DE1642717C - Method of making L Pro Im - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Prolin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in hierfür üblichen, Ammonium- und Chloridionen enthaltenden wäßrigen Nährmedien mit einem Gehalt an Biotin in einer für das Wachstum der Mikroorganismen mindestens ausreichenden Menge.The invention relates to a method for producing L-proline by aerobic cultivation of microorganisms in aqueous nutrient media containing ammonium and chloride ions customary for this purpose a content of biotin in an amount that is at least sufficient for the growth of the microorganisms.
Es ist bereits bekannt, daß L-Prolin auf fermentativem Wege unter Verwendung einer Mutanten von Escherichia coli aus Glutaminsäure hergestellt werden kann. Es ist ferner bekannt, daß sich zur fermentativen Herstellung von L-Prolin aurh Neurospora sitophila und verschiedene Hefen eignen.It is already known that L-proline fermentatively using a mutant can be produced by Escherichia coli from glutamic acid. It is also known that to fermentative production of L-proline aurh Neurospora sitophila and various yeasts are suitable.
Aus der französischen Patentschrift 1 427 534 ist es bereit? bekannt, daß L-Prolin auf fermentativem Wege in einem ein Kohlenhydrat enthaltenden Nährmedium angereichert wird, wenn in diesem Brevibacterium flavum ATCC 15 940 kultiviert wird. Aus der USA.-Patentschrift 3 222 258 ist schließlich bereits ein Verfahren zur Herstellung von L-Prolin auf fermentativem Wege unter Verwendung von Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas und Candida in einem üblichen, Biotin, Ammonium- und Chloridionen in einer Konzentration von etwa 0,1 Mol/Liter enthaltenden Nährmedium bekannt.From French patent specification 1 427 534 is it ready? known that L-proline on fermentative Ways in a nutrient medium containing a carbohydrate is enriched when in that Brevibacterium flavum ATCC 15 940 is cultivated. From the USA patent specification 3,222,258 is finally already a process for the production of L-proline by fermentation using microorganisms of the genus Pseudomonas and Candida in a common, biotin, ammonium and chloride ions known in a concentration of about 0.1 mol / liter containing nutrient medium.
Die bisher bekannten Verfahren zur Herstellung von L-Prolin sind jedoch wegen der damit erzielbaren geringen Ausbeute für die großtechnische Herstellung dieser bekannten Aminsäure nicht geeignet.The previously known processes for the production of L-proline are, however, achievable because of the low yield not suitable for the large-scale production of this known amino acid.
Aufgabe der Erfindung ist es nun, ein verbessertes Verfahren zur fennentativen Herstellung von L-Prolin anzugeben, mit dessen Hilfe die den bisher bekannten Verfahren anhaftenden Nachteile beseitigt werden können und das insbesondere zur großtechnischen Herstellung von L-Prolin geeignet und einfach durchführbar istThe object of the invention is now to provide an improved process for the fennentative production of L-proline indicate, with the help of which the disadvantages inherent in the previously known methods are eliminated can, and in particular, be suitable and easy to carry out for the large-scale production of L-proline is
Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe dadurch gelöst werden kann, daß man ganz bestimmte Mikro-Organismen der Gattung Micrococcus glutamicus verwendet und in dem Nähnnedium eine Mindestkonzentration an Ammonium- und Chloridionen von jeweils 0,5 Mol pro Liter aufrechterhält.It has now been found that this object can be achieved by using very specific microorganisms of the genus Micrococcus glutamicus and a minimum concentration in the sewing medium of ammonium and chloride ions of 0.5 moles per liter each.
Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren zur Herstellung von L-Prolin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in hierfür üblichen, Aß'-aonium- und Chloridioneri enthaltenden wäßrigen Nährmedien mit einem Gehalt an Biotin in einer für das Wachstum der Mikroorganismen mindestens ausreichenden Menge, das dadurch gekennzeichnet ist, daß als Mikroorganismen Micrococcus glutamicus ATCC 21 157, 21 158 oder 21 159 eingesetzt wird und die Ammonium- und Chloridionenkonzentration im Nährmedium jeweils mindestens 0,5 Mol pro Liter beträgt.The invention now relates to a process for the production of L-proline by aerobic cultivation of Microorganisms in aqueous nutrient media containing Aß'-aonium and chloride ions customary for this purpose with a content of biotin at least sufficient for the growth of the microorganisms Amount, which is characterized in that the microorganisms Micrococcus glutamicus ATCC 21 157, 21 158 or 21 159 is used and the ammonium and chloride ion concentration in the Nutrient medium is at least 0.5 mol per liter.
Bezüglich der Konzentration an Biotin in dem Nährmedium ist es zweckmäßig, die Kultivierung unter solchen Bedingungen durchzuführen, bei denen die Biotinkonzentration auf einem Wert gehalten wird.With regard to the concentration of biotin in the nutrient medium, it is advisable to cultivate under to carry out such conditions in which the biotin concentration is kept at a value.
bei dem die Mikroorganismenzellen optimal wachsen. Dabei hat sich gezeigt, daß die Konzentration an Ammoniumionen in dem Nährmedium möglichst hoch gehalten werden muß. Die Bildung von L-Prolin wird begünstigt, wenn die Konzentration des Ammoniumsalzes in dem Nährmedium auf einem Wert von mindestens etwa 4 Gewichtsprozent gehalten wird, insbesondere dann, wenn als Ammoniumsalz Ammoniumchlorid verwendet wird. Ferner wurde gefunden, daß durch die Anwesenheit von zusätzlichen Cnloridionen die Bildung von L-Prolin in synergistischer Weise begünstigt wird.in which the microorganism cells grow optimally. It has been shown that the concentration of ammonium ions must be kept as high as possible in the nutrient medium. The formation of L-proline is favored when the concentration of the ammonium salt is kept in the nutrient medium at a value of at least about 4 percent by weight, especially when ammonium chloride is used as the ammonium salt. It was also found that the presence of additional Cnloridionen the formation of L-proline in a synergistic manner Way is favored.
Die Abhängigkeit der i.-Prolinbildung von der Konzentration der Ammoniumionen und Chloridionen sowie der Konzentration an Biotin in dem Nährmedium geht aus den folgenden Tabellen hervor:The dependence of i.-proline formation on the Concentration of ammonium ions and chloride ions as well as the concentration of biotin in the The nutrient medium is shown in the following tables:
Zusammensetzung des NährmediumsComposition of the nutrient medium
Glukose Glucose
[NH4I,Sf)4 [NH 4 I, Sf) 4
NaCI NaCl
KH,PO4 KH, PO 4
K,HPO4 K, HPO 4
MpSO4 7H.O MpSO 4 7H.O
FeSf)4 7 H,Ό FeSf) 4 7 H, Ό
MnSO4 4H,O MnSO 4 4H, O
Bemerkung I) zu Tabelle INote I) to Table I.
ISg dlISg dl
wie in Tabelle I angegebenas indicated in Table I.
wie in Tabelle I angegebenas indicated in Table I.
0.10 g dl0.10 g dl
0.10 g dl0.10 g dl
(1.05 g dl(1.05 g dl
0.002 g dl0.002 g dl
0,lX>2 ρ dl0, lX> 2 ρ dl
ZnSO4 711,0 0.(X)I g dlZnSO 4 711.0 0. (X) I g dl
NiCI, ■ MU) 0,001 g dlNiCI, ■ MU) 0.001 g dl
K-CrO4 . ." 0.00! i; iüK-CrO 4 . . "0.00! I; iü
Biotin 100 ■ ΊBiotin 100 ■ Ί
Thiaminhulroehlorid - mg 1Thiamine sulphuride - mg 1
Fleischextrakt 0,5 g dlMeat extract 0.5 g dl
HainsipfT 0.5 g dlHainsipfT 0.5 g dl
CaCOj 5.0 g dlCaCOj 5.0 g dl
Bemerkung 2) zu Tabelle IComment 2) to Table I.
ZüchtungsbedingungenBreeding conditions
20 ml des Nährmediums werden in einen Sakaguchi-IColben gegossen und sterilisiert. Der Stamm Micrococcus glutamicus ATCC 21 157 ird eingeimpft uiid unter aeroben Bedingungen unter Schütteln bei 28 bis 305C 96 Stunden lang kultiviert.20 ml of the nutrient medium are poured into a Sakaguchi-I flask and sterilized. The strain Micrococcus glutamicus ATCC 21 157 is inoculated and cultivated under aerobic conditions with shaking at 28 to 30 5 C for 96 hours.
Bemerkung 3) zu Tabelle I Die Zahlenwerte in der Tabelle I zeigen die gebildete L-Prolinmenge in mg/ml.Comment 3) to Table I The numerical values in Table I show the amount of L-proline formed in mg / ml.
temgenerate
tem
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tem
L-GIu-fathered
L-GIu-
rienBacteria
rien
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L-GIu-fathered
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L-GIu-fathered
L-GIu-
rienBacteria
rien
L-GIu-sign
L-GIu-
Bemerkung l|r: Tabelle IINote l | r: Table II
Zusammensetzung des Nährmediums:Composition of the nutrient medium:
Glukose wie in der TabelleGlucose as in the table
NH4Cl wie in der TabelleNH 4 Cl as in the table
K,H PO4 0.10 g/dlK, H PO 4 0.10 g / dl
KH1PO4 0.10 g/dlKH 1 PO 4 0.10 g / dl
MgSO4 · 7H,O 0,05 g dlMgSO 4 • 7H, O 0.05 g dl
FeSO4 · 7H,Ö 0.002 g/dlFeSO 4 7H, Ö 0.002 g / dl
MnSO4 · 4H,0 0.002 g dlMnSO 4 · 4H, 0 0.002 g dl
ZnSO4 -7H,Ö 0.001 g dtZnSO 4 -7H, Ö 0.001 g German
NiCI, -6H,O 0.001 g dlNiCI, -6H, O 0.001 g dl
K2CrO4 .." Ü.OOI g/dlK 2 CrO 4 .. "U.OOI g / dl
Biotin wie in der TabelleBiotin as in the table
Thiaminhydrociilorid 2 mg/1Thiamine hydrochloride 2 mg / 1
Fleischextrakt 0,5 g/dlMeat extract 0.5 g / dl
Harnstoff 0 5 a/dlUrea 0 5 a / dl
CaCO3 5,0 g/dlCaCO 3 5.0 g / dl
Bemerkung 2) zu Tabelle IINote 2) to Table II
Züchtungsbedingungen Wie in Tabelle I.Cultivation conditions As in Table I.
Bemerkung 3) zu Tabelle II Die Mengen an Baktcricnzellen wurden an Hand des Gewichtes der getrockneten Bakterienzellen ermittelt.Comment 3) to Table II The amounts of bacterial cells were determined on the basis of the weight of the dried bacterial cells.
Die Beziehung zwischen der Ammoniumchloridkonzcntration und der Biotinkonzentration geht aus den Tabellen I und II hervor, wobei Ammoniumsulfat als Ammoniumionenquelle, Natriumchlorid als Ch'.oridionenquelle und Ammoniumchlorid als Quelle sowohl für Ammonium- als auch Chloridionen eingesetzt wurden. Wie aus diesen Tabellen zu ersehen ist. steig», die Menge an gebildetem t-Prolin durch Erhöhung der Ammoniumionenkonzentration in dem Nährmedium an. Darüber hinaus wird die. Bildung von ι-Prolin durch eine steigende Chloridioncnkonzen· tration (Zugabe von Natriumchlorid) erheblich beschleunigt. Beträgt die Konzentration an beiden Ionen 0.5 Mol pro Liter oder darüber, dann verstärkt sich diese Neigung erheblich, wobei die Menge an gebildetem i-Prolin bei einer Konzentration von ungefähr 0.7 bis 1.2 Mol pro Liter ein Maximum erreicht.The relationship between the concentration of ammonium chloride and the biotin concentration is shown in Tables I and II, where ammonium sulfate as the source of ammonium ions, sodium chloride as the source of chloride ions and ammonium chloride as the source were used for both ammonium and chloride ions. As can be seen from these tables. increase », the amount of t-proline formed by increasing it the ammonium ion concentration in the nutrient medium. In addition, the. formation of ι-proline due to an increasing chloride ion concentration tration (addition of sodium chloride) accelerated considerably. Is the concentration of both ions 0.5 mol per liter or above, then this tendency increases considerably, with the amount of i-proline reaches a maximum at a concentration of about 0.7 to 1.2 moles per liter.
Wie aus einem Vergleich der Tabellen I und II hervorgeht, kann die optimale Menge eine beträchtlich höhere Konzentration bei der Zugabe von Ammoniumchlnrid als Ammonium- und Chloridionenquelle erreichen als dies der Fall ist, wenn zwei Verbindungen, wie beispielsweise Ammoniumchlorid und Natriumchlorid, zugesetzt werden. Die Menge an gebildetem ι-Prolin kann auf diese Weise gesteigert werden.As can be seen from a comparison of Tables I and II, the optimal amount can be a considerable higher concentration when adding ammonium chloride as a source of ammonium and chloride ions than is the case when two compounds, such as ammonium chloride and sodium chloride, can be added. The amount of ι-proline formed can be increased in this way.
to Diese Erscheinung scheint auf die Tatsache zurückzuführen zu sein, daß im Falle von Ammoniumchlorid der osmotische Druck in dem Medium nicht so stark erhöht wird, daß seine wachstumshemmende Wirkung auf die Mikroorganismen gering ist. wobei die unerwünschte hemmende Wirkung anderer Ionen, wie beispielsweise von Natrium- und Sulfationen, nicht eintritt. Ferner steht die Wirkung dieser beiden Ionen auf die Erzeugung von i.-Prolin in enger Beziehung to this phenomenon appears to be due to the fact that in the case of ammonium chloride, the osmotic pressure in the medium is not increased so much that its growth inhibitory effect is small on the microorganisms. whereby the undesirable inhibitory effect of other ions, such as sodium and sulfate ions, does not occur. Furthermore, the effect of these two ions on the production of i.-proline is closely related
zu der Konzentration an Biotin in dem Nährmedium. Die Bildung von L-Prolin zeigt dann ein Maximum, wenn eine Biotinmenge in dem Nährmedium zugegen ist, die fur das Wachstum der Bakterienzellen ausreicht oder über dieser ausreichenden Menge liegt.to the concentration of biotin in the nutrient medium. The formation of L-proline shows a maximum when an amount of biotin is present in the nutrient medium which is sufficient for the growth of the bacterial cells or is above this sufficient amount.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist sowohl ein synthetisches Nährmedium als auch ein natürliches Nährmeüium geeignet, sofern es die für das Wachsen des eingesetzten Mikroorganismus erforderlichen Nährstoffe enthält. Solche Nährstoffe sind bekannt. Zu ihnen gehören beispielsweise eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Verbindungen, wobei diese Nährstoffe von dem eingesetzten Mikroorganismus in entsprechenden Mengen verbraucht werden.To carry out the method according to the invention is both a synthetic nutrient medium as also a natural nutrient medium suitable, provided that it is necessary for the growth of the microorganism used contains necessary nutrients. Such nutrients are known. They include, for example a carbon source, a nitrogen source and inorganic compounds, these being nutrients are consumed in appropriate quantities by the microorganism used.
Als Kohlenstoffquelle seien beispielsweise genannt: Kohlehydrate, wie z. B. Glukose, Fruktose, Maltose, Rohrzucker. Stärke, Stärkehydrolysat und Melassen, oder irgendwelche anderen geeigneten Kohlenstoff quellen, wie beispielsweise Glycerin, Mannit. Sorbit, aliphatische organische Säuren, z. B. Gluer nsäure. Zitronensäure und Essigsäure. Diese Substanzen können entweder allein oder in Form von Mischungen aus zwei oder mehreren Substanzen eingesetzt werden.As a carbon source, for example: Carbohydrates, such as. B. glucose, fructose, maltose, Cane sugar. Starch, starch hydrolyzate and molasses, or any other suitable carbon swell, such as glycerin, mannitol. Sorbitol, aliphatic organic acids, e.g. B. Gluer n acid. Citric acid and acetic acid. These substances can can be used either alone or in the form of mixtures of two or more substances.
Als Stickstoffquelle kommen verschiedene anorganische oder organische Salze oder Verbindungen in Frage, beispielsweise Harnstoff, Ammoniak, Ammoniumsalze, z. B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat. Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat und Ammoniumphosphat, oder natürliche. Stickstoff enthaltende Substanzen, beispielsweise Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl. Fleischbrühe. Kaseinhydrolysate, lösliche Fischbestandteile oder Reiskleieextrakt. Diese Substanzen können ebenfalls allein oder in Form einer Mischung aus zwei oder mehreren Substanzen eingesetzt werden.Various inorganic or organic salts or compounds can be used as nitrogen sources Question, for example urea, ammonia, ammonium salts, e.g. B. ammonium chloride, ammonium sulfate. Ammonium nitrate, ammonium acetate and ammonium phosphate, or natural. Containing nitrogen Substances, for example corn steep liquor, yeast extract, meat extract, peptone, fish meal. Meatsoup. Casein hydrolyzates, soluble fish ingredients or rice bran extract. These substances can can also be used alone or in the form of a mixture of two or more substances.
Anorganische Verbindungen, die dem Nährmedium zugesetzt werden können, sind beispielsweise Magnesiumsulfat. Natriumphosphat, Kaliumhydrogenphosphat. Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat. Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid oder andere Salze von Kalium, Magnesium, Eisen und Mangan. Außerdem können verschiedene Nährstoffe, wie beispielsweise Vitamine, Aminosäuren oder Nucleinsäuren, dem Nährmedium zugesetzt werden.Inorganic compounds that can be added to the nutrient medium are, for example, magnesium sulfate. Sodium phosphate, potassium hydrogen phosphate. Potassium monohydrogen phosphate, iron sulfate. Manganese chloride, calcium chloride, sodium chloride or other salts of potassium, magnesium, iron and manganese. In addition, various nutrients, such as vitamins, or amino acids Nucleic acids, added to the nutrient medium.
Die Chloi uionen können in Form von beispielsweise Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder Calciumchlorid zugefügt werden. Lie Verwendung von Ammoniumchlorid, das beide Ionen enthält, ist sowohl aus wirtschaftlichen Gründen als auch hinsichtlich des Wirkungsgrades zu empfehlen.The Chloi uionen can be in the form of, for example Sodium chloride, potassium chloride or calcium chloride can be added. Lie use of ammonium chloride, containing both ions is both economical and economical the efficiency is recommended.
Die optimale Konzentration an Biotin, die bei dem erfindungsgemäßen Fermentationsverfahren zur Erzeugung von ι.-Prolin eingesetzt wird, schwankt etwas mit· der Zusammensetzung des Nährmediums, den Züchtungsbedingungen u. dgl. Folglich ändert sich die dem Nährmedium zuzusetzende' Biotinkonzentration mit diesen Bedingungen. Im allgemeinen wird die Zugabe von etwa 30 bis 1000 v/l bevorzugt. Im Handel erhältliche Quellen für reines Biotin sowie Rohprodukte, die Biotin enthalten, sind einsetzbar. Falls Biotin enthaltende Substanzen, wie beispielsweise Melassen, in dem Medium verwendet werden, kann ein Teil des Biotins o';r die ganze erforderliche Biotinmenge in dieser Form zugeführt werden. Bekannte Biotinersatzverbindungen können ebenfalls eingesetzt werden. Von deri.<'igen verwendbaren Ersatzverbindungen seien beispielsweise Biotinhomologe, wie z. B. Biocitin und dJ-Desthiobiotin, Substanzen mit Pelargonsäuregruppen, wie beispielsweise 7-Keto-8-amino-pelargonsäuresalze und 7,8-Diketopelargonsäure, höhere ungesättigte Fettsäuren, wie beispielsweise Linoleinsäure und ölsäure sowie nichtionische oberflächenaktive Mittel, wie beispielsweise Sorbitanmonooleat und Polyoxyäthylensorbitanmonooleat, erwähnt. Substanzen, die als Äquivalente zu Biotin angesehen werden, können ebenfalls ge-The optimal concentration of biotin which is used for production in the fermentation process according to the invention is used by ι.-proline, fluctuates somewhat with · the composition of the nutrient medium, the Cultivation conditions and the like. As a result, the biotin concentration to be added to the nutrient medium changes with these conditions. In general, the addition of about 30 to 1000 v / l is preferred. in the Commercially available sources of pure biotin as well as raw products containing biotin can be used. If substances containing biotin, such as molasses, are used in the medium, may be part of the biotin o '; r all of the required Amount of biotin can be supplied in this form. Known biotin replacement compounds can also can be used. Of these usable substitute compounds are, for example, biotin homologs, such as. B. biocitin and dJ-desthiobiotin, substances with pelargonic acid groups, such as 7-keto-8-amino-pelargonic acid salts and 7,8-diketopelargonic acid, higher unsaturated fatty acids such as linoleic acid and oleic acid as well as nonionic ones surface-active agents such as sorbitan monooleate and polyoxyethylene sorbitan monooleate, mentioned. Substances that are regarded as equivalents to biotin can also be used
gebenenfails verwendet werden. Werden diese Ersatzmittel eingesetzt, dann richtet sich die zugesetzte Menge nach der Wirksamkeit des Ersatzmittels, die im allgemeinen bekannt ist.giveenfails are used. If these substitutes are used, the added one is determined Amount according to the effectiveness of the substitute, which is generally known.
Die Züchtung oder Fermentierung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, beispielsweise durch aerobes Schütteln oder durch Belüften und Rühren, und zwar bei einer Temperatur von etwa 25 bis 35C C, verzugsweise 28 bis 32° C. und bei einen, ,Ή von ungefähr 6.0 bis 7,0. Es ist am zweckmäßigsten, das pH während der Züchtung auf den angegebenen Bereich einzustellen. Als Neutralisierungsmittel für diesen Zweck seien Ammoniak, Harnstoff, Natriumhydroxyd. Kaliumhydroxyd und Calciumcarboriat erwähnt, ι.-Prolin wird in der erhaltenen Fermentationsfiüssigkeil gewöhnlich nach 2- bis 5tägigem Züchten als Hauptprodukt angereichert.The cultivation or fermentation is carried out under aerobic conditions, for example by aerobic shaking or by aeration and stirring, namely at a temperature of about 25 to 35 C C, preferably 28 to 32 ° C and at a,, Ή from about 6.0 to 7.0. It is most convenient to adjust the pH to the specified range during cultivation. Neutralizing agents for this purpose are ammonia, urea, sodium hydroxide. Potassium hydroxide and calcium carborate mentioned, ι.-proline is usually enriched in the fermentation liquid wedge obtained after 2 to 5 days of cultivation as the main product.
Nach Beendigung d<:r Fermentation kann das L-Prolin aus eier Fermentalionsflüssigkeit durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz abgetrennt werden. Beispielsweise wird das Fermentationsmedium filtriert, die Fermentationsfiüssigkeit mittels eines Kationenaustauscherharzes behandelt und von letzterem anschließend das L-Prolin eluiert. Nach der Konzentrierung des Eluais unter vermindertem Druck wird Methanol zugesetzt, um in Methanol kaum lösliche Aminosäuren durch Filtration abzutrennen. Anschließend wird in der methanolischen i.-f'rolinlösung das Methanol durch Wasser ersetzt, worauf die Lösung durch ein Katiorenaustauscherharz sowie durch ein Anionenaustauscherharz zur Entfernung kleiner Mengen basischer und saurer Aminosäuren geleitet wird. Aus dem konzentrierten mit Methanol versetzten Eluat können nach Filtration und Einengen zur Trockne unter vermindertem Druck rohe Kristalle von L-Prolin erhalten werden.After the fermentation has ended, that can L-proline is separated from egg fermentation liquid by treatment with an ion exchange resin will. For example, the fermentation medium is filtered and the fermentation liquid is filtered treated with a cation exchange resin and the L-proline is then eluted from the latter. After Concentration of the eluent under reduced pressure, methanol is added to hardly in methanol separate soluble amino acids by filtration. Then in the methanolic i.-f'rolin the methanol is replaced by water, whereupon the solution is replaced by a Katiorenaustauschharz as well by an anion exchange resin to remove small amounts of basic and acidic amino acids is directed. After filtration and concentration, the concentrated eluate mixed with methanol can be used crude crystals of L-proline are obtained to dryness under reduced pressure.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern. Die Prozentangaben sind Gewichtsprozent.The following examples are intended to illustrate the invention. The percentages are percentages by weight.
Ein Nährmedium der folgenden Zusammensetzung wird ir I 1 Wasser hergestellt:A nutrient medium with the following composition is prepared in 1 liter of water:
25 g/dl Glukose,25 g / dl glucose,
6 g/dl NH4Cl,6 g / dl NH 4 Cl,
0.10g/dl KH7PO4,0.10g / dl KH 7 PO 4 ,
0,15 e/dl K-HPO4.0.15 e / dl K-HPO 4 .
0,10 g/dl MgOO4-TH2O,0.10 g / dl MgOO 4 -TH 2 O,
0,002 g/dl FeSO4-7H2O,0.002 g / dl FeSO 4 -7H 2 O,
0,002 g/dl MnSO4-4H2O,0.002 g / dl MnSO 4 -4H 2 O,
0.001 g/dl ZnSO4-7H2O,0.001 g / dl ZnSO 4 -7H 2 O,
2 mg/1 Thiaminhydrochlorid,2 mg / 1 thiamine hydrochloride,
5,0 g/dl CaCO-,5.0 g / dl CaCO-,
0,5 g/dl Hefeextrakt,0.5 g / dl yeast extract,
0,5 g/dl Harnstoff,
80 v/dl Biotin.0.5 g / dl urea,
80 v / dl biotin.
20 ml des vorstehend beschriebenen Nährmediums werden in einen 500-ml-Sakaguchi-Kolben gegossen und 15 Minuten lane bei 12O0C sterilisiert. Die Phos-20 are poured into a 500-ml Sakaguchi flask, and 15 minutes at 12O 0 C lane sterilized ml of the culture medium described above. The Phos
phate und der Harnstoff werden jeweils getrennt sterilisiert. Auf Teile des erhaltenen Nährmediums, die in einzelnen Kolben enthalten sind, wird Micrococcus glutamicus ATCC 21 158 aufgeimpft. Das Züchten wird dann unter aerobem Schütteln 96 Stunden lang bei 300C durchgeführt.The phate and the urea are each sterilized separately. Micrococcus glutamicus ATCC 21 158 is inoculated into parts of the nutrient medium obtained, which are contained in individual flasks. Culturing is performed under aerobic shaking for 96 hours at 30 0 C.
Die Menge des im Fermentationsmedium nach Beendigung des Züchtens angereicherten i.-Prolins beträgt im Durchschnitt 22,4 mg/ml. Die Menge an als Nebenprodukt anfallender Glutaminsäure beträgt durchschnittlich 4,2 mg/ml.The amount of i.-prolin accumulated in the fermentation medium after the cultivation is complete averages 22.4 mg / ml. The amount of by-product glutamic acid is average 4.2 mg / ml.
Nach Beendigung des Züchtens wird das erhaltene Fermentationsmedium gesammelt und auf ein Volumen von 11 gebracht. Anschließend wird das pH durch Zugabe von Schwefelsäure auf 2 eingestellt, worauf unlösliche Substanzen abfiltriert werden. Das Filtrat wird durch ein Kationenaustauscherharz (SuI-fonsäuretyp) geleitet, worauf nach der Adsorption eine Eluierung mit Ammoniakwasser durchgeführt wird. 0,31 der L-Prolin-Abflußfraktion werden unter vermindertem Druck bis auf ein Volumen von etwa 50 ml eingeengt. Anschließend wird kontinuierlich Methanol zugesetzt, wobei gleichzeitig die Lösung konzentriert wird. Auf diese Weise wird das Wasser durch Methanol ersetzt. Die Methanollösung wird zur Entfernung von Aminosäuren, die in Methanol kaum löslich sind, filtriert. Das Methanol wird durch Wasser ersetzt und diese wäßrige Lösung durch eine Kationenaustauscherharz-Kolonne sowie anschließend durch eine Anionenaustauscherharz-Kolonne geleitet. Nach der Konzentrierung des Efluats wird das Wasser erneut zur Entfernung von unlöslichen Substanzen durch Methanol ersetzt. Die erhaltene Methanollösung (etwa 100 ml) wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Dabei fallen 16-g roher i-Prolin-Kristalle an.After the cultivation is completed, the obtained fermentation medium is collected and made up to volume brought by 11. The pH is then adjusted to 2 by adding sulfuric acid, whereupon insoluble substances are filtered off. The filtrate is replaced by a cation exchange resin (sulfonic acid type) passed, whereupon elution with ammonia water is carried out after the adsorption will. 0.31 of the L-proline effluent fraction are below concentrated under reduced pressure to a volume of about 50 ml. Then it is continuous Methanol is added, the solution being concentrated at the same time. This is how the water becomes replaced by methanol. The methanol solution is used to remove amino acids that are present in methanol are hardly soluble, filtered. The methanol is replaced by water and this aqueous solution by a Cation exchange resin column and then through an anion exchange resin column directed. After concentrating the efluate, the water is used again to remove insolubles Substances replaced by methanol. The methanol solution obtained (about 100 ml) is reduced under reduced pressure Pressure evaporated to dryness. 16 g of crude i-proline crystals are obtained.
In 1 1 Wasser wird folgendes Nährmedium hergestellt: The following nutrient medium is prepared in 1 liter of water:
20 g/dl Glukose,20 g / dl glucose,
5 g/dl (NH4J2SO4,5 g / dl (NH 4 J 2 SO 4 ,
5 g/dl NaCl,5 g / dl NaCl,
0.10g/dl KH2PO4,0.10g / dl KH 2 PO 4 ,
0.10 g/dl K2HPO4,0.10 g / dl K 2 HPO 4 ,
0.05 g/dl MgSO4 -7H2O,0.05 g / dl MgSO 4 -7H 2 O,
0.002 g/dl MnSO4 4H2O,0.002 g / dl MnSO 4 4H 2 O,
0,001 e/dl ZnSO4 - 7H2O,0.001 e / dl ZnSO 4 - 7H 2 O,
0,001 g/dl NiCl2 · 6H2O,0.001 g / dl NiCl 2 6H 2 O,
0.001 g/dl K2CrO4,0.001 g / dl K 2 CrO 4 ,
1 mg/ml Thiaminhydrochlorid,1 mg / ml thiamine hydrochloride,
4.0g/di CaCO3,4.0g / di CaCO 3 ,
1,0 g/dl Hefeextrakt,1.0 g / dl yeast extract,
.0,5 g/dl Harnstoff,
50 γ ft Biotin..0.5 g / dl urea,
50 γ ft biotin.
20-ml-Portionen des vorstehend beschriebenen Nährmediums werden in konische 500-ml-Kolben gegeben und 15 Minuten lang bei 1200C sterilisiert. Die Phosphate und der Harnstoff werden getrennt sterilisiert. Jeder Kolben, welcher das Nährmedium enthält, wird mit Micrococcus glutamicus ATCC 21 157 beimpft. Das Züchten wird dann unter aerobem Schütteln 96 Stunden lang bei 28° C durchgeführt. 20 ml portions of the nutrient medium described above are placed in conical 500 ml flasks and sterilized at 120 ° C. for 15 minutes. The phosphates and urea are sterilized separately. Each flask containing the nutrient medium is inoculated with Micrococcus glutamicus ATCC 21,157. Culturing is then carried out with aerobic shaking for 96 hours at 28 ° C.
Die nach Beendigung des Züchtens im Fermentationsmedium angereicheue Menge an L-Prolin beträgt durchschnittlich 24,8 mg /ml. Die Menge der als Nebenprodukt anfallenden l.-Giutaminsäurc wird zu durchschnittlich 3.1 mg/ml ermittelt.The amount of L-proline that accumulates in the fermentation medium after cultivation is complete averages 24.8 mg / ml. The amount of 1-giutamic acid obtained as a by-product is determined to be an average of 3.1 mg / ml.
Nach Beendigung des Züchtens wird das l-'ermcntationsmedium gesammelt und auf ein Volumen von 1 1 gebracht. Die Abtrennung des ι,-Prolins erfolgt in der gleichen Weise wie im Beispiel 1. Auf diese Weise werden ungefähr 18 g roher i.-Prolin-Kristalle erhalten.After the cultivation is completed, the impregnation medium becomes collected and brought to a volume of 1 l. The separation of the ι, -proline takes place in in the same manner as in Example 1. In this way, about 18 g of crude i.-proline crystals are obtained receive.
In 1 1 Wasser wird ein Nährmedium der folgenden Zusammensetzung hergestellt:A nutrient medium with the following composition is prepared in 1 liter of water:
25 g/dl Glukose,25 g / dl glucose,
5 g/dl NH4Cl,
0,10g/dl KH2PO4,5 g / dl NH 4 Cl,
0.10g / dl KH 2 PO 4 ,
0,15 g/dl K2HPO4,0.15 g / dl K 2 HPO 4 ,
0,05 g/dl MgSO4-7H2O,0.05 g / dl MgSO 4 -7H 2 O,
0,003 g/dl MnSO4-4H2O,0.003 g / dl MnSO 4 -4H 2 O,
0,002 g/dl ZnSO4-7H2O,
2 mg/1 Thiaminhydrochlorid.0.002 g / dl ZnSO 4 -7H 2 O,
2 mg / 1 thiamine hydrochloride.
4,0 g/dl CaCO3,4.0 g / dl CaCO 3 ,
0,5 g/dl Hefeextrakt,0.5 g / dl yeast extract,
0,5 g/dl Harnstoff,
100 yft Biotin.0.5 g / dl urea,
100 yft biotin.
31 des vorstehend beschriebenen Nährmediums werden in eine 5-1-Glas-Fermentierungsvorrichtung gegeben und 15 Minuten lang bei 1200C sterilisiert. Die Phosphate sowie der Harnstoff werden jeweils31 of the nutrient medium described above are placed in a 5-1 glass fermentation device and sterilized at 120 ° C. for 15 minutes. The phosphates as well as the urea are each
3a getrennt sterilisiert. Anschließend wifd das Nährmedium mit einer Impfbaktcrienflüssigkeit aus Microcoecus glutamicus ATCC 21 159 beimpft. Das Züchten wird anschließend unter Belüften und Rühren der Submerskultur bei einer Temperatur von 30° C durchgeführt, wobei die Belüftung mit 3 I pro Minute erfolgt und mit einer Geschwindigkeit von 650 UpM gerührt wird.3a sterilized separately. Then the nutrient medium is wifd inoculated with a vaccine bacterial liquid from Microcoecus glutamicus ATCC 21 159. The breeding The submerged culture is then aerated and stirred at a temperature of 30 ° C carried out, the aeration taking place at 3 l per minute and at a speed of 650 rpm is stirred.
Die Menge des im Fermentationsmedium nach Beendigung des Züchtens angereicherten i.-Prolins beträgt 30.4 mg/ml, während die Menge der als Nebenprodukt anfallenden L- Glutaminsäure zu 3,8 mg/ml ermittelt wird.The amount of i.-prolin accumulated in the fermentation medium after the cultivation is complete is 30.4 mg / ml, while the amount of L-glutamic acid obtained as a by-product increases 3.8 mg / ml is determined.
Nach Beendigung des Züchtens wird das erhaltene Fermentationsmedium in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise behandelt. Dabei werden 70 g rohei L-Prolin Kristalle erhalten.After the cultivation is completed, the fermentation medium obtained is used in that described in Example 1 Treated wisely. This gives 70 g of crude L-proline crystals.
Das Züchten wird nach der im Beispiel 1 beschriebenen Weise durchgeführt, mit der Ausnahme, dai die in der folgenden Tabelle III aufgeführten Sub stanzen an Stelle des im Beispiel 1 verwendeten Bia tins eingesetzt werden. Die Ergebnisse sind ebenfall:Cultivation is carried out in the manner described in Example 1, with the exception that the substances listed in the following Table III instead of the Bia used in Example 1 tins are used. The results are also:
in der folgenden Tabelle III zusammengefaßt.summarized in the following Table III.
an er
zeugtemcrowd
to him
testified
Neben
produkton as
Next
product
Biotinersatz6o
Biotin substitute
FortNCt/uni·FortNCt / uni
an er
zeugtemcrowd
to him
testified
Neben
produkton as
Next
product
!.-Glutagenerated
! .- Gluta
an er
zeugtemcrowd
to him
testified
oleatlo sorbitan mono-
oleat
Neben
produkton as
Next
product
26602660
Claims (1)
Family
ID=
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