DE1767955B2

DE1767955B2 - PROCESS FOR THE PRODUCTION OF L-GLUTAMIC ACID

Info

Publication number: DE1767955B2
Application number: DE19681767955
Authority: DE
Inventors: Hideo Osaka; Kanzaki Toshihiko Takarazuka; Okazaki Hisayoshi Suita; Sumino Yasuhiro; Isobe Kazuko; Osaka Fukuda (Japan)
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1967-08-22
Filing date: 1968-07-05
Publication date: 1977-06-02
Also published as: ES356323A1; JPS524628B1; CH529725A; DE1767955A1

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Heritellung von L-Glutaminsäure durch Kultivierung von Mikroorganismen in einem Kulturmedium, das Essigläure enthält.The invention relates to a new process for the preparation of L-glutamic acid by culturing Microorganisms in a culture medium, the acetic acid contains.

Eine Reihe von Mikroorganismen sind bekannt, die L-Glutaminsäure /u bilden und im Kulturmedium anzureichern vermögen. Die Mikroorganismen, die in der Praxis für die Großherstellung von L-Glutaminiäure verwendet werden, erfordern jedoch im allgemeinen Biotin zum Wachstum, aber ihre Fähigkeit, L-Glut-•minsäure zu bilden, wird stark unterdrückt, wenn die Biotinmengc im Kulturmedium einen gewissen Wert übersteigt. Dies bedeutet, daß umständliche Maßnahmen zur Überwachung und Steuerung der Wirkung von Biotin im Kulturmedium wahrend der gesamten KU11i\ ring erforderlich sind. Noch schlimmer ist, daß die meisten gebräuchlichen und wirtschaftlichen Nährstoffquellen, wie Melasse, Stärkehydrolysat, Maisquellwasser und Hefeextrakte, zu viel Biotin für die Durchführung der bisher bekannten Verfahren unter Verwendung der bekannten Mikroorganismen enthalten, es sei denn, daß die Wirkung des Biotins in geeigneter Weise gesteuert wird. Dies ist einer der Nachteile der bekannten Verfahren. Derartige VerfahrenA number of microorganisms are known which form L-glutamic acid / u and in the culture medium able to enrich. The microorganisms used in practice for the large-scale manufacture of L-glutamic acid but generally require biotin for growth, but their ability to use L-glutic acid to form is strongly suppressed when the amount of biotin in the culture medium has a certain value exceeds. This means that cumbersome measures to monitor and control the effect of biotin in the culture medium during the entire KU11i \ ring are required. Is worse that most common and economical Sources of nutrients, like molasses, starch hydrolyzate, corn steep liquor, and yeast extracts, make too much biotin for that Implementation of the previously known methods using the known microorganisms included, unless the action of the biotin is properly controlled. This is one of the drawbacks the known procedures. Such procedures

Beispielexample lindgültige L-Glut-tender L-glow Ausbeute an L-Glui-Yield of L-Glui- aminsäuremengeAmic acid amount aminsäure auf Basisamic acid based im Kulturmediumin the culture medium von Essigsäureof acetic acid (mg/ml)(mg / ml) (%)(%) Erfindungs-Inventive gemäßaccording to II. 53-6653-66 44-5844-58 22 6060 46,546.5 33 nicht angegebennot specified 41-5341-53 44th 4848 4949 US-PSU.S. PS 31 1791531 17915 11 1515th 3030th 22 7,3-14.87.3-14.8 11,3-24,811.3-24.8 33 1313th 26.626.6

Die Erfindung ist in den Ansprüchen definiert.The invention is defined in the claims.

Als ungesättigte Fettsäuren mit 16 bis 22 Kohlenstoffatomen eignen sich beispielsweise Oleinsäure, Palmitoleinsäure, Linolsäure. Linolensäure oder Arachidonsäure. Als Quellen für ungesättigte Fettsäuren eignen sich für die Zwecke der Erfindung beispielsweise ungesättigte Fettsäuren, ihre Saize (/.. B. das Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalz) und ihre Ester mit mehrwertigen Alkoholen, z. B. Glyccridc (z. B. Schmal/ oder Olivenöl). Es genügt im allgemeinen, einfach eine solche Quelle für ungesättigte Fettsäuren in einer Menge von etwa 50 bis 1000 )'/ml dem Kulturmedium zuzusetzen.Suitable unsaturated fatty acids with 16 to 22 carbon atoms are, for example, oleic acid, Palmitoleic acid, linoleic acid. Linolenic acid or arachidonic acid. As sources of unsaturated fatty acids are suitable for the purposes of the invention, for example unsaturated fatty acids, their salts (/ .. B. the sodium, potassium or ammonium salt) and their Esters with polyhydric alcohols, e.g. B. Glyccridc (z. B. Schmal / or olive oil). It is generally sufficient simply such a source of unsaturated fatty acids in an amount of about 50 to 1000) '/ ml dem Add culture medium.

Als Kohlenstoffquellen eignen sich im ursprünglichen Kulturmedium alle gebbräuchlichen Kohlenstoffquellen, z. B. Melasse, Stärkehydrolysat und Essigsäure. All common carbon sources are suitable as carbon sources in the original culture medium, z. B. molasses, starch hydrolyzate and acetic acid.

Geeignete Stickstoffquellen für das Verfahren sind beispielsweise Maisquellwasser, entfettetes Sojabohnenmehl, Ammoniak und Harnstoff.Suitable nitrogen sources for the process are, for example, corn steep liquor, defatted soybean meal, Ammonia and urea.

Als weitere Nährstoffe eignen sich für das Verfahren gemäß der Erfindung beispielsweise Natriumphosphat, Kaliumphosphat, Calciumchlorid und Magnesiumsulfat Other nutrients suitable for the method according to the invention are, for example, sodium phosphate, Potassium phosphate, calcium chloride and magnesium sulfate

Beim Verfahren gemäß der Erfindung ist es völlig unnötig, Maßnahmen zur Steuerung aer Biotinwirl;ung ^rzu ergreifen, wie sie bei allen bekannten Verfahren erforderlich sind, da das Ergebnis des Verfahrens gemäß der Erfindung durch die Biotirtmenge im Kulturmedium nicht beeinflußt wird.In the method according to the invention, it is completely unnecessary to take measures to control aer Biotinwirl; ung to take ^r, as are required in all known method, since the result of the process is not affected according to the invention by the Biotirtmenge in the culture medium.

Beim Verfahren gemäß der Erfindung kann die als Kohlenstoffquelle dienende Essigsäure in Form von Salzen, z. B. des Natrium-, Kalium-, Ammonium- oder Calciumsalzes, an Stelle der freien Säure zugesetzt werden. Bei Verwendung von Essigsäure als ursprüngliche Kohlenstoffquelle wird ihre Konzentration im Kulturmedium zweckmäßig bei einem Wert gehalten, der nicht höher ist als etwa 2%, bezogen auf das Volumen des ursprünglichen Kulturmediums. Nachdem jedoch der Punkt erreicht ist, bei dem die Konzentration der ursprünglichen Kohlenstoffquelle etwa 1% oder weniger erreicht hat, wird die Kultivierung zur Bildung von L-Glutaminsäure weitergeführt, während die Konzentration der Essigsäure im Medium bei einem Wert von nicht mehr als etwa 1 % gehalten wird.In the process according to the invention, the acetic acid used as a carbon source can be in the form of Salts, e.g. B. the sodium, potassium, ammonium or calcium salt, added in place of the free acid will. If acetic acid is used as the original source of carbon, its concentration in the Culture medium expediently kept at a value which is not higher than about 2%, based on the volume of the original culture medium. However, after reaching the point where focus is reached of the original carbon source becomes about 1% or less, cultivation becomes education of L-glutamic acid, while the concentration of acetic acid in the medium is at one Value of no more than about 1% is kept.

Um die Essigsäurekonzentration im Kulturmedium zu regeln, ist es zweckmäßig, die Menge des gelösten Sauerstoffs im Kulturmedium zu überwachen. Solange diese Menge nicht höher ist als etwa 5 ppm bei einem pH-Wert von etwa 7-8, liegt die Essigsäurekonzentration im gewünschten Bereich. Die Einstellung des pH-Wertes erfolgt zweckmäßig durch Zusatz einer Base, z. B. von wäßrigem Ammoniak oder Harnstoff, wobei diese Base als Teil der Stickstoffquelle dienen kann.In order to regulate the acetic acid concentration in the culture medium, it is useful to measure the amount of the dissolved Monitor oxygen in the culture medium. As long as this amount is no more than about 5 ppm for one pH value of about 7-8, the acetic acid concentration is in the desired range. The setting of the The pH is expediently carried out by adding a base, e.g. B. of aqueous ammonia or urea, this base can serve as part of the nitrogen source.

Wie bereits erwähnt, kann Essigsäure als einzige Hauptkohlenstoffquelle während der gesamten Kultivierung verwendet werden. Es ist bemerkenswert, daß Kristalle von L-Glutaminsäure von hoher Reinheit erhalten werden, wenn Essigsäure als einzige Hauptkohleitstoffquelle verwendet wird.As mentioned earlier, acetic acid can be the only main source of carbon during the entire cultivation process be used. It is noteworthy that crystals of L-glutamic acid are of high purity can be obtained when acetic acid is the only major source of carbon is used.

Die auf diese Weise im Kulturmedium gebildete L-Glutaminsäure wird in an sich bekannter Weise gewonnen, z. B. durch Filtration der Kulturbrühe, Einstellung des pH-Wertes des erhaltenen Filtrats auf etwa 3,2 durch Zusatz von Salzsäure und Abtrennung der ausgefällten L-Glutaminsäure aus dem FiltratThe L-glutamic acid formed in this way in the culture medium is obtained in a manner known per se, z. B. by filtration of the culture broth, adjustment of the pH of the filtrate obtained about 3.2 by adding hydrochloric acid and separating the precipitated L-glutamic acid from the filtrate

Die Abkürzung »IFO« in den folgenden Beispielen bedeutet »Institute for Fermentation Osaka«.The abbreviation "IFO" in the following examples means "Institute for Fermentation Osaka".

example 1

'5 Je 20ml eines Impfkulturmediums, das 2,0% Glucose, 0,5%Harnstoff, 0,1%KH,PO₄,0,05% MgSO, · 7 HO. 0,5% Maisquellwasser und 100 y/ml Natriumoleat (als Oleinsäure) enthält, wird in 200-ml-Erlenmeyer-Kolben gegossen, die sterilisiert werden. Das Medium wird ίο jeweils mit einem der in der folgenden Tabelle genannten Stämme geimpft, worauf ?4 Stunden bei 28 C in einer rotierenden Schüttelvorrichtung die eine Drehzahl von 200UpM hat, bebrütet wird5 Each 20 ml of an inoculation culture medium containing 2.0% glucose, 0.5% urea, 0.1% KH, PO ₄ , 0.05% MgSO, · 7 HO. 0.5% corn steep liquor and 100 μg / ml sodium oleate (as oleic acid) is poured into 200 ml Erlenmeyer flasks, which are sterilized. The medium is inoculated with one of the strains mentioned in the following table, whereupon it is incubated for 4 hours at 28 ° C. in a rotating shaker with a speed of 200 rpm

Je 70 ml eines Hauptkulturmediums, das ein enzy-²S matisches Hydrolysat von Stärke von süßen Kartoffeln (5% als direkt reduzierender Zucker), Melasse (5 % als Zucker), Harnstoff (1,5%), KH₁PO₄ (0,1%). MgSO₄-7 H₂O (0,05%), Maisquellwasser (0,5%) und Natriumoleat (300y/ml als Oleinsäure) enthält, wird in 200-ml-Kolben gegeben, die sterilisiert werden. Das Hauptkulturmedium wird mit je 3,5 ml der Impfkultur geimpft, worauf die Kultivierung bei 30 ( auf einer mit 200UpM rotierenden Schüttelvorrichtung durchgeführt wird. In der 24. Stunde der Kultivierung wird Harnstoff in einer Menge von 0,5%, bezogen auf die Kulturbrühe, zugesetzt Etwa 30 Stunden nach Beginn der Kultivierung, d. h. nach Erreichen eines Restzuckergehaltes im Kulturmedium von 1 % oder weniger, wird Essigsäure intermittierend so zugesetzt, daß 4" die Konzentration an gelöstem Sauerstoff im Medium bei etwa 5 ppm oder weniger gehalten wird, während gleichzeitig wäßriges Ammoniak so zugetropft wird, daß das Kulturmedium bei einem pH-Wert von etwa 7,0 bis 7,3 gehalten wird. Die Kultivierung ist in 4s 48 Stunden beendet Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.70 ml of a main culture medium, which is a enzy- ² S matic hydrolyzate of starch from sweet potatoes (5% as a direct reducing sugar), molasses (5% than sugar), urea (1.5%), KH ₁ PO ₄ (0 ,1%). MgSO ₄ _{-7H 2} O (0.05%), corn steep liquor (0.5%) and sodium oleate (300 µg / ml as oleic acid) is placed in 200 ml flasks which are sterilized. The main culture medium is inoculated with 3.5 ml of the inoculation culture, after which the cultivation is carried out at 30 (on a shaking device rotating at 200 rpm. In the 24th hour of cultivation, urea is added in an amount of 0.5%, based on the culture broth , added About 30 hours after the start of cultivation, ie after reaching a residual sugar content of 1% or less in the culture medium, acetic acid is added intermittently so that the concentration of dissolved oxygen in the medium is kept at about 5 ppm or less, while at the same time Aqueous ammonia is added dropwise in such a way that the culture medium is kept at a pH of about 7.0 to 7.3 The cultivation is completed in 4 s 48 hours The results are compiled in the following table.

MikroorganismusMicroorganism

Brevibactcrium thiogenitalis IFO 12 331 Brevibacterium sp. 11-Ό 12 332
Brevibacterium thiogenitalis IFO 12400 Brevibacterium thiogenitalis IFO 12 401 Coryncbacterium sp. IFO 12 399 Corynebacteriuni sp. IFO 12 398 Micrococcus glutamicus IFO 12 523 Micrococcus glutamicus IFO 12 524 Uriivihiicterium flavum IFO 12 525Brevibactcrium thiogenitalis IFO 12 331 Brevibacterium sp. 11-Ό 12 332
Brevibacterium thiogenitalis IFO 12400 Brevibacterium thiogenitalis IFO 12 401 Coryncbacterium sp. IFO 12 399 Corynebacteriuni sp. IFO 12 398 Micrococcus glutamicus IFO 12 523 Micrococcus glutamicus IFO 12 524 Uriivihiicterium flavum IFO 12 525

L-Glutamin-L-glutamine EndgültigeFinal InsgesamtAll in all Ausbeute anYield to säuremengeamount of acid L-Glutamin-L-glutamine zugesetzteadded L-GlutaminL-glutamine vor Zusatzbefore addition säuremengeamount of acid Essigsäureacetic acid säure, bezogenacid, related von Essigsäureof acetic acid auf zugesetzteon added Essigsäureacetic acid (mg/ml)(mg / ml) (mg/ml)(mg / ml) (%)(%) (%>(%> 5252 6666 2,52.5 5858 4545 5353 1,81.8 4444 4646 5555 2.02.0 4646 4747 5454 1,61.6 4444 5050 62:62: 2,32.3 5353 5151 6565 2,52.5 5555 4848 5757 2,02.0 4646 5050 6060 2,22.2 4848 4949 5959 2,12.1 4646

Example 2

Mit Brevibacterium thiogenitahs IFO 12 331, der in einem Saka^uchi-Kolben kultiviert worden ist, werden 301 eines sterilisierten Impfkulturmediums geimpft, das die gleiche Zusammensetzung hat wie das im Beispiel 1 genannte Impfkulturmedium, worauf 16 Stunden bei 28 C kultiviert wird. Mit 51 der in dieser Weise hergestellten Impfkultur werden 1001 eines sterilisierten Hauptkulturmediums geimpft, das Melasse (5 % als Zucker), FeSO₄-7 H₂O (0,05%), Harnstoff (0,1%), Maisquellwasser (0,3%), KH₂PO₄ (0,2%), MgSO₄ ■ H₂O (0,05%) und Natriumoleat(200 y/ml als Oleinsäure) enthält, worauf 48 Stunden bei 30 C unter Bewegung mti-150 UpM und Belüftung mit 25 l/Minute kultiviert wird. Wenn der Restzuckergehalt im Kulturmedium auf 1,0% gefallen ist, wird mit Jer kontinuierlichen Zugabe einer 50 %igen wäßrigen Essigsäureiösung zum Kulturmedium begonnen, wobei so dosiert wird, daß die Sauerstoffkonzentration im Kulturmedium im Bereich von 0 bis 2 ppm gehalten wird. Die Kultivierung wird 48 Stunden durchgeführt Während der gesamten Zeit wird eine wäßrige Ammoniaklösung dem Kulturmedium so zugesetzt, daß der pH-Wert der Kulturlösung automatisch im Bereich von etwa 7 bis 7,3 gehalten wird.With Brevibacterium thiogenitahs IFO 12 331, which has been cultivated in a Saka ^ uchi flask, 301 of a sterilized inoculation culture medium, which has the same composition as the inoculation culture medium mentioned in Example 1, is inoculated, followed by cultivation at 28 ° C. for 16 hours. 1001 of a sterilized main culture medium are inoculated with 51 of the inoculated culture produced in this way, which contains molasses (5% as sugar), FeSO ₄ -7 H ₂ O (0.05%), urea (0.1%), corn steep liquor (0, 3%), KH ₂ PO ₄ (0.2%), MgSO ₄ · H ₂ O (0.05%) and sodium oleate (200 μg / ml as oleic acid), whereupon 48 hours at 30 ° C. with agitation mti-150 UpM and aeration at 25 l / minute is cultivated. When the residual sugar content in the culture medium has fallen to 1.0%, continuous addition of a 50% strength aqueous acetic acid solution to the culture medium is started, metering in such a way that the oxygen concentration in the culture medium is kept in the range from 0 to 2 ppm. The cultivation is carried out for 48 hours. During the entire time, an aqueous ammonia solution is added to the culture medium in such a way that the pH of the culture solution is automatically maintained in the range from about 7 to 7.3.

Eine Bioanalyse der erhaltenen Kulturbrühe unter Verwendung von Lactobacillus arabinosu-· ergibt, daß 60 mg L-Glutaminsäure pro ml gebildet worden sind. Die Ausbeute an L-Glutaminsäure beträgt etwa 46,5%, bezogen auf verbrauchte Essigsäure.A bioanalysis of the culture broth obtained using Lactobacillus arabinosu- · shows that 60 mg L-glutamic acid per ml have been formed. The yield of L-glutamic acid is about 46.5%, based on acetic acid consumed.

Die erhaltene Kulturbrühe wird nitriert und das FiI-trat durch Zusatz von Salzsäure auf pH 3,2 eingestellt, wobei sich Kristalle abscheidea Die Kristalle werden abgetrennt, wobei 6,1 kg L-Glutaminsäure erhalten werden.The culture broth obtained is nitrated and the filtrate is removed adjusted to pH 3.2 by adding hydrochloric acid, crystals separating out. The crystals are separated, whereby 6.1 kg of L-glutamic acid are obtained.

Example 3

Je 20 ml eines Impfkulturmediums, das 2,0% Glucose, 0,5% Harnstoff, 0,)% KH₂PO₄, 0,05% MgSo₄-7 H₂0,0,5 % Maisquellwasser und 100 y/ml N.itriumoleat als Oleinsäure) enthalt, werden in 200-ml-Erlenmeyer-Kolben gegossen und sterilisiert. Das Kulturmedium wird mit jeweils einem der in der folgenden Tabelle genannten Mikroorganismen geimpft, worauf 24 Stunden bei 28 ( in einer mit 200 UpM rotierenden Schüttelvorrichtung kultiviert wird.20 ml each of an inoculation culture medium containing 2.0% glucose, 0.5% urea, _{0.1% KH 2} PO ₄ , 0.05% MgSo ₄ -7 H _2, 0.0.5% corn steep liquor and 100 μg / ml Nitrium oleate as oleic acid) are poured into 200 ml Erlenmeyer flasks and sterilized. The culture medium is inoculated with one of the microorganisms mentioned in the table below, followed by cultivation for 24 hours at 28 (in a shaking device rotating at 200 rpm.

Je 70 ml sines Hauptkulturmediums, das 1,2% Ammoniumacetat, 0,3% Maisquellwasser, 0,1% KH₁PO₄,0.05 % MgSO₄ ■ 7 H₂0,0,001 % MnISO₄ 4H,O. 0,01% FeSO₄ 7H₂O, 0,005% CaCI₂ 51,0, 20O)YmI Natriumoleat (als Oleinsäure), 100 y/ml Vitamin B, (als Hydrochloridl und 10mg/1 Phenolrot enthält, werden in 200-ml-Schüttelenten gegossen und sreilisiert. Mit je 3,5 ml der so hergestellten Impfkultur wird das Hauptkulturmedium geimpft, worauf de Kultivierung bei 32 C auf einer mit 200UpM rotierenden Schüttelvorrichtung durchgeführt wird.70 ml each of its main culture medium, the 1.2% ammonium acetate, 0.3% corn steep liquor, 0.1% KH ₁ PO ₄ , 0.05% MgSO ₄ 7 H ₂ 0.0.001% MnISO ₄ 4H, O. 0.01% FeSO ₄ 7H ₂ O, 0.005% CaCl ₂ 51.0, 20O) YmI sodium oleate (as oleic acid), 100 y / ml vitamin B, (contains as hydrochloride and 10 mg / 1 phenol red, in 200 ml The main culture medium is inoculated with 3.5 ml each of the inoculation culture produced in this way, after which cultivation is carried out at 32 ° C. on a shaking device rotating at 200 rpm.

Zur Überwachung der Essigsäurekonzentration im Kulturmedium wird jeder Kolben zu Beginn der Kultivierung mit einem Analysator für gelöster Sauerstoff versehen. Wenn die Menge des gelösten Sauerstoffs im Kulturmedium 5 ppm übersteigt (dies bedeutet, daß der größte Teil der Essigsäure verbraucht worden ist), wird Essigsäure dem Kulturmedium so /udosiert. daß ihre Konzentration etwa 0,1 % des Volumens des Kulturmediums beträgt, während der pH-Wert des Kulturmediums durch Zusatz von wäßrigem Ammoniak nach der Anzeige des larbumschlages durch das Phenolrol bei etwa 7-8 gehalten wird. Die Kultivierung -vi- n.uh der in der Tabelle genannten Zeit abgebrochen, wenn Essigsäure in einer Menge von etwa 15%, bezogen auf das Volumen des ursprünglichen Kulturmediums, verbraucht worden ist Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt.To monitor the acetic acid concentration in the culture medium, each flask is used at the beginning of the cultivation fitted with a dissolved oxygen analyzer. When the amount of dissolved oxygen exceeds 5 ppm in the culture medium (this means that most of the acetic acid has been consumed), acetic acid is added to the culture medium in this way. that their concentration is about 0.1% of the volume of the culture medium is, while the pH of the culture medium by adding aqueous ammonia the display of the larbumlauf is held by the Phenolrol at about 7-8. The cultivation -vi- n.uh aborted the time specified in the table when acetic acid in an amount of about 15%, based on the volume of the original culture medium that has been consumed The results are in the following Called table.

Mikroorganismus. IFO Nr.Microorganism. IFO No.

Kultivicrungsdautr Cultivation date

(Std.)(Hours.)

Ausbeute an L-Glutaminsäure, bezogen auf eingesetzte EssigsäureYield of L-glutamic acid, based on acetic acid used

Brevibacterium thio- 45 52Brevibacterium thio- 45 52

genitalis 12 331genitalis 12 331

Brevibacterium 12 332 51 45Brevibacterium 12 332 51 45

Brevibacterium thio- 43 50Brevibacterium thio- 43 50

genitalis 12 400genitalis 12 400

Brevibacterium thio- 43 4SBrevibacterium thio- 43 4S

genitalis 401genitalis 401

Corynebaeterium sp. 12 399 48 45Corynebaeterium sp. 12 399 48 45

Corynebacterium sp. 12 398 42 53Corynebacterium sp. 12 398 42 53

Micrococcus glutamicus 43 41Micrococcus glutamicus 43 41

12 52312 523

Micrococcus glutamicus 45 48Micrococcus glutamicus 45 48

12 52412 524

Brevibacterium flavum 50 45Brevibacterium flavum 50 45

12 52512 525

Brevibacterium flavum 43 31Brevibacterium flavum 43 31

ATCC 14 067ATCC 14 067

Anmerkung: Brevibacterium flavum ATCC 14 067 braucht Biotin zum Wachstum und wurde für einen Vergleichsvcrsuch verwendet.Note: Brevibacterium flavum ATCC 14 067 needs Biotin for growth and was used for comparison used.

Example 4

Mit Brevibacterium thiogenitalis IFO 12 331. der in einem Sakaguchi-Kolben kultiviert worden ist. werden 301 eines sterilisierten Impfkulturmediums geimpft, das die gleiche Zusammensetzung wie das im Beispiel 3 genannte Impfkulturmedium hat. Die Kultur wird in einen 50-1-Fermenter gegeben und 16 Stunden bei 28 C auf die im Beispiel 3 beschriebene Weise fermentiert. 5 1 der so hergestellten Impfkultur werden in 100 1 eines in einem 200-1-Fermenter enthaltenen sterilisierten Hauptkuiturmediums gegeben, das 1,2% Ammoniumacetat, 0,1% Maisquellwasser, 0.1% KH₁PO₄. 0.05% MgSO₄-7 H,O, 0,01% FeSO₄ -7 11,0, 0,01% CaCI: ■ 2 H₂O, 0,001% MnSO₄ · 4 H₂O, 250 y/ml Natriumoleat (als Oleinsäure) und 100 y/1 Thiaminhydrochlorid enthält, worauf die Kultivierung bei 32 C unter Zufuhr von 301 Luft/Minute bei 240UpM vorgenommen wird. Wenn die Konzentration des gelösten Sauerstoffs im Kulturmedium 5 ppm oder mehr erreicht, wird eine sterilisierte 40%ige wäßrige Eisessiglösung dem Kulturmedium so /udosiert, daß die Essigsäurekonzentration etwa 0.1 "... bezogen auf das Volumen des ursprünglichen Kulturmediums, beträgt. Die Kultivierung wird 48 Stunden durchgeführt. Während dieser Zeit wird der pH-Wert des Kulturmediums durch Zusatz von wäßrigem Ammoniak bei etwa 7.0 bis 8,0 gehalten. Der Verbrauch an Essigsäure beträgt 15".·, bezogen auf das Volumen des ursprünglichen Kulturmediums. With Brevibacterium thiogenitalis IFO 12 331. which has been cultivated in a Sakaguchi flask. 301 a sterilized inoculation culture medium which has the same composition as the inoculation culture medium mentioned in Example 3 is inoculated. The culture is placed in a 50 l fermenter and fermented in the manner described in Example 3 at 28 ° C. for 16 hours. 5 l of the inoculation culture produced in this way are added to 100 l of a sterilized main culture medium contained in a 200 l fermenter, the 1.2% ammonium acetate, 0.1% corn steep liquor, 0.1% KH ₁ PO ₄ . 0.05% MgSO ₄ -7 H, O, 0.01% FeSO ₄ -7 11.0, 0.01% CaCI: ■ 2 H ₂ O, 0.001% MnSO ₄ · 4 H ₂ O, 250 y / ml sodium oleate ( as oleic acid) and 100 μg / 1 thiamine hydrochloride, whereupon the cultivation is carried out at 32 ° C. with a supply of 301 air / minute at 240 rpm. When the concentration of dissolved oxygen in the culture medium reaches 5 ppm or more, a sterilized 40% aqueous glacial acetic acid solution is dosed into the culture medium so that the acetic acid concentration is about 0.1 "... based on the volume of the original culture medium 48 hours. During this time, the pH of the culture medium is kept at about 7.0 to 8.0 by adding aqueous ammonia. The consumption of acetic acid is 15 "., Based on the volume of the original culture medium.

7 87 8

Die Bioanalyse der erhaltenen Kulturbriihe auf die wird nitriert und der pH-Wert des Filtrais durch ZusatzThe bioanalysis of the culture broth obtained is nitrated and the pH of the filter is added

im Beispiel 3 beschriebene Weise ergibt, daß 48 mg von Salzsäure auf etwa 3,2 eingestellt, v/obei sich eineIn the manner described in Example 3 shows that 48 mg of hydrochloric acid adjusted to about 3.2, v / obei there is one

L-Glutaminsäure/ml gebildet worden sind. Die Aus- Füllung abscheidet, die abgetrennt und kristallisiertL-glutamic acid / ml have been formed. The filling is deposited, which is separated and crystallized

beute an L-Glutaminsäure beträgt 49 %, bezogen auf die wird. Als Produkt werden 6,6 kg L-Glutaminsäure erhalten,L-glutamic acid yield is 49% of that. The product obtained is 6.6 kg of L-glutamic acid,

verbrauchte Essigsäure. Die erhaltene Kuiturbrühe ^used acetic acid. The Kuitur Broth obtained ^

Claims

'f patent claims:

1. Process for the production of L-glutamic acid by cultivating microorganisms in a culture medium containing acetic acid, characterized in that one L-glutamic acid-producing microorganism from the Brevibacterium thiogenitalis group IFO 12 331, Brevibacterium thiogenitalis IFO 12400, Brevibacterium thiogenitalis IFO 12401, Brevibacterium sp. IFO 12 332, Brevibacterium flavum IFO 12 525, Corynebacterium sp. IFO 12 399, Corynebacterium sp. IFO 12 398, Micrococcus glutamicus IFO 12 523 and Micrococcus glutamicus IFO 12 524, which does not require biotin, but requires unsaturated fatty acids from 16 to 22 carbon atoms, all in one Growing culture medium, which is a source of carbon and nitrogen, a source of unsaturated fatty acids and other nutrients necessary for growth, with the concentration of the Carbon source is maintained at a level no higher than about 1% by while the cultivation period after the point in time when the original carbon source was in the culture medium acetic acid is added, unless it has been used up to a concentration of less than about 1% and the resulting L-glutamic acid is then separated from the culture medium.

2. The method according to Vnspruch 1, characterized in that one .ils unsaturated fatty acids oleic acid, Palm oil acid, linoleic acid, linolenic acid or mixtures of these acids are used.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the original carbon source Contains acetic acid.

4. The method according to claim 3, characterized in that the amount of acetic acid is not higher than about 2% based on the volume of the initial culture medium.

are z. B. in GB-PS 9 68 560 and Japanese patent publication 29819/64. This process uses hydrocarbons as a source of carbon.

The production of L-glutamic acid by cultivation of microorganisms in a culture medium containing acetic acid are known. These are known However, processes are not suitable for large-scale production because of the poor yield of L-glutamic acid. Such methods are disclosed in U.S. Pat 31 17 915 and Japanese Patent Publication 17 348/64.

The microorganisms used according to US Pat. No. 3,117,915 are Brevibacterium roseum (ATCC 13 825), Brevibacterium flavum (ATCC 13 826), Brevibacterium lactofermenium (ATCC 13 869) and Corynebacterium acetoacidophilum (ATCC 13 870). These microorganisms need biotin for their growth. This emerges from "Amino Acid and Nucleic Acid" 1965. p. 4, table 4.

In contrast, the microorganisms according to the present invention do not need any biotin for their growth, which is absolutely unexpected and not obvious to the expert.

That the yields of L-glutamic acid according to the known method according to US-PS 31 17 915 and her corresponding Japanese Patent Publication; 17 348/64 bad and unsuitable for large-scale production are evident from the following comparison with the yields according to the present invention. The following are the yields of L-glutamic acid based on the L-glutamic acid obtained im Culture medium and compared on the basis of acetic acid consumed.