CH624415A5

CH624415A5 -

Info

Publication number: CH624415A5
Application number: CH965676A
Authority: CH
Inventors: Ulrich Dr Eder; Gregor Dr Haffer; Gerhard Dr Sauer; Guenter Dr Neef; Rudolf Prof Wiechert; Alfred Dr Weber; Mario Dr Kennecke; Alfred Dr Popper; Rudolf Dr Mueller
Original assignee: Schering Ag
Priority date: 1975-08-01
Filing date: 1976-07-28
Publication date: 1981-07-31
Also published as: SE7608575L; JPS6253160B2; DK140172C; DD127114A5; FR2319650A1; JPS5238090A; FR2319650B1; DK140172B; DD131562A5; HU183019B; ATA565676A; IE44308L; IT1065955B; DK343976A; DE2534911C2; SE420731B; CS191981B2; IE44308B1; DE2534911A1; NL7608540A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 5-Androsten-17-on-Derivaten der allgemeinen Formel I

0

Ri ein Wasserstoffatom und R2 eine niedere Alkoxygruppe oder Rx und R2 gemeinsam eine niedere Alkylendioxygruppe 40 bedeuten, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein Sterin-Derivat der allgemeinen Formel II

55

worin Rx und R2 die obengenannte Bedeutung besitzen und R3 den 8 bis 10 Kohlenstoffatome enthaltenden Kohlenwasserstoffrest eines Sterins darstellt, mit einer zum Seitenkettenabbau von Sterinen befähigten Mikroorganismenkultur fermentìo tiert.

Unter einem niederen Alkoxyrest R2 soll vorzugsweise ein 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthaltender Alkoxyrest verstanden werden. Geeignete Alkoxyreste sind beispielsweise der Propyl-oxyrest und der Butyloxyrest oder insbesondere der Methoxy-65 rest und der Äthoxyrest.

Unter einem Alkylendioxyrest R! und R2 soll vorzugsweise ein 2 bis 6 Kohlenstoffatome enthaltender Alkylendioxyrest verstanden werden. Geeignete Alkylendioxyreste sind beispiels-

3

624 415

weise der 1,2-ÄthyIendioxyrest, der 1,3-Propylendioxyrest, der Zoo- oder Phytosterinen, wie zum Beispiel Cholesterin, Stigma-

2-Methyl-l,3-propylendioxyrest, der 2,2-Dimethyl+ 1,3-pro-pylendioxyrest der 2,3-Butylendioxyrest oder der 1,4-Butylen-dioxyrest.

Unter einem 8 bis 10 Kohlenstoffatome enthaltenden Kohlenwasserstoffrest R3 soll ein Rest verstanden werden, wie er beispielsweise in den Seitenketten von natürlich vorkommenden

Sterin, Campesterin, Brassicasterin oder den Sitosterinen vorliegt.

Geeignete Sterin-Derivate der allgemeinen Formel II sind 5 beispielsweise solche Verbindungen, die durch die allgemeine Formel II a

(IIa)

worin Rj und R2 die obengenannte Bedeutung besitzen, die 25 eine sehr begrenzte Fähigkeit besitzen, aus Sterinen 1,4-Andro-

Bindung eine Einfachbindung oder eine Doppelbin- stadien-3,17-dion oder 4-Androsten-3,17-dion zu bilden.

dung darstellt und R9 ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein oder eine Äthylgruppe bedeutet charakterisiert werden können. Verfahren zum Seitenkettenabbau Sterinen zu erstellen, dem

Es ist bekannt, dass zahlreiche Mikroorganismen (so zum die Nachteile der bekannten Verfahren nicht anhaftet.

Beispiel solche der Gattungen Arthrobacter, Brevibacterium, 30 Diese Aufgabe wurde durch die Bereitstellung eines Ver-Microbacterium, Protaminobacter, Bacillus, Norcardia, Strepto- fahrens gelöst, welches dadurch gekennzeichent ist, dass man myces und insbesondere sondere Mycobacterium) die natürliche ein Sterin-Derivat der allgemeinen Formel II mit einer zum Fähigkeit besitzen, Zoo- und Phytosterine zu Kohlendioxyd und Seitenkettenabbau von Sterinen befähigten Mikroorganismen-Wasser abzubauen und dass bei diesem Abbau intermediär kultur fermentiert.

4-Androsten-3,17-dion und l,4-Androstadien-3,17-dion gebil- 35 Für den Fachmann ist es gewöhnlich sehr überraschend, det werden. dass bei dieser fermentativen Umwandlung in hohen Ausbeuten

Da zahlreiche Zoo- und Phytosterine (wie zum Beispiel das die 5-Androsten-17-on-Derivate der allgemeinen Formel I geCholesterin, das Stigmasterin, das Campesterin, das Brassicaste- bildet werden. Dies deshalb, weil beispielsweise bekannt ist, rin oder die Sitosterine) in der Natur weit verbreitet und somit dass der Seitenkettenabbau von Sterinen durch ein sehr komieicht zugängliche Rohstoffe für die Synthese pharmakologisch 40 plexes Fermentsystem bewirkt wird und man nicht erwarten wirksamer Steroide sind, wurden zahlreiche Untersuchungen konnte, dass alle am Seitenkettenabbau natürlicher Steroide durchgeführt, den Abbau der Sterine so zu lenken, dass bei der mitwirkenden Enzyme die Fähigkeit besitzen, auch den Seiten-Fermentation ein weiterer Abbau des gebildeten 4-Androsten- kettenabbau der in der Natur nicht vorkommenden Sterin-Deri-3,17-dions und des l,4-Androstadien-3,17-dions verhindert vate der allgemeinen Formel II zu bewirken. Darüberhinaus wird. 45 konnte man beispielsweise nicht vorhersehen, dass die den Ab-

So war es beispielsweise möglich, den weiteren Abbau von bau des l,4-Androstadien-3,17-dions und des 4-Androsten-l,4-Androstadien-3,17-dion und 4-Androsten-3,17-dion 3,17-dions bewirkenden Enzymsysteme nicht befähigt sind, die dadurch zu verhindern, dass man den Fermentationsansätzen 5-Androsten-17-on-Derivate der allgemeinen Formel I abzu-Inhibitoren zusetzt. (Siehe deutsche Offenlegungsschriften bauen.

1 543 269 und 1 593 327, sowie die US-Patentschrift 50 Abgesehen von der Verwendung anderer Ausgangsverbin-

1 208 078). Durch die Verwendung von Inhibitoren wird aber düngen und von der Tatsache, dass die Umsetzung in Abwesen-eine technische Durchführung dieser Umsetzungen sehr auf- heit von Inhibitoren durchgeführt werden kann, wird das erfin-wendig ; dies nicht zuletzt deshalb, weil die verwendeten Inhibi- dungsgemässe Verfahren vorzugsweise unter den gleichen Fer-toren nach erfolgter Umsetzung aus den Fermentationskulturen mentationsbedingungen durchgeführt, welche man auch bei den entfernt werden müssen um zu vermeiden, dass diese Stoffe in 55 bekannten mikrobiologischen Seitenkettenabbau-Reaktionen die Abwässer gelangen. Darüberhinaus haben diese bekannten von Sterinen anwendet.

Umsetzungen den Nachteil, dass bei ihnen stets 1,4-Androsta- Erfindungsgemäss wird die fermentation unter Verwendung dien-3,17-dion oder Gemische von l,4-Androstadien-3,17- der Mikroorganismenkulturen durchgeführt, welche man üb-dion und 4-Androsten-3,17-dion gebildet werden. Das gebilde- licherweise zum Seitenkettenabbau von Sterinen verwendet, te 1,4-Androstadien-3,17-dion ist aber als Ausgangssubstanz 60 Geeignete Kulturen sind beispielsweise zum Seitenkettenabbau für die Synthese zahlreicher pharmakologisch wirksamer Steroi- von Sterinen befähigte Baterienkulturen der Gattungen Arthrode wenig geeignet. bacter, Brevibacterium, Microbacterium, Protaminobacter,

Andererseits konnte der weitere Abbau von 1,4-Androsta- Streptomyces oder insbesondere der Gattung Mycobacterium. dien-3,17-dion und von 4-Androsten-3,17-dion auch dadurch Als geeignete Mikroorganismen seien beispielsweise genannt: verhindert werden, dass man zur fermentativen Umwandlung 65 Microbacterium lactum IAM-1640, Protaminobacter alboflavus der Sterine mutierte Mikroorganismen der Gattung Mycobacte- IAM-1040, Bacillus roseus IAM-1257, Bacillus sphäricus rium verwendete. (Siehe US-Patentschrift 3 684 657). Die bis- ATTC-7055, Norcardia gardneri IAM-105, Norcardia minima her gezüchteten Mutanten haben aber den Nachteil, dass sie nur IAM-374, Norcardia corallina IFO-3338, Streptomyces rubes-

624 415

cens IAM-74 oder insbesondere die Mikroorganismen Mycobacterium avium IFO-3082, Mycobacterium phlei IFO-3158, Mycobacterium phlei (Institut für Gesundheitswesen, Budapest Nr. 29), Mycobacterium phlei ATCC-354, Mycobacterium smegmatis IFO-3084, Mycobacterium smegmatis ATCC-20, Mycobacterium smegmatis (Institut für Gesundheitswesen, Budapest Nr. 27), Mycobacterium smegmatis ATCC-19979, Mycobacterium fortuitum CBS-49566, Mycobacterium spec. NRRL-B-3805 und Mycobacterium spec. NRRL-B-3683.

Unter den für diese Mikroorganismen üblicherweise verwendeten Kulturbedingungen werden in einem geeigneten Nährmedium unter Belüften, Submerskulturen angezüchtet. Dann setzt man in der Regel den Kulturen das Substrat (in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst oder vorzugsweise in emulgierter Form) zu und fermentiert, bis eine maximale Substratumwandlung erreicht ist.

Geeignete Substratlösungsmittel sind beispielsweise Methanol, Äthanol, Glykolmonomethyläther, Dimethylfomamid oder Dimethylsulfoxyd). Die Emulgierung des Substrats kann beispielsweise bewirkt werden, indem man dieses in mikronisierter Form oder in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel (wie Methanol, Äthanol, Aceton, Glykolmonomethyläther, Dime-thylformamid oder Dimethylsulfoxyd) gelöst unter starker Turbulenz in (vorzugsweise entkalktem) Wasser, welches die üblichen Emulgationshilfen enthält, eindüst. Geeignete Emulga-tionshilfen sind nichtionogene Emulgatoren, wie zum Beispiel Äthylenoxydaddukte oder Fettsäureester von Polyglykolen. Als geeignete Emulgatoren seien die handelsüblichen Netzmittel Tegin(R), Tagat(R), Tween(R) und Span^R) Beispielsmässig genannt.

Insbesondere bei der Fermentation der 3-Alkoxyverbindun-gen der allgemeinen Formel II ermöglicht die Emulgierung der Substrate normalerweise einen erhöhten Substratdurchsatz und somit eine Steigerung der Substratkonzentration. Es ist aber selbstverständlich beispielsweise auch möglich, bei dem erfin-dungsgemässen Verfahren andere Methoden zur Steigerung des Substratdurchsatzes, wie sie dem Fermentationsfachmann wohl bekannt sind, anzuwenden.

Die optimale Substratkonzentration, Substratzugabezeit und Fermentationsdauer ist im allgemeinen von der Struktur des verwendeten Substrates und der Art des verwendeten Mikroorganismus abhängig. Diese Grössen müssen, wie dies bei mikrobiologischen Steroidumwandlungen allgemein erforderlich ist, im Einzelfall normalerweise Vorversuche, wie sie dem Fachmann geläufig sind, ermittelt werden.

Die weitere Umsetzung von 5-Androsten-17-on-Derivaten der allgemeinen Formel I mit Rj und R2 in der Bedeutung einer niederen Alkylendioxygruppe zu beispielsweise pharmakologisch wirksamen Steroiden bereitet gewöhnlich keine Schwierigkeiten. So kann man die Ketalgruppe dieser Verbindungen beispielsweise, gegebenenfalls nach Reduktion der Ketogruppe mit Natriumborhydrid, mittels Säuren hydrolytisch abspalten und erhält so die bekannten Steroide 4-Androsten-3,17-dion und Testosteron.

Demgegenüber enthalten die 5-Androsten-17-on-Derivate der allgemeinen Formel I mit Rt in der Bedeutung eines Wasserstoffatoms und R2 in der Bedeutung einer niederen Alkoxygruppe normalerweise eine relativ schwer spaltbare Äthergruppe. Es sind zwar zahlreiche Methoden zur Spaltung von Ätherbindungen bekannt, die meisten bekannten Methoden zur Ätherspaltung eignen sich aber in der Regel nicht zur Spaltung dieser Verbindungen.

Die Reaktion der 17-Ketogruppe der 5-Androsten-17-on-Derivate der allgemeinen Formel I kann üblicherweise mittels der dem Fachmann wohlbekannten Arbeitsmethoden erfolgen. (Siehe zum Beispiel John Fried: Organic Reactions in Steroid Chemistry-van Nostrand Reinhold Comp. New York etc. 1972, Volume 1, Seite 61 ff). So kann man diese Verbindungen beispielsweise mit Natriumborhydrid oder Lithiumaluminiumhydrid umsetzen und erhält die entsprechenden 17ß-Hydroxy-5-androsten-Derivate.

Ebenso bekannt sind die Methoden: die 17-Ketogruppe zu 5 alkylieren (siehe zum Beispiel John Fried: Organic Reactions in Steroid Chemistry - van Nostrand Reinhold Comp., New York etc. 1972, Volume 2, Seite 53 ff).

Die als Ausgangsverbindungen im erfindungsgemässen Verfahren verwendeten 3-Alkoxyverbindungen der allgemeinen io Formel II können aus den entsprechenden 3-Hydroxyverbin-dungen hergestellt werden, indem man diese beispielsweise nach der Methode J.P. Duszo et al. (Steroids 1966,495—509) mit Trialkylorthoameisensäureestern in Gegenwart von Perchlorsäure umsetzt.

15 Die als Ausgangsverbindungen im erfindungsgemässen Verfahren verwendeten 3-Ketale der allgemeinen Formel II lassen sich beispielsweise aus den 3-Hydroxyverbindungen herstellen, indem man diese beispielsweise nach der Methode von Oppenauer oxydiert und die gebildeten 3-Keto-A4-steroide mit den 20 Alkandiölen in Gegenwart von p-Toluolsulfonsäure ketalisiert (C. Djerassi: Steroid Reactions Holden Day Inc., San Francisco 1963, Seite 3 bis 8 und 92 bis 101).

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung. •

25

Beispiel 1

a) Ein 21 Erlenmeyerkolben wird mit 500 ml einer sterilen Nährlösung enthaltend 1% Hefeextrakt, 0,45% Dinatriumhy-drogenphosphat, 0,34% Kaliumdihydrogenphosphat und 0,2%

30 Tween(R)80 - eingestellt auf pH 6,7 - beschickt mit einer Trok-kenkultur von Mycobacterium spec NRRL-B-3805 beimpft und 3 Tage lang mit 190 Umdrehungen pro Minute bei 30 °C geschüttelt.

b) 50 g Cholesterin werden in 120 ml Dichlormethan und

35 50 ml Orthoameisensäuretriäthylester unter Argon suspendiert, mit 0,5 ml 70 %iger Perchlorsäure versetzt und 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann giesst man die Mischung in Wasser, rührt zwei Stunden lang, extrahiert mit Dichlormethan, wäscht die Dichlormethanphase, engt sie im Vakuum ein, kri-40 stallisiert den Rückstand aus Methanol um und erhält 43,25 g 3ß-Äthoxy-5-cholesten vom Schmelzpunkt 82 bis 83 °C.

25,0 g der so dargestellten 3-Äthoxy-5-cholestens werden mit 10 g Tegin (R)und 750 ml Wasser mit Natronlauge auf pH-11,3 eingestellt bei 95 °C mit einem Ultra-Turrax(R) (Firma 45 Jahnke und Kunkel, BRD) 5 Minuten emulgiert. Man sterilisiert die Emulsion 20 Minuten lang bie 120 °C.

c) Ein 500 ml Erlenmeyerkolben mit 85 ml steriler Nährlösung enthaltend 2,0% Cornsteep liquor, 0,3% Diammoniumhy-drogenphosphat und 0,25 % Tween 80 - eingestellt auf pH - 7,0

50 — wird mit 5 ml der Mycobacteirum spec. Vorkultur beimpft, mit 14 ml der 3ß-Äthoxy-5-cholesten-Suspension (dies entspricht 0,5 g 3-Äthoxy-5-cholesten) versetzt und 120 Stunden lang mit 220 Umdrehungen pro Minute bei 30 °C geschüttelt.

Dann extrahiert man die Fermentationskultur mit Tetra-55 chloräthan, engt die organische Phase nach Waschen ein, reinigt den Rückstand durch Chromatographie über eine Kieselgelsäule und erhält neben 0,025 g 3-Äthoxy-5-cholesten, nach Umkri-stallisation aus Äthylacetat 0,25 g 3ß-Äthoxy-5-androsten-17-on vom Schmelzpunkt 146 bis 147 °C.

60

Beispiel 2

a) 50 g eines Stigmasterin-Rohprodukts werden unter den im Beispiel 1 b beschriebenen Bedingungen in den 3ß-Äthyl-65 äther überführt.

25,0 g des so erhaltenen 3ß-Äthoxy-stigmasterin-Rohpro-dukts (Reinheit 92%ig) werden, wie im Beispiel 1 b beschrieben emulgiert.

b) 14 ml der so dargestellten 3ß-Äthoxy-stigmasterin-Su-spension (dies entspricht 0,46 g 3-Äthoxy-stigmasterin) werden unter den im Beispiel 1 c beschriebenen Bedingungen 120 Stunden lang mit einer Mycobacterium spec. NRRL-B-3805-Kultur fermentiert und man erhält nach Aufbereitung wie im Beispiel 1 c beschrieben 0,1 g 3ß-Äthoxy-stigmasterin und 0,18 g 3ß-Äthoxy-4-androsten-17-on vom Schmelzpunkt 146 bis 147 °C.

Beispiel 3

a) 25 g 4-Cholesten-3-on werden mit 150 ml Benzol, 30 g Glykol und 0,5 g p-Toluolsulfonsäure versetzt und 24 Stunden lang am Wasserabscheider erhitzt.

Dann lässt man die Mischung erkalten, verdünnt sie mit Benzol, wäscht die Benzolphase mit Natriumhydrogencarbonat und Wasser, trocknet sie über Natriumsulfat und engt sie im Vakuum ein.

Der Rückstand wird aus Aceton-Hexan umkristallisiert und man erhält 19,6 g 3,3-Äthylendioxy-5-cholesten vom Schmelzpunkt 130 bis 132 °C.

5 g 3,3-Äthylendioxy-5-cholesten werden bei 60 °C in 100 ml Dimethylformamid gelöst.

b) Unter den Bedingungen des Beispiels 1 c werden 100 ml einer Mycobacterium spec. NRRL-B-3805-Kultur hergestellt, mit 1 ml 3,3-Äthylendioxy-5-cholesten-Lösung versetzt und 96 Stunden lang fermentiert.

Man arbeitet die Fermentationsmischung auf, wie im Beispiel 1 c beschrieben und erhält neben 0,01 g 3,3-Äthylendioxy-5-cholesten 0,013 g 3,3-Äthylendioxy-5-androsten-17-on vom Schmelzpunkt 164 bis 165 °C.

Beispiel 4

a) Unter den im Beispiel 1 b beschriebenen Bedingungen werden 25 g 3ß-Methoxy-5-cholesten emulgiert.

b) Unter den im Beispiel 1 c beschriebenen Bedingungen werden 100 ml einer Mycobacterium spec. NRRL-B-3805-Kul-tur hergestellt, die Kultur 24 Stunden lang incubiert, mit 7 ml 3-Methoxy-5-cholesten-Suspension (dies entspricht 0,25 g 3-Methoxy-5-cholesten) versetzt und weitere 96 Stunden lang fermentiert. Man arbeitet die Fermentationsmischung auf, wie im Beispiel 1 c beschrieben und erhält 110 mg 3ß-Methoxy-5-andorsten-17-on vom Schmelzpunkt 141 bis 142 °C.

Beispiel 5

a) 25 g 4-Cholesten-3-on werden unter den im Beispiel 2 a beschriebenen Bedingungen, jedoch unter Verwendung von 2,2-Di-methylpropandiol anstelle von Glykol, umgesetzt und aufbereitet und man erhält 17,3 g 3,3-(2', 2'-Dimethylpropylen-dioxy)-5-cholesten vom Schmelzpunkt 144 bis 145 °C.

0,5 g 3,3-(2', 2'-Dimethylpropylendioxy)-5-cholesten werden bei 60 °C in 15 ml Dimethylformamid gelöst.

b) Unter den im Beispiel 1 b beschriebenen Bedingungen werden 100 ml einer Mycobacterium spec. NRRL-B-3805-Kul-tur hergestellt und 24 Stunden lang incubiert. Dann setzt man der Kultur 0,15 ml der 3,3-(2', 2'-Dimethylpropylendioxy)-5-cholesten-Lösung zu und fermentiert weitere 96 Stunden. Man arbeitet den Fermentationsansatz auf, wie im Beispiel 1 c beschrieben und erhält neben 0,01 g 3,3-(2\ 2'-Dimethylpropy-lendioxy)-5-cholesten 0,03 g 3,3-(2', 2'-Dimethylpropylendi-oxy)-5-androsten-17-on vom Schmelzpunkt 200 bis 201 °C.

Beispiel 6

a) Unter den Bedingungen des Beispiels 1 a werden 500 ml einer Vorkultur von Mycobacterium spec. NRRL-B-3683 hergestellt.

b) 100 ml einer Nährlösung gemäss Beispiel 1 c werden mit

5 624 415

10 ml der Vorkultur beimpft und 24 Stunden lang incubiert. Dann setzt man der Kultur 1,4 ml einer gemäss Beispiel 1 b hergestellten 3ß-Äthoxy-5-cholesten-Suspension zu, (dies entspricht 0,05 g 3ß-Äthoxy-5-cholesten) fermentiert weitere 96 5 Stunden, arbeitet den Fermentationsansatz auf, wie im Beispiel 1 c beschrieben und erhält neben 0,005 g 3-Äthoxy-5-cholesten 0,025 g 3ß-Äthoxy-5-androsten-17-on vom Schmelzpunkt 147 °C.

xo Beispiel 7

Unter den Bedingungen des Beispiels 6, jedoch unter Verwendung von Mycobacterium phlei (Institut für Gesundheitswesen, Budapest Nr. 29) oder von Mycobacterium phlei ATCC-354 werden aus 0,05 g 3ß-Äthoxy-5-cholesten neben 0,02 g 15 Ausgangsverbindung 0,015 g 3ß-Äthoxy-5-androsten-17-on erhalten.

Beispiel 8

Unter den Bedingungen des Beispiels 6, jedoch unter Ver-20 Wendung von Mycobacterium smegmatis ATCC-20 werden aus 0,05 g 3ß-Äthoxy-5-cholesten 0,01 g 3ß-Äthoxy-5-andro-sten-17-on erhalten.

Beispiel 9

Unter den Bedingungen des Beispiels 6, jedoch unter Verwendung von Mycobacterium smegmatis ATCC-19979 werden aus0,05g3ß-Äthoxy-5-cholesten0,02g3ß-Äthoxy-5-andro-sten-17-on erhalten.

Beispiel 10

Unter den Bedingungen des Beispiel 6, jedoch unter Verwendung von Mycobacterium fortuitum CBS 49566 wurden aus 0,05 g3ß-Äthoxy-5-choIesten 0,02 g 3ß-Äthoxy-5-androsten-17-on erhalten.

35 Beispiel 11

a) Unter den Bedingungen des Beispiels 1 a werden in einem 750 ml Erlenmeyerkolben 200 ml einer Mycobacterium spec. NRRL-B-3805-KuItur bei 29 °C angezüchtet.

b) Ein 501 Fermenter mit 401 einer sterilen Nährlösung 40 enthaltend 1,23% Hefeextrakt (65%ig), 0,68% Kaliumdihy-

drogenphosphat und 0,2% Tween(R) 80 - eingestellt auf pH=6,0 - wird mit 200 ml der Mycobacterium spec. Anzuchtskultur beimpft und die Vorkultur bei 29 °C unter Belüftung (2 m3 pro Stunde) 48 Stunden lang incubiert.

45 c) 200 g 3ß-Äthoxy-5-cholesten werden mit 80 g Tegin(R) und 61 mit Natronlauge auf pH= 11,3 eingestelltes Wasser bei 95 °C mit einem Dispax (R)-Reaktor D-3-6-6 (Firma Jahnke und Kunkel; BRD) 30 Minuten lang emulgiert. Man sterilisiert die Emulsion 20 Minuten lang bei 120 °C.

d) Ein 501 Fermenter wird mit 401 steriler Nährlösung der gleichen Zusammensetzung, wie im Beispiel IIb beschrieben, jedoch eingestellt auf pH=6,5 — beschickt, mit 21 Mycobacterium spec. Vorkultur beimpft und unter Belüften (1 m3 pro 55 Stunde) und Rühren (220 Umdrehungen pro Minute) 24 Stunden lang bei 29 °C incubiert.

Dann setzt man der Kultur die gemäss Beispiel 11c hergestellte 3ß-Äthoxy-5-cholesten-Emulsion zu und fermentiert weitere 92 Stunden lang.

so Nach erfolgter Fermentation wird die Kultur 3 mal mit je 51 Äthylenchlorid extrahiert, der Äthylenoxydextrakt filtriert und im Vakuum eingeengt.

Der Rückstand (148 g) wird über eine Kieselgelsäule Chromatographien, aus Äthylacetat umkristallisiert und man erhält

6 83,5 g 3ß-Äthoxy-5-androsten-17-on vom Schmelzpunkt 145 bis 146,5 °C.

C

Claims

624 415
2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, 20 dass man ein Sterin-Derivat der allgemeinen Formel II a

(IIa)

worin R( ein Wasserstoff atom und Rz eine niedere Alkoxygruppe oder Rj und R2 gemeinsam eine niedere Alkylendioxygruppe, die Bindung eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung und R9 ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder eine Äthylgruppe bedeutet, mit einer zum Seitenkettenabbau von Sterinen befähigten Mikroorganismenkultur fermentiert.

2

PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von 5-Androsten-17-on-Deri-vaten der allgemeinen Formel I

(I),

10

(II),

worin

R.! ein Wasserstoff atom und R2 eine niedere Alkoxygruppe oder Rj und R2 gemeinsam eine niedere Alkylendioxygruppe bedeuten, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Sterin-Derivat der allgemeinen Formel II

worin Rj und R2 die obengenannte Bedeutung besitzen und R3 15 den 8 bis 10 Kohlenstoff atome enthaltenden Kohlenwasserstoffrest eines Sterins darstellt, mit einer zum Seitenkettenab-bau von Sterinen befähigten Mikroorganismenkultur fermentiert.
3. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Fermentation eine zum Seitenkettenabbau von Sterinen befähigte Mikroorganismenkultur der Gattungen Ar-throbacter, Brevibacterium, Microbacterium, Protaminobacter, Bacillus Norcardia, Streptomyces oder insbesondere der Gattung Mycobacterium verwendet.