Procédé de préparation de 6-désoxytétracyclines
La présente invention a pour objet un procédé de préparation 6-désoxytétracyclines.
Les composés obtenus par le procédé selon rinvention peuvent répondre à la formule :
EMI1.1
dans laquelle R, est un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyle. A partir de ces 6-désoxytétracy- clines on peut préparer les sels thérapeutiquement actifs, acides et basiques ainsi que les complexes et leurs épimères 4, par exemple les sels d'acides miné- raux, les sels alcalins et les sels alcalino-terreux, ainsi que divers complexes tels que ceux formés avec des sels d'aluminium, de magnésium et de calcium.
Les composés mentionnés sont apparentés à la tétracycline et à l'oxytétracycline, antibiotiques à large spectre bien connus et largement utilisés. Les 6 désoxytétracyclines diffèrent essentiellement des antibiotiques précédents par le fait que le groupe hydroxyle en position 6 du noyau naphtacène est remplacé par un atome d'hydrogène. Cette modification produit une différence frappante dans l'activité des composés obtenus, qui apparaissent plus efficaces vis-à-vis de certaines souches de bactéries résistantes à la tétracycline.
Il est très surprenant que les 6-dés oxytétracyclines, particulièrement la 6-désoxytétracy- cline proprement dite, gardent l'activité antibactérienne à large spectre qui caractérise les tétracyclines, surtout lorsqu'on sait que l'anhydrotétracycline, qui est aussi dépourvue de groupe hydroxyle en position 6 du noyau naphtacène, ne présente qu'une activité antibactérienne très inférieure à celle du composé dont elle dérive.
Suivant la nomenclature internationale, le nom chimique correct de cet analogue de la tétracycline est 4-diméthylamino-1, 4, 4a, 5, 5a, 6, 11, 12a-octahydro- 3, 10, 12, 1 2a-tétrahydroxy-6-méthyl-1, 1 1-dioxo-naph- tacène-2-carboxamide. L'analogue de roxytétracy- cline présente un groupe hydroxyle en position 5 du noyau et on le désigne de façon similaire.
L'un des avantages les plus importants que possè- dent ces nouveaux composés par rapport aux tétracyclines décrites antérieurement est leur stabilité accrue en présence d'acides et d'alcalis. L'instabilité de la tétracycline en milieu acide et l'instabilité de la chlorotétracycline en milieu alcalin sont bien connues.
La chlorotétracycline en solution aqueuse avec un tampon au carbonate de sodium à pH 9, 85 perd 50% de son activité en 29, 2 minutes à 230 C. Par contre, la 6-désoxytétracycline ne perd pas plus de 1% de son activité en 24 heures dans les mêmes conditions.
La tétracycline a une demi-vie inférieure à 1 minute dans 1'acide chlorhydrique 3 N à 100"C. La 6-dés- oxytétracycline par contre a une demi-vie de 27 heures dans les mêmes conditions. La 6-désoxy-oxytétra- cycline dans les mêmes conditions a une demi-vie de 45 heures. La tétracycline a une demi-vie d'environ 6 minutes dans une solution de soude 0, 1 N à 100 C.
Par contre, la 6-désoxytétracycline a une demi-vie de 9 t/2 heures dans les mêmes conditions, et la 6-dés oxy-oxytétracycline a une demi-vie de 10 vu heures dans ces mêmes conditions. Ces propriétés inattendues sont très précieuses étant donné que l'instabilité de la tétracycline en milieu acide et l'instabilité de la chlorotétracycline en milieu alcalin limitent ou excluent entièrement l'usage de ces antibiotiques dans de nombreuses applications. Grâce à la stabilité bien meilleure des 6-désoxytétracyclines, il est possible de préparer de nombreux produits pharmaceutiques qui ne pourraient pas être préparés de façon satisfaisante avec les tétracyclines antérieurement connues.
D'autre part, la stabilité accrue permet d'améliorer les mé thodes de récupération et de purification, car on peut utiliser des conditions de pH et de température plus sévères sans détruire les composés nouveaux.
Comme on ra indiqué plus haut, l'activité antibactérienne des 6-désoxytétracyclines est tout à fait similaire à de nombreux égards à celle des tétracyclines antérieurement connues, et ainsi le médecin peut administrer les composes nouveaux de la même façon et approximativement aux mêmes doses que les tétracyclines actuellement utilisées. De plus, étant donné que les nouvelles 6-désoxytétracyclines présentent l'activité antibiotique à spectre large qui caractérise les tétracyclines antérieurement connues, elles peuvent servir à traiter diverses infections produites par des bactéries Gram + aussi bien que Gram- , là où le traitement de ces infections par la tétracycline ou l'oxytétracycline est indiqué.
Le spectre antibactérien des nouveaux composés, représentant la quantité nécessaire pour inhiber la croissance de diverses bactéries typiques, est déterminé de façon usuelle par la méthode des bandes à dilution d'agar-agar qui sert communément à essayer les nouveaux antibiotiques. Les concentrations minima d'inhibition de la 6-désoxytétracycline et de la 6-désoxy-oxytétracycline exprimées en gammas par cm3, vis-à-vis de divers organismes essayés, sont indiquées dans le tableau ci-dessous. A titre de comparaison, on indique aussi l'activité antibactérienne de la tétracycline vis-à-vis des mêmes organismes.
Tableau 1
Organismeoxytetra-.J'-de'
cycline tetracycline cycline
Mycobacterium ranae 0, 2 0, 2 0, 4
Mycobacterium smegmatis
ATCC 607 0, 2 0, 2 0, 4 Staphylococcus aureus
ATCC 6538P 0, 2 0, 8 0, 4 (Micrococcus pyogenes var aureus)
Sarcina Lutea
ATCC 9341 0, 2 0, 4 0, 4
Bacillus subtilis
ATCC 6633 0, 2 ¯ 0, 1 0, 4
Streptococcus hemolyticus, ¯ hémolytique 0, 8 0, 2 6 Organisme d'Chlorhydrate
cycline tetracycline cycline
Streptococcus hemolyticus, g hémolytique > 50 6 25
Staphylococcus albus > 50 6 25
Streptococcus hemolyticus Groupe D > 50 6 25
Staphylococcus aureus 1, 5 1, 5 1, 5
Bacillus cereus
ATCC 10702 1, 5 1, 5 0,
8
Proteus vulgaris 12 12 6
Escherichia coli
ATCC 9637 12 12 6
Salmonella gallinarum 12 12 6
D'après ce qui précède, on remarquera qu'à bien des points de vue, le spectre antibactérien des nouveaux composes est étroitement parallèle à celui de la tétracycline, mais qu'en outre, la 6-désoxytétracycline est efficace vis-à-vis de certaines souches de bactéries résistantes à la tétracycline, telles que le Streptococcus hemolyticus gamma hémolytique, le Staphylococcus albus et le Streptococcus hemolyticus groupe D. En outre, ces deux composés nouveaux sont beaucoup plus efficaces vis-à-vis du Streptococcus hemolyticus bêta hémolytique que la tétracycline.
Selon la présente invention, on prépare les 6-désoxytétracyclines par une réduction catalytique assez remarquable de la tétracycline correspondante, en solution dans un solvant, en présence d'une substance qui est capable de former un noyau chélaté avec un noyau hydronaphtalène péri-dioxygéné ; on peut préparer ainsi la 6-désoxytétracycline en réduisant catalytiquement la tétracycline, la chlorotétracycline ou la bromotétracycline, et on peut préparer la 6-désoxy- oxytétracycline en réduisant catalytiquement l'oxyté- tracycline.
On peut conduire le procédé de réduction en mettant en contact avec de l'hydrogène une solution de la tétracycline correspondante dans un solvant, en présence d'un catalyseur approprié, tel que le palladium métallique finement divisé ou un autre métal de la famille du platine, sur du charbon de bois, ou bien l'hydroxyde de palladium sur du charbon de bois.
Des composés appropriés qui possèdent la propriété de former un noyau chélaté et qui peuvent servir avec succès dans le présent procédé de réduction sont 1'acide borique, les trihalogénures de bore tels que le trifluorure de bore, les sels d'aluminium et de magnésium tels que le chlorure d'aluminium, l'acétate de magnésium, etc. L'acide borique ou les trihalogé- nures de bore semblent être les composés les plus utiles au point de vue du rendement en produit désiré.
Habituellement, l'acide borique ou le trihalogénure de bore est utilisé en quantité au moins équimolaire. On peut conduire la réduction à des températures variant de 0 à 1000 C, et de préférence entre la température ambiante et 500 C environ, et sous des pressions d'hydrogène de 0, 5 à 100 atmosphères environ.
Les solvants inertes appropries qui peuvent servir dans la réaction sont les solvants polaires divers tels que 1'eau, le dioxane, l'acide acétique glacial, le 2 éthoxy-éthanol, et l'acétate d'éthyle. On a trouvé qu'un rapport de 1 : 1 entre 1'eau et la diméthylformamide donnait un mélange solvant particulièrement bon pour cette réaction. On ajoute habituellement une petite quantité d'acide perchlorique à la solution. Une concentration de catalyseur d'au moins 5% en poids de la tétracycline correspondante est généralement nécessaire, et on peut en utiliser jusqu'à 100% environ. On conduit habituellement l'hydrogénolyse jusqu'à ce qu'une mole d'hydrogène soit absorbée, lorsque la matière première est la tétracycline, et à ce moment le taux d'absorption tend à diminuer.
Quand on utilise la chlorotétracycline, il faut évidemment 2 moles d'hydrogène. Il faut veiller à ne pas prolonger l'hydrogénation pendant un temps excessif, car il pourrait se dérouler des réductions plus poussées et indésirables avec formation de produits moins intéressants.
Les substances capables de former un noyau chélaté comme indiqué ci-dessus et qui sont utilisées dans le processus de réduction décrit, sont des réactifs très importants car ils jouent apparemment le rôle de formateurs de complexes et ont pour effet d'empêcher la réduction des fonctions oxygénées en position 11 et 12 du noyau naphtacène. Ces réactifs sont très importants dans la réduction, car en l'absence de ces agents, la réduction se fait en position 12 de préférence à la position 6, et le composé résultant ne possède aucune activité biologique. Mais dans le processus de réduction décrit, la chélation a pour effet de bloquer ces fonctions oxygénées et d'empêcher leur réduction, de sorte que l'activité antibactérienne du composé se conserve.
Une fois l'hydrogénation achevée, on peut récupérer la 6-désoxytétracycline ou la 6-désoxy-oxytétra- cycline par tous moyens désirés, par exemple en éli- minant le catalyseur et en concentrant la solution.
On peut évaporer le produit jusqu'à siccité, le purifier par précipitation fractionnée dans le méthanol et on peut encore purifier en recristallisant dans l'alcool de façon usuelle. On peut convertir le produit neutre ainsi formé en un sel d'acide minéral, par exemple en chlorhydrate, en le traitant par des acides tels que l'acide chlorhydrique, à un pH inférieur à 4 environ. On peut former de façon similaire d'autres sels d'acides, tels que le sulfate, le phosphate, le trichloracétate, etc. De préférence, on peut mettre les 6-désoxytétracyclines en suspension dans un solvant approprié pendant l'acidification. On peut former simplement les sels alcalins et alcalino-terreux en traitant le composé amphotère par un équivalent environ de la base choisie, par exemple la soude, la potasse, la chaux, la baryte, etc.
On peut préparer les sels métalliques en solution aqueuse ou dans un solvant approprié. De préférence, on prépare les sels basiques à un pH de 6 ou supérieur. On peut obtenir la base libre à un pH de 4 à 6 environ. On peut former les complexes, par exemple le complexe de 6-désoxyté- tracycline et de gluconate d'aluminium, en mélangeant simplement le chlorhydrate du composé nouveau et le gluconate d'aluminium en solution aqueuse.
Pour former les épimères 4 des 6-désoxytétracyclines, c'est-à-dire ceux qui ont une forme épimère sur l'atome de carbone en position 4, ainsi qu'on l'a décrit à propos des autres composés de la série tétracycline, on peut ajuster simplement le pH d'une solution concentrée de l'antibiotique entre 3, 0 et 5, 0 et laisser reposer la solution jusqu'à ce que l'isomérisa- tion soit parvenue à l'équilibre.
Le plus commode est de conduire l'isomérisation à la température ambiante, bien que l'on obtienne un taux de conversion plus élevé aux températures supérieures. Le pH doit être compris entre 3, 0 et 5, 0 environ, de préférence entre 3, 5 et 4, 5. Il se produit une certaine épimérisation aux pH qui sortent de ces intervalles, et même dans 1'eau distillée ; mais la vitesse d'épimérisation est très faible. La concentration de l'antibiotique dans la solution aqueuse doit être aussi forte que possible, afin de donner les plus grandes vitesses d'épimérisation. L'équilibre complet peut nécessiter un laps de temps d'environ 24 heures à 25o C, mais un équilibre satisfaisant peut être obtenu en un temps beaucoup plus court dans des conditions particulières.
Toutefois, en général, on obtient les meilleurs résultats en laissant reposer les solutions pendant une durée d'une semaine ou plus. Il semble que l'équilibre soit atteint dans la plupart des cas à 50% environ ; autrement dit, la moitié environ de l'antibiotique se convertit en épimère à l'équilibre.
Etant donné que la concentration est un facteur important pour obtenir des rendements élevés pendant de courts laps de temps, il est préférable de choisir un système solvant qui donne la plus forte concentration en antibiotique. Il est généralement indiqué de tamponner ces systèmes de manière à obtenir un pH situé dans l'intervalle préférentiel.
Comme solvants, on citera le méthanol, l'éthanol, le butanol, l'acétone, le 2-éthoxyéthanol, le 2-méthaxy- propanol, l'acide acétique glacial, le tétrahydrofurane, la diméthylformamide, et les mélanges de ces solvants. On peut utiliser encore d'autres solvants. Un tampon préférentiel est le phosphate monosodique, mais on peut utiliser d'autres tampons et couples de tampons qui maintiennent le pH dans l'intervalle dé- sire.
Exemple 1
On met en suspension 12 g de chlorhydrate de tétracycline dans 10 volumes d'un mélange à 1 : 1 d'eau et de diméthylformamide. Au mélange, on ajoute 1, 48 g d'acide borique, 12 g de palladium non réduit à 5% sur charbon, et 0, 5 cm3 d'acide perchlorique. On conduit l'hydrogénation par réaction sur l'hydrogène à environ 2, 8 kg/cm2, sur une secoueuse
Parr, pendant 2 Vs heures environ. On arrête l'hydrogénation dès que 1 mole d'hydrogène environ a été absorbée. On filtre la solution et on lave le catalyseur avec 10 cm3 de diméthylformamide, puis on lave une deuxième fois avec 10cm3 d'eau.
On ajuste à pH 3, 0 le filtrat obtenu par le procédé décrit à 1'exemple 1, à l'aide d'ammoniaque concentrée, et on évapore sous vide jusqu'à siccité. On ajoute 50cm3 de butanol saturé d'eau, on agite le mélange et on filtre. On concentre l'activité dans l'eau et on ajuste le pH à 3, 0, puis on filtre. On ajuste le filtrat à pH 1, 5 et on extrait en retour avec 100 cm3 de butanol. On concentre l'extrait jusqu'à environ 5-10 cm3 sous atmosphère d'azote. On ensemence la solution et on la laisse reposer pendant 18 heures à la température ambiante. On filtre les cristaux, on les lave à l'acétone puis à l'éther et on sèche sous vide à 40O C pendant 20 heures pour obtenir 179 mg de 6-désoxytétracycline.
Exemple 2
On délaie 2/3 de gramme de 6-désoxytétracycline dans 13, 5 cm3 d'alcool éthylique. On ajoute 0, 5 cm3 d'acide chlorhydrique concentré pour ajuster le pH à 0, 8-1, 0. On laisse reposer la solution pendant 3 1/2 heures. Il se forme des cristaux de chlorhydrate de 6-désoxytétracycline que l'on sèche sous vide pendant 20 heures à 100 C.
Analyse : calculée pour CW, H2-, N C107 : C 56, 7 ;
H 5, 38 ; N 6, 02 ; Cl 7, 69 ; O 24, 1 ; effective : C 56, 52 ; H 5, 46 ; N 5, 94 ; Cl 7, 71 ; O 23, 89.
Le produit a une rotation optique [a] 20 de-292¯ dans H2SOY U, 1 N.
On détermine le spectre d'absorption d'ultraviolet sur un échantillon du composé dans H¯SO4 0, 1 N, à une concentration de 30, 65 gammas par cm3.
On détermine le spectre d'absorption d'infrarouge sur un échantillon du composé mélangé à des cristaux de KBr et comprimé en un disque.
Exemple 3
On répète l'opération de l'exemple 1, à cette seule exception près que l'on utilise 12 g d'oxytétra- cycline comme matière première au lieu du chlorhydrate de tétracycline utilisé dans ledit exemple. A la solution de réduction ainsi obtenue, on ajoute 5 g de terre d'infusoires et on filtre le mélange. On lave le gâteau filtre avec 50 cm3 d'un mélange à 50/50 de diméthylformamide et d'eau. On réunit le filtrat et les liqueurs de lavage pour obtenir un volume de 168 cm3. On ajuste le pH des liqueurs de lavage et du filtrat réunis à 3, 0 à l'aide d'ammoniaque concentrée et on évapore la solution sous vide jusqu'à siccité à 40-600 C.
On extrait les solides avec 75 cm3 d'eau pendant une heure avec agitation. On filtre la bouillie. On ajuste le pH de la solution à 1, 0 avec de l'acide chlorhydrique. On extrait à deux reprises l'ac- tivité dans du butanol. On réunit les extraits et on les évapore jusqu'à siccité. On ajoute 7 cm3 d'acé- tone à l'extrait sec, et on ajoute de l'acide chlorhydrique pour ajuster le pH à 1, 0. On élimine les solides par centrifugation. On ensemence le liquide qui surnage et on laisse reposer 6 heures les cristaux formés, on filtre et on lave à l'acétone, puis à l'éther. On sèche les cristaux sous vide à 400 C pendant 12 heures. Rendement : 84, 7 mg de 6-désoxy-oxytétracy- cline.
Analyse calculée pour CH., N., C10g : C 54, 90 ;
H 5, 20 ; N5, 83 ; C17, 38 ; 026, 70 ; analyse effective : C 54, 48 ; H 4, 81 ; N 5, 50 ; Cl 7, 74 ; 0 26, 55.
Le produit a une rotation optique [a] 25' de-251¯ dans HoSO4 S04 0, 1 N.
On détermine le spectre d'absorption d'ultraviolet sur un échantillon du composé dans H. S04 0, 1 N à une concentration de 40, 76 gammas par cm3.
On détermine le spectre d'absorption d'infrarouge sur un échantillon du composé mélangé à des cristaux de KBr et comprimé en un disque.
Exemple 4
A 1, 0 g de chlorhydrate de tétracycline, on ajoute 25 cms d'un mélange à 1 : 1 de diméthylformamide et d'eau. On ajoute 3 cm3 (10 équivalents molaires) de trifluorure de bore à 45% dans l'éther, et on ajuste le pH à 1, 3 avec 2 cm3 de triéthylamine. On ajoute 1, 0 g de palladium à 5% sur carbone et on place le mélange sur une secoueuse Parr et on laisse réagir sur l'hydrogène pendant 100 minutes (absorption d'hydrogène 1 mole). On filtre le mélange et on rince les insolubles avec 10 cep d'eau. On obtient de la 6-désoxytétracycline.
Exemple 5
A 2, 5 g de chlorhydrate de tétracycline, on ajoute 25 cm3 d'un mélange à 1 : 5 de diméthylforma- mide et d'eau. On ajoute 1, 1 g d'acétate de magnésium, Mg (C2HSO2) 2, 4HLO. On ajuste le pH à 1, 8 avec de l'acide chlorhydrique. On ajoute 2, 5 g de palladium à 5% sur charbon et 2 gouttes d'acide perchlorique, et on place le mélange sur une se coueuse Parr et on le fait réagir sur l'hydrogène pendant 71 minutes (absorption d'hydrogène : 1 mole).
On filtre la solution réduite et on rince les insolubles avec de l'acide chlorhydrique 0, 1 N. On obtient de la 6-désoxytétracycline.
Exemple 6
A 2, 5 g de chlorhydrate de tétracycline, on ajoute 25 cm3 d'un mélange à 1 : 1 de diméthylfor- mamide et d'eau. On ajuste le pH à 1, 8 avec de 1'acide chlorhydrique. On ajoute 0, 55 g de chlorure de calcium, 2 gouttes d'acide perchlorique et 2, 5 g de palladium sur charbon. On place le mélange sur une secoueuse Parr et on laisse réagir sur rhydro- gène pendant 97 minutes (absorption : 1 mole de H2).
On filtre le mélange et on le rince avec 5 cm3 d'acide chlorhydrique 0, 1 N. On obtient de la 6-désoxytétra- cycline.
Exemple 7
A 1 g de chlorhydrate de tétracycline, on ajoute 25 cm3 d'un mélange à 1 : 1 de diméthylformamide et d'eau contenant 0, 27 g de chlorure d'aluminium.
On ajuste le pH à 1, 5 avec de 1'acide perchlorique.
On ajoute 1, 0 g de palladium à 5% sur charbon et on place le mélange sur une secoueuse Parr pendant 150 minutes (absorption 1 mole de HJ. On filtre le mélange. On obtient de la 6-désoxytétracycline.
Exemple 8
A 5 mg de 6-désoxytétracycline, on ajoute 1 cm3 d'acide acétique glacial. On agite le mélange et on le laisse s'équilibrer à la température ambiante pendant 18 heures, puis on filtre. La chromatographie sur papier montre la présence de la 6-désoxy-4-épi- tétracycline.
Exemple 9
A 5 mg de 6-désoxy-oxytétracycline, on ajoute 1 cm3 d'acide acétique glacial. On agite le mélange et on le laisse s'équilibrer à la température ambiante pendant 18 heures puis on filtre. La chromatographie sur bande de papier montre la présence de 6-désoxy 4-épioxytétracycline.
Exemple 10
A 1, 0 g de chlorhydrate de tétracycline, on ajoute 0, 13 g d'acide borique dissous dans 28 cm3 d'un mélange à 1 : 1 de diméthylformamide et d'eau.
On ajuste le pH à 2, 1 avec de l'acide chlorhydrique.
A 13 cm3 de cette solution, on ajoute 0, 75 g de palladium à 5% sur charbon. On place le mélange dans un autoclave en acier inoxydable et on le laisse réagir sur l'hydrogène à une pression de 133 kg/cm2 pendant 80 minutes. On filtre le mélange et on lave les insolubles avec de 1'eau. Des titrages spectrophotométriques du filtrat de réduction indiquent la présence de 6-désoxytétracycline.
Exemple I1
On suit la méthode de l'exemple 1, sauf que ron utilise comme matière première le chlorhydrate de chlorotétracycline au lieu de chlorhydrate de tétracy- cline. On ajoute le chlorhydrate de chlorotétracycline à 15 cm3 d'un mélange à 50 : 50 de diméthylforma- mide et d'eau et on conduit l'hydrogénation comme dans 1'exemple 1 jusqu'à ce que deux moles d'hydrogène aient été absorbées. L'examen chromatographique du produit révèle la présence de la 6-désoxytétra- cycline.
Exemple 12
A 4 cm3 d'une solution que l'on prépare en mélangeant 25 cm3 de diméthylformamide, 25 cm3 d'eau, 32, 5 mg d'acide borique et une goutte d'acide perchlorique, on ajoute 5, 67 mg de 4-épioxytétracycline neutre (J. A. C. S. 79, 2849, 1957). On ajoute 7mg de palladium à 5% sur charbon et on met le mélange en contact avec de l'hydrogène à une pression de 2, 1 kg/cm2 pendant 6 heures. L'analyse chromatographique sur papier et l'analyse spectrophotométrique indiquent la présence de 6-désoxy-4-épioxytétracy- cline.
Exemple 13
A 4 cm3 d'une solution que l'on prépare en mélangeant 25 cm3 de diméthylformamide, 25 cm3 d'eau, 32, 5 mg d'acide borique et une goutte d'acide perchlorique, on ajoute 5, 0 mg de sel d'ammonium de 4-épi-bromotétracycline (J. A. C. S. 79, 2849, 1957).
On ajoute 7 mg de palladium à 5% sur charbon et on met le mélange en contact avec de l'hydrogène à une pression de 2, 1 kg/cm2 pendant 6 heures. L'analyse chromatographique sur papier et l'analyse spec trophotométrique indiquent la présence de 6-désoxy 4-épitétracycline.
Exemple 14
A 4 cm3 d'une solution que l'on prépare en mélangeant 25 cm3 de diméthylformamide, 25 cm3 d'eau, 32, 5 mg d'acide borique et une goutte d'acide perchlorique, on ajoute 5, 0 mg de chlorhydrate de 4-épi chlorotétracycline (J. A. C. S. 79, 2849, 1957). On ajoute 7 mg de palladium à 5% sur charbon et on met le mélange en contact avec de l'hydrogène à une pression de 2, 1 kg/cm2 pendant 7 heures. L'analyse chromatographique sur papier et 1'analyse spectrophotométrique indiquent la présence de 6-désoxy-4- épitétracycline.
Exemple 15
A 4 cm3 d'une solution que l'on prépare en mélangeant 25 cm3 de diméthylformamide, 25 cm3 d'eau, 32, 5 mg d'acide borique et une goutte d'acide perchlorique, on ajoute 6, 0 mg de bromotétracycline. On ajoute 7 mg de palladium à 5% sur charbon et on met le mélange en contact avec de l'hydrogène à une pression de 2, 1 kg/cm2, pendant 6 heures. L'analyse chromatographique sur papier et 1'analyse spec trophotométrique montrent la présence de 6-désoxytétracycline.
Exemple 16
A 4 cm3 d'une solution que l'on prépare en mélangeant 25 cm3 de diméthylformamide, 25 cm3 d'eau, 32, 5 mg d'acide borique et une goutte d'acide perchlorique, on ajoute 5, 0 mg de 4-épitétracycline (J. A. C. S. 79, 2849, 1957). On ajoute 7 mg de palladium à 5% sur charbon et on met le mélange en contact avec de l'hydrogène à une pression de 2, 1 kg/ cm2 pendant 4 heures. L'analyse chromatographique sur papier et 1'analyse spectrophotométrique indiquent la présence de 6-désoxy-4-épitétracycline.
Process for the preparation of 6-deoxytetracyclines
The present invention relates to a process for the preparation of 6-deoxytetracyclines.
The compounds obtained by the process according to the invention can correspond to the formula:
EMI1.1
in which R, is a hydrogen atom or a hydroxyl group. From these 6-deoxytetracyclines, therapeutically active, acidic and basic salts can be prepared as well as complexes and their epimers 4, for example salts of mineral acids, alkali salts and alkaline earth salts, as well as various complexes such as those formed with aluminum, magnesium and calcium salts.
The compounds mentioned are related to tetracycline and oxytetracycline, well known and widely used broad spectrum antibiotics. The 6 deoxytetracyclines differ essentially from the previous antibiotics in that the hydroxyl group at position 6 of the naphtacene ring is replaced by a hydrogen atom. This modification produces a striking difference in the activity of the compounds obtained, which appear to be more effective against certain strains of bacteria resistant to tetracycline.
It is very surprising that 6-deoxytetracyclines, particularly 6-deoxytetracycline itself, retain the broad spectrum antibacterial activity that characterizes tetracyclines, especially when we know that anhydrotetracycline, which is also group-free. hydroxyl in position 6 of the naphtacene nucleus, exhibits only antibacterial activity much lower than that of the compound from which it is derived.
According to international nomenclature, the correct chemical name for this tetracycline analogue is 4-dimethylamino-1, 4, 4a, 5, 5a, 6, 11, 12a-octahydro- 3, 10, 12, 1 2a-tetrahydroxy-6 -methyl-1,1-dioxo-naphtacene-2-carboxamide. The roxytetracycline analog has a hydroxyl group at the 5-position of the ring and is similarly designated.
One of the most important advantages of these new compounds over the tetracyclines described previously is their increased stability in the presence of acids and alkalis. The instability of tetracycline in an acidic medium and the instability of chlorotetracycline in an alkaline medium are well known.
Chlorotetracycline in aqueous solution with sodium carbonate buffer at pH 9.85 loses 50% of its activity in 29.2 minutes at 230 C. On the other hand, 6-deoxytetracycline does not lose more than 1% of its activity in 24 hours under the same conditions.
Tetracycline has a half-life of less than 1 minute in 3N hydrochloric acid at 100 ° C. 6-deoxytetracycline, on the other hand, has a half-life of 27 hours under the same conditions. 6-deoxy-oxytetra - cyclin under the same conditions has a half-life of 45 hours Tetracycline has a half-life of about 6 minutes in a 0.1 N sodium hydroxide solution at 100 C.
On the other hand, 6-deoxytetracycline has a half-life of 9 t / 2 hours under the same conditions, and 6-deoxy-oxytetracycline has a half-life of 10 hours under these same conditions. These unexpected properties are very valuable given that the instability of tetracycline in an acidic medium and the instability of chlorotetracycline in an alkaline medium limit or entirely exclude the use of these antibiotics in many applications. Thanks to the much better stability of 6-deoxytetracyclines, it is possible to prepare many pharmaceutical products which could not be satisfactorily prepared with the previously known tetracyclines.
On the other hand, the increased stability allows improved recovery and purification methods, since more severe pH and temperature conditions can be used without destroying the new compounds.
As noted above, the antibacterial activity of 6-deoxytetracyclines is quite similar in many respects to that of previously known tetracyclines, and thus the physician can administer the new compounds in the same manner and in approximately the same doses as the tetracyclines currently in use. In addition, since the newer 6-deoxytetracyclines exhibit the broad spectrum antibiotic activity that characterizes previously known tetracyclines, they can be used to treat various infections produced by Gram + as well as Gram- bacteria, where treatment of such infections with tetracycline or oxytetracycline is indicated.
The antibacterial spectrum of the new compounds, representing the amount necessary to inhibit the growth of various typical bacteria, is determined in the usual way by the dilution band method of agar which is commonly used in testing new antibiotics. The minimum inhibition concentrations of 6-deoxytetracycline and 6-deoxy-oxytetracycline expressed in gamma per cm 3, with respect to various organisms tested, are indicated in the table below. By way of comparison, the antibacterial activity of tetracycline towards the same organisms is also indicated.
Table 1
Organismeoxytetra-.J'-de '
cyclin tetracycline cycline
Mycobacterium ranae 0, 2 0, 2 0, 4
Mycobacterium smegmatis
ATCC 607 0, 2 0, 2 0, 4 Staphylococcus aureus
ATCC 6538P 0, 2 0, 8 0, 4 (Micrococcus pyogenes var aureus)
Sarcina Lutea
ATCC 9341 0, 2 0, 4 0, 4
Bacillus subtilis
ATCC 6633 0.2 ¯ 0, 1 0, 4
Streptococcus hemolyticus, ¯ hemolytic 0, 8 0, 2 6 Organism of hydrochloride
cyclin tetracycline cycline
Streptococcus hemolyticus, hemolytic g> 50 6 25
Staphylococcus albus> 50 6 25
Streptococcus hemolyticus Group D> 50 6 25
Staphylococcus aureus 1, 5 1, 5 1, 5
Bacillus cereus
ATCC 10702 1, 5 1, 5 0,
8
Proteus vulgaris 12 12 6
Escherichia coli
ATCC 9637 12 12 6
Salmonella gallinarum 12 12 6
From the above, it will be appreciated that in many ways the antibacterial spectrum of the new compounds closely parallels that of tetracycline, but that in addition, 6-deoxytetracycline is effective against certain strains of bacteria resistant to tetracycline, such as Streptococcus hemolyticus gamma hemolytic, Staphylococcus albus and Streptococcus hemolyticus group D. In addition, these two new compounds are much more effective against Streptococcus hemolyticus beta hemolytic than tetracycline.
According to the present invention, the 6-deoxytetracyclines are prepared by a rather remarkable catalytic reduction of the corresponding tetracycline, in solution in a solvent, in the presence of a substance which is capable of forming a chelated nucleus with a perioxygenated hydronaphthalene nucleus; 6-deoxytetracycline can thus be prepared by catalytically reducing tetracycline, chlorotetracycline or bromotetracycline, and 6-deoxy-oxytetracycline can be prepared by catalytically reducing oxytetracycline.
The reduction process can be carried out by contacting with hydrogen a solution of the corresponding tetracycline in a solvent, in the presence of a suitable catalyst, such as finely divided metallic palladium or another metal of the platinum family. , on charcoal, or palladium hydroxide on charcoal.
Suitable compounds which possess the property of forming a chelate ring and which can be used successfully in the present reduction process are boric acid, boron trihalides such as boron trifluoride, aluminum and magnesium salts such as. than aluminum chloride, magnesium acetate, etc. Boric acid or boron trihalides appear to be the most useful compounds from the standpoint of desired product yield.
Usually, boric acid or boron trihalide is used in at least equimolar amount. The reduction can be carried out at temperatures varying from 0 to 1000 ° C., and preferably between room temperature and 500 ° C. approximately, and under hydrogen pressures of from 0.5 to 100 atmospheres approximately.
Suitable inert solvents which can be used in the reaction are various polar solvents such as water, dioxane, glacial acetic acid, ethoxy-ethanol, and ethyl acetate. A 1: 1 ratio of water to dimethylformamide has been found to give a particularly good solvent mixture for this reaction. Usually a small amount of perchloric acid is added to the solution. A catalyst concentration of at least 5% by weight of the corresponding tetracycline is generally required, and up to about 100% can be used. The hydrogenolysis is usually carried out until one mole of hydrogen is absorbed, when the raw material is tetracycline, and at this time the absorption rate tends to decrease.
When using chlorotetracycline, you obviously need 2 moles of hydrogen. Care must be taken not to prolong the hydrogenation for an excessive time, as further and undesirable reductions could take place with the formation of less interesting products.
Substances capable of forming a chelated nucleus as indicated above and which are used in the described reduction process, are very important reagents because they apparently play the role of complex formers and have the effect of preventing the reduction of functions. oxygenated in position 11 and 12 of the naphtacene nucleus. These reagents are very important in the reduction, because in the absence of these agents, the reduction takes place at position 12 preferably at position 6, and the resulting compound does not have any biological activity. But in the reduction process described, chelation has the effect of blocking these oxygen functions and preventing their reduction, so that the antibacterial activity of the compound is retained.
After the hydrogenation is complete, the 6-deoxytetracycline or 6-deoxy-oxytetracycline can be recovered by any means desired, for example by removing the catalyst and concentrating the solution.
The product can be evaporated to dryness, purified by fractional precipitation in methanol and can be further purified by recrystallizing from alcohol in the usual way. The neutral product thus formed can be converted into an inorganic acid salt, for example the hydrochloride, by treating it with acids such as hydrochloric acid, at a pH below approximately 4. Other salts of acids, such as sulfate, phosphate, trichloroacetate, etc. can similarly be formed. Preferably, the 6-deoxytetracyclines can be suspended in a suitable solvent during the acidification. The alkali and alkaline earth salts can be formed simply by treating the amphoteric compound with approximately one equivalent of the chosen base, for example soda, potash, lime, barite, etc.
The metal salts can be prepared in aqueous solution or in a suitable solvent. Preferably, the basic salts are prepared at a pH of 6 or higher. The free base can be obtained at a pH of about 4 to 6. The complexes, for example, the complex of 6-deoxyteracycline and aluminum gluconate, can be formed by simply mixing the hydrochloride of the new compound and the aluminum gluconate in aqueous solution.
To form the 4-epimers of 6-deoxytetracyclines, i.e. those which have an epimeric form on the carbon atom in position 4, as has been described in connection with the other compounds of the tetracycline series One can simply adjust the pH of a concentrated solution of the antibiotic to between 3.0 and 5.0 and allow the solution to stand until the isomerization has come to equilibrium.
The most convenient is to carry out the isomerization at room temperature, although a higher conversion rate is obtained at higher temperatures. The pH should be between approximately 3.0 and 5.0, preferably between 3.5 and 4.5. Some epimerization occurs at the pH values outside these ranges, and even in distilled water; but the epimerization rate is very low. The concentration of the antibiotic in the aqueous solution should be as high as possible, in order to give the highest rates of epimerization. Complete equilibrium may take about 24 hours at 25o C, but satisfactory equilibrium can be achieved in a much shorter time under particular conditions.
However, in general, the best results are obtained by allowing the solutions to stand for a period of a week or more. It seems that equilibrium is reached in most cases at around 50%; that is, about half of the antibiotic converts to an epimer at equilibrium.
Since concentration is an important factor in obtaining high yields for short periods of time, it is preferable to choose a solvent system which gives the highest concentration of antibiotic. It is generally advisable to buffer these systems so as to obtain a pH within the preferential range.
As solvents, mention will be made of methanol, ethanol, butanol, acetone, 2-ethoxyethanol, 2-methaxy-propanol, glacial acetic acid, tetrahydrofuran, dimethylformamide, and mixtures of these solvents. Still other solvents can be used. A preferred buffer is monosodium phosphate, but other buffers and pairs of buffers can be used which keep the pH within the desired range.
Example 1
12 g of tetracycline hydrochloride are suspended in 10 volumes of a 1: 1 mixture of water and dimethylformamide. To the mixture are added 1.48 g of boric acid, 12 g of unreduced 5% palladium on charcoal, and 0.5 cm3 of perchloric acid. The hydrogenation is carried out by reaction with hydrogen at about 2.8 kg / cm2, on a shaker
Parr, for about 2 Vs hours. The hydrogenation is stopped as soon as approximately 1 mole of hydrogen has been absorbed. The solution is filtered and the catalyst is washed with 10 cm3 of dimethylformamide, then washed a second time with 10 cm3 of water.
The filtrate obtained by the method described in Example 1 is adjusted to pH 3.0 using concentrated ammonia and evaporated in vacuo to dryness. 50cm3 of water-saturated butanol are added, the mixture is stirred and filtered. The activity is concentrated in water and the pH is adjusted to 3.0, then filtered. The filtrate is adjusted to pH 1.5 and back-extracted with 100 cm3 of butanol. The extract is concentrated to about 5-10 cm3 under a nitrogen atmosphere. The solution is seeded and allowed to stand for 18 hours at room temperature. The crystals are filtered, washed with acetone and then with ether and dried under vacuum at 40 ° C. for 20 hours to obtain 179 mg of 6-deoxytetracycline.
Example 2
2/3 gram of 6-deoxytetracycline is stirred in 13.5 cm3 of ethyl alcohol. 0.5 cm3 of concentrated hydrochloric acid is added to adjust the pH to 0.8-1.0. The solution is left to stand for 3 1/2 hours. Crystals of 6-deoxytetracycline hydrochloride form which are dried under vacuum for 20 hours at 100 C.
Analysis: calculated for CW, H2-, N C107: C 56.7;
H 5.38; N 6.02; Cl 7.69; O 24, 1; effective: C 56, 52; H 5.46; N 5, 94; Cl 7.71; O 23, 89.
The product has an optical rotation [a] 20 of -292¯ in H2SOY U, 1 N.
The ultraviolet absorption spectrum is determined on a sample of the compound in 0.1N H¯SO4 at a concentration of 30.65 gammas per cm3.
The infrared absorption spectrum is determined on a sample of the compound mixed with KBr crystals and compressed into a disc.
Example 3
The operation of Example 1 is repeated, with the sole exception that 12 g of oxytetracycline are used as starting material instead of the tetracycline hydrochloride used in said example. To the reduction solution thus obtained, 5 g of diatomaceous earth is added and the mixture is filtered. The filter cake is washed with 50 cm3 of a 50/50 mixture of dimethylformamide and water. The filtrate and the washings are combined to obtain a volume of 168 cm3. The combined wash liquors and filtrate are adjusted to pH 3.0 with concentrated ammonia, and the solution evaporated in vacuo to dryness at 40-600 ° C.
The solids were extracted with 75 cm3 of water for one hour with stirring. The porridge is filtered. The pH of the solution is adjusted to 1.0 with hydrochloric acid. The activity is extracted twice in butanol. The extracts are combined and evaporated to dryness. 7 cm3 of acetone is added to the dry extract, and hydrochloric acid is added to adjust the pH to 1.0. The solids are removed by centrifugation. The liquid which supernates is inoculated and the crystals formed are left to stand for 6 hours, filtered and washed with acetone, then with ether. The crystals are dried under vacuum at 400 ° C. for 12 hours. Yield: 84.7 mg of 6-deoxy-oxytetracycline.
Analysis calculated for CH., N, C10g: C 54.90;
H 5.20; N5, 83; C17, 38; 026, 70; effective analysis: C 54, 48; H 4.81; N 5.50; Cl 7.74; 0 26, 55.
The product has a 25 'optical rotation [a] of -251¯ in 0.1N HoSO4 SO4.
The ultraviolet absorption spectrum is determined on a sample of the compound in 0.1N H. SO4 at a concentration of 40.76 gammas per cm3.
The infrared absorption spectrum is determined on a sample of the compound mixed with KBr crystals and compressed into a disc.
Example 4
To 1.0 g of tetracycline hydrochloride, 25 cms of a 1: 1 mixture of dimethylformamide and water are added. 3 cm3 (10 molar equivalents) of 45% boron trifluoride in ether are added, and the pH is adjusted to 1.3 with 2 cm3 of triethylamine. 1.0 g of 5% palladium on carbon is added and the mixture is placed on a Parr shaker and allowed to react with hydrogen for 100 minutes (absorption of 1 mol of hydrogen). The mixture is filtered and the insolubles are rinsed with 10 cep water. 6-deoxytetracycline is obtained.
Example 5
To 2.5 g of tetracycline hydrochloride is added 25 cm3 of a 1: 5 mixture of dimethylformamide and water. 1.1 g of magnesium acetate, Mg (C2HSO2) 2.4HLO are added. The pH is adjusted to 1.8 with hydrochloric acid. 2.5 g of 5% palladium on charcoal and 2 drops of perchloric acid are added, and the mixture is placed on a Parr bed and reacted with hydrogen for 71 minutes (hydrogen absorption: 1 mole).
The reduced solution is filtered and the insolubles are rinsed with 0.1N hydrochloric acid. 6-deoxytetracycline is obtained.
Example 6
To 2.5 g of tetracycline hydrochloride is added 25 cm3 of a 1: 1 mixture of dimethylformamide and water. The pH is adjusted to 1.8 with hydrochloric acid. 0.55 g of calcium chloride, 2 drops of perchloric acid and 2.5 g of palladium on charcoal are added. The mixture is placed on a Parr shaker and allowed to react with hydrogen for 97 minutes (absorption: 1 mole of H2).
The mixture is filtered and rinsed with 5 cm3 of 0.1N hydrochloric acid. 6-deoxytetracycline is obtained.
Example 7
To 1 g of tetracycline hydrochloride are added 25 cm3 of a 1: 1 mixture of dimethylformamide and water containing 0.27 g of aluminum chloride.
The pH is adjusted to 1.5 with perchloric acid.
1.0 g of 5% palladium on charcoal is added and the mixture is placed on a Parr shaker for 150 minutes (absorption 1 mole of HJ. The mixture is filtered. 6-deoxytetracycline is obtained.
Example 8
To 5 mg of 6-deoxytetracycline, 1 cm3 of glacial acetic acid is added. The mixture is stirred and allowed to equilibrate at room temperature for 18 hours, then filtered. Chromatography on paper shows the presence of 6-deoxy-4-epitetracycline.
Example 9
To 5 mg of 6-deoxy-oxytetracycline, 1 cm3 of glacial acetic acid is added. The mixture is stirred and allowed to equilibrate at room temperature for 18 hours then filtered. The paper strip chromatography shows the presence of 6-deoxy 4-epioxytetracycline.
Example 10
To 1.0 g of tetracycline hydrochloride is added 0.13 g of boric acid dissolved in 28 cm3 of a 1: 1 mixture of dimethylformamide and water.
The pH is adjusted to 2.1 with hydrochloric acid.
To 13 cm3 of this solution, 0.75 g of 5% palladium on charcoal is added. The mixture is placed in a stainless steel autoclave and allowed to react with hydrogen at a pressure of 133 kg / cm2 for 80 minutes. The mixture is filtered and the insolubles washed with water. Spectrophotometric titrations of the reduction filtrate indicate the presence of 6-deoxytetracycline.
Example I1
The method of Example 1 is followed, except that the starting material is chlorotetracycline hydrochloride instead of tetracycline hydrochloride. Chlorotetracycline hydrochloride is added to 15 cc of a 50:50 mixture of dimethylformamide and water, and the hydrogenation is carried out as in Example 1 until two moles of hydrogen have been absorbed. . Chromatographic examination of the product reveals the presence of 6-deoxytetracyclin.
Example 12
To 4 cm3 of a solution which is prepared by mixing 25 cm3 of dimethylformamide, 25 cm3 of water, 32.5 mg of boric acid and a drop of perchloric acid, 5.67 mg of 4- are added. neutral epioxytetracycline (JACS 79, 2849, 1957). 7 mg of 5% palladium on charcoal are added and the mixture is contacted with hydrogen at a pressure of 2.1 kg / cm2 for 6 hours. Chromatographic analysis on paper and spectrophotometric analysis indicate the presence of 6-deoxy-4-epioxytetracycline.
Example 13
To 4 cm3 of a solution which is prepared by mixing 25 cm3 of dimethylformamide, 25 cm3 of water, 32.5 mg of boric acid and a drop of perchloric acid, 5.0 mg of salt is added. 4-epi-bromotetracycline ammonium (JACS 79, 2849, 1957).
7 mg of 5% palladium on charcoal are added and the mixture is contacted with hydrogen at a pressure of 2.1 kg / cm2 for 6 hours. Chromatographic analysis on paper and spec trophotometric analysis indicate the presence of 6-deoxy 4-epitetracycline.
Example 14
To 4 cm3 of a solution which is prepared by mixing 25 cm3 of dimethylformamide, 25 cm3 of water, 32.5 mg of boric acid and a drop of perchloric acid, 5.0 mg of hydrochloride is added. 4-epi chlorotetracycline (JACS 79, 2849, 1957). 7 mg of 5% palladium on charcoal are added and the mixture is contacted with hydrogen at a pressure of 2.1 kg / cm2 for 7 hours. Paper chromatographic analysis and spectrophotometric analysis indicate the presence of 6-deoxy-4-epitetracycline.
Example 15
To 4 cm3 of a solution which is prepared by mixing 25 cm3 of dimethylformamide, 25 cm3 of water, 32.5 mg of boric acid and a drop of perchloric acid, 6.0 mg of bromotetracycline are added. 7 mg of 5% palladium on charcoal are added and the mixture is contacted with hydrogen at a pressure of 2.1 kg / cm2 for 6 hours. Chromatographic analysis on paper and spec trophotometric analysis show the presence of 6-deoxytetracycline.
Example 16
To 4 cm3 of a solution which is prepared by mixing 25 cm3 of dimethylformamide, 25 cm3 of water, 32.5 mg of boric acid and a drop of perchloric acid, 5.0 mg of 4- are added. epitetracycline (JACS 79, 2849, 1957). 7 mg of 5% palladium on charcoal are added and the mixture is contacted with hydrogen at a pressure of 2.1 kg / cm2 for 4 hours. Paper chromatographic analysis and spectrophotometric analysis indicate the presence of 6-deoxy-4-epitetracycline.