CH634293A5 - Process for preparing the novel antibiotic derivative dihydroisocyclosporin D - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikum-Derivates Dihydro-iso-cyclo-sporin D (Formel I).

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Erfindungsgemäss gelangt man zu Dihydro-iso-cyclosporin D, indem man Dihydro-cyclosporin D (Formel II)

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unter geeigneten Bedingungen einer Säurebehandlung unterwirft.

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Zu Dihydro-iso-cyclosporin D kann man gelangen, in- produkte kann anschliessend durch Chromatographie an dem man Dihydro-cyclosporin D (erhalten durch Hy- Kieselgel mit Chloroform-Methanol als Elutionsmittel ge-

drierung von Cyclosporin D) z. B. in einem geeigneten Lö- reinigt werden. Die Chromatographiefraktionen können sungsmittel mit starken organischen Säuren behandelt. Zum dünnschichtchromatographisch auf Einheitlichkeit geprüft

Beispiel kann Dihydro-cyclosporin D in Methanol oder Di- 65 werden, wofür sich z. B. Polygram SIL G-Folien mit dem oxan mit Methansulfonsäure während 6 bis 20 Stunden bei Fliessmittel Chloroform-Methanol-Eisessig (90:6:4) eignen 50 °C umgesetzt werden. Das nach Abpuffern der Säure, z. B. (Laufstrecke 10 cm). Die aus der Chromatographie erhal-

mit Natriumacetat, erhaltene Gemisch der Reaktions- tenen reinen oder annähernd reinen Fraktionen werden zum

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Schluss in Äther aufgenommen und das Produkt anschliessend mit Petroläther gefällt.

Eigenschaften von Dihydro-iso-cyclosporin D

Farbloses amorphes Pulver, Smp. 145-147° [a]D20 = -205° (c = 0,51 in CHC13) = - 146,6e (c = 0,60 in CH3OH)

Elementaranalyse

C63H115Nai012

Ber.: C 62,1 H 9,5 N 12,6 O 15,8%

Gef.: C 61,9 H 9,7 N 12,8 O 16,1%

Im UV-Spektrum zeigt die Verbindung Endabsorption. Im IR-Spektrum (in CH2C12, Fig. 1) ist bei 1735 cm-1 eine Esterbande ersichtlich.

Das 'H-NMR-Spektrum in CDC13 bei 90 MHz mit Tetramethylsilan als internem Standard ist in Fig. 2 dargestellt.

Dihydro-iso-cyclosporin D ist gut löslich in Methanol, Aceton, Essigester, Chloroform; mässig löslich in Äther;

sehr schwer löslich in Wasser und in gesättigten Kohlenwasserstoffen.

Im Dünnschichtchromatogramm auf Polygramm SIL G-Folien mit Chloroform-Methanol-Eisessig (90:6:4), Laufstrecke 10 cm, wird ein Rf-Wert von 0,31 beobachtet. Die Detektion erfolgt mit Joddampf.

Dihydro-iso-cyclosporin D zeichnet sich durch interessante chemotherapeutische und pharmakologische Eigenschaften aus und kann daher als Heilmittel verwendet werden. So hemmt es das Wachstum von Aspergillus niger und Curvularia lunata.

Insbesondere zeichnet sich die Substanz durch eine immunosuppressive und entzündungshemmende Wirkung aus.

Die immunosuppressive Wirkung von Dihydro-iso-cyclosporin D kann wie folgt gezeigt werden:

a) Im Lymphozytenstimulationstest nach Jânossy wird in vitro in Konzentrationen von 0,01 bis 10,0 ng/ml eine starke Hemmung des H3-Thymidin-Einbaus, der Proliferationsrate und der Blastogenese von mit Concanavalin A stimulierten Lymphozyten aus Mäusemilz festgestellt.

b) Oxazolon-Test an der Maus: Die Abnahme der Ohrschwellung wird als suppressiver Index (SI) ausgedrückt; SI = 0,57 nach 5 x 70 mg/kg p.o.

Aufgrund seiner immunosuppressiven Wirkung kann Di-hydro-iso-cyclosporin D zur Prophylaxe und Behandlung von Krankheiten, die mit der Beeinflussung der Abwehrreaktion im negativen Sinn zusammenhängen, angewandt werden.

Dihydro-iso-cyclosporin D besitzt ebenfalls eine Arthritishemmende Wirkung. So wirkt es z.B. im Freund-Ad-juvans-Arthritis-Latenzzeitversuch an der Ratte in Dosen von ca. 50 mg/kg Körpergewicht/Tag stark schwellungshem-mend.

Eine ähnliche Wirkung wird im Freund-Adjuvans-Ar-thritis-Therapieversuch an der Ratte in Dosen von 10 mg/ kg/Tag beobachtet.

Aufgrund seiner Arthritis-hemmenden Wirkung kann Dihydro-iso-cyclosporin D zur Prophylaxe und Behandlung von Arthritis und rheumatischen Krankheiten angewandt werden.

Die zu verwendenden Dosen variieren naturgemäss je nach Art der Administration und des zu behandelnden Zu-standes. Im allgemeinen werden jedoch bei Testtieren befriedigende Resultate mit einer Dosis von 10 bis 200 mg/kg Körpergewicht erzielt. Diese Dosis kann nötigenfalls in 2 bis 3 Anteilen oder auch als Retardform verabreicht werden.

Für grössere Säugetiere liegt die Tagesdosis bei etwa 50 bis 900 mg. Für orale Applikationen können die Teildosen beispielsweise etwa 25 bis 300 mg des Dihydro-iso-cyclosporin D neben festen und flüssigen Trägersubstanzen enthalten.

Als Heilmittel kann Dihydro-iso-cyclosporin D allein oder in geeigneter Arzneiform mit pharmakologisch indifferenten Hilfsstoffen verabreicht werden.

Das als Ausgangsmaterial verwendete Dihydro-cyclosporin D wird wie folgt hergestellt:

400 mg Palladium-Kohle (10% Palladium) werden in 15 ml Äthanol während 20 Minuten vorhydriert. Zu dieser Suspension des Palladiumkatalysators wird die Lösung von 3,66 g Cyclosporin D in 30 ml Äthanol zugegeben und darauf bei 24° und einem Druck von 736 mm Quecksilbersäule bis zur beendeten Wasserstoffaufnahme hydriert. Anschliessend filtriert man vom Katalysator ab und dampft das Filtrat im Vakuum bei 20 bis 40° zur Trockne ein. Dabei fällt das dünnschichtchromatographisch einheitliche Dihydro-cyclosporin D als farbloses amorphes Pulver an, das im Hochvakuum während 4 Stunden bei 70° getrocknet wird.

Das als Ausgangsmaterial verwendete Cyclosporin D wird wie folgt hergestellt:

5001 einer Nährlösung, die pro Liter 40 g Glucose, 5 g Caseinpepton, 5 g MgS04-7H2Ò,2 g KH2P04, 3 g NaN03, 0,5 g KCl, 0,01 g FeS04 und entmineralisiertes Wasser enthält, werden mit 501 einer Vorkultur des Stammes NRRL 8044 angeimpft und in einem Stahlfermenter unter Rühren (170 UPM) und Belüftung (I Liter Luft/Min./Liter Nährlösung) 13 Tage bei 27° inkubiert (siehe DOS 2 455 859).

Die Kulturbrühe wird mit der gleichen Menge n-Butyl-acetat ausgerührt, nach Abtrennung der organischen Phase wird diese im Vakuum konzentriert und der Rohextrakt durch 3stufige Verteilung zwischen Methanol-Wasser (9:1) und Petroläther entfettet. Die methanolische Phase wird abgetrennt, im Vakuum konzentriert und das Rohprodukt durch Zugabe von Wasser ausgefallt. Das nach der Filtration gewonnene Material wird an der 5- bis 7fachen Menge Sephadex LH-20 mit Methanol als Elutionsmittel chromato-graphiert. Die Spitzenfraktionen werden anschliessend an Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,20 mm (Merck) mit Hexan-Aceton (2:1) chromatographiert, wobei die zuerst eluierten Fraktionen vorwiegend Cyclosporin A und Cyclosporin D enthalten, die später eluierten Anteile vorwiegend Cyclosporin C. Zur weiteren Reinigung werden die Cyclosporin A- und D-haltigen Fraktionen aus der 2- bis 2,5fachen Menge Aceton bei —15° kristallisiert und anschliessend durch zweimalige Chromatographie an Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,20 mm (Merck) weiter aufgetrennt, wobei die mit Hexan-Aceton (2:1) zuerst eluierten Fraktionen Cyclosporin D in stark angereicherter Form enthalten. Diese werden in der doppelten Menge Aceton gelöst und bei —15° kristallisieren lassen. Das dabei erhaltene Rohkri-stallisat von Cyclosporin D wird zur weiteren Reinigung in der lOfachen Menge Aceton gelöst, mit 2 Gewichtsprozent Aktivkohle versetzt und während 5 Minuten auf 60° erwärmt. Das nach Filtration über Talk erhaltene klare und beinahe farblose Filtrat wird auf ein Drittel des Volumens eingeengt und auf Raumtemperatur erkalten lassen, wobei Cyclosporin D spontan auskristallisiert. Durch Stehenlassen bei —17° wird die Kristallisation vervollständigt. Die durch Abfiltrieren gewonnenen Kristalle werden mit wenig eiskaltem Aceton gewaschen und anschliessend im Hochvakuum bei 80° während 2 Stunden getrocknet.

Smp. 148-151°

[a]D20 = -245° (c = 0,52 in CHC13)

[a]D20 = -211° (c = 0,51 inCH3OH).

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2 Blatt Zeichnungen

Claims (4)

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   PATENTANSPRUCH

   Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikum-Derivates Dihydro-iso-cyclosporin D (Formel I),

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   einer Säurebehandlung unterwirft.

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