'air quelle une partie de la particule se trouvait dans le faisceau 36 entFe la solution d'électroly te amont et l'orifice 16 et entre la ou, en d'autres termes, son temps de passage. Un tel circuit est solution d'électrolyte aval et l'orifice 16, réduisant ainsi les décrit dans le brevet USA No 3 890 568 de COULTER et al. pertes de courant à haute fréquence.

Du fait que les vitesses des particules lorsqu'elles traversent la a partir du premier signal d'impédance S(LF), du second ligne-de focalisation 38 peuvent être prédéterminées, un ordi- 35 sjgnaj d'impédance S(RF) et du signal de durée de passage^

nateur digital 44 peut être utilisé pour mettre en rapport le provenant du circuit de durée d'impulsion 43, l'ordinateur 44

temps de passage de chaque particule avec sa longueur le long digitalise les signaux, met en rapport les signaux particule par de son grand axe. particule et stocke les signaux en mémoire. Dans Ta forme

Le tube d'introduction de l'échantillon 12, réalisé en un ^ d'exécution préférée de l'appareil, les signaux optiques sont matériau conducteur, sert, dans la forme d exécution préférée, 40 produits à des endroits situés en-dessous de l'emplacement d'électrode amont pour l'orifice 16 de détection d impédance. auquel les signaux d'impédance sont produits. De ce fait, il y

Le tube d'entrée 26 est également réalisé en un matériau con- a un délai entre le moment où les premier et second signaux ducteur et sert d'électrode aval pour l'orifice 16. Le manchon^ d'impédance sont produits et lorsque le signal de durée est

14 est en un matériau non conducteur. L orifice 16 est ménagé produit. La capacité de stockage des données de l'ordinateur dans une pièce d'insertion en saphir 45 placée à 1 extrémité du 45 digital 44 effectue aisément le comptage de ce délai et permet manchon 14. Du fait que l'orifice 16 assure la seule liaison aux trojs signaux d'être mis au compte de chaque particule,

pour le fluide entre le tube 12 et le tube 26, un champ électri- gn variante, un circuit peut être utilisé pour assurer les re-

que est établi dans cet orifice. Dans une disposition connue, tards des signaux d'impédance pour permettre aux trois si-

une source de courant à basse fréquence 46 et une source de gnaux d'être mis en corrélation comme décrit par le brevet courant à haute fréquence 48 sont électriquement reliées au so USA No 3 976 g62) au nom de CURBELO. Pour une meil-

tube d'introduction de l'échantillon 12 par un conducteur 50, leure visualisation des calculs effectués par l'ordinateur 44, ce et au tube d'entrée 26 par un conducteur 52 qui est maintenu à dernier est divisé en une première mémoire, en des moyens de un potentiel de masse. La source de courant à basse fréquence collationnement et de calculation 60, en une seconde mémoire

46 fournit un courant continu à «fréquence zéro» ou un cou- en des moyens de collationnement et de calculation 62. Un rant à une fréquence suffisamment faible pour que la partie 55 cjrcujt électrique de l'ordinateur 44 est possible et comporte-

réactive de l'impédance de particule ait un effet négligeable rait ces unités distinctes. Cependant, il est préférable d'utiliser sur la réponse de l'appareil 10, donnée sous forme des temps l'ordinateur digital 44 avec des moyens de commande à pro-

typiques que prennent les particules pour traverser 1 orifice gramme stocké. Les moyens de calculation 60 reçoivent le si-

16. Dans le cas présent, cette source de courant à basse fré- gnal d'ipédance S(LF) et le signal de temps de passage t et, à

quence sera constituée par une source de courant continu. Le 60 partir de ces signaux, font entrer en ligne de compte la forme seul critère réside dans le fait que les signaux résultants attri- de chaque particule et modifient le signal d'impédance S(LF)

buables à la source à basse fréquence, lorsque les particules pour obtenir une mesure exacte et réelle du volume vp et une traversent l'orifice 16, soient directement proportionnels à la , , , ,, , a dimension des particules. La source de courant à haute/ré- mesure de raPPort de la ligueur Par raPPort a la lar§eur $

quence 48 fournit un courant à travers l'orifice 16 en même 65 chaque particule. Les moyens de calculation 60 qui n'exi-

temps que la source de courant 46 mais à une fréquence dans gent par de signal d'impédance S(RF) produisent d'eux-mê-

le spectre radio ou même plus élevée. Les deux sources 46 et mes une sortie utilisable du fait que les signaux d'impédance

48 produisent chacune des signaux identifiables capables S(LF) peuvent être corrigés pour refléter le volume réel vp et le

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rapport longueur par rapport à la largeur en fonction de la la mesure de la résistivité cellulaire pf dépend de la forme de la déformation de particules. En outre, sont fournis des moyens ?!ule * f son orientation. C'est pourquoi la forme exacte de détection optique utilisant le faisceau plat 36 pour détermi- de la ce"ule f01,1 ere detemunee et son orienta ion maintenue ner le signal de temps de passage t. Les moyens 60 calculent 5 en VUe de calculer îa in^er"ede !f cellu/e a Partir ,des aussi un facteur de formef à partir du signal de temps de pas- Parainetres mesures. Cela est rendu difficile par le fait que la sage t et du signal d'impédance S(LF) et le passent aux résistivité de membrane pm est beaucoup plus grande en va-

moyëns de calcul 62. Ces moyens 62 reçoivent une combinai- ieur absolue que la résistivité interne pj quoique la résistivité

son nouvelle de signaux pour chaque particule consistant en interne p,- soit typiquement plus grande en valeur absolue que un signal d'impédance S(RF) en un signal d'impédance S(LF) la résistivité liquide pe. En raison de la combinaison unique du et en un signal de facteur de forme f qui, à son tour, a été cal- 10 signal de l'appareil 10, la résistivité interne pj peut être déter-

culé à partir du signal d'impédance S(LF) et du signal du minée sur une base cellule par cellule. Une discussion des ma-

temps de passage t dans les moyens de calculation 60. Les thématiques servant à déterminer la résistivité interne pj ou moyens de calcul 62 digitalisent les signaux, les mettent en son inverse, la conductivité interne ctj, sera décrite après,

corrélation sur une base particule par particule et stockent les Comme cela est évident, si le facteur de forme_f peut être signaux en mémoire. A partir de la combinaison unique de 15 déterminé, la résistivité interne p; ou son inverse, la conducti-

tpus les signaux d entrée, les moyens 62 peuvent calculer la ré- vité Oi, peut être déterminée également. En outre, le signal sistivité interne S; sur une base particule par particule. Des d'impédance S(LF) peut être corrigé pour refléter le volume moyens de collationnement 64 mettent en corrélation la me- exact vp. La relation entre le signal d'impédance S(LF) et le sure de volume réel vD, la mesure de rapport (r) et la mesure ,n Yréel Vau m°yen du facteur de forme £ est la réponse p Mr 20 a 1 équation suivante:

de résistivité interne p; pour chaque particule individuelle et . . c fi p^) = f • • p (1 p^

des moyens de lecture 66 impriment et/ou affichent les don- ' ^v!~ w ~~ vp )

nées accumulées. Les mathématiques permettant d'effectuer La rdation eQtre le si l d<impédarice S(RF) et le voiUme les calculs susmentionnés sont indiquées ci-apres. ^ ^ au moyen du facteur de forme£ répond à réquation

Alors que la présente invention est destinée à se rapporter suivante:

aux particules en général, de façon plus particulière le terme (j /P. ) • E (R F)

de «particules» désigne des particules entourées d'une mem- (2) g [p p") = f • v 1 —

brane appelée ci-après «cellules». Les cellules peuvent être par P \ + (ß /OV (f — H

exemple des cellules biologiques ou des cellules à membrane 30 e' 1

artificielle. L'opacité Op est obtenue comme suit:

La fig. 2 represente un circuit connu pour modeler les caractères électriques d'une cellule et du liquide de suspension sTrf^ (i-p /p.VEfRF)

qui l'entoure considéré ici simplement comme un moyen pour — J _ e/ '

aider à la compréhension. La èellule est représentée par une li- 3s (3) Op ~ > ~~ 7. /n\-Cf - HT - P A P"\

gnepointillée 68. Les diverses valeurs de résistance électrique ^^1") L' + vr?/^\ ) v vJ ^-v- ' )

Ren ohms, qui seront décrites ci-après, se rapportent aux va- _ , . . . ,

leurs de résistivité électrique p des matériaux spécifiques ou , Présentation suivante décrit une methode pour deriver des solutions au moyen d'équations bien connues. La résisti- |.es «i««"»* 1 et 2. La particule est supposée avoir une con-

vité p qui est la réciproque de la conductivité est mesurée 40 ti^ation ellipsoïdale allongée. L équation de Laplace est re-

d'une façon générale en ohms-an-. La valeur de résistivité de soluf e,n coordonnées allipsoidales pour la particule, le grand pe, pm et Pi désigne la résistivité du liquide de suspension d'é- axe ®, Partlcule ellipsoïdale simulee étant défini comme lectrolyte entourant la cellule, la membrane de la cellule et les ^ ?axe des coordonneesz, lequel est parallele au champ constituants internes de la cellule, respectivement. De ce fait, fCtnquef au flux de c°urant dans onfice Tout d abord, le un circuit 70 comprend une série de circuits de résistance 4s ?eorefme de t9ree?' ^U1 donne un volume intelai en termes Rl(Pe), de résistance R2(Pe) et de résistance R3(Pe), chacun re- de s^e Jntegrale' Peut etre ecnt comme sult la ou ü n y a présentant une partie du liquide de suspension. Un circuit 72, Pas e 0 ar®e"

représentant la cellule, est en parallèle avec la résistance f f d(b'

R2(pe). Ce circuit 72 inclut deux fois en série l'impédance de la ^ (p [<p ■ -— —Z • ) • d s =0

.(£(&--

membrane de cellule représentée par l'agencement en parai- 50 Je, V dn dn lèle d'une résistance R4(pm) et d'une capacitance Cl et par ^^ ^ ,, .

une résistance R5(pm) et une capacitance C2, les deux impê- ou ^ f1 la distribution potentielle hee externe a la particule dances étant admises comme étant égales. Une résistance in-

terne R6(pi) est mterposee en sene entre ces deux impedances. suivante-

La résistance interne R6(pj) joue un rôle important pour l'exa-55

men des cellules. La trajectoire prédéterminée 74 est représen- r . D

tée comme étant alignée sur le grand axe de la cellule. Dans À _ . p. v — c /t"\

l'exemple représenté à la fig. 1, la trajectoire prédéterminée ^ jf p ^ O— ^ vW * v0

coïncide avec l'axe central 18. Le courant est supposé être par- 0

allèle à la trajectoire prédéterminée 74. Dans un but illustratif, 60

on imagine maintenant que la cellule a tourné. Si elle possède où À R est le changement de la résistance de l'orifice R lors-un grand axe et si cet axe est progressivement incliné par rap- qu'une particule est présente, E est la tension de champ êlec-port à la trajectoire prédéterminée 74, la résistance interne trique en tout point à l'intérieur de l'orifice, v0 est le volume R6(pj) décroît progressivement. De ce fait, il a été trouvé que, effectif de l'orifice et S(E) est le signal d'impédance mesuré. Le afin de comparer la valeur de résistance R6(pj) de différentes 65 potentiel sur la surface de la particule peut être donné par la cellules, l'orientation des cellules doit être la même pour cha- solution de l'équation de Laplace avec les conditions de liai-cune d'elles, au moment de la mesure. Des concepts qui précè- son qu'il y a un potentiel à travers la membrane et un courant dent tirés d'un modèle analogique dont on ne dira pas plus ici, continu à travers celle-ci. De ce fait, on a la relation suivante:

7

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(6)

<P = [- E- F(f,) + a ■ G(p]- ~ F(£2) ■■ F(f3)

où S(E) = S(LF) et E = E(LF). En conséquence, on a:

où Ç), et sont des coordonnées ellipsoïdales. Les autres termes de l'équation ci-dessus sont définis comme suit:

(17)

S(LF)=f-(V/v0)-E(LF)

(7)

(B)

(9)

(10)

Ftf>e+a2;z

A i= [ (b2-a2) • (c - a2)]

^-OO

.2 2A T 2

En se référant aux figs. 1 et 2, la première condition de limitation des conditions est que, pour l'application de la source de courant à basse fréquence 46, les capacitances Cl et C2 produisent des hautes impédances telles qu'elles agissent sensiblement comme des circuits ouverts. De ce fait, la résistance interne de la cellule n'est pas détectable en raison de la haute résistivité de la membrane de cellule. La seconde condition de limitation pour l'équation (14) est l'application de la source de courant à haute fréquence 48 qui produit dans l'orifice un champ électrique E(RF). Si la fréquence est suffisamment élevée, par exemple 30 MHz, cela conduit aux résultats suivants:

R(u) = [(u+a2) • (u + b2) • (u+C2)]2

où a, b, etç sont des axes semi-long, semi-court et semi-court de l'ellipsoïde allongé, respectivement. Le terme u est une coordonnée généralisée. Le terme ai est égal à la surface intégrale de la particule divisée par 4k donnant:

(11)

= 4 Ttcx

,(18)

où S(E) = S(RF) et E = E(RF). En conséquence, nous avons:

(19) S(RF) = f-(Yvo

Vm=0

"(l-Pe/P>E(RF)

KPe/PiXH)

a, est à son tour défini en appliquant des conditions de liaison appropriées sur la description du potentiel interne et externe de la cellule.

(12) oc

(13)

—~f • Vp

ATT

(I-Pe/P.) ■ E+CPe/PP'CV.Va)

i+Q°e/P,)-C'-0

En se référant aux figs. 1 et 2, la seconde condition de limi-30 tation est que, pour l'application de la source de courant à haute fréquence 48, les capacitances Cl et C2 font sensiblement court-circuit pour fonctionner comme shunts sur les résistances de membrane très élevées. En conséquence, la résistivité interne de la cellule est mesurée rapidement. Il faut main-35 tenant calculer l'opacité, ce qui conduit à la relation suivante:

HA-

(20)

0

40

S(RF)

P S(LF)

(l-Pe/P,)-E(RF)

(l+(Pe/Pi)-(f-0}E(LF)

(14)

s<ËH-(%}

"d-Pe/P,)E+(Pe/P.)-(V^)

KPe/Pi)-(H)

r00

_• a'b'c / du 2 L F2(UVR(Ü

(15)

'o F (u)- R(u) (21)

En se référant à l'équation (20), toutes les variables sont connues à l'exception du facteur de forme f et de la résistivité interne pi. De ce fait, si le facteur de formef peut être déter-45 miné, la résistivité interne p,- peut être calculée. Cela peut être accompli en développant la relation suivante: le volume réel vp de la cellule et la longueur sont en rapport avec le facteur de forme f, où les demi-petits axes_b et.c sont égaux, selon les équations suivantes:

3 »*2

50

b = v.

47T

f-l r oo a-b-c du

2 4dF2(u)-R(U)

où O] et oe sont les résistivités interne et externe de la cellule,

respectivement, v^ est le potentiel de membrane (désigné par la lettre «m») aux pôles (désignés par la lettre «o») de l'ellipsoïde alignés avec la direction du courant. Il faut maintenant examiner les conditions de limitation pour l'équation (14): la première condition de limitation est l'application de la source de courant à basse fréquence 46 qui produit dans l'orifice 16 un champ électrique E(LF). Cela conduit au résultat suivant:

55 (22)

60

(23)

f-l = -

rrr nr i2_|

m-cosh m (m2 - |)i

for m > |

(16)

V™=f-a-E(LF)

Ainsi, les équations (17) et (23) fournissent deux équations simultanées non linéaires pour résoudre le facteur de forme f et le volume réel vp. Les calculs pour obtenir ces deux valeurs 65 peuvent être exécutés avec le signal d'impédance S(LF) et la durée de passage t qui fournissent la longueur de particule a. L'équation (21) admet que la particule a une forme ellipsoïdale. Comme représenté à la fig. 1, le facteur de forme f et le

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volume réel vp sont calculés à l'aide des moyens de calculation 60. En ayant calculé le facteur de forme f, l'équation (20) peut être résolue par les moyens de calcul 62 pour trouver la résistivité interne pj sur une base cellule par cellule. Ce calcul nécessite la réception du signal d'impédance S(RF), du signal d'impédance S(LF) et du facteur de forme f.

Un autre moyen d'obtenir électroniquement la longueur du grand axe des particules est décrit dans le brevet USA No 3 793 587 de THOM et al. Bien qu'on utilise de préférence des moyens de détection optiques pour obtenir la longueur de particules, la même détermination de longueur peut être effectuée, quoique avec moins de précision, par le dispositif à deux orifices du brevet de THOM.

En ayant obtenu une longueur de particule par des moyens de détection électroniques connus ou par les nouveaux moyens de détection électroniques optiques, une nouvelle combinaison d'entrée de signaux consistant en un signal d'impédance S(LF), en un signal d'impédance S(RF) et dans la longueur des particules permet la détermination de la résistivité interne des cellules pj. Un des deux orifices du brevet de THOM a une longueur axiale du même ordre de grandeur que les longueurs de particules ou plus petit que celles-ci. La durée de l'impulsion produite par la particule est en corrélation avec la longueur de particule. De ce fait, lorsque la phrase «moyens de détection» pour déterminer la longueur de particule est utilisée dans les revendications, il est entendu qu'elle couvre les moyens de détection optiques tels que l'utilisation d'un faisceau plat 36 et également les moyens de détec-5 tion électroniques tels que les orifices du brevet de THOM, qui a une courte longueur axiale.

Les changements électriques causés par les particules se produisent dans des limites effectives de l'orifice 16 défini comme étant la zone de détection ou l'ambiance de détection. 10 Comme décrit en détail dans le brevet USA No 3 890 568 de COULTER et al, la zone de détection s'étend sensiblement au-delà de la longueur axiale de l'orifice 16. Dans le but de la présente demande, la zone de détection sera définie comme comportant la région entourant l'orifice 16 où l'intensité de 15 champ électrique est au moins un pourcentage ou plus de celle de la région centrale à l'intérieur de l'orifice 16.

Il est à remarquer que l'arrangement du flux ayant une chambre de flux 20, comme décrit dans le brevet USA No 3 710 933 de FULWYLER et al, représente seulement un des 2C agencements possibles du flux qui peuvent être utilisés pour la mise en œuvre de la présente invention, cell-ci n'étant pas limitée à cette disposition. L'invention peut être utilisée avec tout agencement de flux traversant dans lequel des particules sont focalisées hydrodynamiquement pour être amenées à passer à travers un orifice de détection d'impédance.

C

1 feuille dessins