JP4808853B2

JP4808853B2 - New antitumor agent

Info

Publication number: JP4808853B2
Application number: JP2001025030A
Authority: JP
Inventors: 裕之長田; 秀昭掛谷; 雅志植木
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2001-02-01
Filing date: 2001-02-01
Publication date: 2011-11-02
Anticipated expiration: 2021-02-01
Also published as: JP2002226483A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗腫瘍剤などの医薬の有効成分として有用な新規化合物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
真核細胞の増殖サイクルである細胞周期(G1→S→G2→M→G1)において、G1期で作用する種々の癌遺伝子の活性化および癌抑制遺伝子の不活性化は、制御を逸脱した癌細胞の無限増殖能の獲得の大きな要因である。したがって、癌細胞におけるG1期からS期への細胞周期進行を制御できる化合物は、新たな抗癌剤のリード化合物となりうるものと期待される。既に多数の化合物が抗腫瘍剤として実用化されているが、新規な構造を有する抗腫瘍性化合物に対しては不断の希求があると言え、とりわけ細胞周期進行を制御できる化合物の発見が待ち望まれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、細胞周期進行を制御することにより抗腫瘍活性を発揮する新規化合物を提供することにある。また、本発明の別の課題は、上記の特徴を有する新規化合物の製造方法、及び該化合物を有効成分として含む医薬を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、長崎県長崎市稲佐山周辺にて採取した土壌から分離されたフサリウム属に属するカビRK97-94株が抗腫瘍活性を有する新規化合物を生産することを見いだし、該化合物の構造を決定した。また、該化合物が細胞周期進行を制御することにより抗腫瘍活性を発揮することを確認した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
【０００５】
すなわち、本発明は、以下の式（Ｉ）：
【化３】

で表される化合物を提供するものである。この発明の好ましい態様によれば、下記の式（II）で表される化合物が提供される（式中の立体は相対配置を示す）。
【化４】

【０００６】
別の観点からは、本発明により、上記の化合物を有効成分として含む医薬が提供される。この医薬は抗腫瘍剤として用いることができる。また、本発明により、上記の化合物を有効成分として含む細胞周期進行の調節剤；及びフサリウム属に属する上記化合物の生産菌を培養した培養物から上記化合物を分離・採取する行程を含む上記化合物の製造方法が提供される。
【０００７】
さらに別の観点からは、悪性腫瘍の治療方法であって、上記化合物の治療有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する行程を含む方法、細胞周期進行の調節方法であって、上記化合物の有効量を細胞に接触させる行程を含む方法が本発明により提供される。
【０００８】
【発明の実施の形態】
式（Ｉ）で表される化合物は不斉炭素を有しており、不斉炭素に基づく光学異性体又はジアステレオマーなどの立体異性体が存在するが、本発明の範囲には純粋な形態の立体異性体のほか、任意の立体異性体の混合物又はラセミ体などが包含される。また、本発明の化合物は５個のオレフィン性二重結合を有しており、それぞれの二重結合に基く幾何異性体が存在する場合があるが、純粋な形態の幾何異性体のほか、任意の幾何異性体の混合物も本発明の範囲に包含される。さらに、本発明の化合物は互変異性体として存在する可能性もあるが、任意の互変異性体又はそれらの混合物も本発明の範囲に包含される。本発明の化合物は任意の結晶形として存在することができ、水和物又は溶媒和物として存在する場合もある。これらの物質がいずれも本発明の範囲に包含されることは言うまでもない。
【０００９】
式（Ｉ）で表される化合物のうち、好ましい化合物は式（II）で示される化合物である。この化合物を本明細書において「RK-9794」と呼ぶ場合がある。なお、この化合物は立体異性体（又は幾何異性体）が一部平衡状態にあり、上記の式（II）はその立体異性体の主要な１つを特定したものである。この特定の立体異性体を高速液体クロマトグラフィーなどの分離・精製手段により純粋な形態にした場合には、速やかに他の立体異性体（または幾何異性体）との平衡に到達する。
【００１０】
本発明の式（Ｉ）で表される化合物、好ましくは式（II）で表される化合物は、フサリウム属に属する上記化合物の生産菌を培養することにより生産可能である。フサリウム属に属する上記化合物の生産菌としてはフサリウム属RK97-94株(Fusarium sp. RK97-94)が挙げられる。該微生物は平成12年12月18日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM P-18143として寄託されている。上記フサリウム属 RK97-94株は長崎県長崎市稲佐山周辺にて採取した土壌から分離された微生物である。
【００１１】
本発明の式（Ｉ）で表される化合物、好ましくは式（II）で表される化合物は、好ましくは上記フサリウム属RK97-94株を培養した培養物から分離・採取することにより製造可能である。上記化合物を分離・採取する方法は特に限定されず、例えば後述する実施例に記載の方法により好適に行うことができる。例えば、フサリウム属に属する菌の通常の培養方法によって培養液を得た後、通常の分離・精製手段により本発明の化合物を得ることができる。培養終了後、培養液から本発明の化合物を分離・単離するには、一般に微生物代謝産物を採取するのに通常用いられる手段を適宜利用して行うことができる。例えば、各種イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂、ゲル濾過クロマトグラフィー、または活性炭、アルミナ、シリカゲル等の吸着剤によるクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー、あるいは結晶化、減圧濃縮、又は凍結乾燥の手段を単独でまたは適宜組み合わせて、あるいは反復して用いることが可能である。
【００１２】
本発明の化合物は、後述の試験例に示すように抗腫瘍活性を有しており、例えば抗腫瘍剤として用いる医薬の有効成分として有用である。本発明の化合物を有効成分とする医薬は、その使用目的にあわせて投与方法、剤型、投与量を適宜決定することが可能である。例えば、本発明の化合物を有効成分とする医薬の投与形態は、経口投与でも非経口投与でもよい。剤型としては、例えば錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、シロップ剤等の経口投与剤、又は注射剤、点滴剤、若しくは坐剤等の非経口投与剤を挙げることができる。これらの製剤は、賦形剤、結合剤等の製薬上許容される添加剤を用いて既知の方法で製造することができる。本発明の化合物を有効成分として含む医薬の投与量は、患者の年齢、体重、感受性、症状の程度などにより異なるが、通常効果的な量は、成人１日あたり0.1 mg〜1 g程度であり、１日一回又は数回にわけて投与することも可能である。また、必要により上記範囲外の量を用いることができる。
【００１３】
また、本発明の化合物を試薬として使用する場合には、有機溶剤又は含水有機溶剤に溶解して用いることができる。例えば、各種培養細胞系へ直接投与すると細胞成長を抑制することができる。使用可能な有機溶剤としては、例えばメタノールやジメチルスルホキシド等を挙げることができる。剤型としては、例えば、粉末などの固形剤、又は有機溶剤若しくは含水有機溶剤に溶解した液体剤などを挙げることができる。通常、上記の化合物を試薬として用いて細胞成長抑制作用を発揮させるための効果的な使用量は、0.1〜100 μg/mlであるが、適切な使用量は培養細胞系の種類や使用目的により異なり、適宜選択可能である。また、必要により上記範囲外の量を用いることができる。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
製造例１
グルコース 2%、可溶性デンプン 1%、肉エキス 0.3%、酵母抽出液 2.5%、食塩 0.05%、リン酸第２カリウム 0.005%、炭酸カルシウム 0.05%、硫酸マグネシウム 0.05%からなる組成の培地（pH7.2）に、フサリウム属97-94株を接種して28℃で48時間振盪培養を行った。この培養液140 mlを同組成の培地15リットルに接種し、28℃で96時間振盪培養を行った。
【００１５】
上記培養液（計30リットル）を遠心分離器で菌体と上清に分離し、菌体を85%アセトン10リットルを用いて抽出した。減圧濃縮後、得られた水溶液をpH7.0に調整し、5リットルの酢酸エチルで抽出した。抽出後、すべての酢酸エチルを合わせて減圧濃縮し、褐色のシロップ5.0 gを得た。このシロップをクロロホルム10 mlに溶解し、クロロホルムで充填したシリカゲルカラム（直径4 cm、長さ60 cm）に浸潤させた。最初に、クロロホルム1リットルで溶出した後、割合配合を順次変えたクロロホルム-メタノール溶液（100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1）各600 mlずつで溶出した。活性物質RK-9794は、クロロホルム-メタノール溶液(20:1)の画分に溶出した。この分画を減圧濃縮することにより、1.8 gの褐色シロップを得た。
【００１６】
次に、この褐色シロップ1.8 gをメタノール18 mlに溶解し、逆相ODSカラム（直径2 cm、長さ 25 cm、PEGASIL ODS、センシュー科学社製）を用いて、高速液体クロマトグラフィーによる分取（70%メタノール、流速9.0 ml/分）を行い、淡黄色アモルファス状物質RK-9794(50mg)を得た。RK-9794のNMRデータを表１に示す（溶媒：重クロロホルム、δppm、内部標準: TMS、¹³C：125 MHz、¹H：500 MHz）。
性状：淡黄色アモルファス状
分子式：C₂₂H₂₇NO₆
高分解能質量分析 (HR-FAB, pos.) ： (M+H)+
実験値 (m/z)：402.1923
理論値 (m/z)：402.1917
UV λmax nm (メタノール) (ε)：273 (8800), 363 (48200)
IR λmax (neat) cm^-1：3420, 1710, 1650, 1580, 1435, 1255, 1135
Rf値（シリカゲル60 F₂₅₄、メルク社製）
0.55 (solvent; CHCl₃:メタノール=10:1)
呈色反応（陽性）：10%硫酸、ヨウ素
【００１７】
【化５】

【００１８】
【表１】

【００１９】
試験例１：RK-9794の細胞周期阻害活性
癌抑制遺伝子p53を欠損しているヒト肺癌細胞H1299細胞におけるRK-9794の細胞周期阻害活性を測定した。H1299細胞は10%子牛血清を含むDMEM(ダルベッコ変法イーグル培地)培地にて5%炭酸ガスと水蒸気を飽和させた培養器内で培養した。対数増殖期にあるH1299細胞に一連の希釈系列のRK-9794を添加し24時間後にフローサイトメーターによりH1299細胞の細胞周期の進行を解析した。表２の結果は、本発明のRK-9794が細胞周期阻害剤として有効であることを示している。
【００２０】
【表２】

【００２１】
試験例２：RK-9794の細胞増殖抑制効果
各種血球系培養癌細胞におけるRK-9794の細胞増殖抑制効果を測定した。対数増殖期にある各細胞に、一連の希釈系列のRK-9794を添加し48時間後にMTT試薬を用いて細胞の生育数を測定し、IC₅₀ (50%増殖阻害濃度：μg/ml)を算出した。表３の結果は、本発明のRK-9794が抗腫瘍剤として有効であることを示している。
【００２２】
【表３】

【００２３】
製剤例１：注射・点滴剤
RK-9794 10 mgを含有するように、粉末ブドウ糖5 gを加えてバイアルに無菌的に分配して密封し、窒素、ヘリウムなどの不活性ガスを封入して冷暗所に保存した。使用前にエタノールに溶解し、0.85%生理的食塩水100 mlを添加して静脈内注射剤とし、一日あたり10〜100 mlを症状に応じて静脈内注射または点滴で投与する。
【００２４】
製剤例２：顆粒剤
RK-9794 1 g、乳糖98 g、およびヒドロキシプロピルセルロース1 gをそれぞれ取り、よく混和した後、定法にしたがって粒状に成形し、それをよく乾燥して、瓶やヒートシール包装などに適した顆粒剤を製造した。一日あたり100〜1000 mgを症状に応じて経口投与できる
【図面の簡単な説明】
【図１】 RK-9794のメタノール中の紫外線吸収スペクトルを示した図である。
【図２】 RK-9794の¹H NMR (溶媒：CDCl₃)スペクトルを示した図である。
【図３】 RK-9794の¹³C NMR (溶媒：CDCl₃)スペクトルを示した図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel compound useful as an active ingredient of a medicament such as an antitumor agent.
[0002]
[Prior art]
In the cell cycle (G1->S->G2->M-> G1), which is the proliferation cycle of eukaryotic cells, activation of various oncogenes acting in the G1 phase and inactivation of tumor suppressor genes are out of control. This is a major factor in the acquisition of unlimited cell growth. Therefore, a compound capable of controlling the cell cycle progression from G1 phase to S phase in cancer cells is expected to be a lead compound for a new anticancer agent. Many compounds have already been put to practical use as antitumor agents, but it can be said that there is a constant demand for antitumor compounds having a novel structure, and in particular, the discovery of compounds that can control cell cycle progression is awaited. ing.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a novel compound that exhibits antitumor activity by controlling cell cycle progression. Another object of the present invention is to provide a method for producing a novel compound having the above characteristics, and a medicament containing the compound as an active ingredient.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that Fusarium strain RK97-94 belonging to the genus Fusarium isolated from soil collected around Inasayama, Nagasaki City, Nagasaki Prefecture has antitumor activity. A new compound was found to be produced and the structure of the compound was determined. It was also confirmed that the compound exerts antitumor activity by controlling cell cycle progression. The present invention has been completed based on the above findings.
[0005]
That is, the present invention provides the following formula (I):
[Chemical 3]

The compound represented by these is provided. According to a preferred embodiment of the present invention, a compound represented by the following formula (II) is provided (the solid in the formula shows a relative configuration).
[Formula 4]

[0006]
From another aspect, the present invention provides a medicament comprising the above compound as an active ingredient. This medicament can be used as an antitumor agent. Further, according to the present invention, there is provided a regulator of a cell cycle progression comprising the above compound as an active ingredient; and a step of separating and collecting the compound from a culture in which a fungus producing the compound belonging to the genus Fusarium is cultured. A manufacturing method is provided.
[0007]
Yet another aspect is a method for treating malignant tumors, comprising the step of administering a therapeutically effective amount of the above compound to a mammal, including a human, a method for regulating cell cycle progression, wherein the compound is effective. A method comprising the step of contacting an amount with a cell is provided by the present invention.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The compound represented by the formula (I) has an asymmetric carbon, and there are stereoisomers such as optical isomers or diastereomers based on the asymmetric carbon, but the pure form is within the scope of the present invention. In addition to these stereoisomers, mixtures of any stereoisomers or racemates are included. In addition, the compound of the present invention has 5 olefinic double bonds, and geometric isomers may exist based on each double bond. Also included within the scope of this invention are mixtures of these geometric isomers. Furthermore, the compounds of the present invention may exist as tautomers, but any tautomers or mixtures thereof are also encompassed within the scope of the present invention. The compounds of the invention can exist in any crystalline form and may exist as hydrates or solvates. It goes without saying that any of these substances are included in the scope of the present invention.
[0009]
Of the compounds represented by formula (I), preferred compounds are those represented by formula (II). This compound may be referred to herein as “RK-9794”. In this compound, stereoisomers (or geometric isomers) are partially in equilibrium, and the above formula (II) specifies one of the main stereoisomers. When this specific stereoisomer is made into a pure form by separation / purification means such as high performance liquid chromatography, the equilibrium with other stereoisomer (or geometric isomer) is quickly reached.
[0010]
The compound represented by the formula (I) of the present invention, preferably the compound represented by the formula (II), can be produced by culturing the above-mentioned compound-producing bacteria belonging to the genus Fusarium. Examples of the bacteria producing the above-mentioned compounds belonging to the genus Fusarium include Fusarium sp. RK97-94 (Fusarium sp. RK97-94). The microorganism was deposited at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science (December 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki, Japan) as a deposit number FERM P-18143 on December 18, 2000. The above-mentioned Fusarium RK97-94 strain is a microorganism isolated from soil collected around Inasayama, Nagasaki City, Nagasaki Prefecture.
[0011]
The compound represented by the formula (I) of the present invention, preferably the compound represented by the formula (II), can be preferably produced by separating and collecting from the culture obtained by culturing the above-mentioned Fusarium RK97-94 strain. is there. The method for separating and collecting the above compound is not particularly limited, and for example, it can be suitably carried out by the method described in Examples described later. For example, the compound of the present invention can be obtained by a normal separation / purification means after obtaining a culture solution by a normal culture method for bacteria belonging to the genus Fusarium. In order to separate and isolate the compound of the present invention from the culture solution after completion of the culture, generally, means generally used for collecting microbial metabolites can be appropriately used. For example, various ion exchange resins, nonionic adsorption resins, gel filtration chromatography, chromatography using an adsorbent such as activated carbon, alumina, silica gel, or high performance liquid chromatography, or crystallization, concentration under reduced pressure, or freeze drying Can be used alone, in appropriate combination, or repeatedly.
[0012]
The compound of the present invention has antitumor activity as shown in the following test examples, and is useful as an active ingredient of a medicine used as an antitumor agent, for example. A pharmaceutical comprising the compound of the present invention as an active ingredient can be appropriately determined in its administration method, dosage form, and dosage in accordance with its intended purpose. For example, the dosage form of a pharmaceutical comprising the compound of the present invention as an active ingredient may be oral administration or parenteral administration. Examples of the dosage form include oral administration agents such as tablets, powders, capsules, granules, extracts, and syrups, and parenteral administration agents such as injections, drops, and suppositories. These preparations can be produced by known methods using pharmaceutically acceptable additives such as excipients and binders. The dosage of the pharmaceutical agent containing the compound of the present invention as an active ingredient varies depending on the age, weight, sensitivity, symptom of the patient, etc., but the effective amount is usually about 0.1 mg to 1 g per day for an adult. It is also possible to administer once or several times a day. Further, if necessary, an amount outside the above range can be used.
[0013]
Moreover, when using the compound of this invention as a reagent, it can melt | dissolve and use in an organic solvent or a water-containing organic solvent. For example, cell growth can be inhibited by direct administration to various cultured cell lines. Examples of the organic solvent that can be used include methanol and dimethyl sulfoxide. Examples of the dosage form include a solid agent such as powder, or a liquid agent dissolved in an organic solvent or a water-containing organic solvent. Usually, the effective use amount for exerting the cell growth inhibitory action using the above compound as a reagent is 0.1 to 100 μg / ml, but the appropriate use amount depends on the type and purpose of the cultured cell line. It is different and can be selected as appropriate. Further, if necessary, an amount outside the above range can be used.
[0014]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further more concretely, the scope of the present invention is not limited to the following Example.
Production Example 1
Medium with pH 2%, soluble starch 1%, meat extract 0.3%, yeast extract 2.5%, salt 0.05%, dibasic potassium phosphate 0.005%, calcium carbonate 0.05%, magnesium sulfate 0.05% (pH 7.2 ) Was inoculated with Fusarium sp. Strain 97-94 and cultured with shaking at 28 ° C. for 48 hours. 140 ml of this culture solution was inoculated into 15 liters of the medium having the same composition, and cultured with shaking at 28 ° C. for 96 hours.
[0015]
The culture broth (total 30 liters) was separated into microbial cells and supernatant using a centrifuge, and the microbial cells were extracted using 10 liters of 85% acetone. After concentration under reduced pressure, the resulting aqueous solution was adjusted to pH 7.0 and extracted with 5 liters of ethyl acetate. After extraction, all ethyl acetate was combined and concentrated under reduced pressure to obtain 5.0 g of brown syrup. This syrup was dissolved in 10 ml of chloroform and infiltrated into a silica gel column (diameter 4 cm, length 60 cm) packed with chloroform. First, after eluting with 1 liter of chloroform, 600 ml each of chloroform-methanol solutions (100: 1, 50: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1) with different proportions Eluted with. The active substance RK-9794 eluted in a chloroform-methanol solution (20: 1) fraction. This fraction was concentrated under reduced pressure to obtain 1.8 g of a brown syrup.
[0016]
Next, 1.8 g of this brown syrup was dissolved in 18 ml of methanol, and fractionated by high performance liquid chromatography using a reverse phase ODS column (diameter 2 cm, length 25 cm, PEGASIL ODS, manufactured by Senshu Kagaku Co., Ltd.) 70% methanol, flow rate 9.0 ml / min) to obtain a light yellow amorphous substance RK-9794 (50 mg). NMR data of RK-9794 are shown in Table 1 (solvent: deuterated chloroform, δ ppm, internal standard: TMS, ¹³ C: 125 MHz, ¹ H: 500 MHz).
Property: Pale yellow amorphous molecular formula: C ₂₂ H ₂₇ NO ₆
High resolution mass spectrometry (HR-FAB, pos.): (M + H) +
Experimental value (m / z): 402.1923
Theoretical value (m / z): 402.1917
UV λmax nm (methanol) (ε): 273 (8800), 363 (48200)
IR λmax (neat) cm ^-1 : 3420, 1710, 1650, 1580, 1435, 1255, 1135
Rf value (silica gel 60 F ₂₅₄ , manufactured by Merck)
0.55 (solvent; CHCl ₃ : methanol = 10: 1)
Color reaction (positive): 10% sulfuric acid, iodine [0017]
[Chemical formula 5]

[0018]
[Table 1]

[0019]
Test Example 1: Cell cycle inhibitory activity of RK-9794 The cell cycle inhibitory activity of RK-9794 in human lung cancer cells H1299 cells lacking the tumor suppressor gene p53 was measured. H1299 cells were cultured in a DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium) medium containing 10% calf serum in a culture vessel saturated with 5% carbon dioxide and water vapor. A series of dilution series of RK-9794 was added to the H1299 cells in the logarithmic growth phase, and the progression of the cell cycle of the H1299 cells was analyzed by a flow cytometer 24 hours later. The results in Table 2 indicate that RK-9794 of the present invention is effective as a cell cycle inhibitor.
[0020]
[Table 2]

[0021]
Test Example 2: Cell growth inhibitory effect of RK-9794 The cell growth inhibitory effect of RK-9794 in various blood cell culture cancer cells was measured. A series of dilution series of RK-9794 was added to each cell in the logarithmic growth phase, 48 hours later, the number of cells grown was measured using MTT reagent, and IC ₅₀ (50% growth inhibitory concentration: μg / ml) was determined. Calculated. The results in Table 3 indicate that RK-9794 of the present invention is effective as an antitumor agent.
[0022]
[Table 3]

[0023]
Formulation Example 1: Injection / Drip
To contain 10 mg of RK-9794, 5 g of powdered glucose was added and aseptically distributed into vials, sealed, sealed with an inert gas such as nitrogen and helium, and stored in a cool dark place. Before use, dissolve in ethanol, add 100 ml of 0.85% physiological saline to make an intravenous injection, and administer 10-100 ml per day by intravenous injection or infusion depending on the symptoms.
[0024]
Formulation Example 2: Granule
Take 1 g of RK-9794, 98 g of lactose and 1 g of hydroxypropyl cellulose, mix them well, shape them according to the usual method, dry them well, and make them suitable for bottles and heat-sealing packaging. An agent was produced. 100 to 1000 mg per day can be administered orally according to symptoms [Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing an ultraviolet absorption spectrum of RK-9794 in methanol.
FIG. 2 is a diagram showing a ¹ H NMR (solvent: CDCl ₃ ) spectrum of RK-9794.
FIG. 3 is a diagram showing a ¹³ C NMR (solvent: CDCl ₃ ) spectrum of RK-9794.

Claims

The following formula (II):

A compound represented by

A medicament comprising the compound according to claim 1 as an active ingredient.

The medicament according to claim 2 , which is an antitumor agent.

The method for producing a compound according to claim 1 , comprising a step of separating and collecting the compound according to claim 1 from a culture obtained by culturing Fusarium RK97-94 strain (FERM P-18143) .