Procédé de préparation d'un nouvel antibiotique
La présente invention concerne un procédé d'un nouveau composé chimique présentant une action antibiotique remarquable qui le rattache à la fois aux séries des tétracyclines et des pénicillines.
Ce nouveau composé présente des propriétés caractéristiques, d'une part, en ce qu'il est remarquablement soluble dans l'eau et, d'autre part, en ce qu'il ne présente pratiquement aucune sensibilité à la pénicil- linasse, ce qui assure l'activité de sa portion pénicilline sur des staphylocoques considérés jusqu'ici comme résistant aux pénicillines connues, à savoir plus spé- cialement le Staphylococcus aureus, producteur de pénicillinase.
On sait que, chacune de leur côté, les tétracycli- nes et les pénicil1ines présentent leurs avantages et leurs inconvénients propres, ces derniers limitant dans une large mesure leur emploi.
Ainsi, on sait que la tétracycline et la plupart de ses dérivés sont pratiquement insolubles dans l'eau.
D'autre part, les pénicillines connues sont actuellement sans action sur certains staphylocoques producteurs de pénicillinase.
Enfin, bien qu'on ait déjà pense à associer la tétracycline à certaines pénicillines, le seul composé de ce type, le phénoxyméthylpénicillinate de tétracycli, ne, qui présente une certaine activité sur certains staphylocoques résistant à la'pénicilline, est également pratiquement insoluble dans l'eau, ce qui le rend difficilement utilisable médicalement.
Le produit obtenu selon l'invention ne présente ni l'un ni l'autre de ces inconvénients, de sorte qu'il constitue le premier produit qui soit à la fois soluble dans l'eau, donc d'utilisation thérapeutique avanta gesse, let actif en présence de péniciUinase, c'est -dire actif sur les souches de staphylocoques, même productrices de pénicillinase.
Le composé obtenu selon l'invention est le phén- oxyméthylpénicillmrate de N2 (ou 9, ou 7)-4' (p- hydroxyéthyl)-dibhylènediaminaméthyl) tétracycline, dont une formule vraisemblable est :
EMI1.1
Il convient de noter que l'on n'a pas encore pu déterminer cette formule complète avec certitude, en particulier pour ce qui concerne l'emplacement de la substitution sur le cycle tétracycline, et que ce n'est qu'à titre indicatif que la formule avec liaison en position N est illustrée ci-dessus.
On donnera ci-après en détail les principales propriétés physiques, physico-chimiques et biologiques de ce nouveau composé.
Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'on fait réagir, dans un solvant commun, des quantités équimoléculaires de phénoxyméthylpénicilline, de tétracycline base et de N-hydroxyéthyl-N'-hydroxy- méthyldiéthylèncdiamine.
La réaction a lieu de préférence à chaud à une température de l'ordre de 400 C.
Selon la nature du solvant utilisé, on peut isoler le produit par différentes techniques.
Ainsi quand le solvant commun est l'eau, on peut isoler le produit par lyophilisation, tandis que quand le solvant est un solvant organique, tel que le méthan- ol ou l'isopropanol, on peut isoler le produit par précipitation par l'éther et filtration.
On peut envisager diverses variantes de mise en oeuvre de ce procédé.
Selon une première variante, on peut introduire, dans une solution chaude, la N-hydroxyéthyl-N'-hydroxyméthyldiéthylènediamine, le dérivé de pénicil- line et la tétracycline base, individuellement ou en mélange, en une seule fois ou par portions successives.
Selon une seconde variante, on peut préparer la N-hydroxyéthyl-N'-hydroxyméthyldiéthylènediami- ne in situ par réaction de la N- (-hydroxyéthyldi- éthylènediamine avec la formaldéhyde, en introduisant alors, simultanément ou non, les quatre consti- tuants réactionnels.
Le choix de l'une ou l'autre de ces variantes est déterminé par des considérations de commodité et d'efficacité d'isolement et de purification du produit final.
Exemple 1
Dans cet exemple qui illustre la variante préférée consistant à former à l'avance la N-hydroxyéthyl-N' hydroxyméthyldiéthylènediamine, on prépare tout d'abord une solution de 6, 63 g de p-hydroxyéthyldi- éthylènediamine et de 3, 8 g de formaline à 38 /o par chauffage de cas réactifs vers 60-700 C dans 200 cc de méthanol. Après repos pendant une heure, on ajoute à cette solution, à peu près simultanément, 22, 2 g de tétracycline base anhydre et 17, 5 g de phé noxyméthylpénicilline anhydre, et on chauffe le mélange réactionnel au bain d'huile à 400 C pendant 90 minutes. La dissolution complète est obtenue en 30 minutes environ.
On verse alors le mélange réactionnel dans 600 ce d'éthanol en agitant. Il précipite un produit que l'on filtre, lave deux fois à l'éther et sèche sous vide à 400 C pendant 5 heures. Ce produit représente 40 g de phénoxyméthylpénicillinate de ? (ou 9, ou 7)-4' (p-hydroxyéthyl)-diéthylenediaminométhyltétracycli- ne, soit un rendement d'environ 85-90 ouzo ; les proprié- tés de ce produit sont énumérées plus loin.
Exemple 2
Cet exemple illustre une autre variante, consistant à préparer en premier lieu le produit de la réaction de la tétracycline avec les constituants de la diamine, à savoir la N2 (ou 9, ou 7)-4' (ss-hydroxyéthyl)-diéthyl- enediaminoéthyltétracycime, par une réaction classique du type Réaction de Mannich. On fait réagir ensuite ce nouveau dérivé de tétracycline avec la phé noxyméthylpénicilline pour obtenir le produit.
On dissout 58, 6 g de N2 (ou 9, ou 7)-4' (1, 3-hydro- oxyéthyl)-diéthylènediaminométhyltétracycline et 35 g de phénoxyméthylpénicilline dans 300 cc de méthanol en agitant ; on filtre cette solution sur Biichner, puis on reprend le filtrat avec 990 cc d'éther anhydre en agitant fortement, on filtre à nouveau sous pression et on lave le gâteau filtré, deux fois avec 50 cc d'éther anhydre ; on sèche le produit sous vide ; on obtient 84 g d'une poudre blanche jaunâtre présentant également les caractéristiques physico-chimiques indiquées plus loin.
Exemple 3
On dissout les mêmes quantités des mêmes réactifs qu'à 1'exemple 2, dans 500 cc d'eau distillée à 5O C ; on filtre la solution sur Buchner, puis on soumet le filtrat à une lyophilisation à - 40 C ; on obtient un produit lyophilisé présentant les mêmes caractéristiques que celui des exemples précédents.
Dans les trois cas, le produit obtenu finalement se présente sous forme d'une poudre blanche jaunâtre, inodore, un peu amère, très soluble dans l'eau ( > 1, 5 g/cc), soluble dans le méthanol et l'éthanol, insoluble dans l'éther. Le pH d'une solution aqueuse à 2 ouzo est de 5, 6 ; P. F. : 143-155o C (avec décompo sition, non corrigé) ; (a ¯-50, 5 2 (en solution à O/o dans le méthanol).
Analyse : calculée pour : C ; H ; GNôOI4S
C 57, 67 H 6, 02 N 8, 96 S 3, 42
trouvée :
C 56, 41 H 6, 11 N 6, 11 S 3, 36
Calculée Dérivé Dérivé pour les portions de tétracycline de pénicilline (I) (II)
62, 6"/o 37, 4"A,
trouvée : 61, 7% 37,2%
Le titrage de la portion (I) est effectué par iodométrie. Celui de la portion (II), par titrage spectophotométrique, en déterminant E à 356 mu. d'une solution à 10 y/cc dans le HC1 N/10.
Cette solubilité remarquable et le pH de la solution obtenue rendent possible l'administration de ce composé par voie intramusculaire, et même intraveineuse.
Le phénoxyméthylpénicillinate de Ni' (ou 9, ou 7)-4' (-hydroxyéthyl)-diéthylenediaminométhyltétra- cycline obtenu selon l'invention présente d'exceptionnelles caractéristiques antibiotiques, nettement diffé- rentes des caractéristiques des antibiotiques qui le composent.
L'activité la plus élevée est exercée sur les staphy- locoques résistant à la pénicilline. Malgré la'résistance prouvée de ces gemmes à la phénoxyméthylpénicilline, le produit obtenu selon la présente invention exerce une action nettement supérieure à celle de la N2 (ou 9, ou 7)-4' (ss-hydroxyéthyl)-diéthylènediaminométhyl- tétracycline, et naturellement à celle de tous les dérivés connus de la tétracycline.
En effet, il est bactéricide, tandis que la Na (ou 9, ou 7)-4' ((3-hydroxyéthyl)-diéthylènediaminométhyl- tétracycline est seulement baotériostatique.
Sur les germes non résistants à la pénicilline, l'ac- tion est également nettement supérieure à celle de la seule fraction basique.
La mortalité constatée sur des lots de souris blan- ches infectées par des staphylocoques résistants à la pénicilline est nettement plus faible dans les lots trai- tés par le phénoxyméthylpénicillinate de N2 (ou 9, ou 7)-4' (ss-hydroxyéthyl) dióthylènediaminométhyl- tétracycline, que dans les lots'traités par la N2 (ou 9, ou 7)-4' (ss-hydroxyóthyl)-diéthylènediaminométhyl- tétracycline.
Il ressort des spectres xanbibactérienls ci-apfès que la dose minimum inhibitrice (D. M. I.) est remarquablement faible ; il convient, pour évaluer cette dose, de tenir compte du fait que le composé obtenu selon l'invention comportant une portion pénicilline et une portion tétracycline la proportion de chacune de ces portions dans une quantité donnée du produit soumis à l'essai représente la moitié de la quantité de la portion correspondante soumise individuellement à l'essai comparatif.
De même, dans l'appréciation des résultats, il convient de noter que la toxicité du produit résulte uniquement de ta proportion de la portion tétracycline dans le produit, c'est-à-dire que'latoxicité du produit obtenu selon l'invention est d'environ la moitié de celle de la toxicité du poids de tétracyclin* égal au poids du composé soumis à l'essai,
On notera dans le tableau oiaptès, qui indique les doses minima inhibitrices en microgrammes par centimètre cube (y/cc ou A) que l'on a désigné par P le produit selon l'invention,
par T la portion tétra cycline p solubilisée de ce produit et par pmp la portion phénoxyméthylpénicilline .
Spectre antibactérien in vitro
D. M. I. y/cc
Souche T pmp P
Staphylococcus aureus Ox 0, 66 0, 02 0, 03
Sarcina lutea 0, 40 0, 04 0, 06
Streptococcus viridans 0, 40 0, 05 0, 08
Streptococcus Hem. A 0, 40 0, 02 0, 03
Diplococcus pneum. 0, 45 0, 03 0, 05
Nesseria gonorrea 0, 30 0, 01 0, 01
B. subtilis 1 0, 08 0, 13
E. Coli 0 0, 65 1, 00
E. Coli 12 0, 4-0, 38
E.
Coli N 0, 2-0, 25
Staphylococcus aureus 209 PFDA 0, 2 0, 03 0, 05
Staphylococcus aureus pénicillino résitant 62 γ/cc 0, 35 62 0, 25
Staphylococous aureus pénieiNino Tesistatit 60'y/ce 0, 48 60 0, 48
Staphylococcus aureus Silver 2 pénicillino frésistant 6 y/cc 0, 16 6 0, 16
B. Subtilis pénicillino résistant 100 y/ce 0, 24 100 0, 24
Activitéin vitro de P sur différentes souches
Plusieurs méthodes ont été employées : 1) Méthode des dilutions progressives en milieu liquide.
Les germes utilisés sont isolés des malades, ou bien ils appartiennent à la collection de souches du Laboratoire.
Produit examiné : P
Produits de comparaison : T et phénoxyméthylpénicilline.
La lecture des résultats se fait 18 heures après rensemencemont.
a) Première série d'essais :
D. M.. I.
Souches bactériennes
Staph. p. doré res. pen. 100 U. I. y/ce
Staph. p. doré res. pen. 200 U. I. y/cc
Staph. res. pen. E. U. I. y/cc res. tetr. 8 y/ce T Phénoxyméthylpénicilline P 0, 66 y/cc 100 U. I. ou 62 y/cc 0, 50 y/cc 0, 80 y/ce200 U. I. ou 124 y/ce 0, 60 y/ce 8 y/ce3 U. I. ou 4 y/ce0, 8 y/ce
b) Deuxième série d'essais (C. M. I. = concentration minimum inhibitrice).
En employant cette méthode, on a obtenu les résultats suivants en étudiant à la fois la Bactériostase et la Bactéricidie.
2) Méthode des dilutions on carrés. Bacteriostase Bactericide
Colibacille III 1) Résistant à la pénicilline 2) T C. M. I. = 0, 93 y/cc, soit 0, 70 y/cc de tétra
cyc. base 3) P C. M. I. = 0, 93 y/cc, soit 0, 43 y/cc de tétra-
cyc. base 1) Résistant à la pénicilline 2) T ler taux 100 O/o bactéricide = 5, soit 3, 78 γ/cc
de tétrac. base 3) P ler'taux 100 /o bactéricide = 5, soit 2, 36 y/cc
de tétrac. base
Staphylocoque Issoudun 1) Pénicilline : C. M. I. = 0, 46 y/cc 2) T : C. M.
I. = 0, 62 γ/cc, soit 0, 46 γ/cc de tétra
cyc. base 3) P : C. M. I. = 0, 23 y/cc, soit 0, 10 y/cc de titra-
cyc. base, et 0, 09 y/cc de pénic.
1) Pénicilline : ler taux 100 /o = 0, 62 y/cc 2) T : lez taux 100 /o = 2, 5 y/cc, soit 1, 89 y/cc
de tétracyc. base 3) P : ler taux 100 /o = 0, 95 y/cc, soit 0, 44 γ/cc
de tétracyc. base, et 0, 36 y/cc de pénic.
Résultats des mesures bactériologiques
à l'appareil de Warburg
De même, il ressort très clairement des essais effectues avec l'appareil de Warburg, c'est-à-dire : -des courbes de consommation d'oxygène des bac
téries, qui rendent compte de l'activité respira
toire de ces dernières, et de l'étude simultanée ;
-de la prolifération des bactéries, que comparative
ment à la phénoxyméthylpénicilline, à la N (ou
9, ou 7)-4' (-hydroxyéthyl)-diéthylènediSamino-
méthyltétracycline, ainsi qu'à un contrôle qui n'est
soumis à l'action d'aucun antibiotique, le produit
obtenu selon l'invention a une action tout à fait
différente et incomparablement supérieure.
Cette action se trouve illustrée par les graphiques reproduits aux fig. 1 et 2 ci-jointes.
La fig. 1 illustre la variation de la consommation d'oxygène des bactéries, et
la fig. 2 illustre la prolifération de staphylocoques dorés.
Sur les deux jeux de courbes représentés sur les fig. 1 et 2, on a désigné par 1, 2, 3 et 4, les résultats observés dans les quatre cas suivants, respectivement :
Courbe 1 : aucun antibiotique appliqué (contrôle) ;
Courbe 2 : application de phénoxyméthylpénicilline,
à raison de 0, 23 microgramme par cc ;
Courbe 3 : application de N2 (ou 9, ou 7)-4' (P-hy
droxy éthyldiéthylènediaminométhyl tétra
cycline, à raison de 0, 4 miorogramme
par cc.
Courbe4 : application du produit selon l'invention,
à raison de 0, 63 microgr, amme par cc.
On notera que, bien qu'il puisse sembler que les doses appliquées pour l'obtention des courbes 2, 3 et 4 soient différentes, il n'en est rien, car la dose de 0, 63 y/cc de la courbe 4 équivaut à la somme des 0, 23 y/ce de la courbe 2 et des 0, 4 y/ce de la courbe 3.
Les courbes de la fig. 1 sont portées en logarithmes de la quantité, en millimètres cubes d'oxygène consommée par les bactéries en fonction du temps en heures.
Les courbes de la fig. 2 sont portées en logarith- mes du nombre de micro-organismes vivants en fonc- tion du temps en heures. On constate sur la fig. 1 les résultats nettement améliorés du produit obtenu selon l'invention, sur l'inhibition de la respiration du Sta phylococcus Aureus.
De même, la prolifération du Staphylococcus Au- reus est affectée d'une façon spectaculaire par le produit obtenu selon l'invention : en effet, alors que les courbes 1 et 2 indiquent une croissance du nombre de micro-organismes, la courbe 3 indique seulement un nombre constant, c'est-à-dire seulement une bacté riostase. Au contraire, la courbe 4 indique une dimi- nution croissante de ce nombre, c'est-à-dire une bac téricidie. Le composé obtenu selon l'invention est donc bien, comme indique plus haut, non seulement bactériostatique, mais encore bactéricide, ce qui est surprenant quand on considère les propriétés individuelles de ses portions constitutives.
En effet, il est intéressant, en se reportant à la formule développée, indiquée ci-dessus, de remarquer que la portion tétracyoline de cette formule correspond à une substance à action purement bactériostatique, que la portion diaminohétérocyclique seule correspond à un grou pement solubilisant et que la portion pénicilline substituée correspond seule à une substance bactéricide ; alors que la molécule complexe du produit obtenu selon l'invention est entièrement soluble et exerce une action bactéricide sur toutes les bactéries gram+ producteurs de pénicillmase, y compris les staphylo- coques dorés.
C'est précisément dans cotte propriété essentielle que réside l'originalité et l'intérêt du produit obtenu selon l'invention.
Il semble que le comportement dans l'organisme du nouveau composé obtenu selon l'invention peut s'expliquer par ses caractéristiques physiques qui montrent qu'au contraire des sels de la portion tétra- cycline autres que le phénoxymothyl-pénicitlate, ce nouveau composé ne subit qu'une ionisation très fai- ble et très progressive, de sorte que chaque portion de la grande moilécule complexe n'intervient pas indivi- duellement, mais qu'au contraire c'est cette grande molécule qui agit dans son ensemble avec ses propane- tés propres.
Cette théorie peut se justifier, en premier lieu, par la comparaison des points cryoscopiques et des valeurs des fésisdvités de solutions de différenlts sels de la N2 (ou 7, ou 9)-4' (fi-hydroxyéthyl)-diéthylène- diaminomëthyltétracycime :
Point cryoscopique Résistance ( C sur solution aqueuse (108 ohms/cm
Sel du dérivé T 0, 05 M) sur soluttion laqueuse 0, 01 M) citrate 0, 15 0, 35 glutamate 0, 14 0, 51 succinate 0, 13 0, 39 phénoxyméthylpénicillate 0, 09 0, 74
De même, l'application de la formule classique de Raoult, liant l'abaissement du point cryoscopique A à la constante de dissociation K d'un sel de masse moléculaire M en solution aqueuse de concentration c, A=K- donne dans le cas présent M
-0,09 = K # 0, 05
d'où K =-18
Cette valeur de Kest pratiquement celle correspondant aux non-électrolytes, ce qui montre qu'en solu- tion 0,
05 M l'ionisation est pratiquement nulle à 0O C.
Ces résultats sont encore confinés par les mesures conductimétriques effectuées à diverses températures sur des solutions aqueuses à diverses concentrations du composé obtenu selon l'invention, et réunies dans le tableau ci-après :
EMI5.1
<tb> <SEP> C <SEP> M/94 <SEP> M/940 <SEP> M9400 <SEP> M/94000
<tb> <SEP> c <SEP> 0, <SEP> 103 <SEP> 0, <SEP> 32 <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> 0, <SEP> 003
<tb> <SEP> x <SEP> # <SEP> X <SEP> # <SEP> X <SEP> # <SEP> X
<tb> <SEP> 0 C <SEP> 23623, <SEP> 329, <SEP> 6283, <SEP> 6341, <SEP> 28 <SEP> 121
<tb> 20o <SEP> C <SEP> 396 <SEP> 37, <SEP> 5 <SEP> 51 <SEP> 48 <SEP> 6, <SEP> 83 <SEP> 66 <SEP> 2, <SEP> 80 <SEP> 262 <SEP>
<tb> 37 CX <SEP> 563 <SEP> 53,
5 <SEP> 74 <SEP> 70 <SEP> 8,80 <SEP> 83 <SEP> 3,20 <SEP> 302
<tb>
est exprimé
1000
# =
c
On a reporté ces résultats sur la fig. 3, sur laquelle les courbes A, B et C représentent la variation du coefficient # du tableau ci-dessus en fonction de 103#c à des températures respective de 0 C, 20 C et 37 C, Chacune de ces courbes est caractéristique d'une électrolyse très faible.
Bien que ces courbes # = #(c) ne permettent pas d'extrapoler la valeur de ##, on peut conclure qu'7 la concentration c = 10-5, le coeffi cient d'ionisation
I portionacidephénoxyméthylpénicillinique 11 portiondérivéde, tétracycline i A10-; a=-
I composé selon l'invention !.,-.c # est nettement inférieur à 1. Le composé obtenu selon l'invention se comporte donc comme un complexe partiel.
Cette ionisation incomplète et faible du produit obtenu selon l'invention peut certainement, bien que peut être encore imparfaitement, justifier son comportement bactériologique particulier, ainsi que ses clearances rénales nettement abaissées par comparaison à celles de ses constituants. Le terme clearance est utilisé ici avec sa signification médicale classique :
On appelle clearance d'une substance, par exemple l'urée : la quantité (ml) de plasma qui renfermait la quantité (grammes) de substance (urée) éliminée en 1 minute d'activité rénale . (Réf. B. A. Houssa
Physiologie Humaine-p. 1061-Flammarion éd.-1950).
Process for preparing a new antibiotic
The present invention relates to a method of a new chemical compound exhibiting remarkable antibiotic action which relates both to the tetracycline and penicillin series.
This new compound has characteristic properties, on the one hand, in that it is remarkably soluble in water and, on the other hand, in that it exhibits practically no sensitivity to penicillinass, which ensures the activity of its penicillin portion on staphylococci considered hitherto to be resistant to known penicillins, namely more especially Staphylococcus aureus, a penicillinase producer.
It is known that, each in turn, tetracyclines and penicillins have their own advantages and disadvantages, the latter limiting to a large extent their use.
Thus, it is known that tetracycline and most of its derivatives are practically insoluble in water.
On the other hand, the known penicillins currently have no action on certain staphylococci which produce penicillinase.
Finally, although it has already been thought to combine tetracycline with certain penicillins, the only compound of this type, tetracycline phenoxymethylpenicillinate, which exhibits some activity against certain staphylococci resistant to penicillin, is also practically insoluble in water, which makes it difficult to use medically.
The product obtained according to the invention exhibits neither one nor the other of these drawbacks, so that it constitutes the first product which is both soluble in water, and therefore of advantageous therapeutic use, let active in the presence of penicillinase, that is to say active on strains of staphylococci, even penicillinase-producing strains.
The compound obtained according to the invention is N2 (or 9, or 7) -4 '(p-hydroxyethyl) -dibhylenediaminamethyl) tetracycline phenoxymethylpénicillmrate, a probable formula of which is:
EMI1.1
It should be noted that this complete formula has not yet been able to be determined with certainty, particularly with regard to the location of the substitution on the tetracycline ring, and that it is only indicative that the formula with bond in the N position is illustrated above.
The main physical, physicochemical and biological properties of this new compound will be given in detail below.
The process according to the invention is characterized in that equimolecular quantities of phenoxymethylpenicillin, tetracycline base and N-hydroxyethyl-N'-hydroxy-methyldiethylenediamine are reacted in a common solvent.
The reaction preferably takes place hot at a temperature of the order of 400 C.
Depending on the nature of the solvent used, the product can be isolated by different techniques.
Thus, when the common solvent is water, the product can be isolated by lyophilization, while when the solvent is an organic solvent, such as methanol or isopropanol, the product can be isolated by precipitation with ether. and filtration.
Various alternative embodiments of this method can be envisaged.
According to a first variant, it is possible to introduce, into a hot solution, the N-hydroxyethyl-N'-hydroxymethyldiethylenediamine, the penicillin derivative and the tetracycline base, individually or as a mixture, all at once or in successive portions.
According to a second variant, it is possible to prepare N-hydroxyethyl-N'-hydroxymethyldiethylenediamine in situ by reacting N- (-hydroxyethyldiethylenediamine with formaldehyde, then introducing, simultaneously or not, the four reaction constituents. .
The choice of one or the other of these variations is determined by considerations of convenience and efficiency of isolation and purification of the final product.
Example 1
In this example which illustrates the preferred variant consisting in forming in advance the N-hydroxyethyl-N 'hydroxymethyldiethylenediamine, first of all a solution of 6.63 g of p-hydroxyethyl-ethylenediamine and 3.8 g of p-hydroxyethyl-ethylenediamine is prepared. formalin at 38% by heating reactive cases to 60-700 C in 200 cc of methanol. After standing for one hour, to this solution are added, approximately simultaneously, 22.2 g of anhydrous tetracycline base and 17.5 g of anhydrous phe-noxymethylpenicillin, and the reaction mixture is heated in an oil bath at 400 C for 90 minutes. Complete dissolution is obtained in approximately 30 minutes.
The reaction mixture is then poured into 600 cc of ethanol with stirring. It precipitates a product which is filtered, washed twice with ether and dried under vacuum at 400 ° C. for 5 hours. This product represents 40 g of phenoxymethylpenicillinate? (or 9, or 7) -4 '(p-hydroxyethyl) -diethylenediaminomethyltetracycline, ie a yield of about 85-90 ouzo; the properties of this product are listed below.
Example 2
This example illustrates another variant, consisting in first preparing the product of the reaction of tetracycline with the constituents of the diamine, namely N2 (or 9, or 7) -4 '(ss-hydroxyethyl) -diethyl- enediaminoethyltetracycime, by a conventional reaction of the Mannich reaction type. This new tetracycline derivative is then reacted with the phe-noxymethylpenicillin to obtain the product.
58.6 g of N2 (or 9, or 7) -4 '(1, 3-hydrooxyethyl) -diethylenediaminomethyltetracycline and 35 g of phenoxymethylpenicillin are dissolved in 300 cc of methanol with stirring; this solution is filtered through Biichner, then the filtrate is taken up in 990 cc of anhydrous ether while stirring vigorously, it is filtered again under pressure and the filter cake is washed twice with 50 cc of anhydrous ether; the product is dried under vacuum; 84 g of a yellowish white powder are obtained, also exhibiting the physicochemical characteristics indicated below.
Example 3
The same amounts of the same reagents as in Example 2 are dissolved in 500 cc of distilled water at 5O C; the solution is filtered through a Buchner funnel, then the filtrate is subjected to lyophilization at -40 ° C.; a lyophilized product is obtained having the same characteristics as that of the preceding examples.
In all three cases, the product finally obtained is in the form of a yellowish white powder, odorless, a little bitter, very soluble in water (> 1.5 g / cc), soluble in methanol and ethanol. , insoluble in ether. The pH of a 2 ouzo aqueous solution is 5.6; P.F .: 143-155o C (with decomposition, uncorrected); (a ¯-50.5 2 (in O / o solution in methanol).
Analysis: calculated for: C; H; GNôOI4S
C 57, 67 H 6, 02 N 8, 96 S 3, 42
found:
C 56, 41 H 6, 11 N 6, 11 S 3, 36
Calculated Derivative Derivative for the tetracycline portions of penicillin (I) (II)
62.6 "/ o 37.4" A,
found: 61.7% 37.2%
The titration of portion (I) is carried out by iodometry. That of portion (II), by spectophotometric titration, by determining E at 356 mu. of a 10 y / cc solution in HCl N / 10.
This remarkable solubility and the pH of the solution obtained make it possible to administer this compound intramuscularly, and even intravenously.
The Ni '(or 9, or 7) -4' (-hydroxyethyl) -diethylenediaminomethyltetra-cyclin phenoxymethylpenicillinate obtained according to the invention exhibits exceptional antibiotic characteristics, clearly different from the characteristics of the antibiotics which compose it.
The highest activity is exerted on penicillin resistant staphy- lococci. Despite the proven resistance of these gems to phenoxymethylpenicillin, the product obtained according to the present invention exerts an action markedly superior to that of N2 (or 9, or 7) -4 '(ss-hydroxyethyl) -diethylenediaminomethyl-tetracycline, and naturally to that of all known tetracycline derivatives.
Indeed, it is bactericidal, while Na (or 9, or 7) -4 '((3-hydroxyethyl) -diethylenediaminomethyl-tetracycline is only baoteriostatic.
On bacteria not resistant to penicillin, the action is also markedly greater than that of the basic fraction alone.
The mortality observed in batches of white mice infected with staphylococci resistant to penicillin is markedly lower in batches treated with N2 (or 9, or 7) -4 '(ss-hydroxyethyl) dióthylenediaminomethyl phenoxymethylpenicillinate. - tetracycline, only in batches treated with N2 (or 9, or 7) -4 '(ss-hydroxyóthyl) -diethylenediaminomethyl-tetracycline.
It emerges from the xanbibactérienls spectra below that the minimum inhibitory dose (D. M. I.) is remarkably low; in order to assess this dose, it is necessary to take into account the fact that the compound obtained according to the invention comprising a penicillin portion and a tetracycline portion the proportion of each of these portions in a given quantity of the product under test represents half the amount of the corresponding portion individually subjected to the comparative test.
Likewise, in assessing the results, it should be noted that the toxicity of the product results only from the proportion of the tetracycline portion in the product, that is to say that the toxicity of the product obtained according to the invention is about half that of the toxicity of the weight of tetracyclin * equal to the weight of the compound under test,
It will be noted in the oiaptès table, which indicates the minimum inhibitory doses in micrograms per cubic centimeter (y / cc or A) which the product according to the invention has been designated by P,
by T the solubilized tetra cyclin p portion of this product and by pmp the phenoxymethylpenicillin portion.
Antibacterial spectrum in vitro
D. M. I. y / cc
Strain T pmp P
Staphylococcus aureus Ox 0, 66 0, 02 0, 03
Sarcina lutea 0, 40 0, 04 0, 06
Streptococcus viridans 0, 40 0, 05 0, 08
Streptococcus Hem. A 0, 40 0, 02 0, 03
Diplococcus pneum. 0, 45 0, 03 0, 05
Nesseria gonorrea 0, 30 0, 01 0, 01
B. subtilis 1 0, 08 0, 13
E. Coli 0 0.65 1.00
E. Coli 12 0, 4-0, 38
E.
Coli N 0, 2-0, 25
Staphylococcus aureus 209 PFDA 0, 2 0, 03 0, 05
Staphylococcus aureus penicillino resisting 62 gamma; / cc 0.35 62 0.25
Staphylococous aureus penieiNino Tesistatit 60'y / ce 0, 48 60 0, 48
Staphylococcus aureus Silver 2 Fresistant penicillin 6 y / cc 0, 16 6 0, 16
B. Subtilis penicillino resistant 100 y / cc 0.24 100 0.24
In vitro activity of P on different strains
Several methods were used: 1) Method of progressive dilutions in liquid medium.
The germs used are isolated from patients, or they belong to the laboratory's collection of strains.
Product examined: P
Comparison products: T and phenoxymethylpenicillin.
The results are read 18 hours after rensemencemont.
a) First series of tests:
D. Mr. I.
Bacterial strains
Staph. p. golden res. pen. 100 U. I. y / ce
Staph. p. golden res. pen. 200 U. I. y / cc
Staph. res. pen. E. U. I. y / cc res. tetr. 8 y / ce T Phenoxymethylpenicillin P 0.66 y / cc 100 IU or 62 y / cc 0, 50 y / cc 0, 80 y / ce200 IU or 124 y / ce 0, 60 y / ce 8 y / ce3 IU or 4 y / ce0, 8 y / ce
b) Second series of tests (C. M. I. = minimum inhibitory concentration).
Using this method, the following results were obtained by studying both Bacteriostasis and Bactericide.
2) Method of dilutions on squares. Bacteriostasis Bactericide
Colibacillus III 1) Resistant to penicillin 2) T C. M. I. = 0, 93 y / cc, or 0, 70 y / cc of tetra
cyc. base 3) P C. M. I. = 0.93 y / cc, i.e. 0.43 y / cc of tetra-
cyc. base 1) Resistant to penicillin 2) T ler rate 100 O / o bactericidal = 5, or 3, 78 γ / cc
of tetrac. base 3) 100 / o bactericidal rate = 5, i.e. 2.36 y / cc
of tetrac. based
Staphylococcus Issoudun 1) Penicillin: C. M. I. = 0.46 y / cc 2) T: C. M.
I. = 0.62 γ / cc, or 0.46 γ / cc of tetra
cyc. base 3) P: C. M. I. = 0.23 y / cc, i.e. 0.10 y / cc of titra-
cyc. base, and 0.09 y / cc of penic.
1) Penicillin: 1st rate 100 / o = 0.62 y / cc 2) T: lez rate 100 / o = 2.5 y / cc, i.e. 1.89 y / cc
of tetracyc. base 3) P: 1st rate 100 / o = 0.95 y / cc, i.e. 0.44 γ / cc
of tetracyc. base, and 0.36 y / cc of penic.
Results of bacteriological measurements
to the Warburg device
Likewise, it emerges very clearly from the tests carried out with the Warburg apparatus, that is to say: - curves of oxygen consumption of the tanks
teries, which account for the activity respira
of the latter, and of simultaneous study;
-the proliferation of bacteria, that comparative
ment with phenoxymethylpenicillin, N (or
9, or 7) -4 '(-hydroxyethyl) -diethylenediSamino-
methyltetracycline, as well as a control that is not
subjected to the action of no antibiotics, the product
obtained according to the invention has a completely
different and incomparably superior.
This action is illustrated by the graphs reproduced in fig. 1 and 2 attached.
Fig. 1 illustrates the variation in oxygen consumption of bacteria, and
fig. 2 illustrates the proliferation of Staphylococcus aureus.
On the two sets of curves shown in FIGS. 1 and 2, we denote by 1, 2, 3 and 4, the results observed in the following four cases, respectively:
Curve 1: no antibiotic applied (control);
Curve 2: application of phenoxymethylpenicillin,
at 0.23 micrograms per cc;
Curve 3: application of N2 (or 9, or 7) -4 '(P-hy
droxy ethyldiethylenediaminomethyl tetra
cyclin, at a rate of 0.4 miorogram
per cc.
Curve4: application of the product according to the invention,
at 0.63 microgrms per cc.
Note that, although it may seem that the doses applied to obtain curves 2, 3 and 4 are different, this is not the case, because the dose of 0.63 y / cc of curve 4 is equivalent to the sum of the 0.23 y / ce of curve 2 and the 0.4 y / ce of curve 3.
The curves in fig. 1 are plotted in logarithms of the quantity, in cubic millimeters of oxygen consumed by bacteria as a function of time in hours.
The curves in fig. 2 are plotted in logarithms of the number of living microorganisms as a function of time in hours. It can be seen in FIG. 1 the clearly improved results of the product obtained according to the invention, on the inhibition of the respiration of Sta phylococcus Aureus.
Likewise, the proliferation of Staphylococcus Au- reus is dramatically affected by the product obtained according to the invention: indeed, while curves 1 and 2 indicate a growth in the number of microorganisms, curve 3 indicates only a constant number, that is to say only a bacteriostasis. On the contrary, curve 4 indicates an increasing decrease in this number, that is to say a bac tericide. The compound obtained according to the invention is therefore, as indicated above, not only bacteriostatic, but also bactericidal, which is surprising when we consider the individual properties of its constituent portions.
Indeed, it is interesting, referring to the structural formula, indicated above, to notice that the tetracyolin portion of this formula corresponds to a substance with purely bacteriostatic action, that the diaminoheterocyclic portion alone corresponds to a solubilizing group and that the substituted penicillin portion alone corresponds to a bactericidal substance; whereas the complex molecule of the product obtained according to the invention is entirely soluble and exerts a bactericidal action on all gram + bacteria which produce penicillmase, including golden staphylococci.
It is precisely in this essential property that the originality and interest of the product obtained according to the invention reside.
It seems that the behavior in the body of the new compound obtained according to the invention can be explained by its physical characteristics which show that, unlike the salts of the tetracyclin portion other than the phenoxymothyl-penicitlate, this new compound does not. undergoes very weak and very gradual ionization, so that each portion of the large complex moilecule does not intervene individually, but on the contrary it is this large molecule which acts as a whole with its propane - clean tees.
This theory can be justified, in the first place, by the comparison of the cryoscopic points and the values of the fesisdvities of solutions of different salts of N2 (or 7, or 9) -4 '(fi-hydroxyethyl) -diethylene-diaminomëthyltetracycime:
Cryoscopic point Resistance (C on aqueous solution (108 ohms / cm
Salt of derivative T 0, 05 M) on lacquer solution 0, 01 M) citrate 0, 15 0, 35 glutamate 0, 14 0, 51 succinate 0, 13 0, 39 phenoxymethylpenicillate 0, 09 0, 74
Likewise, the application of the classical formula of Raoult, linking the lowering of the cryoscopic point A to the dissociation constant K of a salt of molecular mass M in aqueous solution of concentration c, A = K- gives in the case present M
-0.09 = K # 0.05
hence K = -18
This value of K is practically that corresponding to non-electrolytes, which shows that in solution 0,
05 M ionization is practically zero at 0O C.
These results are further confined by the conductimetric measurements carried out at various temperatures on aqueous solutions at various concentrations of the compound obtained according to the invention, and collected in the table below:
EMI5.1
<tb> <SEP> C <SEP> M / 94 <SEP> M / 940 <SEP> M9400 <SEP> M / 94000
<tb> <SEP> c <SEP> 0, <SEP> 103 <SEP> 0, <SEP> 32 <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> 0, <SEP> 003
<tb> <SEP> x <SEP> # <SEP> X <SEP> # <SEP> X <SEP> # <SEP> X
<tb> <SEP> 0 C <SEP> 23623, <SEP> 329, <SEP> 6283, <SEP> 6341, <SEP> 28 <SEP> 121
<tb> 20o <SEP> C <SEP> 396 <SEP> 37, <SEP> 5 <SEP> 51 <SEP> 48 <SEP> 6, <SEP> 83 <SEP> 66 <SEP> 2, <SEP> 80 <SEP> 262 <SEP>
<tb> 37 CX <SEP> 563 <SEP> 53,
5 <SEP> 74 <SEP> 70 <SEP> 8.80 <SEP> 83 <SEP> 3.20 <SEP> 302
<tb>
is expressed
1000
# =
vs
These results have been reported in FIG. 3, on which the curves A, B and C represent the variation of the coefficient # of the table above as a function of 103 # c at respective temperatures of 0 C, 20 C and 37 C, Each of these curves is characteristic of very weak electrolysis.
Although these curves # = # (c) do not allow to extrapolate the value of ##, we can conclude that7 the concentration c = 10-5, the ionization coeffi cient
I portionphenoxymethylpenicillinic acid 11 derivative portion, tetracycline i A10-; a = -
I compound according to the invention!., -. C # is clearly less than 1. The compound obtained according to the invention therefore behaves like a partial complex.
This incomplete and weak ionization of the product obtained according to the invention can certainly, although it can still be imperfect, justify its particular bacteriological behavior, as well as its renal clearances markedly lowered by comparison with those of its constituents. The term clearance is used here with its classic medical meaning:
We call clearance of a substance, for example urea: the quantity (ml) of plasma which contained the quantity (grams) of substance (urea) eliminated in 1 minute of renal activity. (Ref. B. A. Houssa
Human Physiology-p. 1061-Flammarion ed.-1950).