CH629894A5 - Process for separating the free fractions from the bound fractions in an immunoassay procedure - Google Patents

Description

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revendications

1. Procédé pour séparer les fractions libres des fractions liées dans une opération d'immuno-dosage où l'on met en contact une solution avec un composite comprenant une matrice de dérivé de Polysaccharide couplée par covalence à un anticorps par un agent coupleur bifonctionnel, et l'on sépare la solution contenant les fractions libres du composite ayant réagi, caractérisé en ce que ledit agent coupleur bifonctionnel est choisi parmi ceux de formule suivante:

+nh, +nh2 Il " Il

H2e+1CeO-C-(CH2)„-C-OCeH2e+1 (I)

où n est un nombre entier ayant la valeur 1 à 6 et e est égal à 1 ou 2.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite matrice de Polysaccharide a une dimension maximum moyenne à l'état humide de 1 à 18 [x.

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en outre en ce que ledit procédé est un procédé d'immuno-dosage sur colonne en phase solide.

4. Procédé selon l'une des revendications 1,2 et 3, caractérisé en ce que ledit composite immuno-chimique a la formule suivante:

OH

I

matrice de polysaccharide-0-CH2-CH-CH2-NH-(CH2)m-

+nh2 +nh,

Il II

NH-C-(CH2)n-C-NH-anticorps d'anticorps primaire et en ce qu'on incube un antigène marqué et l'échantillon sur ladite colonne d'anticorps primaire.

13. Procédé selon l'une des revendications 1,2 et 3, caractérisé en ce que le dit procédé d'immuno-dosage est un procédé de s radio-immuno-dosage.

14. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la dite matrice de dérivé de Polysaccharide comprend une matrice de Polysaccharide activé couplé à un a,o-diamino-espaceur par l'intermédiaire d'un des groupes amino de l'a,«a-diamino-

îc espaceur.

15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le dit composite immuno-chimique a la formule suivante:

matrice de polysaccharide-0-CH2-CH-CH2-

où m est un nombre entier ayant la valeur 1 à 12.

16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que 25 la dite matrice de Polysaccharide est choisie parmi les suivantes:

des polymères cellulosiques, des polymères de dextran, l'agaro-se et leurs dérivés où m est un nombre entier ayant la valeur 4 à 6 et n est un nombre entier ayant la valeur 4 à 6.

17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que 30 le dit anticorps est un anticorps secondaire.

+nh2 +nh2 Il II

20 NH-(CH2)m—NH-C—(CH2)n-C—NH-anticorps

35 La présente invention a pour objet un procédé de séparation où m est un nombre entier ayant la valeur 1 à 12. de fractions libres de fractions liées dans une opération d'im-

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que muno-dosage.

ladite matrice de Polysaccharide est choisie parmi les suivants: Le radio-immuno-dosage (RIA) en phase solide a eu du des polymères cellulosiques, des polymères de dextran, l'agaro- succès parce que, du fait que la réaction antigène-anticorps et la se et leurs dérivés où m est un nombre entier ayant la valeur 4 à 40 séparation d'antigènes libres et liés peuvent être obtenus en une

6 et n est un nombre entier ayant la valeur 4 à 6. seule étape, on obtient non seulement un radio-immuno-dosage

6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que simple et rapide mais cela élimine un certain nombre d'erreurs ladite matrice de Polysaccharide est choisie parmi les suivants : de manutention et autres qui sont inhérentes à d'autres techni-

des polymères cellulosiques et leurs dérivés ayant une dimen- ques de séparation. Catt et al., Biochem. J., 100: 31c (1966) ont sion maximum à l'état humide de 10 à 15 |x. 45 utilisé à l'origine comme matières en phase solide des polymères

7. Procédé selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce pulvérisés portant des groupes réactifs thiocyanato (-N=C=S)

que ledit anticorps est un anticorps secondaire. capables de former des liaisons covalentes avec des anticorps.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'un Des anticorps couplés à des particules de dextran et de cellulose tube contenant ledit composite reste pratiquement immobile activées au bromure de cyanogène sont devenues à la mode à la pendant une étape d'incubation. 50 suite des travaux de Wide, Porath, et Axen [Wide et al., Bio-

9. Procédé selon les revendications 3 et 7, caractérisé en ce ehem. Biophys. Acta, 130: 257 (1966), Axen et al., Nature qu'on conduit une réaction d'immuno-dosage primaire hors de (Lond.) 214:1302 (1967) et Wide, Acta Endocrinol. (Copen-

îadite colonne, puis en ce qu'on incube une partie aliquote dudit hagen) Suppl. No. 142: 207 (1969)]. En variante, Ternynck et mélange réactionnel sur ladite colonne de deuxième anticorps al., F.E.B.S. Letts. 23:24 (1972) ont utilisé le glutaraldéhyde en phase solide. 55 comme corps réagissant bi-fonctionnel à deux étapes pour coup-

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'un 1er des anticorps aux groupes amido du Polyacrylamide.

excès du deuxième anticorps est présent sur la dite colonne en H est bien établi que l'efficacité de substances adsorbantes phase solide. par affinité, augmente beaucoup lorsqu'on introduit des hydro-

11. Procédé selon les revendications 3 et 7, caractérisé en ce carbures d'espacement pour séparer le ligand de la matrice soli-

que les dites colonnes de deuxième anticorps en phase solide eo de [Cuatrecasas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S., 61:636

sont chargées d'un anticorps primaire, d'un antigène marqué et (1968)]. On croit que l'espaceur augmente la flexibilité et la de l'échantillon et en ce que à la fois la dite réaction primaire et mobilité du ligand, ce qui permet l'accès libre de la protéine au la dite étape d'incubation avec une préparation solide d'un deu- ligand.

xième anticorps se poursuivent simultanément dans l'espace vi- Connaissant ceci, Cambiaso et al., Immuno-chem., 12: 273

de de la colonne. 65 (1975), ont couplé des fractions de gamma globulines à des

12. Procédé selon les revendications 3 et 7, caractérisé en ce dérivés amino-hexyle de sepharose-4B activés au glutaraldéhy-que l'anticorps primaire est incubé sur la dite colonne de deuxiè- de comme indiqué dans la formule ci-après et ils ont montré que me anticorps en phase solide produisant ainsi une colonne ce procédé donne des immuno-absorbants utiles.

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NH

-0-C-NH-(CH2)6-N=CH-(CH2)2-CH=N-Protéine

Il reste à établir si des anticorps purifiés ou un anticorps contenu dans des fractions de gamma-globuline couplées au sé-pharose par ce procédé se montreront plus efficaces pour la fixation d'un antigène que les mêmes anticorps couplés au sé-pharose au moyen du procédé au bromure de cyanogène. A cet égard, Bolton et al., Biochemica et Biophysica Acta, 329: 318 (1973), ont rapporté que la récupération de l'activité de l'anticorps tend à être plus élevée sur des préparations solides d'anti-sérums contre des haptènes et des petits peptides activées au bromure de cyanogène que pour des préparations analogues en phase solide d'anti-sérums à des hormones protéïniques à poids moléculaires élevés:

NH

II

—O—C -NH-Protéine

Bien qu'il puisse sembler raisonnable que des préparations en phase solide d'anti-sérums contre grosses molécules produites par des procédés analogues à ceux de Cambiaso et al., ci-dessus, puissent donner un meilleur isolement de l'activité de l'anticorps que les préparations solides produites sans un espa-ceur, il existe deux désavantages dans les procédés chimiques actuellement utilisés pour lier par covalence des anticorps à des matric es solides. Premièrement, dans de nombreux cas, la nature exacte des réactions chimiques n'est pas bien établie et deuxièmement les anticorps immobilisés peuvent être liés à la matrice solide de manière statistique et ainsi la possibilité que le couplage implique un reste d'amino-acide «essentiel» augmente.

Déjà en 1959, Ludwig et al., Abst. 135th Meeting Am. Chem. Soc., 44c (1959) ont rapporté la réaction d'imido-esters substitués ayant des groupes a et E-amino typiques de la gly-cylglycine et de l'acide e-amino~caproique pour former des amidines:

+NH2

II

R-C-OET + Pr±NH3—»

+NH2 II

R-C-NH-Pr + ETOH + H+

Ces auteurs ont dit que la réaction se poursuit rapidement en solution aqueuse voisine d'un pH neutre même à 1 °C., et que dans ces conditions, le corps réagissant qui est l'imido-ester ne réagit pas avec des composés modèles contenant des groupes sulfhydryles, des groupes phénoliques, des groupes imidazoles ou des liaisons peptidiques. En outre, ils ont remarqué que la charge nette du peptide est inchangée sur presque toute la gamme de pH, la fonction amidino ayant une valeur pk voisine de 12.

En 1963, Wofsky et al., Biochem., 2:104 (1963), ont amidi-né diverses protéines et ils ont trouvé que la réaction était très spécifique pour les restes de lysine. En outre, ils ont rapporté qu'une amidination étendue produit bien peu d'effets détectables sur l'activité biologique des anticorps. Ils ont conclu que la lysine n'est pas impliquée de manière critique dans les sites réactifs de n'importe lequel des anticorps examinés (protéines du sérum anti-bovin) (anti-BSA), (l'arsenate anti-benzène, l'acétate anti-D-benzoylaminophényle, l'anti-SIII, l'anti-DNP, et l'anti-ß-lactoside).

Plus tard en 1966, Dutton et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm., 23: 730 (1966), ont modifié de manière étendue des anticorps, anti-DNP avec l'agent de réticulation qui est le dichlorhydrate de malonimidate de diéthyle et ont rapporté de s manière analogue la rétention quantitative de l'activité de l'anticorps selon le schéma ci-après:

-cih2n+ +nh2ci-II II

xo 2-Anticorps- +NH3 + QH5-O-C CH2-C-0-C2H5-h>

+nh2 +nh2

15

Anticorps-NH-C-CH2-C-NH-Anticorps + 2C2H5OH + 2HC1

Bien que les travaux de Ludwig et al., Wofsky et al., et de Dutton et al. soient connus dans ce qu'on appellerait dans les 20 milieux scientifiques un nombre d'années important, personne n'a transféré leur travail dans le domaine des procédés d'immuno-dosage. Une des raisons de cela peut-être que les techniciens qualifiés préfèrent ne pas utiliser des matrices dérivées chargées. Par exemple, Wilchek et al., Molecular and Cellular Biochemi-25 stry Vol. 4, No. 3, p. 181 (1974), rapportent que des matrices dérivées et chargées positivement causent une adsorbtion non spécifique et donc ne sont pas avantageuses pour une utilisation dans des procédés d'immuno-dosage. Donc ceux du métier ont peut-être considéré que l'utilisation des corps réagissant qui 30 sont les imido-esters ci-dessus soient désavantageux du fait que ces corps réagissant produiraient des composites immuno-chi-miques en phase solide chargés positivement.

Le point final de toutes analyses compétitives de liaison implique la détermination de la proportion relative d'antigène (ou 35 d'haptène) qui est libre et d'antigène (ou d'haptène) qui est lié à l'agent liant pouvant être saturé. Les techniques de séparation de base couramment utilisées, impliquent la migration différentielle des fractions liées et libres (c'est-à-dire la chromato-elec-trophorèse sur papier, la filtration sur gel), des procédés 40 d'adsorbtion (c'est-à-dire de charbon, de silicates), la précipitation fractionnée (c'est-à-dire sulfate d'ammonium, polyéthylène glycol), et un procédé double anticorps. Selon Ratcliffe, Br. Med. Bull., 30:32 (1974), une technique idéale de séparation devrait satisfaire aux critères suivants:

45 A. Elle doit séparer complètement les fractions libres et liées avec une large gamme d'erreurs dans les conditions utilisées pour la séparation.

B. Elle doit être simple, rapide, bon marché et utiliser des réactifs et un appareil qu'on trouve facilement.

so C. Elle ne doit pas être affectée par le plasma ou le sérum.

En outre, Ratcliffe note que pour l'application clinique générale toutes les manipulations doivent être conduites dans un seul tube, elles doivent être appropriées pour l'automatisation et doivent être applicables à une vaste gamme d'antigènes ou 55 d'haptènes (c'est-à-dire de petits peptides et stéroides ainsi que des protéines à poids moléculaires élevés).

Bien que le procédé à double anticorps pour la séparation des fractions libres et liées dans des systèmes de radio-immuno-dosage (RIA) soit couramment une des techniques de sépara-60 tion les plus utilisée et que dans des conditions optimales elle satisfait la plupart des critères cités plus haut, elle possède pourtant certains désavantages inhérents. Voir Ratcliffe, supra; Seki et al., Endocrinol. Japan, 20:121 (1973) ; et Koninckx et al., Acta Endocrinol., 81:43 (1976). Du moment qu'il faut ajouter 65 une protéine-véhicule, de grandes quantités d'anticorps de précipitation choisie sont nécessaires et ainsi le procédé est coûteux. Il faut un temps considérable pour que la réaction d'immu-no- précipitation atteigne l'équilibre (24 à 48 heures à 40 °C).

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Enfin, à cause de la possibilité d'interférences aspécifiques par re élevé. De même, des anti-sérums haptène couplés par cova-des facteurs présents dans le sérum, il faut évaluer avec soin les lence à des matrices solides présentent peu ou moins de sensibi-conditions du dosage avant de choisir un système de dosage. lité de dosage lorsqu'on les comparent au système à anticorps

Un des désavantages principaux lors de l'utilisation d'anti- non couplés tandis qu'il y avait une perte désastreuse de sensibi-corps primaires en phase solide dans des systèmes RIA est qu'à 5 lité lorsqu'on a soumis aux essais des anticorps-hormones pro-la suite de la perte en titre d'anticorps et l'avidité qui se produi- téiniques à poids moléculaire élevée. Ces auteurs ont conclu que sent souvent pendant l'étape de couplage, on doit développer toute perte de sensibilité de dosage résultant de l'utilisation des systèmes plus longs, plus coûteux et plus compliqués (c'est- d'anti-sérums fixés chimiquement est causée probablement par à-dire des dosages en séries). (Zeltner et al., Clin. Chem., 20:5 un empêchement stérique des antigènes les plus gros. (1974)). Récemment, Den Hollander et al., J. Immunol. Me- 10 Donc, un des principaux désavantages contre indiquant l'u-thods, 1}2A1 (1972), ont développé un nouveau procédé de tilisation de préparations solides d'anticorps primaires dans des séparation utilisant un deuxième anti-sérum couplé à une matri- systèmes RIA est que ce procédé n'est pas universel. (L'appro-ce insoluble en utilisant le bromure de cyanogène et ils ont che ne peut pas être aussi bonne pour des grosses molécules et appelé ce procédé de séparation le procédé en phase solide des petites molécules). D'autres désavantages qui s'appliquent à

double d'anticorps (DASP). Bien que le titre et l'avidité du 15 tous les procédésRIA en phase solide primaires sont les sui-deuxième anticorps soit certainement réduits dans ces prépara- vants: il faut pipeter une quantité précise d'anticorps d'une sus-tions solides, la réaction d'anticorps primaires reste inchangée et pension de gel insoluble, il faut agiter mécaniquement le mélan-ainsi on évite un des désavantages principaux des systèmes en ge de dosage pour assurer un mélange approprié et une centrifu-phase solide. En fait, ce procédé DASP possède des avantages gation est habituellement nécessaire pour séparer les fractions suivants par rapport à la méthode de séparation des fractions 20 libres et liées.

libres et liées d'anticorps doubles solubles classiques: L'utilisation de colonne de «Sephadex» dans des seringues

A. Puisque des préparations solides d'anticorps de précipita- en matière plastique pour lier un mélange de thyroxine marqué tion nécessitent peu ou pas de protéines-véhicules, il faut une à I125 (T4) et la T4 libérée des protéines du sérum par un alcali, quantité moindre du deuxième anticorps pour précipiter le pre- suivie d'une analyse de liaisons protéiniques subséquente avec mier anticorps. 25 une quantité fixe limitatrice de globuline se fixant à la thyroide

B. Le procédé DASP nécessite moins de temps pour la sépa- (TBG) sur chaque colonne a été introduite récemment. Seligson ration complète des fractions libres et liées. et al., Clin. Chem. Acta, 38:199 (1972) et Alexander et al.,

C. Des interférences aspécifiques par des facteurs présents Clin. Chem., 20:553 (1974). Dans ce procédé, la colonne de dans le sérum sont complètement absents avec le procédé de Sephadex sert aussi à séparer la T4 libre du complex T4—TBG. précipitation DASP si on travaille dans le domaine d'un excès 30 Des essais analogues ont été développés pour la Tri-iodothyro-du deuxième anticorps. En fait, une fois qu'on a établi les condì- nine marquée par un isotope (T3) dans laquelle on utilise un tions optimales pour la précipitation de l'immuno-complex, une anticorps envers T3 comme agent liant protéinique compétitif, réévaluation fréquente n'est pas nécessaire. Alexander et al., Clin. Chem., 20:1353 (1974).

Pour tous les avantages qu'on obtient avec des préparations Dans les deux dosages, la colonne de «Sephadex» sert pour solides pour la précipitation de l'anticorps, il demeure un dés- 35 fixer le mélange d'antigènes et pour marquer tandis que d'autres avantage mécanique commun à tous les dosages en phase solide, composants du sérum ne sont pas retenus par le gel. Ensuite, on Dans tous les dosages en phase solide, il est nécessaire d'agiter incube une quantité fixe d'agents liants protéiniques compétitifs les corps en réaction continuellement et en plus, il faut d'abord dans l'espace vide de la colonne et pendant ce temps, les antiboucher le tube de dosage puis, les centrifuger et les déboucher sérums et le produit marqué sont répartis de nouveau entre la avant l'étape de lavage. Chan et al., Ann. Clin. Biochem., 40 colonne et l'agent liant. L'élution avec un tampon enlève le 12:173 (1975), ont couplé des anticorps primaires à du «Se- complex agent liant-antigènes, tandis que l'antigène libre reste phadex G25» (marque) activés au bromure de cyanogène, un attaché à la colonne de Sephadex. Bien que cette technique soit gel de dextran formé en perles ultra fin (grosseur particulaire en facilement automatisée, ce système exige la charge précise de dessous de 10|i) et on rapporté qu'avec de petits volumes d'in- quantités égales de gel dans toutes les colonnes. Ainsi, il faut cubation (300 à 400 micro-litres) la réaction de l'anticorps peut 45 agiter continuellement le Sephadex au moyen d'un agitateur se poursuivre sans qu'une rotation verticale soit nécessaire ni un magnétique, tandis qu'on transfère la suspension au moyen d'u-autre moyen d'agitation continue. ne pipette graduée.

Actuellement, des anticorps sont fixés par covalence à une Boguslaski et al., Analytical Chemistry, Vol. 47, No 9,1583

variété de matrices solides telles que l'agarose, le verre, un poly- (1975), ont récemment fait un rapport sur un radio-immuno-acrylamide et même de la poudre d'oxyde de fer. Siegel et al., J. 50 dosage sur colonnes pour le dosage de la digitoxine (pm=765) Clin. Endocrinol. Metab., 37:526 (1973), Weetall, Chem. qui utilise une colonne d'anticorps primaires immobilisés qui

Abst., 77:18064y (1972), Moore et al., Steroids, 20:199 (1972), agit à la fois comme chambre réactionnelle et comme dispositif et Hersh et al., Clinica Chemica Acta, 63:69 (1975). de séparation. Des radio-immuno-dosages sur colonnes d'anti-

Bien qu'en principe, le premier anticorps lié à une phase corps primaires ont été rapportés pour la vitamine B12 solide représente un procédé de séparation simple et versatile, 55 (pm=1.355), Boguslaski et al., Clinica Chemica Acta, 62:349 cette approche présente un certain nombre de désavantages. Les (1975), et insuline (pm~6000), Davis et al., Clinica Chemica deux questions auxquelles il faut répondre, en ce qui concerne Acta, 66:379 (1976). Au vu du travail de Bolton et al., ci-les systèmes en phase solide utilisant des anticorps primaires dessus, ce procédé n'est pas universel du fait que la sensibilité de sont: premièrement la perte possible en activité de l'anticorps dosage de grosses molécules (par exemple, la TSH c'est-à-dire (titre) et le gaspillage qui s'en suit d'anti-sérum précieux et deu- 6"l'hormone stimulant la thyroïde ayant un poids moléculaire de xièmement la réduction possible de la sensibilité pouvant résul- 30 000) serait restreinte à cause des propriétés des anticorps en ter avec des systèmes solides comparés à celles qu'on peut obte- phase solide envers de grosses molécules.

nir en utilisant les mêmes anti-sérums en solution aqueuse. On a trouvé que des composites immuno-chimiques conte-

Comme on a noté plus haut, Bolton et al., supra, ont rapporté nant des imido-esters chargés positivement comme agents de que l'isolement de l'activité de l'anticorps tendait à être plus 6Î couplage sont d'excellents moyens pour séparer les fractions élevée dans des préparations solides d'anti-sérum et d'haptène liées des fractions libres dans un procédé d'immuno-dosage. et de petits peptides qu'avec des préparations solides analogues La présente invention a pour objet un procédé de séparation d'anti-sérum avec des hormones protéiniques à poids moléculai- des fractions libres des fractions liées dans un procédé d'immu-

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no-dosage selon lequel on met en contact une solution avec un ce de Polysaccharide est activée par un halogénure de cyanogè-

composite comprenant une matrice dérivée d'un Polysaccharide ne la matrice dérivée d'un Polysaccharide a la formule:

couplée par covalence à l'anticorps par un agent coupleur bifonctionnel, et l'on sépare la solution contenant les fractions NH libres du composite ayant réagi, caractérisé en ce que ledit agent 5 II coupleur bi-fonctionnel est choisi parmi ceux de formule sui- matrice-0-C-NH-Y-NH2 vante:

dans laquelle la matrice est une matrice de Polysaccharide telle

+NHZ +NH2 que définie ci-dessus et dans laquelle Y est un espaceur. Des

Il II io exemples d'espaceurs comprennent les suivantes:-(CH2)m-, H2e+lCeO-C-(CH2)n-C-OCeH2e+1

où n est un nombre entier ayant la valeur 1 à 6 et e est un -(CH2)b -NH-(CH2)c-, (CH2)d —et nombre entier égal à 1 ou 2. — — ^—'

Le composite immuno-chimique utilisé dans le procédé se- 15 /—y

Ion la présente invention comprend une matrice dérivée d'un N = N °n m est un nombre entier ayant la valeur 1 à Polysaccharide couplée par covalence à un anticorps par un agent coupleur bi-fonctionnel. La matrice de Polysaccharide 12 et de Préférence 4 à 6, où b et c indépendamment sont des peut être n'importe quelle matrice à laquelle sont fixés plusieurs nombres entiers ayant la valeur 1 à 6, de préférence 2 ou 3, et ou groupes hydroxyles ainsi que leurs dérivés. Les matrices de po- 20 ^ est un nombre entier ayant la valeur 1 à 10, de préférence 2 a

Iysaccharide préférées comprennent des polymères celluiosi- préférence Y est le groupe -(CH2)„1—.

ques, des dextrans polymères, l'agarose, et leurs dérivés. Les Comme autre illustration d une matrice dérivée d un poly-

polymères cellulosiques et leurs dérivés sont les matrices de saccharide, si la matrice de Polysaccharide est activee par une

Polysaccharide de choix épihalogénohydrine, la matrice dérivée du Polysaccharide a la

Selon une forme d'exécution de l'invention, la matrice de 25 ^ormu'e'

Polysaccharide est finement divisée et une dimension maximale moyenne à l'état humide de 1 à 18 ji, et de préférence 10 à 15 [i. Selon cette forme d'exécution, la matrice de Polysaccharide . '

peut être sphérique, linéaire ou avoir n'importe quelle autre matrice-0-CH2CHCH2—NH—Y-NH2 configuration géométrique, à condition que sa dimension maxi- 30

male moyenne à l'état humide (diamètre, côté, longueur) soit dans 'a1uf"e 'a matrice et Y sont tels que définis ci-dessus, comme décrit plus haut. Plusieurs type de matrices de polysac- ^ ant^corPs aucLue'on couple par covalence la matrice déri-

charide sont disponibles dans le commerce sous cette forme vée d'un Polysaccharide peut être soit un anticorps primaire soit finement divisée, par exemple, la marque Sephadex, un gel de un anticorps secondaire. Du moment que la seule exigence pour dextran sous forme de perles est disponible en plusieurs qualités 35 'a présente invention est que 1 anticorps possède un reste de ayant un diamètre particulaire à l'état sec de 10 à 40 n ainsi lysine, pratiquement tous les anticorps primaires et secondaires qu'un diamètre en dessous de 10 |x. Il est aussi possible de peuvent être couplés par covalence à la matrice dérivée d un réduire la dimension maximale moyenne à l'état humide des Polysaccharide parce que tous les anticorps possèdent ces rési-matrices de Polysaccharide par des techniques chimiques, par dus de !ysine-De préférence l'anticorps est un anticorps secon-exemple, par hydrolyse. Pour hydrolyser cette matrice, on met 40 da're"

par exemple en contact la matrice de Polysaccharide avec une ^ar «anticorps secondaire», on entend dans le présent expo-

solution acide, par exemple, une solution d'acide chlorhydrique, sé un anticorps produit dans un organisme vivant en réponse à la sulfurique, 3 à 10 N ou un autre acide approprié pendant un présence d'un antigène dans cet organisme lorsque l'antigène est temps suffisant par exemple 2 à 24 heures. On neutralise alors le lui-même un anticorps. Par opposition, on entend par «antimélange acide avec une solution basique, par exemple, une solu- 45 corPs primaire» un anticorps produit de la même manière à tion hydroxyde de sodium ou de potassium 3 à 10 N, etc. et Partir de tout autre antigène. Cette terminologie est bien connue ensuite on lave et on sèche selon des techniques connues. des spécialistes en la matière.

Les matrices de Polysaccharide peuvent être activées par fondement de la présente invention est 1 utilisation d imi-

n'importe quel moyen approprié connu de ceux du métier. Des do-esters comme agent coupleur pour le composite immuno-exemples des réactifs appropriés pour activer la matrice de poly- 50 chimique. L imido-ester a la formule générale:

saccharide comprennent un halogénure de cyanogène, l'épihalo-

hydrine, des halogénures d'halogéno-acétyle et la divinyl-sul- ^*2 NH2

phone. Voir Patty, Industriai Hygiène and Toxicology, Vol. 2. p. " "

634, Interscience, New York, N.Y. (1949), Axen et al., Nature H2e+iCeO-C-(CH2)n-C-OCeH2e+1 (Lond.), 214:1302 (1967), Rosner et al., Biochem., 14:4813 55

(1975), Jagendorph et al., Biochimica et Biophysica Acta, dans ^quelle n est un nombre entier ayant la valeur 1 à 6, de

78:516 (1963), et Porath et al., Nature NewBiol., 238:261 préférence 4 à 6, et dans laquelle e est un nombre entier égal à 1

(1972), lesdites publications étant incorporées in toto ici par 0112- ^ utilisation de ces imido-esters permet de fixer par cova-référence. Avantageusement, on utilise comme réactif un halo- lence des anticorps à des supports solides par des réactions chi-gènure de cyanogène ou une épihalogénohydrine pour activer la 60 nuques connues qui immobilisent à la fois les anticorps primai-matrice de Polysaccharide. De préférence, on active la matrice res sec°ndaires par 1 intermédiaire de leurs restes de lysine de Polysaccharide par une épihalogénohydrine ou un de ces ÇLui dans la Pfupart des cas ne sont pas nécessaires pour l'activité

mélanges et encore mieux on active la matrice de Polysaccharide immuno-logique. En outre, la présence d une matrice chargée par l'épichlorhydrine positivement ne cause pas une adsorbtion non spécifique nuisi-

On couple alors un espaceur a,co-diamino à la matrice de 65 sur 'e présent composite immuno-chimique.

Polysaccharide activée ci-dessus au moyen d'un des groupes Les composites immuno-chimiques à la portée de l'inven-

amino d'espaceur a,co-diamino- formant ainsi une matrice tion peuvent être préparés en procédant comme suit. On met en d'un dérivé de polysaccharide.Pour illustrer ce point, si la matri- contact un réactif activateur avec la matrice de Polysaccharide

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désirée dans une solution ayant le pH désiré. Le pH peut être en général d'environ 7,5 à environ 10,0 et le pH particulier est choisi suivant le réactif activateur et la matrice de Polysaccharide qu'on utilise. On peut laisser la réaction se poursuivre à la température ordinaire. On laisse le réactif activateur en contact avec la matrice de Polysaccharide pendant un temps suffisant, d'environ 5 minutes à 5 heures, pour permettre à la matrice d'être activée. L'excès de réactif activateur est enlevé de la matrice de Polysaccharide activée par lavage de ladite matrice avec un milieu approprié par exemple l'eau, un tampon (par exemple, le bicarbonate de sodium), etc. On met alors en suspension la matrice activée dans un milieu approprié, par exemple, une solution acqueuse de diméthylformamide. On ajoute alors l'espa-ceur a,cû-diamino- désiré à la matrice de Polysaccharide activée mise en suspension et on laisse la réaction se poursuivre pendant environ 1 à 10 heures à la température ordinaire. On enlève l'excès d'espaceur a,co-diamino- de la matrice dérivée d'un Polysaccharide en lavant ladite matrice avec un milieu approprié, par exemple, une solution de diméthylformamide, puis on lave avec un tampon approprié, par exemple, un tampon au bicarbonate de sodium. Après ce double lavage, on met en suspension la matrice dérivée d'un Polysaccharide dans un tampon approprié, par exemple, un tampon au bicarbonate de sodium.

L'agent coupleur bi-fonctionnel ou son mélange est dissous dans une solution basique à environ 4 °C. Si nécessaire, on ajuste le pH à environ 8-9. On met alors en contact la matrice dérivée d'un Polysaccharide mise en suspension avec l'agent coupleur bi-fonctionnel dissous et on agite le mélange par rotation à environ 4 °C pendant 1 à 5 heures.

Après avoir enlevé l'excès d'agent coupleur bi-fonctionnel, on met en suspension la matrice dérivée d'un Polysaccharide couplé dans un mélange contenant un tampon approprié, par exemple, un tampon au bicarbonate de sodium et une fonction d'anticorps primaire ou secondaire. On agite par rotation le mélange pendant environ 10 à environ 24 heures dans un milieu froid. On lave alors à fond le composite immuno-chimique avec un tampon approprié par exemple, un tampon au bicarbonate de sodium, puis on le met en suspension dans un tampon approprié ayant un pH d'environ 8, par exemple, un tampon au barbital contenant environ 0,1% de gélatine.

Le présent composite immuno-chimique préparé selon le procédé ci-dessus a la structure schématique suivante:

NH2+

II

matrice dérivée d'un polysaccharide-C-(CH2)n-

NH2+

II

C-NH-anticorps où la matrice dérivée d'un Polysaccharide n et l'anticorps sont tels que définis plus haut. Le composite immuno-chimique préféré à portée de l'invention a la formule:

OH

matrice de I

polysaccharide-0-CH2-CH-CH2-NH-(CH2)m-

+NH2 +NH2 Il II

NH-C-(CH2)n-C—NH-anticorps dans laquelle la matrice de Polysaccharide m, n et l'anticorps sont tels que définis plus haut.

Le procédé d'immuno-dosage selon l'invention implique la mise en contact d'une solution contenant des fractions libres et liées avec le présent composite immuno-chimique au moyen de techniques bien connues de ceux du métier et ainsi on sépare les fractions libres des fractions liées. Voir Weir, «Immunology for Undergraduates», Churchill Livingstone, Edinburgh, England 5 (1973) and Ratcliffe, British Medicai Bulletin 30:32 (1974), ces publications étant incorporées ici in toto par référence.

Selon une forme d'exécution préférée, le procédé d'immu-no-dosage implique un procédé dans lequel on élimine l'agitation continue et ainsi la nécessité de boucher les tubes. Voir io Chan et al., Ann. Clin. Biochem., 12:173 (1975).Selon une autre forme d'exécution préférée, le procédé d'immuno-dosage est un procédé d'immuno-dosage sur colonne en phase solide utilisant les présents composites immuno-chimiques par des techniques bien connues de ceux du métier et ainsi on sépare les 15 fractions libres des fractions liées. Voir ci-dessus, Ratcliffe, supra, Boguslaski et al., Clinica Chemica Acta, 62: 349 (1974), Boguslaski et al., Analytical Chemistry, Vol. 47, No. 9,1583 (1975), et Davis et al., Clinica Chemica Acta, 66: 379 (1976). De préférence, les procédés d'immuno-dosage sont des procé-20 dés RIA dont les techniques sont également bien connues de ceux du métier Voir Skelley et al., «Radioimmunoassay», Clini-cal Chemistry, Vol. 19, No. 2,146 à 186 (1973), cette publication étant incorporée ici in toto par référence.

Un autre procédé à la portée de l'invention est un procédé 25 en suspension tels que ceux décrits plus haut sauf que le composite utilisé dans ce cas n'est pas le présent composite immuno-chimique qui est décrit plus en détail ci-après mais un réactif d'immuno-dosage comprenant une matrice finement divisée de Polysaccharide couplée par covalence à un anticorps secondaire 30 au moyen d'une des diverses techniques connues de ceux du métier. Bien que ce dernier procédé ne soit pas aussi efficace que les autres procédés de la présente invention (voir les exemples et la discussion ci-après), cependant, ils représentent une amélioration marquées et présentent des avantages nets compa-35 rés aux procédés à anticorps primaires connus tels que ceux de Chan et al.

Dans les procédés connus en suspension, on fixe l'anticorps primaire à une matrice, gênant ainsi la réaction biologique anticorps primaire-gros antigènes. En outre, ces procédés connus 40 nécessitent une addition précise d'un gel (c'est-à-dire des composites comprenant des anticorps primaires liés à des matrices) ce qui est une source constante d'erreurs. Cependant, les procédés en suspension à la portée de l'invention qui utilisent des anticorps secondaires fixés à des matrices éliminent les deux 45 difficultés décrites plus haut pour les procédés connus.

En général, on peut utiliser les composites immuno-chimiques à la portée de l'invention dans un procédé d'immuno-dosage sur colonne en phase solide en procédant comme suit. On place les présents composites immuno-chimiques dans ime coso lonne ou un autre récipient réactionnel approprié, de préférence lavés préalablement avec un tampon approprié, formant ainsi les appareils immuno-chimiques selon la présente invention pour séparer les fractions libres des fractions liées au moyen d'un procédé d'immuno-dosage sur colonne à phase solide. Pour 55 minimiser le coût ainsi que pour améliorer le débit à travers ladite colonne, on préfère ajouter aussi à la colonne des matrices de Polysaccharide non activées de diverses grosseurs. Toutes les colonnes chargées ont un volume de retenu (Hold-up) inhérent (c'est-à-dire la quantité maximale de fluide pouvant être retenu 60 par la colonne sans élution d'une quantité quelconque dudit fluide).

Si on désire utiliser les présents composites chimiques qui contiennent des anticorps secondaires dans un procédé d'immuno-dosage sur colonne en phase solide, de préférence, on conduit la réaction d'immuno-dosage primaire en dehors de la colonne. Lorsqu'on conduit l'immuno-dosage primaire en dehors de la colonne on peut le conduire dans n'importe quel volume approprié, de préférence, un volume final de 400 X. La réaction

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d'immuno-dosage primaire peut prendre de 0,5 à 5 heures, de préférence, 0,5 à 1 heure, le temps exact étant dicté suivant le dosage qu'on conduit. On ajoute alors à la colonne une partie aliquote dudit mélange réactionnel approximativement égal au volume de retenu de ladite colonne remplie et on incube sur la colonne d'anticorps secondaire à phase solide pendant 0,5 à 1 heure, le temps exact étant denouveau dicté suivant le dosage qu'on conduit. Après la période d'incubation, on lave la colonne avec une quantité appropriée d'un tampon approprié, la dite quantité étant suffisante pour séparer les fractions libres des fractions liées (c'est-à-dire qui est au moins égale au volume de retenu de la colonne). La colonne qui contient maintenant seulement la fraction liée est alors bouchée puis on procède au comptage.

Le temps réactionnel pour l'incubation des colonnes peut être très raccourci en utilisant un excès du deuxième anticorps lié et on peut même éluer immédiatement à travers les colonnes du deuxième anticorps en phase solide, si on utilise un excès du deuxième anticorps.

La procédé d'immuno-dosage décrit plus haut en utilisant les colonnes de deuxième anticorps en phase solide selon l'invention peut être donc séparé en trois étapes de base: l'incubation de la réaction d'anticorps primaires a un poste éloigné de la colonne, l'application d'une partie aliquote du mélange réactionnel à la colonne du deuxième anticorps en phase solide et l'élution de la fraction libre avec un tampon immédiatement ou après une période d'incubation minimale sur la colonne.

Le procédé décrit plus haut avec le deuxième anticorps en phase solide est simple, il est facile à automatiser, il est précis et versatile. Ainsi, on peut conduire aussi bien des dosages pour des grosses molécules (par exemple, TSH) et de petits haptènes (Digoxin, T4, T3) en utilisant les présents composites immuno-chimiques. De plus, on obtient des fractions liées et libre tout à fait distinctes avec une large marge d'erreurs dans des conditions utilisées pour la séparation. Le procédé ne gêne pas la réaction de liaison primaire, il est relativement peu coûteux et utilise un appareil des réactifs qu'on trouve facilement.

En ce qui concerne les petites molécules, les colonnes des deuxième anticorps en phase solide selon l'invention peuvent être utilisés de plus qu'un manière. Les colonnes peuvent être chargées d'anticorps primaires, d'antigènes marqués (ou haptè-ne), et on peut laisser se poursuivre la réaction entre l'échantillon et à la fois la réaction primaire et la réaction d'anticorps en phase solide simultanément dans l'espace libre de la colonne. Après un certains temps, on élue les colonnes avec un tampon pour séparer les fractions libres des fractions liées.

Un autre mode de faire consiste à incuber l'anticorps primaire sur la colonne de deuxième anticorps en phase solide et de produire ainsi des colonnes d'anticorps primaires sur lesquels l'anticorps primaire est lié biologiquement au deuxième anticorps fixé par covalence. On incube alors le produit de marquage et l'échantillon sur les colonnes qui servent de dispositif pour séparer les fractions libres et liées.

En plus du procédé sur colonne en phase solide décrit ci-dessus, selon l'invention on peut aussi utiliser les présents composites composites immuno-chimiques où lesdits composites contiennent des anticorps primaires couplés par covalence à une matrice dérivée d'un Polysaccharide.

En outre, un autre mode d'opération à la portée de l'invention implique un procédé d'immuno-dosage sur colonne en phase solide où le composite utilisé n'est pas le présent composite immuno-chimique décrit plus haut, mais un réactif d'immuno-dosage comprenant une matrice de Polysaccharide couplée par covalence à un anticorps secondaire par n'importe laquelle des techniques connues de ceux du métier. Bien que ce dernier procédé ne soit pas aussi efficace que les autres procédés selon l'invention, cependant, il représente une forte amélioration et présente de nets avantages comparé aux procédés à colonnes primaires en phase solide connus. Bien qu'il y ait une perte en activité d'anticorps (titre) lorsqu'on couple par covalence un deuxième anticorps à une matrice dérivée d'un Polysaccharide, la consommation du deuxième anticorps est cependant réduite s parceque de grandes quantités de globulines-véhicules ne sont pas nécessaires comme c'est le cas du procédé double à anticorps en phase liquide. Un autre avantage d'un procédé d'immuno-dosage utilisant les colonnes de deuxième anticorps en phase solide est que ce procédé facilite la difficulté de mesurer io avec précision une quantité précise d'un deuxième anticorps dans une suspension d'un gel parceque dans le présent procédé, il ne faut qu'une quantité minime du deuxième anticorps. Des niveaux au-dessus de cette quantité minimale préalablement établie n'ont pas d'effets sur la sensibilité ou la précision des 15 résultats obtenus avec le présent procédé.

Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter.

Exemple 1

On a ajouté 3 ml d'épichlorhydrine à un mélange de 6 g de 20 cellulose micro-crystalline du type 50 (grosseur particulaire moyenne = 50 (x) dans 30 ml d'hydroxyde de sodium IN en agittant vigoureusement à la température ordinaire. Après deux heures, on a enlevé l'excès d'épichlorhydrine par lavage avec un litre d'eau. On a alors mis en suspension la matrice cellulosique 25 activée, lavée, dans 60 ml d'une solution aqueuse à 50% de diméthylformamide. A cette matrice activée mise en suspension, on a ajouté 0,85 g de 1,6-hexanediamine. On a laissé la réaction se poursuivre en agittant pendant 2 heures à la température ordinaire puis, on a enlevé l'excès de 1,6-hexanediamine par 30 lavage avec un litre d'une solution aqueuse à 50% de diméthylformamide. Après lavage avec un litre de bicarbonate de sodium 0,1M, on a mis en suspension la matrice cellulosique dérivée dans 0,1M de bicarbonate de sodium pour obtenir un mélange de 1:1 de matrice dérivée: bicarbonate de sodium. 35 On a dissous 0,735 g (3 m moles) d'adipimidate de diméthy-le (DMA) dans 0,6 ml de solution froide d'hydroxyde de sodium 5N en agitant à 4 °C. Après avoir ajouté 0,1M de bicarbonate de sodium froid, on a réglé le pH 8,5 avec de l'hydroxyde de sodium IN. On a ajouté à cette solution 6 ml de bicarbonate de 40 sodium 0,1M contenant de 0,8 à 1,0 grammes de dérivés de cellulose et on a agité le mélange en tournant à 4 °C pendant deux heures.

Après avoir enlevé l'excès d'adipimidate de diméthyle, on a 45 mis en suspension la matrice cellulosique dérivée couplée dans 9 ml de bicarbonate de sodium 0,1M (4 °C) et 1,1 ml d'une fraction de gamma-globuline de chèvre anti-lapin (42,82 mg/ ml) dans 0,1M de bicarbonate de sodium (4 °C) et on a agité par rotation le mélange dans une chambre froide. On a alors lavé à 50 fond le deuxième anticorps immobilisé avec 0,1M de bicarbonate de sodium et finalement on la mis en suspension dans 10 ml de tampon au barbital de pH=8,0 contenant 0,1% de gélatine.

On a aussi préparé un autre composite immuno-chimique en procédant comme dans l'exemple 1 sauf que l'agent coupleur bi-55 fonctionnel utilisé était le dichlorhydrate de suberimidate de diméthyle (DMS) au lieu du DMA de l'exemple 1.

Exemple 2

On a ajouté 1 g de cellulose micro-crystalline de type 50 à 60 une solution de 1,0 g de bromure de cyanogène dans l'eau à la température ordinaire. On a immédiatement réglé le pH du mélange à environ 11,0 avec de l'hydroxyde de sodium 2N et on a maintenu à ce pH pendant 6 à 12 minutes en ajoutant de manière très contrôlée de l'hydroxyde de sodium 2N. Lorsque le 65 pH était stabilisé à environ la valeur 11, on a laissé reposer le mélange pendant encore 5 à 10 minutes avant de laver la matrice cellulosique activée avec 1,1 litre de bicarbonate de sodium 0,1M à 4 °C pour enlever l'excès de bromure de cyanogène.

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Gêï a alors mis en suspension la matrice cellulosique activée, lavée à fond dans 10 ml de bicarbonate de sodium 0,1M et on y a ajouté environ 47 mg de gamma-globuline de chèvre antilapin dans 1,3 ml de bicarbonate de sodium 0,1M. On a alors mélangé la suspension à la température ordinaire pendant une nuit.

Le lendemain, on a lavé le composite immuno-chimique avec 600 ml de bicarbonate de sodium 0,1N et 100 ml de tampon au barbital (pH=8,0) contenant 0,1 % de gélatine. Finalement, on a mis en suspension le composite dans environ 10 ml du tampon au barbital contenant de la gélatine ci-dessus.

Exemple 3

On a titré des préparations en phase solide de cellulose micro-cristalline activée telles que préparées dans les exemples 1 et 2 contre la gamma-globuline de lapin marquée avec 125I comme suit:

200 X - tampon au barbital de pH 8,0 contenant 3,5 % de BSA

100 X—de gamma-globuline de lapin marquée avec 125I contenant 0,1 % de sérum normal de lapin

100 tampon au barbital de pH 8,0

200 X - préparation du deuxième anticorps en phase solide

On a incubé chaque tube à la température ordinaire pendant 'h heure en agitant et ensuite on a centrifugé pendant 20 minutes à 1000 X g.

On a calculé les unités d'activité de la plus grande dilution, c'est-à-dire le titre du deuxième anticorps en phase solide dont résultait la fixation maximale d'antigènes marqués. La formule utilisée pour calculer les unités d'activité est la suivante:

j volume total de la préparation X d'anticorps en phase solide = Unités d'activité

titre grandeur de l'échantillon où la grandeur de l'échantillon dans le présent exemple est 200 X (0,2 ml) et où le volume total de préparation d'anticorps secondaires en phase solide = 10 ml. Du moment que ces titra-tions des conduites en présence de 100 X de sérum de lapin normal à 0,1 % en fait on cherche la plus grand dilution du deuxième anticorps en phase solide capable de fixer environ 1 micro-gramme de gamme-globuline de lapin. Les résultats de ces calculs sont indiqués dans le tableau I. Comme le montre clairement le tableau I, le titre des anti-sérums de chèvre antilapin couplés à la cellulose dérivée de DMA étaient bien supérieurs à la préparation de cellulose micro-crystalline couplée au bromure de cyanogène (CNBr) correspondante.

s Exemple 4

On a titré la cellulose dérivée telle que préparée dans l'exemple 2 et celle dérivée de DMS de l'exemple 1 contre la thyroxine-125! en présence d'environ 1 micro-gramme de gamma-globuline de lapin comme suit:

io 20 X — tampon au barbital de pH 8,0 contenant 3,5 % de BSA

100 X—de thyroxine-125! dans un tampon au barbital de pH 8,0 contenant 2% de BSA

100 X — anti-sérum de lapin contre la thyroxine à une dilu-15 tion de 1 pour 1000 dans un tampon au barbital de pH 8,0

200 X—préparation du deuxième anticorps en phase solide.

On a incubé chaque tube à la température ordinaire pendant environ V2 heure en agitant et ensuite, on a centrifugé pendant 20 20 minutes à 1000 X g. On a alors mis en suspension les précipités dans 1,0 ml tampon au barbital de pH 8,0 contenant 2% de BSA et on a centrifugé pendant 20 minutes à 1000 X g. Dans ces expériences, la thyroxine marquée est fixée immunologi-quement à ces anticorps spécifiques qui sont présents en tant 25 que fractions d'environ 1 micro-gamme de gammaglobuline de lapin. Ainsi, dans cet exemple, on peut mesurer indirectement les unités des deuxièmes anticorps liés à la matrice de cellulose en calculant la plus grande dilution de préparation du deuxième anticorps en phase solide pour donner la liaison maximale de 30 thyroxine marquée.

Le tableau I montre aussi les résultats de ces connées. Comme le montre clairement le tableau I, les expériences avec DMS se comparent favorablement aux données de DMA et les deux préparations sont bien meilleures que leurs témoins au bromure' 35 de cyanogène correspondant. On obtient aussi des améliorations analogues de la quantité d'unités d'activité isolées lorsque les présents composites immuno-chimiques contiennent des anticorps primaires au lieu d'anticorps secondaires.

Donc, il faut considérer les présents composites immuno-40 chimiques chargées positivement et contenant des imido-esters bi-fonctionnels comme agents coupleurs comme une grande amélioration par rapport aux composites immuno-chimiques antérieures utilisées dans les procédés d'immuno-dosages.

Tableau I

Support

*A. 1 g de cellulose micro-cristalline activée au bromure de cyanogène

A. 1 g de cellulose micro-cristalline activée à l'adipidimate de diméthyle

**B. 1 g de cellulose micro-cristalline activée au bromure de cyanogène

B. 1 g de cellulose micro-cristalline activée au suberimidate de diméthyle

Concentration en protéines de l'an- Titre Unité

ticorps contenant une fraction de d'activité

gamma-globuline isolée

47 mg de gamma-globuline de 1/2,3 115 chèvre anti-lapin

47 mg de gamma-globuline de 1/16,5 850 chèvre anti-lapin

40 mg de gamma-globuline de 1/3,2 160 chèvre anti-lapin

40 mg de gamma-globuline de 1/16 800 chèvre anti-lapin

% d'accroissement de l'activité isolée

739

500

*A — gamma-globuline de lapin marquée à 125I **B - thyroxine marquée à 125I

Exemple 5

On a ajouté 9 g de cellulose micro-cristalline de type 50 (grosseur particulaire moyenne = 50 jt) à 30 ml de solution d'acide chlorhydrique 6N et on a agité le mélange pendant 4 h à la température ordinaire. Après les 4 h de temps réactionnel on a neutralisé le mélange avec une solution d'hydroxyde de so-

9

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dium 6N et on lavé la cellulose hydrolysée avec 1200 ml d'eau. On a lavé encore la cellulose de remplissage (packed) avec 300 ml de méthanol, puis avec 100 ml de diéthyléther. On a mis en suspension le résidu de gel dans 100 ml d'éther et on a séché sous pression réduite.

On a répété plusieurs fois l'exemple 5 en faisant varier seulement le temps réactionnel. On a fait varier le temps réactionnel de 4 h à 6,24 et 64 h. L'examen microscopique a montré que la cellulose micro-cristalline de type 50 qu'on avait hydrolysée pendant 4 h et 6 h avait une longueur moyenne à l'état humide d'approximativement 15-20 |x et que celles hydroly-sées pendant 24 et 64 h avaient une longueur moyenne à l'état humide d'approximativement 10-12 |x.

Exemple 6

On a ajouté 3 ml d'épichlorhydrine à un mélange de 6 g de cellulose micro-cristalline de type 50 dans 30 ml d'hydroxyde de sodium IN en agitant vigoureusement à la température ordinaire. Après 2 h, on a enlevé l'excès d'épichlorhydrine par lavage avec 11 d'eau. On a alors mis en suspension la matrice cellulosique activée et lavée dans 60 ml d'une solution aqueuse à 50% de diméthylformamide. A cette matrice activée mise en suspension, on a ajouté 0,85 g de 1,6-hexanediamine. On a laissé la réaction se poursuivre en agitant pendant 2 h à la température ordinaire, puis on a enlevé l'excès de 1,6-hexanediamine par lavage avec 11 d'une solution aqueuse à 50% de diméthylformamide. Après lavage avec 11 de bicarbonate de sodium 0,1 M, on a mis en suspension la matrice cellulosique dérivée dans du bicarbonate de sodium 0,1M pour obtenir un mélange 1:1 de matrice dérivée: bicarbonate de sodium.

On a dissous 0,80 g (3 mmoles) de suberimidate de diméthyle (DMS) dans 0,6 ml de solution froide d'hydroxyde de sodium 5N en agitant à 4 °C. Après avoir ajouté 0,1 M de bicarbonate de sodium froid, on a réglé le pH à 8,5 avec de l'hydroxyde de sodium IN. A cette solution on a ajouté 6 ml de bicarbonate de sodium 0,1 M contenant 0,8-1,0 g de cellulose dérivée et on a agité en tournant le mélange à 4 °C pendant 2 h.

Après avoir enlevé l'excès de DMS, on a mis en suspension la matrice cellulosique dérivée, couplée dans 10 ml de bicarbonate de sodium 0,1 M (4 °C) et 1,3 ml d'une fraction de gammaglobuline de chèvre anti-lapin (36-38 mg/ml) dans 0,1 M de bicarbonate de sodium (4 °C) et on a agité le mélange en tournant dans une chambre froide. On a alors lavé à fond l'anticorps secondaire immobilisé avec 0,1 M de bicarbonate de sodium et finalement on l'a mis en suspension dans un tampon au barbital de pH = 8,0, contenant 0,1 % de gélatine pour obtenir un volume final de 25 ml.

On a répété l'exemple 6 en modifiant seulement la grosseur de la cellulose micro-cristalline utilisée. Les diverses autres grosseurs de cellulose micro-cristalline utilisée étaient une cellulose micro-cristalline de type 20 et une cellulose micro-cristalli-ne de type 50 qu'on avait hydrolysée pendant 4 h, 6 h, 24 h et 64 h.

Exemple 7

On a ajouté 1 g de cellulose micro-cristalline de type 50 à une solution de 1,0 g de bromure de cyanogène (CNBr) dans l'eau à la température ordinaire. On a immédiatement ajusté le pH du mélange à environ 11,0 avec de l'hydroxyde de sodium 2 N et on maintenu à ce pH pendant 6 à 12 mn en ajoutant de manière contrôlée de l'hydroxyde de sodium 2 N. Lorsque le pH était stabilisé à environ 20, on a laissé reposer le mélange pendant encore 5 à 10 mn avant de laver la matrice cellulosique activée avec 1,11 de bicarbonate de sodium 0,1 M à 4 °C pour enlever l'excès de CNBr.

On a alors mis en suspension la matrice cellulosique activée, lavée à fond dans 10 ml de bicarbonate de sodium 0,1 M et on y a ajouté environ 47 mg de gamma-globuline de chèvre antilapin dans 1,3 ml de bicarbonate de sodium 0,1 N. On a alors mélangé la suspension à la température ordinaire pendant une nuit.

Le lendemain, on a lavé le composite immuno-chimique avec 600 ml de bicarbonate de sodium 0,1 N et 100 ml de tampon au barbital (pH=8,0) contenant 0,1 % de gélatine. Finalement, on a mis en suspension le composite dans le tampon au barbital contenant de la gélatine ci-dessus pour obtenir une solution finale de 25 ml.

On a répété l'exemple 7 mais en modifiant la grosseur de la cellulose micro-cristalline utilisée. Les diverses autres grosseurs de cellulose micro-cristalline utilisées étaient une cellulose mi-cro-cristalline de type 20 et une cellulose micro-cristalline de type 50 qu'on avait hydrolysée pendant 4,6,24 et 64 h.

Exemple 8

On a titré des préparations de cellulose micro-cristalline de type 50, solides avec le deuxième anticorps préparées comme dans les exemples 6 et 7 contre la thyroxine-12SI en présence d'environ 1 [tg de gammaglobuline de lapin comme suit:

20 X — tampon au barbital de pH = 8,0 contenant 3,5 % BSA

100 X - thyroxine-125I dans un tampon au barbital de pH = 8,0 contenant 2% de BSA

100 X - antisérum de lapin contre la thyroxine à une dilution de 1 pour 1000 (contenant environ 1 (ig d'IgG de lapin)

200 X - préparations de deuxième anticorps en phase solide.

Dans les expériences où on agitait les corps réagissant on a incubé chaque tube à la température ordinaire pendant 'A h en agitant et ensuite on a centrifugé pendant 20 mn à 100 X g. On a mis en suspension les précipités dans 1,0 ml de tampon au barbital de pH - 8,0 contenant 3,5 % de BSA et on les a centrifugés de nouveau pendant 20 mn à 1000 X g. Cependant, dans les expériences où les corps réagissant n'étaient pas agités, on a incubé chaque tube à 37 °C pendant lh h et avant la centrifuga-tion, on a ajouté 1 ml de tampon au barbital de pH = 8 contenant 3,5 % de BSA. Ensuite, on a centrifugé chaque tube à 1000 X g pendant 20 mn.

Dans ces deux expériences, la thyroxine marquée est fixée immunologiquement à ces anticorps spécifiques qui sont présent en tant que fraction d'approximativement 1 micro-gramme de gammaglobuline de lapin. Ainsi, on peut mesurer indirectement les unités du deuxième anticorps fixées aux diverses matrices de cellulose en calculant la plus grande dilution de chacune des préparations d'anticorps qui précipitent en phase solide pour donner la fixation maximum de thyroxine marquée.

On a calculé les unités d'activité comme décrit plus haut sauf que le volume total de la préparation d'anticorps secondaire en phase solide est de 25 ml. Les résultats de ces calculs sont indiqués dans les Tableaux II et III. Comme le montre clairement les Tableaux II et III, le titre d'antisérum de chèvre anti-lapin couplé à la cellulose finement divisée dérivée de DMS était bien supérieur à la préparation de cellulose micro-cristalline finement divisée couplée à CNBr correspondante. En fait, le titre de cette cellulose finement divisée dérivée de DMS qui n'a pas subie d'agitation était même supérieur aux préparations couplées aux CNBr secouées.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

629 894

10

Tableau II Support

Concentration Titre en protéines de (agitation)

la fraction d'anticorps contenant la gamma globuline

Unités d'activité isolées (agitation)

Titre (sans Unités % Unités agitation) d'activité (agitation)

isolées (sans Unités (sans agitation) agitation)

1 g de cellulose micro-cristalline 47 mg de gamma 1/1,6 de type 50 activée avec CNBr globuline de chèvre anti-lapin

212

1 g de cellulose micro-cristalline do. de type 20 activée avec CNBr

1 g de cellulose micro-cristalline do. de type 50 hydrolysée par un acide pendant 4 h et activée avec CNBr

1/3,7

1/5

462

625

1/1,6

1/2,9

200

362

43,29% 57,92%

1 g de cellulose micro-cristalline de type 50 hydrolysée avec un acide pendant 6 h activée avec CNBr do.

1/5

625

1/2,9

362

57,92%

1 de cellulose micro-cristalline de type 50 hydrolysée avec un acide pendant 24 h activée avec CNBr do.

1/5

625

1/3,4

425

68,00%

1 g de cellulose micro-cristalline do. 1/5,5 688 1/3,4 425 61,77%

de type 50 hydrolysée avec un acide pendant 64 h activée avec CNBr

Tabelau III

Support Concentration en Titre Unités Titre (sans Unités % Unités protéines de la (agitation) d'activité agitation) d'activité (agitation)

fraction d'anticorps isolées isolées (sans Unités contenant la (agitation) agitation) (sans agitation)

gamma globuline

1 g de cellulose micro-cristalline 49 mg de gamma 1/5 750 1/2 250 33,33%

de type 50 activée avec DMS globuline de chèvre anti-lapin

1 g de cellulose micro-cristalline do. 1/11,5 1438 1/5,1 638 44,37%

de type 20 activée avec DMS

1 g de cellulose micro-cristalline do. 1/11,5 1438 1/7,0 875 60,85%

de type 50 hydrolysée avec un acide pendant 4 h activée avec DMS

1 g de cellulose micro-cristalline do. 1/11,5 1438 1/7,0 875 60,85%

de type 50 hydrolysée dans un acide pendant 6 h activée avec DMS

1 g de cellulose micro-cristalline do. 1/11,5 1438 1/7,0 875 60,85%

de type 50 hydrolysée dans un acide pendant 24 h activée avec DMS

11

629 894

Tabelau III Support

Concentration en Titre protéines de la (agitation)

fraction d'anticorps contenant la gamma globuline

1 g de cellulose micro-cristalline de type 50 hydrolysée dans un acide pendant 64 h activée avec DMS

do.

1/11,5

Unités d'activité isolées (agitation)

1438

Titre (sans Unités agitation) d'activité

isolées (sans agitation)

1/7,0

875

Unités

(agitation)

Unités

(sans agitation)

60,85%

Tableau IV Support

Cellulose micro-cristalline de type 50

Cellulose micro-cristalline de type 20

Cellulose micro-cristalline de type 50 hydrolysée avec un acide pendant 4 h

Cellulose micro-cristalline de type 50 hydrolysée avec un acide pendant 24 h

Cellulose micro-cristalline de type 50 hydrolysée avec un acide pendant 64 h

(agitation) Unités d'activité avec DMS Unités d'activité avec CNBr

750 212

1438 462

1438 625

1438 625

1438 625

= 3,54 = 3,11 = 2,30

= 2,30

= 2,09

(sans agitation) Unités d'activité avec DMS Unités d'activité avec CNBr

250 0

638 200

875 362

875 425

875 425

= Indéfini

=3,19

= 2,42

= 2,06

= 2,06

Unités d'activité avec DMS (sans agitation) Unités d'activité avec CNBr (agitation)

250 212

638 462

875 625

875 625

875 625

= 1,18 = 1,38 = 1,40

= 1,40

= 1,27

Tableau V

Temps de dosage Sérum témoin Sérum témoin à 37 °C «Beckman» de «Beckman»,

«Digoxin» thyroxine

Sérums témoins Sérum témoin «Beckman», tri-iodo-thyronine

Sérum témoin Sérum témoin «Beckman», «Beckman»,

TSH

TSH dilué 1/2

«Digoxin» y2 h

(ng/ml)

Tri-iodo-thyronine 2 h (ng/dl)

Thyroxine '/j h

(Hg/dl)

Hormone stimulant la 6 h thyrotropine humaine (micro-unités internationals/ml)

2,75

(2,0-2,7)*

86

(90-110)

12,3 (12-20)

222

(165-225)

85

(70-90)

5,0 (6-7)

77,0 (40-75)

35,2

* Les valeurs entre parenthèses sont celles obtenues avec le procédé connu à double anticorps.

629 894

12

Tableau V (suite)

Sérams témoins

Lederle I

Lederle II

Ortho

I

Ortho n

«Digoxin» (ng/ml)

1,44 (0,94-1,78)

>6,0

0,62 (0,6-1,2)

4,25 (3,2-5,2)

Tri-iodothyronine (ng/dl)

116 (98-118)

474 (409-457)

-

-

Thyroxine (Hg/dl)

7,2 (6,4-9,6)

16,1 (13,6-22)

-

-

Hormone stimulant la thyrotropine humaine (micro-unités internatio-nals/ml)

3,7 (3—4)

2,6

(2,3-2,95)

7,2 (3,9-7,9)

32,2 (23-39)

On a répété l'exemple 8, sauf qu'on a fait varier la grosseur 20 un facteur limitatif pour déterminer la quantité d'activité isolée,

de la cellulose micro-cristalline utilisée. Comme ci-dessus, cette En outre, on peut voir que bien qu'on n'obtienne pas le degré

variation impliquait l'utilisation de cellulose micro-cristalline de d'activité présente lorsqu'il y a agitation, les unités d'activité

type 20 et de cellulose micro-cristalline de type 50 qu'on avait sans agitation isolées en utilisant n'importe lequel des présents hydrolysée pendant 4,6,24 et 64 h. Les résultats de ces données composites immuno-chimiques dépassent de beaucoup la quan-

sont aussi indiqués dans les Tableaux II et III. 25 tité d'unités d'activité isolées avec agitation en utilisant seule-

En examinant le Tableau II, on remarque plusieurs choses. ment un anticorps couplé directement à une matrice par l'inter-

Dans la colonne intitulée «Unités d'activité isolées (agitation)», médiaire du procédé avec CNBr. La raison de cette grande amé-

du moment que la fiole est agitée, toutes les grosseurs de matri- lioration est que les présents composites fixent l'anticorps de ce doivent être mélangées également et mises en suspension manière efficace à une certaine distance de la surface de la

également et donc l'exposition du deuxième anticorps fixé par 30 matrice et ainsi ils diminuent l'effet et l'influence de la grosseur covalence à CNBr à l'antigène est la même. Cependant, il est de la matrice sur la réaction biologique. Selon la présente inven-clair que la grosseur de la matrice a un effet sur l'activité biologi- tion, on sépare l'anticorps de la surface de la matrice mais on que du deuxième anticorps couplé par covalence à CNBr. Cette couple aussi l'anticorps à une matrice dérivée par l'intermédiai-

colonne indique trois groupes de base soit la cellulose micro- re d'un agent coupleur qui, comme on l'a remarqué ci-dessus,

cristalline de type 50, la cellulose micro-cristalline de type 20 et 3s dans la plupart des cas n'a pas d'effet nuisible sur l'activité im-

la cellulose micro-cristalline de type 50 qu'on a hydrolysée pen- munologique de l'anticorps.

dant 4 h ou plus. Cette colonne montre qu'on peut isoler plus En plus des avantages qu'on vient de citer, la meilleure effi-

d'activité en agitant une matrice activée au CNBr qu'on en peut cacité des présents composites chimiques immunologiques per-

isoler en utilisant une cellulose micro-cristalline de type 50 met d'utiliser des grosseurs plus grandes de matrice dans un qu'on a hydrolysée pendant 4 h. 40 procédé sans agitation, ce qui rend possible d'utiliser une centri-

Dans la colonne intitulée «Unités d'activité isolées (sans fugeuse avec moins de g. La possibilité d'utiliser une centrifu-

agitation)», la possibilité de mise en suspension d'une particule geuse ayant une valeur g moindre est importante du fait que et donc la grosseur de la matrice entre en jeu ainsi que l'activité lorsqu'on travaille avec les présents composites immunologiques biologique du deuxième anticorps couplé par covalence. On en peut maintenant utiliser des centrifugeuses de laboratoire trouve dans cette colonne quatre sous-divisions soit la cellulose 45 classiques et ainsi éviter le coût élevé que sinon il faudrait pour micro-cristalline de type 50, la cellulose micro-cristalline de ty- la mise en œuvre d'un procédé connu, par exemple celui de pe 20, la cellulose micro-cristalline de type 50 qu'on a hydroly- Chan et al.

sée pendant 4 h et 6 h et la cellulose micro-cristalline de type 50 Comme le montre très clairement le Tableau IV, on obtient qu'on a hydrolysée pendant 24 et 64 h ; et on trouve l'activité une augmentation d'environ 27 à 40 % en utilisant les présents biologique maximum dans ce dernier cas. so composites immuno-chimiques à la portée de l'invention dans

En comparant de manière analogue les résultats du Tableau un procédé sans agitation comparé au procédé avec agitation où

III, on voit l'amélioration marquée des présents composites im- l'anticorps est directement couplé à une matrice par l'intermé-

muno-chimiques par rapport aux composites immuno-chimi- diaire du procédé avec CNBr.

ques du Tableau II. La colonne intitulée «Unités d'activité iso- Le Tableau V compare l'efficacité de l'utilisation des pré-lées (agitation)» a deux sous-groupes de base au lieu de trois qui 55 sents composites immuno-chimiques par rapport aux procédés apparaissent dans le Tableau II. C'est-à-dire que la cellulose doubles à anticorps antérieurs pour divers essais d'immuno-do-

micro-cristalline de type 50 diffère de la cellulose micro-cristal- sage. Comme l'indique le Tableau V les résultats obtenus en line de type 20 et plus fine. Cette différence implique qu'on ne utilisant le présent procédé et les présents composites immuno-

peut pas obtenir plus d'activité biologique que celle qu'on isole chimiques se comparent avantageusement au procédé connu en utilisant une cellulose micro-cristalline de type 20. Cepen- 60 utilisant le dit procédé double d'anticorps connu. Il est à remar-

dant, lorsqu'on examine la colonne intitulée «Unités d'activité quer que le radio-immuno-dosage de la thyroxine par le procédé

isolées (sans agitation)» on voit que la colonne est répartie en connu à double anticorps prend environ 2 h, tandis qu'un radio-

trois groupes, soit la cellulose micro-cristalline de type 50, la immuno-dosage utilisant les présents composites immuno-chi-

cellulose micro-cristalline de type 20 et la cellulose micro-cri- miques ne prend qu'une demi-heure.

stalline de type 50 qu'on a hydrolysée pendant 4,6,24 ou 64 h. 65

On peut donc conclure que lorsqu'on utilise une cellulose micro- Exemple 9

cristalline ou un Polysaccharide analogue ayant une dimension On a ajouté 3 ml d'épichlorhydrine à un mélange de 6 g de maximum de 18 n ou moins, la grosseur de la matrice n'est pas cellulose micro-cristalline de type 50 (grosseur particulaire

13

629 894

moyenne = 50 n) dans 30 ml d'hydroxyde de sodium 1N en agitant vigoureusement à la température ordinaire. Après 2 h, on a enlevé l'excès d'épichlorhydrine par lavage avec 11 d'eau. On a alors mis en suspension la matrice cellulosique activée, lavée dans 60 ml d'une solution aqueuse à 50% de diméthylformamide. On a ajouté à cette matrice activée mise en suspension, 0,85 g de 1,6-hexanediamine. On a laissé la réaction se poursuivre en agitant pendant 2 h à la température ordinaire, puis on a séparé l'excès de 1,6-hexanediamine par lavage avec 11 d'une solution aqueuse à 50% de diméthylformamide. Après lavage avec 1 I de bicarbonate de sodium 0,1 M, on a mis en suspension la matrice dérivée de cellulose dans 0,1 M de bicarbonate de sodium pour obtenir un mélange 1:1 de matrice dérivée: bicarbonate de sodium.

On a dissous 0,80 g (3 mmoles) de suberimidate de dimé thyle (DMS) dans 0,6 ml de solution froide d'hydroxyde de sodium 5 N en agitant à 4 °C. Après avoir ajouté 0,1 M de bicarbonate de sodium froid on a ajusté le pH à 8,5 avec de l'hydroxyde de sodium IN. On ajouté à cette solution 6 ml de bicarbonate de sodium 0,1 M contenant 0,8 à 1,0 g de denvé de cellulose et on a agité le mélange par rotation à 4 °C pendant 2 h.

Après séparation de l'excès de DMS, on a mis en suspension la matrice dérivée de cellulose couplée dans 9 ml de bicarbonate de sodium 0,1 M (4 °C) et 1,3 ml de fraction de gamma globuline de chèvre anti-lapin (36-38 mg/ml) dans 0,1 M de bicarbonate de sodium (4 °C) et on a agité par rotation le mélange dans une chambre froide. Oli a alors lavé à fond le deuxième anticorps immobilisé avec 0,1 M de bicarbonate de sodium et finalement on l'a mis en suspension dans un tampon au barbital de pH = 8,0 contenant 0,1 % de gélatine pour obtenir un volume final de 25 ml.

Exemple! 0 Procédé de préparation des colonnes:

On lave préalablement chaque colonne vide avec 1 ml de tampon au barbital contenant 0,1 % de gélatine et 2% de BSA. On lave dans des tubes distincts de la cellulose fibreuse et de la cellulose micro-cristalline de type 50. On centrifuge les fractions cellulosiques et on prépare des mélanges 1:1 (en volume) de 5 cellulose fibreuse:tampon et de cellulose micro-cristalline:tam-pon avec le dit tampon étant un tampon au barbital contenant 0,1 % de gélatine. On ajoute alors des volumes égaux des mélanges de cellulose fibreuse et de cellulose micro-cristalline pour obtenir un mélange final qu'on peut utiliser comme support io pour toutes les colonnes. Chaque colonne contient l'équivalent de 1,4 ml du mélange ci-dessus plus 200 X de la dilution appropriée d'anticorps de précipitation en phase solide. Cela donne un volume de retenue de 300 [xl. Ensuite, on lave préalablement chaque colonne chargée avec 1 ml du dit tampon au barbi-15 tal contenant 0,1 % de gélatine et 2% de BSA. Les colonnes sont alors fermées avec un capuchon pour le stockage.

Exemple II

On conduit le radio-immimo-dosage primaire dans un volume final de 400 X à un endroit éloigné de la colonne. On peut conduire la réaction primaire pendant 0,5 à 5 h et de préférence 25 0,5 à 1 h. On applique alors une partie aliquote du mélange réactionnel primaire (300 X)à la colonne du deuxième anticorps en phase solide. On laisse incuber ce mélange pendant 0,5 à 1 h. On lave alors la colonne à phase solide avec 1 ml à 3 ml du dit tampon au barbital contenant 0,1 % de gélatine et 2% de BSA 30 pour séparer les fractions libres des fractions liées. La colonne qui ne contient maintenant que les fractions liées est alors fermée avec un capuchon, puis soumise au comptage.

Des données obtenues en conduisant divers essais selon les procédés généraux esquissés dans les exemples ci-dessus sont 35 indiquées dans le Tableau VI.

Tableau VI

37 °C temps de dosage primaire éloigné de la colonne (h)

Température ordinaire temps d'incubation sur la colonne (h)

Sérums témoins

Lederle Lederle Sérum témoin Sérum témoin Sérum témoin I II «Beckman» de «Beckman» «Beckman»

thyroxine de TSH, dilué V2

«Digoxin»

'h l/n

1,23

3,48

-

-

(ng/ml)

(0,8-1,3)*

(3-3,8)

Thyroxine

'h

Va

8,33

17,37

20,05

7,58

—

(Hg/dl)

. 6,4-9,6)

(13,6-22)

(12-20)

(6-7)

Tri-iodo-

2

V:

110,60

517,57

106,70

93,45

_

thyronine

(98-118)

(409-457)

(90-110)

(70-90)

Hormone stimulant la

5

1

_

59,36

30,92

thyro-tropine humaine

(40-75)

(micro-unités interna-tionals/ml)

* Les valeurs entre parenthèse sont celles obtenues avec le procédé connu à anticorps double

629 894

Tableau Vf (suite)

«Digoxin» (ng/ml)

Thyroxine (jig/dl)

Tri-iodo-thyronine (ng/dl)

Hormone stimulant la thytrotropine humaine (micro-unités internatio-nals/ml)

37 °C

temps de dosage primaire loin de la colonne (h)

'/2

72 2

14

Température ordinaire, temps d'incubation sur la colonne (h)

'/2

V2

>/2

Sérums témoins Sérum témoin Ortho «Beckman» de I tri-iodothyronine

245,06 (165-225)

Ortho n

7,95

(3,9-7,9)

31,63 (23-39)

Le Tableau VI compare l'efficacité de l'utilisation des présents composites immuno-chimiques dans un dosage sur colonne en phase solide avec le procédé connu à anticorps double dans divers essais d'immuno-dosage. Comme l'indique le Tableau VI, les résultats obtenus en utilisant le présent procédé sur solonne en phase solide et les présents composites immuno-

chimiques se comparent favorablement au procédé connu utilisant le dit procédé classique à double anticorps.

Le présent procédé d'immuno-dosage sur colonne en phase 25 solide non seulement présente tous les avantages des procédés d'immuno-dosage en phase solide mais élimine la nécessité de la centrifugation et se prête également à l'automatisation.

C