Verfahren zur Herstellung der l-Glutaminsäure
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der l-Glutaminsäure durch Züchtung von Mikroorganismen in einem Essigsäure enthaltenden Kulturmedium.
Es sind verschiedene Mikroorganismen bekanntgeworden, welche l-Glutaminsäure in Kulturmedien herzustellen oder anzureichern vermögen. Diese für industrielle Herstellung der l-Glutaminsäure verwendeten Mikroorganismen erheischen im allgemeinen für ihr Wachstum Biotin, wobei sich herausstellt, dass die Fähigkeit zur Produktion der l-Glutaminsäure in Gegenwart von Biotin in einer Menge, welche ein gewisses Ausmass des Kulturmediums überschreitet, stark vermindert wird. Dadurch werden unangenehme Massnahmen für die Kontrolle der Wirkung des Biotins im Kulturmedium während des Züchtungsvorganges erforderlich. Hinzu kommt, dass bei den meisten üblichen und wirtschaftlichen Nährquellen, wie z. B.
Molassen, Stärkehydrolysat, Maisflüssigkeit und Hefeextrakten zu viel Biotin vorhanden ist, um unter Verwendung der bekannten Mikroorganismen derartige Methoden erfolgreich durchführen zu können, es wäre denn, man würde die Wirkung von Biotin in geeigneter Weise einstellen, was aber nach den bekannten Methoden praktisch unmöglich ist.
Ferner ist bekannt, dass man l-Glutaminsäure durch Züchtung von Mikroorganismen in einem Essigsäure enthaltenden Kulturmedium herstellen kann. Zufolge der schlechten Ausbeute an l-Glutaminsäure sind aber die bisher bekanntgewordenen Methoden industriell nichtverwertbar.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich nun auf eine wirtschaftlich und industriell geeignete Methode zur Herstellung der l-Glutaminsäure durch Züchtung eines Mikroorganismus, welcher durch die Anwesenheit von Biotin nicht beeinträchtigt wird, und dies unter Verwendung der billigen Essigsäure als Kohlenstoffquelle, wobei man l-Glutaminsäure in guter Ausbeute und bei hoher Reinheit erhält.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man einen l-Glutaminsäure erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Brevibacterium, Corynebacterium oder Micrococcus, welcher kein Biotin, sondern eine ungesättigte Fettsäure mit 16 bis 22 Kohlenstoffatomen verlangt, in einem Kulturmedium züchtet, welches anorganische Salze, eine ungesättigte Fettsäure mit 16 bis 22 Kohlenstoffatomen oder ein Salz oder einen Ester derselben mit einem mehrwertigen Alkohol, eine Stickstoffquelle und als Kohlenstoffquelle eine von sämtlichen vorgenannten Verbindungen verschiedene, C, H und 0 enthaltende organische Verbindung enthält, dass man bei der Züchtung die Konzentration der Kohlenstoffquelle durch Essigsäurezugabe auf einem Wert von höchsten 1 Gew.-Teil, bezogen auf 100 Vol.-Teile des Kulturmediums,
wobei sich Gewichtsteile und Volumteile jeweils wie g und cm3 verhalten, hält, nachdem der Verbrauch der Kohlenstoffquelle im ursprünglichen Kulturmedium deren Konzentration auf weniger als 1 Gew.-Teil, bezogen auf 100 Vol.-Teile des Kulturmediums, herabgesetzt hat, und dass man die im Kulturmedium erzeugte und angereicherte l-Glutaminsäure abtrennt.
Die für das erfindungsgemässe Verfahren verwendbaren Mikroorganismen sind beispielsweise Brevibacterium thiogenitalis D248, Brevibacterium thiogenitalis D253, Brevibacterium thiogenitalis D254, Brevibacterium sp. 111-S09, Brevibacterium flavum BN-1 1, Corynebacterium sp. Nr. 1602, Corynebacterium sp. Nr. 186, Micrococcus glutamicus Nr. 534-MS-023 und Micrococcus glutamicus Nr. 541-MS117.
Als ungesättigte Fettsäure mit 16 bis 22 Kohlenstoffatomen kommen beispielsweise Oleinsäure, Palmitoleinsäure, Linolsäure, Linolensäure oder Arachidonsäure in Frage. Es sei hervorgehoben, dass die ungesättigte Fettsäurequelle, welche im vorliegenden Verfahren verwendet wird, beispielsweise eine ungesättigte Fettsäure, ein Salz davon, z. B. das Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalz, und ein mehrwertiger Ester, wie z. B. ein Glycerid, z. B. Specköl oder Olivenöl, sein kann. Im allgemeinen genügt es, wenn man derartige ungesättigte Fettsäurequellen in einer Menge von etwa 50 bis 1000 y/cm3 dem Kulturmedium zugibt.
Die im anfänglichen Kulturmedium verwendbare Kohlenstoffquelle kann irgendeine beliebige, bisher verwendete Kohlenstoffquelle sein, wie z. B. Molasse, Stärkehydrolysat, sowie Essigsäure.
Die beim vorliegenden Verfahren verwendbaren Stickstoffquellen sind beispielsweise Maisflüssigkeit, entfettetes Sojabohnenmehl, Ammoniak und Harnstoff.
Beim vorliegenden Verfahren verwendbare anorganische
Salze sind beispielsweise Natriumphosphat, Kaliumphosphat,
Calciumchlorid und Magnesiumsulfat.
Beim vorliegenden Verfahren ist es vollständig unnötig und dies im Gegensatz zu den bekannten Methoden - die
Biotinwirkung zu regeln, da das erfindungsgemäss erhältliche
Resultat durch die Anwesenheit von Biotin im Kulturmedium nicht beeinflusst wird.
Beim vorliegenden Verfahren kann die als Kohlenstoff quelle verwendete Essigsäure in Form von Salzen, wie z. B.
das Natrium-, Kalium-, Ammonium- oder Calciumsalz an stelle der freien Essigsäure verwendet werden. Verwendet man Essigsäure als anfängliche Kohlenstoffquelle, so wird deren Konzentration im Kulturmedium vorzugsweise auf nicht mehr als etwa 2 Gew.-Teile auf 100 Vol.-Teile des an fänglichen Kulturmediums gehalten. Nach dem Zeitpunkt, bei welchem der ursprüngliche Kohlenstoffquellengehalt auf weniger als 1 Gew.-Teil - bezogen auf 100 Vol.-Teile des Kulturmediums - verringert worden ist, erfolgt die Erzeugung von l-Glutaminsäure unter Kontrolle der Essigsäurekonzen tration im Medium dermassen, dass die Konzentration einen
Wert von höchstens 1 Gew.-Teil auf 100 Vol.-Teile nicht übersteigt.
Um die Essigsäurekonzentration im Kulturmedium zu regeln, wird man die Menge an gelöstem Sauerstoff im Kul turmedium vorzugsweise prüfen; wenn diese Menge nicht mehr als etwa 5 Teile pro Million Teile bei einem pH-Wert von etwa 7 bis etwa 8 beträgt, kann die Essigsäurekonzentra tion als im gewünschten Bereich eingestellt gelten. Die Ein stellung des pH-Wertes wird vorzugsweise durch Zugabe einer Base, wie z. B. wässrigem Ammoniak oder Harnstoff, durchgeführt, wobei diese letzteren als ein Teil der Stick stoffquelle verwendet werden können.
Wie aus den obigen Erläuterungen hervorgeht, kann man
Essigsäure als alleinige hauptsächliche Kohlenstoffquelle während der ganzen Züchtung verwenden. Dabei ist zu be achten, dass man bei Verwendung von Essigsäure als alleinige hauptsächliche Kohlenstoffquelle äusserst reine Kristalle von l-Glutaminsäure erhalten kann.
Die im Kulturmedium in der besagten Weise erzeugte l-Glutaminsäure wird in an sich bekannter Weise gewonnen, beispielsweise durch Filtrieren der Kulturbrühe, durch Einstellen des pH-Wertes des resultierenden Filtrates auf etwa 3,2 durch Zugabe von Salzsäure, und schliesslich durch Sammeln der Niederschläge von l-Glutaminsäure.
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung.
In der nachstehenden Beschreibung und in den Ansprüchen bedeuten die Abkürzungen 1 , mg , cm3 , r.p.m. , kg , ppm und IFO Liter, Milligramm, Kubikzentimeter, Umdrehungen pro Minute, Kilogramm, Teile pro Million, bzw. Institute for Fermentation Osaka .
Beispiel 1
Ein Kulturmedium, enthaltend 2,0% Glucose, 0,5 % Harnstoff, 0,1% KH2P04, 0,05%MgSO4 7H2O, 0,5%Maisflüs- sigkeit und Natriumoleat (100 y/cm3 bezogen auf Oleinsäure), wird in Mengen von jeweils 20 cm3 in 200 cm3 Erlenmeyerkolben gegossen und diese Kolben sterilisiert.
Einer der in der folgenden Tabelle aufgezählten neun Stämme wird im Medium angeimpft und bei 28" C während 24 Stunden mit einem Rührer bei 200 r.p.m. bebrütet.
Ein Hauptkulturmedium, enthaltend ein enzymatisches Hydrolysat von süsser Kartoffelstärke (5 % reduzierender Zucker), Molassen (5% Zucker) 1,5% Harnstoff, 0,1% KH2PO4, 0,05 % MgSO4 7H20, 0,5 % Maisflüssigkeit und Natriumoleat (300 y/cm3 bezogen auf Ölsäure), wird in Mengen von jeweils 70 cm3 in 200 cm3 konische Kolben eingeführt und darin sterilisiert. Jeweils 3,5 cm3 dieser Saatkultur werden dem Hauptkulturmedium zugegeben und die Züchtung mit Hilfe eines rotierenden Rührwerks bei 200 r.p.m. und bei 30 C vorgenommen. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden gibt man Harnstoff in einer Menge von 0,5 %, bezogen auf die Kulturbrühe, hinzu.
Nach etwa 30 Stunden Inkubation, d. h., nachdem der verbleibende Zuckergehalt im Kulturmedium eine Konzentration von weniger als 1 Gew.-Teil- bezogen auf 100 Vol.-Teile des Mediums - erreicht hat, gibt man in Abständen gewisse Mengen an Essigsäure so hinzu, dass die Konzentration an gelöstem Sauerstoff im Medium etwa 5 ppm oder weniger beträgt, während man wässriges Ammoniak tropfenweise so hinzu gibt, dass das Kulturmedium auf einen pH-Wert von etwa 7,0 bis 7,3 gehalten wird. Die Züchtung ist nach 48 Stunden beendet. Die Resultate befinden sich in der folgenden Tabelle.
Mikroorganismus l-Glutaminsäure- Endmenge an Gesamtmenge an Ausbeute an menge vor Zugabe l-Glutaminsäure zugesetzter 1-Glutaminsäure der Essigsäure (mg/cm3) Essigsäure (%) bezogen auf zuge (mg/cm3) setzte Essigsäure (%) Brevibacterium thiogenitalis D-248 52 66 2,5 58 Brevibacterium sp. 111809 45 53 1,8 44 Brevibacterium thiogenitalis D-253 46 55 2,0 46 Brevibacterium thiogenitalis D-254 47 54 1,6 44
Corynebacterium sp.
No. 1602 50 62 2,3 53 Corynebacteriurn sp. No. 186 51 65 2,5 55
Micrococcus glutamicus No. 534-MS-023 48 57 2,0 46
Micrococcus glutamicus No. 541-MS-117 50 60 2,2 48
Brevibacterium flavum BN-11 49 59 2,1 46
Beispiel 2
Brevibacterium thiogenitalis D-248, gezüchtet in einem Sakaguchikolben, wird in 30 1 eines sterilisierten Saatkulturmediums der gleichen Zusammensetzung wie jenes von Beispiel 1 angeimpft und während 16 Stunden bei 28" C gezüchtet.
5 1 der so erhaltenen Kultur werden in 100 1 eines sterilisierten Hauptkulturmediums, enthaltende Molassen (5 % als Zucker) FeSO4 7H2O (0,05%), Harnstoff (0,1%), Mais flüssigkeit (0,3%), KH2PO4 (0,2%), MgSO4 7H2O (0,05%) und Natriumoleat (200 y/cm3 als Oleinsäure), werden unter Rühren und unter Belüftung von 25 1 pro Minute während 48 Stunden (mit einem Rührwerk, welches mit 150 r.p.m.
arbeitet) gezüchtet. Nachdem der verbleibende Zuckergehalt im Kulturmedium 1,0% erreicht hat, beginnt man mit der kontinuierlichen Zugabe einer 50 %igen wässrigen Essigsäurelösung zum Kulturmedium, so dass die Sauerstoffkonzentration im Kulturmedium in einem Bereiche von 0 bis 2 ppm gehalten werden kann. Die Züchtung wird während 48 Stunden durchgeführt, wobei man gleichzeitig eine wässrige Ammoniaklösung der Kulturlösung zugibt, um den pH-Wert dieser letzteren automatisch in einem Bereiche von etwa 7 bis 7,3 zu halten.
Mittels eines Bioversuchs der resultierenden Kulturbrühe, unter Verwendung von Lactobacillus arabinosus, kann festgestellt werden, dass 60 mg/cm3 l-Glutaminsäure erzeugt worden sind. Die Ausbeute an l-Glutaminsäure beträgt, bezogen auf die verbrauchte Essigsäure, etwa 46,5 %.
Die erzielte Kulturbrühe wird filtriert und das Filtrat durch Zugabe von Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,2 ein gestellt, wobei sicll Kristalle ausscheiden. Die Kristalle wer den gesammelt. Auf diese Weise erhält man 6,1 kg l-Glut- aminsäure.
Beispiel 3
Ein Kulturmedium, enthaltend 2,0% Glucose, 0,5 % Harn stoff, 0,1% KH2PO4, 0,05 % MgSO4 7H2O, 0,5 % Maisflüs sigkeit und Natriumoleat (100 y/cm3, als Oleinsäure berech net) wird jeweils in Portionen von 20 cm3 in 200 cm3 Erlen meyerkolben gegossen und sterilisiert. Einer der in der fol genden Tabelle aufgezählten zehn Mikroorganismen wird im Kulturmedium geimpft und bei 280 C während 24 Stunden mit einem Rührwerk, welches mit 200 r.p.m. arbeitet, gezüchtet.
Ein Hauptkulturmedium, enthaltend 1,2% Ammoniumacetat, 0,3 % Maisflüssigkeit, 0,1% KH2PO4, 0,05 % MgSO4
7H2O, 0,001% MnSO4 4H2O, 0,01% FeSO4 7H2O, 0,005% CaCl2 2H20, Natriumoleat (200 y/cm3, berechnet als Oleinsäure), Vitamin B1 (100 y/cm3, berechnet als Hydrochlorid) und Phenolrot (10 mg/l), wird jeweils in Mengen von 70 cm3 in 200 cm3 Kolben eingetragen und darin sterilisiert. Jeweils 3,5 cm3 der so erhaltenen Saatkulturen werden im Hauptkulturmedium geimpft und die Züchtung erfolgt bei 32 C mit einem Rührwerk, welches mit 200 r.p.m. Iäuft.
Um die Essigsäurekonzentration im Kulturmedium zu kontrollieren, wird zu Beginn der Züchtung jeder Kolben mit einer Analysiervorrichtung für gelösten Sauerstoff ausgerüstet. Sobald die Menge an im Kulturmedium gelöstem Sauerstoff mehr als 5 ppm Teile ausmacht (was bedeutet, dass der grösste Teil der Essigsäure aufgebraucht worden ist) versetzt man das Kulturmedium mit Eisessig, um dessen Konzentration auf etwa 0,1%, bezogen auf das Volumen des Kulturmediums, zu bringen, während man den pH-Wert des Kulturmediums durch Zugabe einer wässrigen Ammoniaklösung unter Zuhilfenahme der Farbänderung mittels Phenolrot auf etwa 7 bis 8 einstellt. Die Züchtung wird dann unterbrochen, und zwar gemäss den Angaben in der folgenden Tabelle, wobei die Essigsäure in einer Menge von etwa 15%, bezogen auf das Volumen des anfänglichen Kulturmediums, konsumiert worden ist.
Die Resultate finden sich in der folgenden Tabelle.
Mikroorganismus Züchtungsdauer Ausbeute an (Std.) I-Glutaminsäure bezogen auf die
Essigsäurezugabe (%)
Brevibacterium thiogenitalis D-248 45 52
Brevibacterium sp. 111-S09 51 45
Brevibacterium thiogenitalis D-253 43 50
Brevibacterium thiogenitalis D-254 43 48
Corynebacterium sp. No. 1602 48 45
Corynebacterium sp. No. 186 42 53
Micrococcus glutamicus No. 534-MS-023 43 41
Micrococcus glutamicus No. 541-MS-117 45 48
Brevibacterium flavum BN-11 50 45
Brevibacterium flavum ATCC 14067 43 31 Bemerkung: Brevibacterium flavum ATCC 14067 erheischt für sein Wachstum Biotin und wird als Kontrollversuch verwendet.
Beispiel 4
Brevibacterium thiogenitalis D-248, gezüchtet in einem Sakaguchikolben, wird in 30 1 eines sterilisierten Saatkulturmediums gleicher Zusammensetzung wie in Beispiel 3 geimpft, in einen 501 Fermentierbehälter gegeben und während 16 Stunden in der in Beispiel 3 beschriebenen Weise bei 28 C gezüchtet. 5 1 der so erhaltenen Kultur werden in 1001 eines sterilisierten Hauptkulturmediums geimpft, welches 1,2% Ammoniumacetat, 0,1% Maisflüssigkeit, 0,1% KH2P04, 0,05% MgS04 7H2O, 0,01% FeS04 7H20, 0,01% CaC12 2H20, 0,001% MnS04 4H20 und Natriumoleat (250 y/cm3, berechnet als Oleinsäure),
Thiaminhydrochlorid (100 y/l) in einem 200 Fermentierbehälter, worauf dieses Medium bei 32 C unter Belüftung bei 30 1/Minute und unter Rühren mit einem Rührwerk, das mit 240 r.p.m.
arbeitet, gezüchtet. Sobald die Konzentration an gelöstem Sauerstoff im Kulturmedium 500 ppm Teile oder mehr beträgt, führt man kontinuierlich eine sterilisierte 40 %ige Eisessiglösung dem Kulturmedium hinzu, um die Essigsäurekonzentration auf etwa 0,1% einzustellen, bezogen auf das Volumen des anfänglichen Kulturmediums. Die Züchtung erfolgt während 48 Stunden, wobei der pH-Wert des Kulturmediums durch Zugabe einer wässrigen Ammoniaklösung zum Kulturmedium auf etwa 7,0 bis etwa 8,0 eingestellt wird, wodurch 15% der Essigsäure, bezogen auf das Volumen des ursprünglichen Kulturmediums, verbraucht werden.
Durch einen Biotest der erzielten Kulturbrühe in gleicher
Weise wie in Beispiel 3 kann man feststellen, dass 48 mg/cm3 l-Glutaminsäure erzeugt worden sind. Die Ausbeute an l-Glutaminsäure, bezogen auf die konsumierte Essigsäure, beträgt 49 %. Die erzielte Kulturbrühe wird filtriert und das pH des Filtrates durch Zugabe von Salzsäure auf etwa 3,2 eingestellt, wobei ein Niederschlag sich abtrennt, welcher ge sammelt und umkristallisiert wird. Auf diese Weise erhält man 6,6 kg l-Glutaminsäure.
Die in den Beispielen dieser Beschreibung verwendeten, verschiedenen Stämme sind beim Institute for Fermentation, in Osaka, Japan (IFO) unter den folgenden Nummern de poniert worden:
Stamm IFO Nr.
Brevibacterium thiogenitalis D-248 IFO-12331 Brevibacterium sp. 111-S09 IFO-12332 Brevibacterium thiogenitalis D-253 IFO-12400 Brevibacterium thiogenitalis D-254 IFO-12401 Corynebacterium sp. No. 1602 IFO-12399 Corynebacterium sp. No. 186 IFO-12398 Micrococcus glutamicus No. 534-MS-023 IFO-12523 Micrococcus glutamicus No. 541-MS-117 IFO-12524 Brevibacterium flavum BN-11 IFO-12525
Process for the production of l-glutamic acid
The present invention relates to a process for producing l-glutamic acid by culturing microorganisms in a culture medium containing acetic acid.
Various microorganisms have become known which are capable of producing or enriching l-glutamic acid in culture media. These microorganisms used for industrial production of l-glutamic acid generally require biotin for their growth, and it is found that the ability to produce l-glutamic acid is greatly reduced in the presence of biotin in an amount exceeding a certain amount of the culture medium . This means that unpleasant measures are required to control the effect of the biotin in the culture medium during the cultivation process. In addition, most common and economical nutrient sources such as B.
Molasses, starch hydrolyzate, corn liquor and yeast extracts there is too much biotin to be able to carry out such methods successfully using the known microorganisms, unless the effect of biotin is adjusted in a suitable manner, which is practically impossible with the known methods .
It is also known that 1-glutamic acid can be produced by culturing microorganisms in a culture medium containing acetic acid. As a result of the poor yield of l-glutamic acid, however, the previously known methods cannot be used industrially.
The present invention now relates to an economically and industrially suitable method for the production of l-glutamic acid by culturing a microorganism which is not affected by the presence of biotin, and this using the cheap acetic acid as a carbon source, l-glutamic acid in good yield and high purity.
The inventive method is characterized in that a l-glutamic acid-producing microorganism of the genus Brevibacterium, Corynebacterium or Micrococcus, which does not require biotin, but an unsaturated fatty acid with 16 to 22 carbon atoms, is grown in a culture medium which contains inorganic salts, an unsaturated fatty acid with 16 to 22 carbon atoms or a salt or an ester thereof with a polyhydric alcohol, a nitrogen source and, as a carbon source, an organic compound containing C, H and O that differs from all the aforementioned compounds, that the concentration of the carbon source is increased by adding acetic acid during cultivation to a value of at most 1 part by weight, based on 100 parts by volume of the culture medium,
parts by weight and parts by volume behave like g and cm3, after the consumption of the carbon source in the original culture medium has reduced its concentration to less than 1 part by weight, based on 100 parts by volume of the culture medium, and that the separates generated and enriched l-glutamic acid in the culture medium.
The microorganisms which can be used for the process according to the invention are, for example, Brevibacterium thiogenitalis D248, Brevibacterium thiogenitalis D253, Brevibacterium thiogenitalis D254, Brevibacterium sp. 111-S09, Brevibacterium flavum BN-11, Corynebacterium sp. No. 1602, Corynebacterium sp. No. 186, Micrococcus glutamicus No. 534-MS-023 and Micrococcus glutamicus No. 541-MS117.
Examples of unsaturated fatty acids having 16 to 22 carbon atoms are oleic acid, palmitoleic acid, linoleic acid, linolenic acid or arachidonic acid. It should be emphasized that the unsaturated fatty acid source which is used in the present process, for example an unsaturated fatty acid, a salt thereof, e.g. B. the sodium, potassium or ammonium salt, and a polyvalent ester, such as. B. a glyceride, e.g. B. Bacon oil or olive oil, can be. In general, it is sufficient if such unsaturated fatty acid sources are added to the culture medium in an amount of about 50 to 1000 μg / cm 3.
The carbon source useful in the initial culture medium can be any previously used carbon source such as e.g. B. molasses, starch hydrolyzate, and acetic acid.
The nitrogen sources that can be used in the present process are, for example, corn liquor, defatted soybean meal, ammonia and urea.
Inorganic ones useful in the present process
Salts are, for example, sodium phosphate, potassium phosphate,
Calcium chloride and magnesium sulfate.
In the present method it is completely unnecessary and this in contrast to the known methods - the
To regulate the effect of biotin, since the obtainable according to the invention
Result is not influenced by the presence of biotin in the culture medium.
In the present process, the acetic acid used as a carbon source in the form of salts, such as. B.
the sodium, potassium, ammonium or calcium salt can be used instead of the free acetic acid. If acetic acid is used as the initial source of carbon, its concentration in the culture medium is preferably kept to no more than about 2 parts by weight per 100 parts by volume of the initial culture medium. After the point in time at which the original carbon source content has been reduced to less than 1 part by weight - based on 100 parts by volume of the culture medium, l-glutamic acid is produced under control of the acetic acid concentration in the medium in such a way that the Concentration one
Does not exceed a value of at most 1 part by weight per 100 parts by volume.
In order to regulate the acetic acid concentration in the culture medium, the amount of dissolved oxygen in the culture medium will preferably be checked; if this amount is no more than about 5 parts per million at a pH of about 7 to about 8, the acetic acid concentration can be considered to have been set in the desired range. A setting of the pH is preferably by adding a base, such as. B. aqueous ammonia or urea, the latter can be used as part of the stick material source.
As can be seen from the explanations above, one can
Use acetic acid as the sole main source of carbon throughout the cultivation. It should be noted that when using acetic acid as the sole main source of carbon, extremely pure crystals of l-glutamic acid can be obtained.
The l-glutamic acid produced in the said manner in the culture medium is obtained in a manner known per se, for example by filtering the culture broth, by adjusting the pH of the resulting filtrate to about 3.2 by adding hydrochloric acid, and finally by collecting the precipitates of l-glutamic acid.
The following examples illustrate the present invention.
In the following description and in the claims, the abbreviations 1, mg, cm3, r.p.m. , kg, ppm and IFO liters, milligrams, cubic centimeters, revolutions per minute, kilograms, parts per million, or Institute for Fermentation Osaka.
example 1
A culture medium containing 2.0% glucose, 0.5% urea, 0.1% KH2PO4, 0.05% MgSO4 7H2O, 0.5% corn liquid and sodium oleate (100 μ / cm3 based on oleic acid) is used in Quantities of 20 cm3 each are poured into 200 cm3 Erlenmeyer flasks and these flasks are sterilized.
One of the nine strains listed in the table below is inoculated in the medium and incubated at 28 ° C. for 24 hours with a stirrer at 200 r.p.m.
A main culture medium containing an enzymatic hydrolyzate of sweet potato starch (5% reducing sugar), molasses (5% sugar) 1.5% urea, 0.1% KH2PO4, 0.05% MgSO4 7H20, 0.5% corn liquor and sodium oleate ( 300 y / cm3 based on oleic acid), is introduced in quantities of 70 cm3 each into 200 cm3 conical flasks and sterilized therein. Each 3.5 cm3 of this seed culture are added to the main culture medium and cultivation is carried out using a rotating stirrer at 200 r.p.m. and made at 30 C. After an incubation time of 24 hours, urea is added in an amount of 0.5%, based on the culture broth.
After about 30 hours of incubation, i.e. that is, after the remaining sugar content in the culture medium has reached a concentration of less than 1 part by weight based on 100 parts by volume of the medium, certain amounts of acetic acid are added at intervals so that the concentration of dissolved oxygen in the medium is about 5 ppm or less while adding aqueous ammonia dropwise so as to maintain the culture medium at a pH of about 7.0 to 7.3. The cultivation is finished after 48 hours. The results are in the following table.
Microorganism l-glutamic acid - final amount of total amount of yield of amount of 1-glutamic acid of acetic acid added before addition of l-glutamic acid (mg / cm3) acetic acid (%) based on added (mg / cm3) acetic acid (%) Brevibacterium thiogenitalis D-248 52 66 2.5 58 Brevibacterium sp. 111809 45 53 1.8 44 Brevibacterium thiogenitalis D-253 46 55 2.0 46 Brevibacterium thiogenitalis D-254 47 54 1.6 44
Corynebacterium sp.
No. 1602 50 62 2.3 53 Corynebacterium sp. No. 186 51 65 2.5 55
Micrococcus glutamicus No. 534-MS-023 48 57 2.0 46
Micrococcus glutamicus No. 541-MS-117 50 60 2.2 48
Brevibacterium flavum BN-11 49 59 2.1 46
Example 2
Brevibacterium thiogenitalis D-248 grown in a Sakaguchi flask is inoculated in 30 liters of a sterilized seed culture medium of the same composition as that of Example 1 and grown at 28 ° C for 16 hours.
5 1 of the culture obtained in this way are in 100 1 of a sterilized main culture medium, containing molasses (5% as sugar) FeSO4 7H2O (0.05%), urea (0.1%), corn liquid (0.3%), KH2PO4 ( 0.2%), MgSO4 7H2O (0.05%) and sodium oleate (200 μg / cm3 as oleic acid) are stirred and aerated at 25 1 per minute for 48 hours (with a stirrer which operates at 150 rpm
works) bred. After the remaining sugar content in the culture medium has reached 1.0%, the continuous addition of a 50% aqueous acetic acid solution to the culture medium is started so that the oxygen concentration in the culture medium can be kept in a range of 0 to 2 ppm. The cultivation is carried out for 48 hours, at the same time an aqueous ammonia solution is added to the culture solution in order to automatically keep the pH of the latter in a range from about 7 to 7.3.
By means of a bioassay of the resulting culture broth using Lactobacillus arabinosus, it can be determined that 60 mg / cm3 of 1-glutamic acid has been produced. The yield of l-glutamic acid, based on the acetic acid consumed, is about 46.5%.
The culture broth obtained is filtered and the filtrate is adjusted to a pH of 3.2 by adding hydrochloric acid, whereupon crystals separate out. The crystals are collected. In this way, 6.1 kg of l-glutamic acid are obtained.
Example 3
A culture medium containing 2.0% glucose, 0.5% urea, 0.1% KH2PO4, 0.05% MgSO4 7H2O, 0.5% corn liquid and sodium oleate (100 μ / cm3, calculated as oleic acid) is used each poured in portions of 20 cm3 into 200 cm3 alder meyer flasks and sterilized. One of the ten microorganisms listed in the following table is inoculated in the culture medium and heated at 280 ° C. for 24 hours with a stirrer which rotates at 200 r.p.m. works, bred.
A main culture medium containing 1.2% ammonium acetate, 0.3% corn liquor, 0.1% KH2PO4, 0.05% MgSO4
7H2O, 0.001% MnSO4 4H2O, 0.01% FeSO4 7H2O, 0.005% CaCl2 2H20, sodium oleate (200 y / cm3, calculated as oleic acid), vitamin B1 (100 y / cm3, calculated as hydrochloride) and phenol red (10 mg / l ), is entered in quantities of 70 cm3 in 200 cm3 flasks and sterilized therein. In each case 3.5 cm3 of the seed cultures obtained in this way are inoculated in the main culture medium and cultivation takes place at 32 ° C. with a stirrer which is operated at 200 r.p.m. Runs.
In order to control the concentration of acetic acid in the culture medium, each flask is equipped with a dissolved oxygen analyzer at the beginning of the cultivation. As soon as the amount of oxygen dissolved in the culture medium is more than 5 ppm parts (which means that most of the acetic acid has been used up), glacial acetic acid is added to the culture medium to bring its concentration to about 0.1%, based on the volume of the Culture medium, while the pH of the culture medium is adjusted to about 7 to 8 by adding an aqueous ammonia solution with the aid of the color change using phenol red. The cultivation is then interrupted according to the information in the following table, the acetic acid having been consumed in an amount of about 15%, based on the volume of the initial culture medium.
The results can be found in the following table.
Microorganism Cultivation time Yield of (hours) I-glutamic acid based on the
Acetic acid addition (%)
Brevibacterium thiogenitalis D-248 45 52
Brevibacterium sp. 111-S09 51 45
Brevibacterium thiogenitalis D-253 43 50
Brevibacterium thiogenitalis D-254 43 48
Corynebacterium sp. No. 1602 48 45
Corynebacterium sp. No. 186 42 53
Micrococcus glutamicus No. 534-MS-023 43 41
Micrococcus glutamicus No. 541-MS-117 45 48
Brevibacterium flavum BN-11 50 45
Brevibacterium flavum ATCC 14067 43 31 Note: Brevibacterium flavum ATCC 14067 requires biotin for its growth and is used as a control experiment.
Example 4
Brevibacterium thiogenitalis D-248, grown in a Sakaguchi flask, is inoculated in 30 l of a sterilized seed culture medium of the same composition as in Example 3, placed in a 50 l fermentation vessel and grown in the manner described in Example 3 at 28 ° C. for 16 hours. 5 l of the culture obtained in this way are inoculated into 100 l of a sterilized main culture medium which contains 1.2% ammonium acetate, 0.1% corn liquor, 0.1% KH2P04, 0.05% MgS04 7H2O, 0.01% FeS04 7H20, 0.01 % CaC12 2H20, 0.001% MnS04 4H20 and sodium oleate (250 y / cm3, calculated as oleic acid),
Thiamine hydrochloride (100 y / l) in a 200 yd fermentation vessel, whereupon this medium at 32 ° C with aeration at 30 1 / minute and with stirring with a stirrer that operates at 240 r.p.m.
works, bred. When the dissolved oxygen concentration in the culture medium is 500 ppm parts or more, a sterilized 40% glacial acetic acid solution is continuously added to the culture medium to adjust the acetic acid concentration to about 0.1% based on the volume of the initial culture medium. Cultivation takes place for 48 hours, the pH of the culture medium being adjusted to about 7.0 to about 8.0 by adding an aqueous ammonia solution to the culture medium, whereby 15% of the acetic acid, based on the volume of the original culture medium, is consumed .
Through a bio test of the culture broth obtained in the same
As in Example 3, it can be found that 48 mg / cm3 of 1-glutamic acid has been generated. The yield of l-glutamic acid, based on the acetic acid consumed, is 49%. The culture broth obtained is filtered and the pH of the filtrate is adjusted to about 3.2 by adding hydrochloric acid, a precipitate separating out, which is collected and recrystallized. In this way, 6.6 kg of l-glutamic acid are obtained.
The different strains used in the examples of this description have been filed with the Institute for Fermentation, in Osaka, Japan (IFO) under the following numbers:
Strain IFO No.
Brevibacterium thiogenitalis D-248 IFO-12331 Brevibacterium sp. 111-S09 IFO-12332 Brevibacterium thiogenitalis D-253 IFO-12400 Brevibacterium thiogenitalis D-254 IFO-12401 Corynebacterium sp. No. 1602 IFO-12399 Corynebacterium sp. No. 186 IFO-12398 Micrococcus glutamicus No. 534-MS-023 IFO-12523 Micrococcus glutamicus No. 541-MS-117 IFO-12524 Brevibacterium flavum BN-11 IFO-12525