DE1767955A1

DE1767955A1 - Process for the production of L-glutamic acid

Info

Publication number: DE1767955A1
Application number: DE19681767955
Authority: DE
Inventors: Hideo Fukuda; Kazuko Isobe; Toshihiko Kanzaki; Hisayoshi Okazaki; Yasuhiro Sumino
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1967-08-22
Filing date: 1968-07-05
Publication date: 1971-09-30
Also published as: ES356323A1; JPS524628B1; DE1767955B2; CH529725A

Description

PATENTANWÄLTEPATENT LAWYERS

DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHÖNWALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL-CHEM. ALEK VON KREISLER DR.-ING. BY KREISLER DR.-ING. SCHÖNWALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL-CHEM. ALEK VON KREISLER

DIPL.-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖPSCH 1 7 C 7 Q C C KÖLN 1, DEICHMANNHAUS DIPL.-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖPSCH 1 7 C 7 QCC COLOGNE 1, DEICHMANNHAUS

Köln, den 3.9.197ο Kl/wyCologne, 3.9.197ο Kl / wy

Takeda Chemical Industries, Ltd.,

27, Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan).27, Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan).

Verfahren zur Herstellung von L-QlutaminsäureProcess for the preparation of L-glutamic acid

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Kultivierung von Mikroorganismen in einem Kulturmedium, das Essigsäure enthält.The invention relates to a new process for the production of L-glutamic acid by cultivating microorganisms in a culture medium containing acetic acid.

Eine Reihe von Mikroorganismen sind bekannt, die L-Glutaminsäure zu bilden und im Kulturmedium anzureichern vermögen. Die Mikroorganismen, die in der Praxis für die Großherstellung von L-Glutaminsäure verwendet werden, erfordern jedoch im allgemeinen Biotin zum Wachstum, aber ihre Fähigkeit, L-Glutaminsäure zu bilden, wird stark unterdrückt, wenn die Biotinmenge im Kulturmedium einen gewissen Wert übersteigt. Dies bedeutet, daß umständliche Maßnahmen zur überwachung und Steuerung der Wirkung von Biotin im Kulturmedium während der gesamten Kultivierung erforderlich sind. Noch schlimmer ist, daß die meisten gebräuchlichen und wirtschaftlichen Nährstoffquellen, wie Melasse, Stärkehydrolysat, Maisquellwasser und Hefeextrakte, zu viel Biotin für die Durchführung der bisher bekannten Verfahren unter Verwendung der bekannten Mikroorganismen enthalten, es sei denn, daß die Wirkung des Biotins in geeigneter Weise gesteuert wird. Dies ist einer der Nachteile der bekannten Verfahren.A number of microorganisms are known to form L-glutamic acid and are able to accumulate in the culture medium. However, the microorganisms which are practically used for the large-scale production of L-glutamic acid generally require biotin for growth, but their ability to produce L-glutamic acid is greatly suppressed when the amount of biotin in the culture medium exceeds a certain level. This means that cumbersome measures for monitoring and controlling the effect of biotin in the culture medium are necessary during the entire cultivation. Worse still, most common and economical sources of nutrients, such as molasses, starch hydrolyzate, corn steep liquor and yeast extracts, contain too much biotin for the previously known methods to be carried out using the known microorganisms, unless the action of the biotin is appropriate is controlled. This is one of the disadvantages of the known methods.

Die Herstellung von L-Glutaminsäure durch Kultivierung 109840/0400 The production of L-glutamic acid by cultivation 109840/0400

von Mikroorganismen in einem Kulturmedium, das Essigsäure enthält, ist bekannt. Diese bekannten Verfahren eignen sich jedoch auf Grund der schlechten Ausbeute an L-Glutaminsäure nicht für die Großherstellung.of microorganisms in a culture medium containing acetic acid contains is known. However, these known methods are suitable because of the poor yield of L-glutamic acid not for large-scale production.

Gegenstand der Erfindung ist ein für die Großherstellung geeignetes Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Kultivierung von Mikroorganismen, die durch die Blotinmenge nicht beeinträchtigt werden, unter Verwendung von billiger Essigsäure als Kohlenstoffquelle und unter Gewinnung von L-Glutaminsäure hoher Reinheit in guter Ausbeute.The invention relates to a large-scale production process for the production of L-glutamic acid by cultivating microorganisms which are not affected by the amount of blotin using of cheap acetic acid as a carbon source and with the production of L-glutamic acid of high purity in good quality Yield.

Das Verfahren gemäß der Erfindung zur Herstelllung von L-Glutaminsäure ist dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus, der L-Glut amins äure bildet^ zur Gattung Brevibacterium, Corynebacterium oder Micrococcus gehört und kein Biotin, aber eine ungesättigte Fettsäure mit 16 bis 22 Kohlenstoffatomen braucht, in einem Kulturmedium züchtet, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, eine Quelle für ungesättigte Fettsäuren und andere Nährstoffe enthält, und die Konzentration der Kohlenstoffquelle im Kulturmedium während der Kultivierungsperiode nach dem Zeitpunkt, zu dem die ursprüngliche Kohlenstoffquelle im Kulturmedium bis auf eine Konzentration von weniger als etwa 1 % verbraucht worden ist, durch Zusatz von Essigsäure bei einem Wert von nicht mehr als etwa 1 % hält.The method according to the invention for the production of L-glutamic acid is characterized in that a microorganism which forms L-glutamic acid belongs to the genus Brevibacterium, Corynebacterium or Micrococcus and does not need biotin, but an unsaturated fatty acid with 16 to 22 carbon atoms , grows in a culture medium containing a carbon source, a nitrogen source, a source of unsaturated fatty acids and other nutrients, and the concentration of the carbon source in the culture medium during the cultivation period after the point in time when the original carbon source in the culture medium is reduced to a concentration of less than about 1 % has been consumed by adding acetic acid to a value of no more than about 1 % .

Als Mikroorganismen eignen sich für das Verfahren gemäß der Erfindung beispielsweise Brevibacterium thiogenltalis D248, Brevibacterium thiogenitalis D25J5, Brevibacterium thiogenitalis D254, Brevibacterium sp.lll-SO9, Brevibacterium flavum BN,11, Corynebacterium sp.Nr.l602, Corynebacterium sp.Nr.l86, Micrococcus glutamicus Nr. und Micrococcus glutamicus Nr.Brevibacterium thiogenltalis, for example, are suitable as microorganisms for the method according to the invention D248, Brevibacterium thiogenitalis D25J5, Brevibacterium thiogenitalis D254, Brevibacterium sp.III-SO9, Brevibacterium flavum BN, 11, Corynebacterium sp.no.1602, Corynebacterium sp.no.186, Micrococcus glutamicus no. and Micrococcus glutamicus no.

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Als ungesättigte Fettsäure mit 16 bis 22 Kohlenstoffatomen eignen sich beispielsweise Oleinsäure, PalmitOleinsäure, Linolsäure, Linolensäure oder Arachidonsäure. Als Quellen für ungesättigte Fettsäuren eignen sich für die Zwecke der Erfindung beispielsweise ungesättigte Fettsäuren, ihre Salze (z.B. das Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalz) und ihre Ester «it mehrwertigen Alkoholen, z.B. Olyceride (z.B. Schmalz oder Olivenöl). Es genügt im allgemeinen, einfach eine solche Quelle für ungesättigte Fettsäuren in einer Menge τοη etwa 50 bis 1000 γ/ml dem Kulturmedium zuzusetzen.As an unsaturated fatty acid with 16 to 22 carbon atoms are for example oleic acid, palmitoleic acid, Linoleic acid, linolenic acid, or arachidonic acid. As sources of unsaturated fatty acids are suitable for the purpose of the invention, for example, unsaturated fatty acids, their salts (e.g. the sodium, potassium or ammonium salt) and their esters with polyhydric alcohols, e.g. olcerides (e.g. lard or olive oil). It is generally sufficient to simply have such a source of unsaturated fatty acids in an amount τοη about 50 to 1000 γ / ml the culture medium to add.

Als Kohlenstoffquellen eignen sich im ursprünglichen Kulturmedium alle gebräuchlichen Kohlenstoffquellen, z.B. Melasse, Stärkehydrolysat und Essigsäure.All customary carbon sources are suitable as carbon sources in the original culture medium, e.g. Molasses, starch hydrolyzate and acetic acid.

Geeignete Stickstoffquellen für das Verfahren gemäß der Erfindung sind beispielsweise Maisquellwasser, entfettetes Sojabohnenmehl, Ammoniak und Harnstoff.Suitable nitrogen sources for the method according to Examples of the invention are corn steep liquor, defatted soybean meal, ammonia and urea.

Als weitere Mährstoffe eignen sich für das Verfahren gemäß der Erfindung beispielsweise Natriumphosphat, Kallunphosphat, Calciumchlorid und Magnesiumsulfat.As further nutrients are suitable for the method according to the invention, for example, sodium phosphate, Kalunphosphat, Calcium chloride and magnesium sulfate.

Beim Verfahren gemäß der Erfindung ist es völlig unnötig, Maßnahmen zur Steuerung der Biotinwirkung zu ergreifen, wie sie bei allen bekannten Verfahren erforderlich sind, da das Ergebnis des Verfahrens gemäß der Erfindung durch die Biotinmenge im Kulturmedium nicht beeinflußt wird.In the method according to the invention, it is completely unnecessary to take measures to control the action of biotin, as they are required in all known methods, since the result of the method according to the invention by the amount of biotin in the culture medium is not influenced.

Beim Verfahren gemäß der Erfindung kann die als Kohlenstoffquelle dienende Essigsäure in Form von Salzen, z.B. des Natrium-, Kalium-, Ammonium- oder Calciumsalzes, an Stelle der freien Säure zugesetzt werden. Bei Verwendung von Essigsäure als ursprüngliche Kohlenstoffquelle wird ihre Konzentration im Kulturmedium zweckmäßig bei einemIn the process according to the invention, the acetic acid serving as the carbon source may be in the form of salts, e.g. the sodium, potassium, ammonium or calcium salt Place of free acid can be added. If acetic acid is used as the original source of carbon their concentration in the culture medium expediently at one

109840/0490109840/0490

BAD ORIGINALBATH ORIGINAL

Wert gehalten, der nicht höher ist als etwa 2 %_t bezogen auf das Volumen des ursprünglichen Kulturmediums. Nachdem Jedoch der Punkt erreicht ist, bei dem die Konzentration der ursprünglichen Kohlenstoffquelle etwa 1 f> oder weniger erreicht hat, wird die Kultivierung zur Bildung von L-GIutaminsäure weitergeführt, während die Konzentration der Essigsäure im Medium bei einem Wert von nicht mehr als etwa 1 % gehalten wird.Maintained value that is not higher than about 2 % _t based on the volume of the original culture medium. However, after reaching the point at which the concentration of the original carbon source has reached about 1 f> or less, cultivation is continued to produce L-glutamic acid, while the concentration of acetic acid in the medium is no more than about 1 % is held.

Um die Essigsäurekonzentration im Kulturmedium zu regeln, ist es zweckmäßig, die Menge des gelösten Sauerstoffs im Kulturmedium zu überwachen. So lange diese Menge nicht höher ist als etwa 5 ppm bei einem powert von etwa 7-8, liegt die Essigsäurekonzentration im gewünschten Bereich. Die Einstellung des p^-Wertes erfolgt zweckmäßig durch Zusatz einer Base, z.B. von wässrigem Ammoniak oder Harnstoff, wobei diese Base als Teil der Stickstoffquelle . dienen kann.In order to regulate the acetic acid concentration in the culture medium, it is useful to control the amount of dissolved oxygen in the Monitor culture medium. As long as this amount is not higher than about 5 ppm at a powert of about 7-8, the acetic acid concentration is in the desired range. The setting of the p ^ value is expediently carried out through Addition of a base, e.g. aqueous ammonia or urea, with this base as part of the nitrogen source. can serve.

Wie bereits erwähnt, kann Essigsäure als einzige Hauptkohlenstoffquelle während der gesamten Kultivierung verwendet werden. Es ist bemerkenswert, daß Kristalle von L-Olutaminsäure von hoher Reinheit erhalten werden, wenn Essigsäure als einzige Hauptkohlenstoffquelle verwendet wird.As mentioned earlier, acetic acid can be used as the only main source of carbon throughout the cultivation. It is noteworthy that crystals of L-olutamic acid of high purity can be obtained when Acetic acid is used as the only major source of carbon.

Die auf diese Welse im Kulturmedium gebildete L-Glutaminsäure wird in an sich bekannter Welse gewonnen, z.B. durch Filtration der Kulturbrühe, Einstellung des p„-Wertes des erhaltenen Filtrats auf etwa 3,2 durch Zusatz von Salzsäure und Abtrennung der ausgefällten L-Glutaminsäure aus dem Filtrat, ·The L-glutamic acid formed on this catfish in the culture medium is obtained in catfish known per se, e.g. by Filtration of the culture broth, adjustment of the p "value of the obtained filtrate to about 3.2 by adding hydrochloric acid and separating off the precipitated L-glutamic acid the filtrate,

Die Abkürzung "IFO" in den folgenden Beispielen bedeutet "Institute for Fermentation Osaka". 109840/0490The abbreviation "IFO" means in the following examples "Institute for Fermentation Osaka". 109840/0490

example 1

Je 20 ml eines Impfkulturmediums, das 2,0# Glucose, 0,5 % Harnstoff, 0,1 % KH₂PO₄, 0,05 % MgSO₄.7 H₃O, 0,96Maisquellwasser und 100 γ /ml Natriumoleat (als Oleinsäure) enthält, wird in 200 ml-Erlenmeyer-Kolben gegossen, die sterilisiert werden. Das Medium wird jeweils mit einem der in der folgenden Tabelle genannten Stämme geimpft, worauf 24 Stunden bei 28° C in einer rotierenden Schüttelvorrichtung, die eine Drehzahl von 200 UpM hat, bebrütet wird.20 ml each of an inoculation culture medium containing 2.0 # glucose, 0.5 % urea, 0.1 % KH ₂ PO ₄ , 0.05 % MgSO ₄ .7 H ₃ O, 0.96 corn steep water and 100 γ / ml sodium oleate ( as oleic acid) is poured into 200 ml Erlenmeyer flasks, which are sterilized. The medium is inoculated in each case with one of the strains mentioned in the table below, followed by incubation for 24 hours at 28 ° C. in a rotating shaker with a speed of 200 rpm.

Je 70 ml eines Hauptkulturmediums, das ein enzymatisches Hydrolysat von Stärke von süßen Kartoffeln (5 % als direkt reduzierender Zucker), Melasse (5 % als Zucker), Harnstoff (1,5 %), KH₂PO₄ (0,1 %), MgSO₄.7 H₂O (0,05 $), Maisquellwasser (0,5 %) und Natriumoleat (300γ /ml als Oleinsäure) enthält, wird in 200 ml-Kolben gegeben, die sterilisiert werden. Das Hauptkulturmedium wird mit je 5*5 ml der Impfkultur geimpft, worauf die Kultivierung bei ?0° C auf einer mit 200 UpM rotierenden Schüttelvorrichtung durchgeführt wird. In der 24.Stunde der Kultivierung wird Harnstoff in einer Menge von 0,5 %, bezogen auf die Kulturbrühe, zugesetzt. Etwa 30 Stunden nach Beginn der Kultivierung, d.h. nach Erreichen eines Restzuckergehaltes im Kulturmedium von 1 % oder weniger, wird Essigsäure intermittierend so zugesetzt, daß die Konzentration an gelöstem Sauerstoff im Medium bei etwa 5 ppm oder weniger gehalten wird, während gleichzeitig wässriges Ammoniak-. so zugetropft wird, daß das Kulturmedium bei einem p_H-Wert von etwa 7,0 bis 7,3 gehalten wird. Die Kultivierung ist in 48 Stunden beendet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.70 ml each of a main culture medium containing an enzymatic hydrolyzate of starch from sweet potatoes (5 % as direct reducing sugar), molasses (5 % as sugar), urea (1.5 %), KH ₂ PO ₄ (0.1 %) , MgSO ₄ .7 H ₂ O ( $ 0.05), corn steep liquor (0.5 %) and sodium oleate (300γ / ml as oleic acid) is placed in 200 ml flasks which are sterilized. The main culture medium is inoculated with 5 * 5 ml of the inoculation culture, after which the cultivation is carried out at −0 ° C. on a shaking device rotating at 200 rpm. In the 24th hour of cultivation, urea is added in an amount of 0.5 % based on the culture broth. About 30 hours after the start of cultivation, ie after reaching a residual sugar content in the culture medium of 1 % or less, acetic acid is added intermittently so that the concentration of dissolved oxygen in the medium is kept at about 5 ppm or less, while aqueous ammonia. that the culture medium is maintained at a _pH value of about 7,0 to 7,3 is added dropwise so. The cultivation is finished in 48 hours. The results are compiled in the following table.

109840/0 490109840/0 490

L-Gluta-
minsäure-
menge vor
Zusatz
von Essig
säure,
mg/mlL-gluta-
minic acid
amount before
additive
of vinegar
acid,
mg / ml - 6 -- 6 - InsgeTotal
samtvelvet
zugeTrains
setztesat
Essigvinegar
säure,acid,
%% 17679551767955 MikroorganismusMicroorganism 5252 End
gültige
L-Gluta-
minsäure-
menge,
mg/mlEnd
valid
L-gluta-
minic acid
lot,
mg / ml 2.52.5 Ausbeute an
L-Glutamin-
säure,bezogen
auf zugesetzte.
Essigsäure,
% Yield to
L-glutamine
acid, related
on added.
Acetic acid,
% Brevibacterium
thiogenitalis D-248Brevibacterium
thiogenitalis D-248 4545 6666 1.81.8 5858 Brevibaoterium
sp. 111-S09Brevibaoterium
sp. 111-S09 4646 5353 2,02.0 4444 Brevibacterium
thiogenitalis D-253Brevibacterium
thiogenitalis D-253 4747 5555 1.61.6 4646 Brevibacterium
thiogenitalis D-254Brevibacterium
thiogenitalis D-254 5050 5454 2.32.3 4444 Corynebacterium sp.
Nr.I602Corynebacterium sp.
No. I602 5151 6262 2.52.5 5353 Corynebacterium sp.
Nr.186Corynebacterium sp.
# 186 4848 6565 2,02.0 5555 Micrococcus gluta
mic us Nr.534-MS-023Micrococcus gluta
mic us # 534-MS-023 5050 5757 2,22.2 4646 Micrococcus gluta
mic us Nr.54l-MS-117Micrococcus gluta
mic us # 54l-MS-117 4949 6060 2.12.1 4848 Brevibacterium
flavum BN-IlBrevibacterium
flavum BN-Il 5959 4646 Beispiel 2Example 2

Mit Brevibacterium thiogenitalis D-248, der In einem Sakaguchi-Kolben kultiviert worden 1st, werden 30 1 eines sterilisierten Impfkulturmediums geimpft, das die gleiche Zusammensetzung hat wie das in Beispiel 1 genannte Impfkulturmedium, worauf 16 Stunden bei 28° C kultiviert wird. Mit 5 1 der in dieser Weise hergestellten Impfkultur werden 100 1 eines sterilisierten Hauptkulturmediums geimpft, das Melasse (5 % als Zucker), FeSO^ . 7 H₃O (0,05 %)» Harnstoff (0,1 #), Maisquellwasser (0,3 %), KHgPO^ (0 MgSO^.7 H₂O (0,05 %) und Natriumoleat (200 γ/ml als Oleinsäure) enthält, worauf 48 Stunden bei 30° C unter Bewegung mit 150 UpM und Belüftung «it 25 l/Minute kul-Brevibacterium thiogenitalis with D-248 which was cultured in a Sakaguchi flask, 1st of a sterilized seed culture are inoculated 30 1 having the same composition as the seed culture medium mentioned in Example 1, followed by 16 hours at 28 ° C is cultivated. With 5 l of the inoculated culture produced in this way, 100 l of a sterilized main culture medium are inoculated, the molasses (5 % as sugar), FeSO ^. 7 H ₃ O (0.05 %) » urea (0.1 #), corn steep liquor (0.3%), KHgPO ^ (0 MgSO ^ .7 H ₂ O (0.05 %) and sodium oleate (200 γ / ml as oleic acid), after which 48 hours at 30 ° C with agitation at 150 rpm and aeration «it 25 l / minute cul-

1098AQ/04901098AQ / 0490

tiviert wird. Wenn der RestZuckergehalt im Kulturmedium auf 1,0 % gefallen ist, wird mit der kontinuierlichen Zugabe einer 50#igen wässrigen Essigsäurelösung zum Kulturmedium begonnen, wobei so dosiert wird, daß die Sauerstoffkonzentration im Kulturmedium im Bereich von 0 bis 2 ppm gehalten wird. Die Kultivierung wird 48 Stunden durchgeführt. Während der gesamten Zeit wird eine wässrige Ammoniaklösung dem Kulturmedium so zugesetzt, daß der p„-Wert der Kulturlösung automatisch im Bereich von etwa 7 bis 7,3 gehalten wird.is activated. When the residual sugar content in the culture medium has fallen to 1.0% , the continuous addition of a 50 # strength aqueous acetic acid solution to the culture medium is started, dosing in such a way that the oxygen concentration in the culture medium is kept in the range from 0 to 2 ppm. The cultivation is carried out for 48 hours. During the entire time, an aqueous ammonia solution is added to the culture medium in such a way that the p "value of the culture solution is automatically kept in the range from about 7 to 7.3.

Eine Bioanalyse der erhaltenen KulturbrUhe unter Verwendung von Lactobacillus arabinosus ergibt, daß 60 mg L-Glutaminsäure pro ml gebildet worden sind. Die Ausbeute an L-Glutaminsäure beträgt etwa 46,5 %, bezogen auf verbrauchte Essigsäure.A bioanalysis of the culture broth obtained using Lactobacillus arabinosus shows that 60 mg of L-glutamic acid per ml have been formed. The yield of L-glutamic acid is about 46.5 %, based on acetic acid consumed.

Die erhaltene Kulturbrühe wird filtriert und das Filtrat durch Zusatz von Salzsäure auf p_R 3,2 eingestellt, wobei sich Kristalle abscheiden. Die Kristalle werden abgetrennt, wobei 6,1 kg L-Glutaminsäure erhalten werden.The culture broth obtained is filtered and the filtrate is _{adjusted to p R} 3.2 by adding hydrochloric acid, whereupon crystals separate out. The crystals are separated, whereby 6.1 kg of L-glutamic acid are obtained.

' Beispiel 3 ' Example 3

Je 20 ml eines Impfkulturmediums,das 2,0 % Glucose, 0,5 % Harnstoff, 0,1 % KH₂PO^, 0,05 % MgSO^.7 H₂O, 0,5 % Maisquellwasser und 100 γ/ml Natriumoleat (als Oleinsäure) enthält, werden in 200 ml-Erlenmeyer-Kolben gegossen und sterilisiert. Das Kulturmedium wird mit jeweils einem der in der folgenden Tabelle genannnten Mikroorganismen geimpft, worauf 24 Stunden bei 28° C in einer mit 200 UpM rotierenden Schüttelvorrichtung kultiviert wird.20 ml each of an inoculation culture medium containing 2.0 % glucose, 0.5 % urea, 0.1 % KH ₂ PO ^, 0.05 % MgSO ^ .7 H ₂ O, 0.5 % corn steep liquor and 100 γ / ml Sodium oleate (as oleic acid) is poured into 200 ml Erlenmeyer flasks and sterilized. The culture medium is inoculated with one of the microorganisms mentioned in the table below, followed by cultivation for 24 hours at 28 ° C. in a shaking device rotating at 200 rpm.

Je 70 ml eines Hauptkulturmediums, das 1,2# Ammoniumacetat, 0,3 % Maisquellwasser, 0,IgKH₂PO^, 0,05 % MgSO^ 0,001 % MnSO^.4 H₃O, 0,01 % FeSO₂^.7 HgO, 0,005 % CaCl H2O» ²OO y/^ml Natriumoleat (als Oleinsäure), 100 γ/ml 109840/0490 70 ml each of a main culture medium, the 1.2 # ammonium acetate, 0.3 % corn steep liquor, 0, IgKH ₂ PO ^, 0.05 % MgSO ^, 0.001 % MnSO ^ .4 H ₃ O, 0.01 % FeSO ₂ ^. 7 HgO, 0.005 % CaCl H2O » ² OO y / ^ml sodium oleate (as oleic acid), 100 γ / ml 109840/0490

Vitamin B₁ (als Hydrochlorid) und 10 mg/1 Phenolrot enthält, werden in 200 ml-Schüttelenten gegossen und sterilisiert. Mit je 3*5 ml der so hergestellten Impfkultur wird das Hauptkulturmedium geimpft, worauf die Kultivierung bei 32° C auf einer mit 200 UpM rotierenden Schüttelvorrichtung durchgeführt wird.Vitamin B ₁ (as hydrochloride) and 10 mg / 1 phenol red are poured into 200 ml shaking ducks and sterilized. The main culture medium is inoculated with 3 * 5 ml of the inoculation culture produced in this way, after which the cultivation is carried out at 32 ° C. on a shaking device rotating at 200 rpm.

Zur überwachung der Essigsäurekonzentration im Kulturmedium wird Jeder Kolben zu Beginn der Kultivierung mit einem Analysator für gelösten Sauerstoff versehen. Wenn die Menge des gelösten Sauerstoffs im Kulturmedium 5 ppm übersteigt, (dies bedeutet, daß der größte Teil der Essigsäure verbraucht worden ist), wird Essigsäure dem Kulturmedium so zudosiert, daß ihre Konzentration etwa 0,1 % des Volumens des Kulturmediums beträgt, während der p„-Wert des Kulturmediums durch Zusatz von wässrigem Ammoniak nach der Anzeige des Farbumschlages durch das Phenolrot bei etwa 7-8 gehalten wird. Die Kultivierung wird nach der in der Tabelle genannten Zeit abgebrochen, wenn Essigsäure in einer Menge von etwa 15 %, bezogen auf das Volumen des ursprünglichen Kulturmediums verbraucht worden ist. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt.To monitor the acetic acid concentration in the culture medium, each flask is provided with a dissolved oxygen analyzer at the beginning of the cultivation. When the amount of dissolved oxygen in the culture medium exceeds 5 ppm (this means that most of the acetic acid has been consumed), acetic acid is added to the culture medium so that its concentration is about 0.1 % of the volume of the culture medium during the The p "value of the culture medium is kept at about 7-8 by adding aqueous ammonia after the color change is indicated by the phenol red. The cultivation is terminated after the time stated in the table when acetic acid has been consumed in an amount of about 15%, based on the volume of the original culture medium . The results are given in the table below.

109840/0490109840/0490

MikroorganismusMicroorganism

5252 17679551767955 4545 Kultivierungs- Ausbeute
dauer, Std. an
L-Gluta-
minsäure
bezogen
auf ein
gesetzte
Essigsäure
% Cultivation yield
duration, hours on
L-gluta-
minic acid
based
to a
set
acetic acid
% 5050 4545 4848 5151 4545 4343 5353 4343 4141 4848 4848 4242 • 45• 45 4343 3131 4545 5050 4343

Brevibacterium thiogenitalis D-248 Brevibacterium sp. 111-S09 Brevibacterium thiogenitalis D-253 Brevibacterium thiogenitalis D-254 Corynebacterium sp.Nr.l602 Corynebacterium sp.Nr.l86 Micrococcus glutamicus Nr.534-MS-023 Micrococcus glutamicus Nr.54l-MS-117 Brevibacterium flavum BN-Il Brevibacterium flavum ATCC I4o67Brevibacterium thiogenitalis D-248 Brevibacterium sp. 111-S09 Brevibacterium thiogenitalis D-253 Brevibacterium thiogenitalis D-254 Corynebacterium sp.no.1602 Corynebacterium sp.no.186 Micrococcus glutamicus # 534-MS-023 Micrococcus glutamicus # 54l-MS-117 Brevibacterium flavum BN-II Brevibacterium flavum ATCC I4o67

Anmerkung: Brevibacterium flavum ATCC l4o67 brauchtBiotin zum Wachstum und wurde für einen Vergleichsversuch verwendet.Note: Brevibacterium flavum ATCC 14o67 needs biotin for growth and was used for a comparative experiment.

Example 4

Mit Brevibacterium thiogenitalis D-248, der in einem Sakaguchi-Kolben kultiviert worden ist, werden 30 1 eines sterilisierten Impfkulturmediums geimpft, das dieWith Brevibacterium thiogenitalis D-248, which has been cultivated in a Sakaguchi flask, 30 1 a sterilized inoculation culture medium that contains the

5 gleiche Zusammensetzung wie das In Beispiel 3 genannte Impfkulturmedium hat. Die Kultur wird in einen 50 1-Permenter gegeben und 16 Stunden bei 28° C auf die in Beispiel 3 beschriebene Weise fermentiert. 5 1 der so hergestellten Impfkultur werden in 100 1 eines in einem 200 1-5 Same composition as that mentioned in Example 3 Has inoculation culture medium. The culture is in a 50 liter permenter given and fermented for 16 hours at 28 ° C in the manner described in Example 3. 5 1 of the so produced Inoculation culture are in 100 1 one in a 200 1

Io Fermenter enthaltenen sterilisierten Hauptkultürmediums gegeben, das 1,2 % Ammoniumacetat, 0,1 % Maisquellwasser, 0,1 % KH₂PO₄, 0,05 % MgSO₄.7 H₂O, 0,01 % FeSO₄.7 H₃O, 0,01 % CaCl₂.2 H₂O, 0,001 % MnSO₄.4 H₂O, 250 γ/ml Natrium-Io fermentor contained sterilized Hauptkultürmediums optionally containing 1.2% ammonium acetate, 0.1% corn steep liquor, 0.1% KH ₂ PO _4, 0.05% MgSO ₄ .7 H ₂ O, 0.01% FeSO ₄ .7 H ₃ O, 0.01 % CaCl ₂ .2 H ₂ O, 0.001 % MnSO ₄ .4 H ₂ O, 250 γ / ml sodium

109840/0490109840/0490

- Io -- Io -

oleat (als Oleinsäure) und 100 γ/1 Thiaminhydrochlorid enthält, worauf die Kultivierung bei 32° C unter Zufuhr von 50 1 Luft/Minute bei 240 UpM vorgenommen wird. Wenn die Konzentration des gelösten Sauerstoffs im Kulturmedium 5 ppm oder mehr erreicht, wird eine sterilisierte 40 #lge wässrige Eisessiglösung dem Kulturmedium so zudosiert, daß die Essigsäurekonzentration etwa 0,1 %, bezogen auf das Volumen des ursprünglichen Kulturmediums, beträgt. Die Kultivierung wird 48 Stunden durchgeführt. Während dieser Zeit wird der p^-Wert des Kulturmediums durch Zusatz von wässrigem Ammoniak bei etwa 7,0 bis 8,0 gehalten. Der Verbrauch an Essigsäure beträgt 15 #, bezogen auf das Volumen des ursprünglichen Kulturmediums.contains oleate (as oleic acid) and 100 γ / 1 thiamine hydrochloride, whereupon the cultivation is carried out at 32 ° C. with a supply of 50 1 air / minute at 240 rpm. When the concentration of dissolved oxygen in the culture medium reaches 5 ppm or more, a sterilized 40 μlg aqueous glacial acetic acid solution is added to the culture medium so that the acetic acid concentration is about 0.1% based on the volume of the original culture medium. The cultivation is carried out for 48 hours. During this time, the p ^ value of the culture medium is kept at about 7.0 to 8.0 by adding aqueous ammonia. The consumption of acetic acid is 15 #, based on the volume of the original culture medium.

Die Bioanalyse der erhaltenen Kulturbrühe auf die in Beispiel 3 beschriebene Weise ergibt, daß 48 mg L-Olutaminsäure/ml gebildet worden sind. Die Ausbeute an L-Glutaminsäure beträgt 49 %, bezogen auf die verbrauchte Essigsäure. Die erhaltene Kulturbrühe wird filtriert und der PjT-Wert des Piltrats durch Zusatz von Salzsäure auf etwa 3,2 eingestellt, wobei sich eine Fällung abscheidet, die abgetrennt und kristallisiert wird. Als Produkt werden 6,6 kg L-Glutaminsäure erhalten.Bioanalysis of the culture broth obtained in the manner described in Example 3 shows that 48 mg of L-olutamic acid / ml have been formed. The yield of L-glutamic acid is 49 %, based on the acetic acid consumed. The culture broth obtained is filtered and the PjT value of the piltrate is adjusted to about 3.2 by adding hydrochloric acid, a precipitate separating out, which is separated off and crystallized. The product obtained is 6.6 kg of L-glutamic acid.

Die in der Beschreibung und in den Beispielen aufgeführten Mikroorganismen sind am Institut für Fermentation, Osaka (Japan) (IFO) unter folgenden Nummern hinterlegt:The microorganisms listed in the description and in the examples are at the Institute for Fermentation, Osaka (Japan) (IFO) deposited under the following numbers:

Brevibacterium thiogenltalis D-248 IFO-I2331Brevibacterium thiogenltalis D-248 IFO-I2331

Brev!bacterium sp. III-S09 IFO-12332Brev! Bacterium sp. III-S09 IFO-12332

Brevibacterium thiogenitalis D-253 IFO-12400Brevibacterium thiogenitalis D-253 IFO-12400

Brevibacterium Thiogenitalis D-254 IFO-12401Brevibacterium Thiogenitalis D-254 IFO-12401

Corynebacterium sp. No. l602 IFO-12399Corynebacterium sp. No. 1602 IFO-12399

Corynebacterium sp. No. I86 IFO-12398Corynebacterium sp. No. I86 IFO-12398

Micrococcus glutamicus No. 534-MS-023 IFO-12523Micrococcus glutamicus No. 534-MS-023 IFO-12523

Micrococcus glutamicus No. 541-MS-117 IFO-12524Micrococcus glutamicus No. 541-MS-117 IFO-12524

Brevibacterium flavum BN-Il IFO-I2525Brevibacterium flavum BN-II IFO-I2525

1Ö98A0704901Ö98A070490

Claims

1) A process for the production of L-glutamic acid, characterized in that an L-glutamic acid-producing microorganism of the genus Brevibacterium, Corynebacterium or Micrococcus, which does not require biotin, but unsaturated fatty acids of 16 to 22 carbon atoms, is grown in a culture medium that has a A source of carbon and nitrogen, a source of unsaturated fatty acids and other nutrients necessary for growth, the concentration of the carbon source being kept at a value not higher than about 1 # by increasing the growth period after the point in time at which the original Carbon source in the culture medium has been used up to a concentration of less than about 1 % , acetic acid is added and the L-glutamic acid formed is then separated off from the culture medium.

2) Method according to claim 1, characterized in that the microorganisms Brevibacterium thiogenitalis D248, Brevibacterium thiogenitalis D252, Brevibacterium thiogenitalis D254, Brevibacterium sp. 111-S09, Brevibacterium flavum BN.11, Corynebacterium sp. No. 1602, Corynebacterium sp. No. 186, Micrococcus glutamicus No.53 ^ -MS-CBJ and Micrococcus glutamicus No. 5 ^ 1-MS-117 begins.

3) Process according to claim 1 or 2, characterized in that the unsaturated fatty acids oleic acid, palm oil acid, Linoleic acid, linolenic acid or mixtures of these acids

. begins;

4) Process according to claims 1 to 3, characterized in that that the original carbon source contains acetic acid.

1.0.8 8 4 0./O 4 9JD 1.0.8 8 4 0./O 4 9JD

5) Method according to claim 4, characterized in that the amount of acetic acid is not higher than about 2%, based on the volume of the initial culture medium.

10-8 840/0490' original inspected10-8 840/0490 'originally inspected